Academiejaar ONTWIKKELING VAN EEN REAL-TIME PCR ASSAY ALS NIEUWE DETECTIETEST IN DE DIAGNOSTIEK VAN TRICHOMONAS INFECTIES

UNIVERSITEIT GENT

ONZE-LIEVE-VROUWZIEKENHUIS

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

CAMPUS AALST – KLINISCH LABORATORIUM

VAKGROEP BIOANALYSE

DIENST MICROBIOLOGIE

Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

Labo Moleculaire Biologie

Academiejaar 2014-2015

ONTWIKKELING VAN EEN REAL-TIME PCR ASSAY ALS NIEUWE DETECTIETEST IN DE DIAGNOSTIEK VAN TRICHOMONAS INFECTIES

Ian VANDENBUSSCHE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor Prof. dr. J. Van Bocxlaer Commissarissen dr. A. Vankeerberghen Prof. dr. K. Boussery

UNIVERSITEIT GENT

ONZE-LIEVE-VROUWZIEKENHUIS

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

CAMPUS AALST – KLINISCH LABORATORIUM

VAKGROEP BIOANALYSE

DIENST MICROBIOLOGIE

Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

Labo Moleculaire Biologie

Academiejaar 2014-2015

ONTWIKKELING VAN EEN REAL-TIME PCR ASSAY ALS NIEUWE DETECTIETEST IN DE DIAGNOSTIEK VAN TRICHOMONAS INFECTIES

Ian VANDENBUSSCHE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor Prof. dr. J. Van Bocxlaer Commissarissen dr. A. Vankeerberghen Prof. dr. K. Boussery

SAMENVATTING Het Onze-Lieve-Vrouwziekenhuis behoort tot de grootste niet-universitaire ziekenhuizen van België. Het heeft, naast de campus in Aalst, ook vestigingen in Asse en Ninove. In samenwerking met de Universiteit Gent wordt deze thesis uitgevoerd op het labo moleculaire biologie in het klinisch laboratorium van het OLVZ, campus Aalst. Het gebruik van PCR technieken in de diagnose van allerhande infecties is tegenwoordig niet langer weg te denken. In de huidige screening op SOA’s wordt, door het relatief onschuldig karakter van de parasiet, Trichomonas vaginalis naast het klassieke microscopisch onderzoek vaak niet opgenomen in andere, gevoeligere detectieanalyses. Nochtans is een goede diagnostiek van Trichomonas infecties essentieel ter vermijding van complicaties voor de patiënt en een ongewenst grotere kost voor de gezondheidszorg. In dat opzicht wordt een realtime PCR (RT-PCR) methode ontwikkeld inzake de diagnose van T. vaginalis infecties. Allereerst wordt de T. vaginalis RT-PCR geoptimaliseerd, zodat in tweede instantie een 6plex RT-PCR methode ontwikkeld kan worden. Deze multiplex PCR screent naast T. vaginalis ook op de aanwezigheid van de bacteriën Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae. Op die manier kan een staal in één en dezelfde analyse geëvalueerd worden op het voorkomen van de drie bovenbeschreven micro-organismen. In de optimalisatie van de 6plex RT-PCR wordt geopteerd voor een PP mix die respectievelijk 300nM en 100nM Trichomonas primers en probe bevat. Zodoende kan met deze condities overgegaan worden tot de validatie van de methode. Er wordt uitgebreid gevalideerd op technisch en theoretisch vlak. De ontwikkelde test doorstaat alle lineariteit- en specificiteitstesten, alsook de testen op houdbaarheid en precisie. De sensitiviteit, specificiteit en accuraatheid bedragen 100%, gebaseerd op 67 geanalyseerde stalen. Er wordt een kostenanalyse gemaakt en terugbetalingstarieven worden gerapporteerd. Een methodevergelijking met de OSOM® Trichomonas Rapid sneltest moet een idee geven van het verschil in performantie tussen beide methoden. Na correcte interpretatie van alle validatiedata wordt er besloten om de ontwikkelde RT-PCR methode op te nemen in de routine PCR analyses in het labo moleculaire biologie van het OLVZ.

Het schrijven van deze thesis zou zonder een aantal mensen niet mogelijk geweest zijn. De afgelopen maanden waren enorm verrijkend, zowel op wetenschappelijk als op menselijk vlak. In de eerste plaats wil ik de mensen van het labo moleculaire biologie bedanken, met in het bijzonder mijn directe promotor dr. Anne Vankeerberghen. Bedankt Anne, voor de goede steun, uitleg en begeleiding tijdens het uitvoeren van mijn thesis. Ook wil ik Karen, Freya, Leen, Inge, Elfi, Astrid, Magda en Melissa bedanken voor de warme, aangename sfeer in het labo en de uitleg en begeleiding wanneer ik die nodig had. Naast mijn vrienden zou ik vooral mijn ouders willen bedanken voor de steun die ze mij tijdens de afgelopen periode geboden hebben. De manier waarop jullie altijd klaar staan voor mij is onvergetelijk en heeft mij gedurende de ganse thesisperiode gesterkt. Ook mijn oma en opa verdienen een welgemeend dankjewel voor hun betrokkenheid en interesse. Tenslotte wens ik klinisch bioloog Apr. An Boel en Prof. dr. Jan Van Bocxlaer te bedanken om mij de mogelijkheid te bieden mijn thesis uit te voeren in het klinisch labo van het OLV Ziekenhuis Aalst. Ian Vandenbussche Aalst, mei 2015.

INHOUDSOPGAVE

1.

INLEIDING .............................................................................................................................................. 1 1.1

TRICHOMONAS VAGINALIS ........................................................................................................... 1

1.1.1

Introductie en prevalentie.................................................................................................... 1

1.1.2

Microbiologie ........................................................................................................................ 1

1.1.3

Complicaties en behandeling ............................................................................................... 2

1.1.4

Diagnose ................................................................................................................................ 3

1.2

1.1.4.1

Microscopie ....................................................................................................................... 3

1.1.4.2

Cultuur ............................................................................................................................... 3

1.1.4.3

Antigen sneltest ................................................................................................................. 3

1.1.4.4

Nucleic Acid Amplification Test (NAAT)............................................................................. 4

CHLAMYDIA TRACHOMATIS EN NEISSERIA GONORRHOEAE ........................................................ 5

1.2.1

Chlamydia trachomatis......................................................................................................... 5

1.2.2

Neisseria gonorrhoeae ......................................................................................................... 6

1.3

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) .......................................................................................... 6

1.3.1

Extractie ................................................................................................................................ 6

1.3.2

PCR ........................................................................................................................................ 7

1.3.2.1

Algemeen........................................................................................................................... 7

1.3.2.2

Real-time PCR .................................................................................................................... 9

1.3.2.3

Multiplex PCR .................................................................................................................. 10

1.3.3

Rapportering ....................................................................................................................... 11

1.3.4

Targets voor PCR ................................................................................................................. 11

1.4

1.3.4.1

Trichomonas vaginalis ..................................................................................................... 11

1.3.4.2

Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae ......................................................... 12

SEQUENCING ............................................................................................................................... 13

2.

OBJECTIEF ............................................................................................................................................ 14

3.

MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................................................... 15 3.1

STALEN......................................................................................................................................... 15

3.2

PRIMERS EN PROBES ................................................................................................................... 15

3.2.1

Selectie primers en probes ................................................................................................. 15

3.2.2

4.

Gebruikte primers, probes en reagentia ............................................................................ 16

3.3

EXTRACTIE ................................................................................................................................... 17

3.4

KLONEREN ................................................................................................................................... 18

3.5

REAL-TIME PCR ............................................................................................................................ 22

3.5.1

Algemeen ............................................................................................................................ 22

3.5.2

Optimalisatie ....................................................................................................................... 23

3.5.3

Validatie .............................................................................................................................. 25

3.6

GELELEKTROFORESE .................................................................................................................... 26

3.7

SEQUENCING ............................................................................................................................... 27

RESULTATEN........................................................................................................................................ 29 4.1

KLONEREN ................................................................................................................................... 29

4.2

OPTIMALISATIE ............................................................................................................................ 30

4.2.1

Optimalisatie van singleplex RT-PCR voor T. vaginalis ..................................................... 30

4.2.2

Optimalisatie van 6plex RT-PCR ......................................................................................... 32

4.3

4.2.2.1

Vergelijking met singleplex RT-PCR ................................................................................. 32

4.2.2.2

Vergelijking met 5plex RT-PCR ........................................................................................ 32

4.2.2.3

Vergelijking met externe referentie ................................................................................ 34

4.2.2.4

Checkerboard analyses.................................................................................................... 34

VALIDATIE .................................................................................................................................... 37

4.3.1 4.3.1.1

Analyse van de specificiteit ............................................................................................. 37

4.3.1.2

Bepalen van de analytische accuraatheid, sensitiviteit en specificiteit .......................... 38

4.3.1.3

Bepalen van de lineariteit................................................................................................ 39

4.3.1.4

Bepalen van de intrarun precisie..................................................................................... 42

4.3.1.5

Bepalen van de houdbaarheid en interrun precisie ........................................................ 42

4.3.2 4.4

Technische validatie ........................................................................................................... 37

Theoretische validatie: kostenanalyse en terugbetalingstarieven ................................... 43

METHODEVERGELIJKING ............................................................................................................. 43

5.

DISCUSSIE ............................................................................................................................................ 44

6.

CONCLUSIE .......................................................................................................................................... 47

7.

LITERATUURLIJST ................................................................................................................................ 48

VERKLARENDE WOORDENLIJST 5plex PCR:

PCR met 5voudige target (16S, CP, omp, porA en PhHV target)

6plex PCR:

PCR met 6voudige target (16S, CP, omp, porA, PhHV en TRIVAG target)

A:

adenine base

acc.nr.:

accessie nummer

BHQ:

Black Hole Quencher

BLAST:

Basic Local Alignment Search Tool

bp:

baseparen

BSA:

Bovine Serum Albumine

C. trachomatis:

Chlamydia trachomatis

C:

cytosine base

CACG:

verdunningsreeks van C. trachomatis

CHTR:

Chlamydia trachomatis

CP:

cryptisch plasmide; C. trachomatis target

Ct waarde:

cycle treshold waarde

Cy5:

cyanine fluorescente stof

ddATP:

dideoxy adenosinetrifosfaat

ddCTP:

dideoxy cytidinetrifosfaat

ddGTP:

dideoxy guanosinetrifosfaat

ddNTP:

dideoxy nucleosidetrifosfaat

ddTTP:

dideoxy thymidinetrifosfaat

DMSO:

dimethylsulfoxide

DNA:

deoxyribonucleïnezuur

dsDNA:

dubbelstrengig DNA

DTCS:

dye terminator cycle sequencing

dXTP:

deoxy nucleosidetrifosfaat

E. coli:

Escherichia coli

Eff%:

efficiëntie

EtOH:

ethanol

EQC:

External Quality Control

FP:

forward primer

FS DNA:

fish sperm DNA

G:

guanine base

GAGG:

verdunningsreeks van N. gonorrhoeae

gem:

gemiddelde

HSV:

Herpes simplex virus

IC:

interne controle

LAF:

Laminar Air Flow

LOD:

Limit Of Detection

mRNA:

messenger RNA

N. gonorrhoeae:

Neisseria gonorrhoeae

NAAT:

Nucleic Acid Amplification Test

NCBI:

National Center for Biotechnology Information

O.D:

optische densiteit

omp:

outer membrane proteïne; N. gonorrhoeae target

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PhHV:

Phocine Herpes virus

PID:

Pelvic Inflammatory Disease

porA:

porine pseudogen; N. gonorrhoeae target

PP mix:

primer-probe mix

R2:

correlatiecoëfficiënt

RIZIV:

Rijksinstituut voor ziekte- en invaliditeitsverzekering

RMO:

rechtstreeks microscopisch onderzoek

RNA:

ribonucleïnezuur

ROX:

referentie fluorescente stof voor achtergrondsignaal

RP:

reverse primer

rpm:

rotations per minute

rRNA:

ribosomaal RNA

RT-PCR:

real-time PCR

S:

Svedberg: sedimentatie eenheid

SLS:

sample loading solution

SOA:

Seksueel Overdraagbare Aandoening

SOC:

Super Optimal broth with Catabolic repression

ssDNA:

enkelstrengig DNA

stdev:

standaarddeviatie

swCT:

Zweedse variant van C. trachomatis

T. vaginalis:

Trichomonas vaginalis

T:

thymine base

TATG:

verdunningsreeks van T. vaginalis

TAE buffer:

Tris base, Acetic acid and EDTA buffer

TAT:

Turn Around Time

TE:

Tris base, EDTA buffer

TRIVAG:

Trichomonas vaginalis

TSA:

Tryptone Soy Agar

TSB:

Tryptone Soy Broth

TV :

Trichomonas vaginalis staal (gevolgd door een nummer)

V:

Volt

VZV:

Varicella zoster virus

W:

Watt

WHO:

World Health Organization

WIV:

Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid

Δ Ct:

delta Ct: verschil tussen Ct waarde van de 6plex en 5plex PCR

1. INLEIDING 1.1 TRICHOMONAS VAGINALIS 1.1.1 Introductie en prevalentie Trichomoniasis, veroorzaakt door het protozoön Trichomonas vaginalis, wordt wereldwijd aanzien als de meest frequente niet virale seksueel overdraagbare aandoening (SOA). Bij seksueel actieve vrouwen vormt het één van de drie hoofdoorzaken van vaginale klachten, samen met bacteriële vaginose en candida vulvovaginitis. Infectie met T. vaginalis gaat typisch gepaard met een geelgroene vaginale afscheiding en vaginale irritatie. Bij mannen manifesteert de infectie zich vooral als een urethrale irritatie en een branderig gevoel na plassen of ejaculatie. Afscheiding is hier beperkter. Het klachtenpatroon kan echter enorm variëren; vaak zijn patiënten zelfs asymptomatisch. Hierbij dient opgemerkt te worden dat bij mannen de infectie frequenter asymptomatisch verloopt dan bij vrouwen. Wanneer de infectie chronisch verloopt zijn symptomen, typisch jeuk en dyspareunie, meestal milder van karakter. i,ii,iii Prevalentie- en incidentiestudies van het WHO rapporteren op globale schaal jaarlijks rond de 180 miljoen infecties, met een prevalentie die bij vrouwen ongeveer tien maal hoger ligt dan bij mannen. De incidentie in beide geslachten is nagenoeg gelijk. Deze gegevens moeten echter met de nodige voorzichtigheid bestudeerd worden. Het zijn slechts schattingen aangezien Trichomonas infecties wegens hun relatief onschuldig karakter niet noodzakelijk gerapporteerd dienen te worden. iv

1.1.2 Microbiologie T. vaginalis is een facultatief anaerobe parasiet met een zeer typerende peervormige structuur die zich kan voortbewegen door de aanwezigheid van flagellen. Vier van deze flagellen bevinden zich anterior van de parasiet. De vijfde flagel wordt posterior teruggevonden en wordt ook wel eens de vrije flagel genoemd. 1

Verder bezit de parasiet een prominent aanwezige nucleus en de axostyle. Deze loopt doorheen de parasiet en biedt stevigheid aan het micro-organisme.ii De overdracht van het protozoön gebeurt hoofdzakelijk seksueel. T. vaginalis gedijt goed in de vrouwelijke urogenitale tractus en mannelijke urethra en prostaat, daar waar de parasiet buiten het lichaam niet zo goed overleeft. De mens is de enige gekende natuurlijke gastheer. Replicatie gebeurt enkel door binaire fissie. Bij lagere pH, wanneer het micro-organisme niet meer in de trofozoïde vorm maar in de cysteuze vorm voorkomt, blijkt T. vaginalis geen klachten te geven, maar kan het wel overleven.v

1.1.3 Complicaties en behandeling Vroeger werd T. vaginalis beschouwd als een onschuldige commensaal van de vagina. Tegenwoordig is deze veronderstelling echter al lang voorbijgestreefd. Zo kan een infectie met de parasiet tot tal van complicaties leiden. Onbehandeld resulteert de infectie vaak in een cystitis of urethritis. Eveneens rapporteerden studies een associatie tussen T. vaginalis infectie en het verwerven van infertiliteit, cervicale neoplasie of zelfs een verhoogd risico op een HIV infectie.vi,vii,viii Er is een verhoogde kans op vroegtijdige geboorte bij zwangerschap en tevens kan de baby tijdens de geboorte zelf geïnfecteerd worden door contact met de vaginale mucosa. ix Complicaties bij mannen zijn minder frequent, al zijn er al gevallen gerapporteerd geweest van prostatitis, balanoposthitis, epididymitis, infertiliteit en zelfs prostaatkanker.v 5-nitroimidazol geneesmiddelen zoals metronidazol zijn voorlopig de enige klasse geneesmiddelen die een curatieve therapie bieden. Voor zowel symptomatische personen als asymptomatische dragers wordt het best een therapie opgestart; gewoonlijk een enkelvoudige dosis van 2g metronidazol of tinidazol. Orale toediening krijgt de voorkeur op vaginale applicatie aangezien de therapeutische spiegels ter hoogte van de urethra veel hoger zijn bij systemische toediening. De urethra kan immers dienen als een soort van reservoir voor het pathogeen waardoor recidieven mogelijk zijn.x

2

1.1.4 Diagnose 1.1.4.1 Microscopie Rechtstreeks microscopisch onderzoek (RMO) wordt aanzien als één van de oudste technieken in de diagnostiek van trichomoniasis. Desondanks de zeer lage gevoeligheid van de techniek, wordt deze toch nog extensief gebruikt in laboratoria. Bovendien moeten afgenomen stalen zo snel mogelijk geanalyseerd worden opdat nog levende kiemen waargenomen zouden kunnen worden. Overige parameters die kunnen inspelen op de performantie van de techniek zijn de ervaring van de laborant, de parasitaire lading en de bewaarcondities van het staal. Net omwille van bovenbeschreven lage gevoeligheid wordt meer en meer gezocht naar nieuwere technieken met een hogere graad van sensitiviteit.xi

1.1.4.2 Cultuur Cultuur is een alternatief in de diagnostiek van T. vaginalis infectie bij patiënten waarbij microscopisch onderzoek onmogelijk blijkt te zijn of wanneer er geen motiele parasieten te zien zijn bij microscopie terwijl de patiënt wel met een verhoogde vaginale pH en een verhoogd leukocytenaantal zit. Een groot nadeel aan diagnose met cultuur is de lange turnaround time (TAT) van gemiddeld 48 uur. Tegenwoordig zijn zowel cultuur als RMO op gebied van gevoeligheid voorbijgestreefd door de nucleïnezuur amplificerende testen (NAATs).xii

1.1.4.3 Antigen sneltest Omwille van de lage gevoeligheid van RMO zijn er een tijdje geleden nieuwe, op immunochromatografie gebaseerde commerciële kits op de markt verschenen. De meest frequent in gebruik genomen kit is de OSOM® Trichomonas Rapid Test (Sekisui Diagnostics, Tokio, Japan) en deze wordt ook in deze thesis geëvalueerd.

3

De test is relatief goedkoop, makkelijk te gebruiken, vereist geen levende organismen en kan als point of care test gebruikt worden.xiii,xiv Het immunochromatografisch principe wordt verklaard aan de hand van onderstaand voorbeeld met de OSOM® Trichomonas Rapid Test. Een positief staal bevat de parasiet en dus ook parasietantigenen in oplossing. Op de absorberende kant van de teststrook is een set gelabelde antilichamen aanwezig, gericht tegen die specifieke antigenen. Wanneer de strook in contact wordt gebracht met de oplossing zal door migratie het gevormde antigen-antilichaam complex ter hoogte van het afleesraam een nieuwe set gefixeerde antilichamen ontmoeten. Deze tweede set antilichamen binden eveneens met de parasietantigenen. Aangezien de met een kleurstof gelabelde antilichamen nog steeds gebonden zijn op de parasietantigenen, zal ter hoogte van de tweede bindingplaats een gekleurd lijntje ontstaan. Even verderop staat als controle nog een derde set antilichamen, specifiek gericht tegen de gelabelde antilichamen. Dit antigen-antilichaam complex moet bijgevolg altijd gevormd worden, zowel bij een positief als negatief staal, en controleert of de migratie correct verlopen is. (zie figuur 1.1).xv

Figuur 1.1: OSOM® Trichomonas Rapid Test (Sekisui Diagnostics, Tokio, Japan)

1.1.4.4 Nucleic Acid Amplification Test (NAAT) NAAT analyses zijn tegenwoordig de nieuwe gouden standaard voor wat diagnose van trichomoniasis betreft. Ze zijn gebaseerd op het principe van PCR, waarbij genetisch materiaal geamplificeerd wordt. Aangezien er bij PCR veel meer detectiemateriaal geproduceerd wordt, zal bijgevolg ook de gevoeligheid veel groter zijn dan bij de hierboven besproken technieken.xvi Een ander voordeel betreft de viabiliteit van Trichomonas.

Levende

parasieten

zijn

hier

niet

noodzakelijk, 4

waardoor onmiddellijke analyse na afname niet nodig is. Hieruit volgt dan onmiddellijk ook een nadeel van de NAAT techniek; het is moeilijk om te bepalen in welk stadium van infectie de patiënt zich bevindt aangezien er geen onderscheid gemaakt wordt tussen een levend pathogeen of een door het immuunsysteem reeds afgedood pathogeen.

1.2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS EN NEISSERIA GONORRHOEAE 1.2.1 Chlamydia trachomatis De meest voorkomende bacteriële oorzaak van seksueel overdraagbare genitale aandoeningen wordt toegeschreven aan infectie met Chlamydia trachomatis. De bacterie is strikt intracellulair en aeroob. Het merendeel van geïnfecteerde personen, zowel mannen als vrouwen, blijkt een asymptomatisch verloop te kennen waardoor de infectie vaak niet opgemerkt wordt en de bacterie aanwezig blijft in de genitale streek. Nadelig is dat de bacterie op die manier onbewust overgedragen wordt. Bij symptomatische vrouwen manifesteert de infectie zich meestal als cervicitis en urethritis. De symptomatologie van deze laatst genoemde betreft vaak pyurie of dysurie. De cervix blijkt de meest frequent voorkomende infectieplaats te zijn en infectie kan onbehandeld leiden tot Pelvic Inflammatory Disease (PID) en in tweede instantie tot infertiliteit. Bij mannen gaat infectie met C. trachomatis voornamelijk gepaard met urethritis, epididymitis of prostatitis. Naast de genitale infectie kan C. trachomatis ook verantwoordelijk worden geacht voor trachoma of granulaire conjunctivitis, een oculaire infectie die bij de geboorte opgelopen kan worden en vaak in de derde wereldlanden tot uiting komt. xvii Diagnose gebeurt bij voorkeur met een NAAT, alhoewel ook sneltesten op de markt zijn die snel resultaat geven en financieel makkelijker haalbaar zijn. Oudere technieken gebaseerd op cultuur worden tegenwoordig minder uitgevoerd. Bovendien hangen ze vaak af van de expertise van de uitvoerder van de test. Elke persoon die seksueel actief is en symptomen vertoont die geassocieerd zouden kunnen zijn met chlamydia, dient een screening te ondergaan, alsook de betrokken partner(s). xvii 5

1.2.2 Neisseria gonorrhoeae Net zoals chlamydia is gonorroe een seksueel overdraagbare aandoening die in dit geval veroorzaakt wordt door de aerobe bacterie Neisseria gonorrhoeae. Opnieuw is een substantieel deel van de geïnfecteerde personen asymptomatisch. N. gonorrhoeae ligt aan de basis van een vaak etterende urethritis bij mannen en cervicitis bij vrouwen. Ook hier dient uitgekeken te worden voor ontaarding van de onbehandelde cervicitis, wat kan leiden tot PID, chronische pijn in de onderbuik, ectopische zwangerschap of eventueel zelfs infertiliteit. Uitzonderlijk kunnen invasieve infecties voorkomen, resulterend in een meningitis of endocarditis. In de routine wordt meer en meer gebruik gemaakt van een multiplex PCR (zie 1.3.2.3) waarbij zowel N. gonorrhoeae als C. trachomatis binnen één en dezelfde PCR assay gedetecteerd kunnen worden. xviii

1.3 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1.3.1 Extractie Vooraleer een staal onderworpen kan worden aan PCR, dient het een extractie te ondergaan. Een extractieprocedure zorgt ervoor dat het onbereikbare intracellulaire DNA en RNA vrijkomt en bovendien afgezonderd wordt. Zodoende kan veel specifieker gewerkt worden en is de hoeveelheid aan storende substanties drastisch verminderd. Extractie wordt uitgevoerd op verschillende soorten stalen: urinestalen, vaginale swabs, respiratoire stalen, bloedstalen… De cellen die de gewenste nucleïnezuren bevatten worden eerst gelyseerd met een lysisbuffer. Naast de lysis zelf zorgt de aanwezigheid van de buffer ook voor inhibitie van DNase en RNase enzymen. In de praktijk wordt onder andere gebruik gemaakt van een silicakolom die selectief DNA bindt of van magnetic beads die eveneens DNA en RNA adsorberen. Uiteindelijk kunnen de nucleïnezuren in de daaropvolgende elutiestap gecollecteerd worden. Het opgezuiverde genetisch materiaal kan vervolgens geamplificeerd worden met behulp van een NAAT. xix

6

1.3.2 PCR 1.3.2.1 Algemeen PCR is een techniek waarbij op korte tijd nucleïnezuren geamplificeerd kunnen worden. Door specifieke stukken van de DNA template te targetten, kan op gecontroleerde wijze vanuit heel weinig DNA heel veel DNA gemaakt worden. Zo kan het staal op eventuele aanwezigheid van het pathogeen gescreend worden. De PCR werd voor het eerst ontwikkeld in 1983 door K. Mullis, en sindsdien is het een onmisbare techniek geworden op vlak van detectie van genetisch materiaal. xx DNA bestaat uit twee complementaire strengen die door base complementariteit aan elkaar gebonden zijn. Een adenine base bindt via twee waterstofbindingen met een thymine base, terwijl een cytosine en guanine base met drie waterstofbindingen verbonden zijn. Het principe van de PCR techniek bestaat erin het gewenste DNA te denatureren tot twee afzonderlijke strengen, zodat beiden dienst kunnen doen als template voor de vorming van een nieuwe complementaire streng, gevormd volgens bovenstaande complementariteit (zie figuur 1.2)

xxi,xxii

. Naast de aanwezigheid van het template DNA dienen er ook twee

primers, Taq polymerase enzym, de vier deoxynucleotiden, MgCl2 en buffer aanwezig te zijn in de correcte hoeveelheden om de reactie optimaal te laten doorgaan. De PCR bestaat grofweg uit 3 stappen: denaturatie, annealing en elongatie. Iedere stap heeft zijn eigen karakteristieken en is essentieel voor de amplificatie. In een eerste stap wordt van dubbelstrengig DNA (dsDNA) enkelstrengig DNA (ssDNA) gemaakt door de temperatuur zodanig op te drijven dat de strengen van elkaar loskomen. Op moleculair vlak wordt deze overgang naar enkelstrengig DNA verklaard door de verbreking van de waterstofbindingen tussen de basen. Bijgevolg is er niets wat de twee strengen nog kan samenhouden waardoor ze ‘uiteenvallen’. De temperatuur voor denaturatie ligt meestal rond 95°C. Vervolgens zakt de temperatuur tot net onder de smelttemperatuur van de toegevoegde primers, vaak rond de 50°C tot 60°C, waardoor aan deze primers de kans 7

gegeven wordt om zich te binden met een regio op de complementaire DNA streng. Deze binding moet specifiek zijn en de primers moeten vooral aan 3’ zijde zeer goed aansluiten met de streng om een correcte elongatie te verkrijgen. Ze mogen ook niet te sterk binden (i.e. te hoog GC gehalte) zodat de hierboven beschreven denaturatiestap nog door kan gaan. Bovendien mag de primer niet met zichzelf of met een andere primer binden. Dergelijke lus-of dimeervorming is nefast voor de efficiëntie van amplificatie. In de elongatiefase wordt de temperatuur terug opgetrokken tot een temperatuur waarbij het Taq polymerase een optimale enzymactiviteit bezit. De oude streng dient nu als template voor het enzym zodat verlenging mogelijk wordt. De beschikbare deoxynucleotides die zich in de oplossing bevinden worden nu stuk voor stuk ingebouwd in de zich nieuw vormende streng. Het eindproduct betreft een dubbelstrengig stuk DNA dat terug gedenatureerd wordt wanneer de eerste fase aanvat. Het grote voordeel van de PCR reactie is de exponentiële amplificatie van enkel de doelsequentie, gelegen tussen de twee gekozen primers. De replicatie van de nieuwe streng start ter hoogte van de plaats waar de primer zich aan de complementaire streng bindt en loopt verder (5’-3’ richting) tot wanneer geen complementaire streng meer voorhanden is. Na doorlopen van 20 cycli en meer zal de aan PCR onderworpen oplossing miljoenen amplicons bevatten. (zie figuur 1.2).

Figuur 1.2: Cycli van de PCR reactie en de basencomplementariteit

Vervolgens kan de hoeveelheid PCR product in de oplossing bepaald worden, met gelelektroforese als een van de meest courante technieken. Tegenwoordig wordt echter 8

meer en meer geopteerd voor het principe van real-time PCR (RT-PCR). Hierbij wordt het geamplificeerd materiaal continu gemeten en weergegeven in een amplificatieplot.

1.3.2.2 Real-time PCR In vergelijking met de conventionele PCR kan de amplificatie bij RT-PCR onmiddellijk gevolgd worden. Een cruciaal verschil ligt in de aanwezigheid van een TaqMan probe. Dit oligonucleotide zal binden in het gebied tussen de twee primers en zorgt voor een fluorescent signaal dat gedetecteerd kan worden door het RT-PCR toestel. Aan het 5’ uiteinde bevat deze probe een reporter R (zie figuur 1.3)xxiii. Na excitatie kan de reporter bij terugval naar de grondtoestand zelf licht uitstralen van een welbepaalde golflengte. Aan het 3’ uiteinde zit echter een quencher Q bevestigd. Deze zal het uitgestraalde licht van de fluorofoor aan 5’ zijde quenchen. In het RT-PCR toestel zit een excitatiebron alsook een detector om het uitgestraalde licht te kunnen detecteren. De quencher aan 5’ zijde van de probe zorgt, naast het quenchen op zich, er ook voor dat het Taq enzyme niet ter hoogte van de probe

begint

ketenverlenging.

aan

de Figuur 1.3: (a) TaqMan probe in oplossing, (b) TaqMan probe gehybridiseerd aan complementaire streng, (c) exonuclease activiteit van polymerase enzym breekt de probe af.

Tijdens de annealingstap van de PCR reactie zal de probe zich vasthechten aan de DNA template. De reporter wordt geëxciteerd door het licht afkomstig van een halogeenlamp, maar zit te dicht bij de quencher waardoor deze de emissie teniet doet. Wanneer het polymerase enzym de nieuwe streng vormt, zal de TaqMan probe op een gegeven moment zijn pad versperren. Dankzij de 5’-3’ exonuclease activiteit kan het enzym de probe nucleotide per nucleotide afbreken en tegelijk toch de nieuwe streng vormen. Dit proces creëert bijgevolg meer ruimte tussen reporter en quencher, 9

zodat quenching van de emissie niet langer mogelijk is. De sterkte van fluorescentie is dan ook evenredig met de toename in PCR product: Hoe meer product er gevormd wordt, hoe meer probe er afgebroken zal worden, dus hoe groter het fluorescent signaal zal zijn. Het uitgestraalde licht gaat via lenzen en een filter naar de detector. Alle data worden vervolgens omgezet tot een amplificatieplot.

1.3.2.3 Multiplex PCR Binnen eenzelfde PCR run kan gebruik gemaakt worden van meerdere probes en primers tegelijk. Hierbij zullen dus meerdere targets tegelijk geamplificeerd worden. In de huidige screening op SOA’s wordt reeds gebruik gemaakt van een multiplex PCR die zowel de aanwezigheid van C. trachomatis als die van N. gonorrhoeae bepaalt.xxiv De keuzemogelijkheden inzake Taqman probes en de reporters in het bijzonder zijn zeer divers, en net omwille van die diversiteit wordt multiplex PCR mogelijk. De emissiegolflengtes van de verschillende reporters zijn karakteristiek, waardoor het corresponderende geamplificeerd product eveneens specifiek geregistreerd wordt (Figuur 1.4)xxv. Afhankelijk van de hoeveelheid beschikbare kanalen in het PCR toestel, kan een multiplex PCR met een even groot aantal targets opgezet worden. Een rationele keuze van reporters en quenchers is noodzakelijk, aangezien interferentie vermeden dient te worden. Interferentie kan mogelijk leiden tot een bias op de werkelijke waarden of veroorzaakt in ergere gevallen zelfs vals positieve waarden. Daarom wordt het best geopteerd voor reporters die niet te dicht bij elkaar in de buurt komen qua emissie.

Figuur 1.4: Reporters met corresponderende emissiespectra

10

1.3.3 Rapportering Een amplificatieplot geeft de toename in genormaliseerde fluorescentie weer in functie van het aantal cycli (zie figuur 1.5).xxvi Er wordt genormaliseerd ten opzichte van ROX, een fluorescente stof die reeds aanwezig is in de gebruikte enzymenmix en zorgt voor een achtergrondsignaal. De fluorescentie stijgt exponentieel en snijdt grafisch met een horizontaal gelegen treshold lijn. Deze lijn wordt getrokken op het punt in de curve waar deze exponentieel stijgt. Vanuit het snijpunt kan op de horizontale as de cycle treshold waarde (Ct waarde) afgelezen worden. De Ct waarde wordt gedefinieerd als het aantal cycli nodig om een fluorescent signaal te genereren dat juist boven de achtergrond uitkomt en is een indicatie voor hoeveel target DNA een staal bevat. Hoe sneller de curve exponentieel zal stijgen, hoe sneller de curve ook zal snijden met de treshold lijn en hoe lager de Ct waarde zal liggen. Een lage Ct waarde is dus representatief voor een hoge concentratie target DNA in het geamplificeerd staal.

Figuur 1.5: Algemene amplificatieplot bij real-time PCR met treshold lijn en Ct waarde van ± 22

1.3.4 Targets voor PCR 1.3.4.1 Trichomonas vaginalis Grondig literatuuronderzoek toonde aan dat vooral een 2-kb sequentie en een sequentie die codeert voor het β tubuline proteïne op de voorgrond treden als meest belovende targets. Specifieke primer/probe sets kunnen bijgevolg gebaseerd worden op bepaalde deelsequenties, op hun beurt gelegen op de desbetreffende 2-kb sequentie. Het lager kopiegetal van het β tubuline gen in vergelijking met de 2-kb sequentie brengt

11

een kleinere detectiekans van T. vaginalis met zich mee, wat de keuze voor het 2kbrepeat target rationaliseert. Het β tubuline target zou immers een minder aantal positieve stalen detecteren.xxvii

1.3.4.2 Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae De klassieke, reeds in de routine opgenomen 5plex PCR voor detectie van Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae baseert zich op het 16S rRNA target en het cryptisch plasmide of CP target voor C. trachomatis enerzijds en op het porA target en het OMP target voor N. gonorrhoeae anderzijds. Het 16S ribosomaal RNA target is een relatief kort stukje RNA van 1542 nucleotiden dat deel uitmaakt van de 30S subeenheid van ribosomen bij prokaryoten. Het target komt enkel voor in bacteriële cellen en vertoont in bepaalde gebieden evolutionair verklaarbare gelijkenissen.xxviii Toch is het 16S rRNA soortspecifiek en net omwille van dat verschil in sequentie is het mogelijk een onderscheid te maken tussen verschillende bacteriën onderling. Naast het 16S rRNA target wordt C. trachomatis ook gedetecteerd via het cryptisch plasmide of CP target. Deze dubbele detectie is er gekomen nadat in 2006 in Zweden een nieuwe variant van de bacterie was opgedoken (swCT). Deze vertoont een deletie in het cryptisch plasmide gen en werd in het verleden vaak gemist toen C. trachomatis nog gescreend werd op enkel het CP target.xxix Ook bij N. gonorrhoeae wordt gebruik gemaakt van 2 targets. Bepaalde varianten op de klassieke bacterie worden niet gedetecteerd aangezien deze het porine pseudogen (porA gen) van de N. meningitidis bacterie bevatten. Het outer membrane proteïn (OMP) gen codeert voor het beschermende buitenste membraan in Gram-negatieve cellen en speelt een belangrijke rol als virulentiefactor. In tegenstelling tot het porA gen, dat bovendien niet noodzakelijk tot expressie komt, is deze target wel ontegensprekelijk in de correcte vorm aanwezig waardoor de zekerheid op detectie toch gegarandeerd kan worden. xxx,xxxi

12

1.4 SEQUENCING De cycle sequencing methode baseert zich in grote lijnen op dezelfde principes als de klassieke PCR, al is er wel verschil tussen beiden. Zo wordt bij PCR bijvoorbeeld geen gebruik gemaakt van dideoxynucleotides (ddNTP’s) en wordt hier slechts met één primer gewerkt. Het gebruik van twee verschillende primers zou het uiteindelijke resultaat vertroebelen doordat per lengte-eenheid twee signalen gegenereerd zouden worden. Een veelgebruikte DNA sequencing methode is de Sanger sequencing methode. In eerste instantie wordt de targetsequentie geamplificeerd. De ketenverlenging is echter niet volledig en stopt op het moment wanneer een ddNTP wordt ingebouwd. Door een ontbrekende 3’ hydroxyl groep op de ddNTP molecules is ketenverlenging niet meer mogelijk. Deze ddNTP’s, bestaande uit ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP, hebben alle vier hun eigen fluorescentielabel. Elk label vertoont een karakteristieke emissie zodat na inbouw in de gerepliceerde streng een fluorescent signaal kan gegeven worden. Door het gebruik van capillaire elektroforese zullen de kortst geamplificeerde producten de detector eerst bereiken. Net zoals bij de klassieke gelelektroforese is de grootte van de molecule rechtevenredig met de weerstand tijdens migratie. Bijgevolg zullen de grootste moleculen het traagst migreren richting detector. Eenmaal de detector bereikt, worden de labels geëxciteerd door de laser waardoor bij terugval naar grondniveau een karakteristiek emissiepatroon opgevangen wordt door de detector. De detector herkent op zijn beurt het ontvangen signaal als één van de vier mogelijke basen, zijde A, G, C of T (zie figuur 1.6).xxxii De ruwe data worden via software verwerkt tot een interpreteerbaar elektroferogram.

Figuur 1.6: Elektroferogram en bijbehorende nucleotidensequentie

13

2. OBJECTIEF In de huidige screening op SOA’s wordt, door het relatief onschuldig karakter van de parasiet, T. vaginalis vaak niet opgenomen in andere, gevoeligere detectieanalyses dan het klassieke microscopisch onderzoek. Nochtans is een goede diagnostiek van Trichomonas infecties essentieel ter vermijding van complicaties zoals cystitis of urethritis. Bovendien leidt het ontbreken van correcte diagnoses tot een hogere transmissiefrequentie. Naast de ongemakken voor de geïnfecteerde patiënt zelf, zorgt dit alles ook voor een ongewenst grotere kost voor de gezondheidszorg. Het doel van deze thesis bestaat erin een RT-PCR methode te ontwikkelen, optimaliseren en valideren zodat T. vaginalis infecties opgespoord kunnen worden. Een T. vaginalis single RTPCR wordt geoptimaliseerd en in tweede instantie bij een reeds bestaande assay gevoegd die screent op de aanwezigheid van de bacteriën Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae. Op die manier zou binnen één en dezelfde analyse een staal geëvalueerd kunnen worden op het voorkomen van zowel C. trachomatis, T. vaginalis als de genitale gonococ. Genitale swabs en stalen worden allereerst onderworpen aan een extractieprocedure waar al het aanwezige DNA en RNA geïsoleerd wordt. Op deze extracten kan vervolgens een PCR uitgevoerd worden. In deze thesis wordt gebruik gemaakt van RT-PCR, waarbij een specifieke TaqMan probe zorgt voor een fluorescent signaal, evenredig met de hoeveelheid geamplificeerd product. Er wordt een 6plex PCR ontwikkeld waarmee C. trachomatis via het 16S rRNA target en CP target, N. gonorrhoeae via het OMP target en porA target en T. vaginalis via een 2kb specifieke repeat gedetecteerd kunnen worden. Het PhHV target wordt als zesde target aangewend als interne extractie- en inhibitiecontrole. Deze 6plex PCR wordt uitgebreid gevalideerd en indien voldoende potent bevonden in gebruik genomen in het OLV Ziekenhuis campus Aalst. T. vaginalis positieve stalen worden ook geanalyseerd via RMO en een commercieel beschikbare antigen sneltest kit: de OSOM® Trichomonas Rapid Test (Sekisui Diagnostics, Tokio, Japan). Deze methodevergelijking levert een goed beeld van het verschil in performantie tussen de ontwikkelde 6plex RT-PCR methode en reeds bestaande referentiemethoden. 14

3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1 STALEN Stalen worden gecollecteerd vanuit het OLV Ziekenhuis campus Aalst zelf, alsook vanuit de campus in Asse en vanuit het AZ Damiaan in Oostende. Stalen positief voor C. trachomatis, N. gonorrhoeae of T. vaginalis zijn ter beschikking voor analyse. De stalen worden via RMO, een antigen sneltest of via PCR getest. Omwille van de patiëntenconfidentialiteit worden de staalnummers van de gebruikte stalen slechts gedeeltelijk weergegeven of worden de staalnummers vervangen door acroniemen.

3.2 PRIMERS EN PROBES 3.2.1 Selectie primers en probes Specifieke primers en probe worden gekozen op basis van een goed gekende en vaak voorkomende targetsequentie in het genoom van het te detecteren microorganisme. Nu wordt gewerkt met een T. vaginalis specifieke repeat met NCBI accessie nummer L23861. Deze sequentie staat opgelijst in de databank van NCBI. Vervolgens kan deze sequentie geanalyseerd worden met het software programma Primer Express, dat primer- en probe combinaties voorstelt die werken bij het temperatuurprofiel van de gebruikte ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR toestellen van Life Technologies, California, USA (serienr. 275013004 en 275013017). Met een samenvattende penalty score worden de primers in het softwareprogramma Primer Express in volgorde van geschiktheid geclassificeerd. De gekozen primers en probe worden bevestigend nog eens gescreend met BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ten opzicht van de T. vaginalis specifieke repeat om eventuele mismatchen op te sporen. Primers en probes voor C. trachomatis , N. gonorrhoeae en het Phocine Herpes Virus (PhHV: interne controle) zijn reeds ter beschikking aangezien in de routine al een 5plex RT-PCR uitgevoerd wordt die bovenstaande oligonucleotiden bevat.

15

3.2.2 Gebruikte primers, probes en reagentia De primers (506 en 507) die nodig zijn voor het amplificeren van de T. vaginalis targetsequentie worden aangekocht bij Life Technologies™, alsook primer 509, die bij het sequencen in de specificiteitsvalidatie gebruikt wordt. De gebruikte TaqMan probe (508) wordt aangekocht bij Eurogentec, Seraing, België. De sequenties en modificaties van de oligonucleotiden worden weergegeven in Tabel 3.1. Tabel 3.1: Overzicht van gebruikte primers en probes Naam

Sequentie (5' - 3')

Trichomonas Forward Primer (p506)

AAG ATG GGT GTT TTA AGC TAG ATA AGG T

Trichomonas Reverse Primer (p507)

CGT CTT CAA GTA TGC CCC AGT AC

Trichomonas Probe (p508)

Cy 5®-CCG AAG TTC ATG TCC TCT CCA AGC GT- BHQ-2®

Forward primer CP CHTR (p324)

CAG CTT GTA GTC CTG CTT GAG AGA

Reverse primer CP CHTR (p325)

CTC GCT CCG GAA AAA TGG T

Probe CP CHTR (p326)

FAM®-CGT GCG GGC GAT TTG CCT TAA C- BHQ-1®

Forward primer 16S CHTR (p321)

AAG TCG AAC GGA GCA ATT GTT T

Reverse primer 16S CHTR (p322)

ACC CCA CCA ACT AGC TGA TAT CA

Probe 16S CHTR (p323)

FAM®-TCG GAT GCC CAAATA TCG CCA CA- BHQ-1®

Forward primer porA (p344)

GCA TTC AAT TTG TTC CGA GTC A

Reverse primer porA (p345)

CCG GAA CTG GTT TCA TCT GAT T

Probe porA (p346)

Cy 5®-CGT GAA AGT AGC AGG CGT ATA GGC GGA- BHQ-2®

Forward primer OMP (p347)

CAT ACC GAC TTT ATG GGT TCT GAA

Reverse primer OMP (p351)

AGC CGA CAG CAG AAA TTC TAG TAG

Probe OMP (p352)

TAMRA®-CTC TGT CCG AAC GCC GCG CAT A- BHQ-2®

Forward primer PhHV (p318)

GGG CGA ATC ACA GAT TGA ATC

Reverse primer PhHV (p319)

GCG GTT CCA AAC GTA CCA A

Probe PhHV (p320)

Yakima Yellow®-TTT TTT ATG TGT CCG CCA CCA TCT GGA TC- BHQ-1®

TOPO® Forward primer (p247)

GTA AAA CGA CGG CCA G CAG GAA ACA GCT ATG AC

TOPO® Reverse primer (p248) Sequencing primer (p509)

GCT GCT TGA CCA TCC GAA AT

Bovenstaande primers en probes worden vervolgens gemengd in een bepaalde verhouding tot een primer probe mix (PP mix), die op zijn beurt gemengd kan worden met een commercieel beschikbare TaqMan® Fast Universal PCR Mastermix van Life Technologies™ (catnr. 4352042). Deze buffer bevat in essentie een hittestabiel gezuiverd DNA polymerase, alle bouwstenen en stoffen voor efficiënte DNA amplificatie en 16

eveneens een fluorescente kleurstof (ROX) die dienst doet als achtergrondsignaal zodat er genormaliseerd kan worden ten opzichte van niet-PCR gerelateerde fluorescenties.

3.3 EXTRACTIE Er wordt gewerkt met het NucliSens easyMAG 1.0 toestel van bioMérieux, Parijs, Frankrijk (serienr. 00108 en 1057), dat op automatische wijze DNA en RNA uit de staalmatrices extraheert. Gecollecteerde genitale stalen worden eerst afgedraaid om lekkage bij het openen te vermijden. 200µL homogeen staal wordt toegevoegd aan de NucliSens Lysis Buffer (bioMérieux, part No 2000292), reeds vooraf uitverdeeld in lysis tubes. De nodige veiligheid moet ingebouwd worden aangezien de buffer guanidine thiocyanaat bevat. Contact met zuren kan zorgen voor een gasontwikkeling die toxisch is. Eveneens wordt 10µL 105 kopieën plasmide/mL PhHV interne controle (IC) toegevoegd. Dit is een extractiecontrole en verzekert een goed verloop van de extractieprocedure wanneer het plasmide DNA van de IC teruggevonden wordt na PCR. Vervolgens wordt goed gevortexed en gedurende 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Het toestel kan ook zelf de stalen lyseren, maar hier wordt dus geopteeerd voor een off board lysis procedure. De stalen kunnen nu met behulp van pasteurse bolpipetten overgebracht worden in de NucliSens easyMAG vessels. Eerst werd aan elk van deze vessels 50µL NucliSens easyMAG Magnetic Silica (bioMérieux, part No 280133) toegevoegd. Deze korrels met nucleïnezuur adsorberende eigenschappen zijn essentieel en zorgen ervoor dat het DNA en RNA gescheiden wordt van het overig celmateriaal in de stalen. Tijdens het wassen worden alle verontreinigingen behalve de geadsorbeerde nucleïnezuren afgezogen, waarna in een volgende stap het gezuiverd DNA en RNA in een onderstaande vloeistof elueert. In deze stappen maakt het toestel gebruik van NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1, 2 en 3 (bioMérieux, part No 280130, 280131 en 280132). Uiteindelijk worden de silica korrels met behulp van een magnetische staaf uit de vloeistof getrokken zodat een zo zuiver mogelijk staalextract bekomen wordt. 17

Via het bijbehorende softwareprogramma kan het toestel vanaf de pc gestuurd worden. Eerst worden alle stalen ingegeven. Bij ‘volume’, ‘eluate’, ‘lysed or non lysed’ en ‘type’ wordt respectievelijk voor volgende parameters gekozen: 200µL, 110µL, Lysed, Other. De geïntroduceerde vessels en reagentia moeten altijd eerst gescand worden. De extractie start en duurt ongeveer 40 minuten, afhankelijk van het aantal te extraheren stalen. xxxiii

3.4 KLONEREN In eerste instantie dienen positieve plasmide controles aangemaakt te worden vooraleer van start kan gegaan worden met de ontwikkeling van de RT-PCR methode. Er wordt een klassieke PCR uitgevoerd op enkele stalen (*7325, *9954 en *6762) die voldoende positief bevonden zijn voor T. vaginalis. Hiertoe worden twee verschillende mixen aangemaakt die in eenheidsvolumes 1µL polymerase enzym (5U/µL), 2µL forward primer 506 (10µM), 2µL reverse primer 507 (10µM), 3µL MgCl2 (50 mM), 10µL deoxynucleotide oplossing (2mM), 10µL PCR buffer 10x en 60µL RNase/DNase vrij water bevatten. In de tweede mix zit eveneens 1µL BSA 100x en DMSO 100x. De gebruikte reagentia werden aangekocht bij Life Technologies™. Van elke mix wordt 90µL gemengd met 10µL van het gewenste DNA extract en aan PCR onderworpen. Initieel wordt de temperatuur in het GeneAmp® PCR system 2700 (Life Technologies™) toestel gedurende 5 minuten op 94°C gehouden waarna 45 cycli aangevat worden: 30 seconden op 94°C, vervolgens 30 seconden op 60°C en 45 seconden op 72°C. De PCR producten worden uiteindelijk nog 15 minuten op 72°C gehouden om dubbelstrengig DNA te verzekeren. De geamplificeerde producten worden vervolgens op gel gezet om het positief karakter van de stalen te verifiëren (Figuur 3.1). Bandjes van positieve stalen hebben een lengte van 84bp.

Figuur 3.1: vlnr. basenpaar ladder, stalen *7325, *9954, *6762 en een negatieve controle met DMSO en BSA mix, stalen *7325, *9954, *6762 en negatieve controle zonder DMSO en BSA mix

18

Een tweede PCR wordt uitgevoerd op de stalen die een correcte bandjeslengte opleveren. De bandjes die het gewenste amplicon bevatten worden uit de gel gesneden met een scalpel, waarna het DNA selectief uit de gel geëxtraheerd wordt met behulp van de QIAquick® Gel Extraction kit van Qiagen (Hilde, Duitsland). Aan de uitgesneden bandjes wordt 600µL QG buffer toegevoegd en geïncubeerd op 50°C gedurende 10 minuten. Er wordt na het oplossen van de gel 200µL isopropanol toegevoegd en goed gemengd. De oplossing wordt overgebracht op QIAquick® columns en er wordt afgedraaid gedurende 1 minuut op 13000rpm. Vervolgens wordt aan het geadsobeerde DNA 750µL PE buffer toegevoegd en gecentrifugeerd. Er wordt droog afgedraaid om een droge kolom te verzekeren. De kolommen worden in nieuwe 1,5mL eppendorfs geplaatst en het gebonden DNA wordt van de kolom afgeëlueerd met 50µL EB buffer. xxxiv Het geëxtraheerde DNA kan nu in een kloneringsvector geligeerd worden. Er wordt gewerkt met de TOPO® TA Cloning® Kit van Life Technologies™. Deze kit bevat de pCR™2.1-TOPO® vector waarin de beoogde sequentie geligeerd kan worden (Figuur 3.2). 2µL DNA product wordt gemengd met 1µL zoutoplossing, 1 µL TOPO® vector en dit alles wordt aangelengd met DNase/ RNase vrij water tot een totaalvolume van 6µL. Er wordt goed

gemengd.

Vervolgens

wordt

gedurende

30

minuten

geïncubeerd

op

kamertemperatuur zodanig dat de PCR producten voldoende de tijd krijgen om te hybridiseren in de vector.xxxv

Figuur 3.2: de pCR™2.1-TOPO® vector klonering site en zijn omgevende sequenties

Competente E. coli bacteriën die op ijs bewaard worden ondergaan een heat shock. Door de korttijdige temperatuursverhoging gaan de poriën in het celmembraan van de bacteriën zich openen zodat de plasmiden makkelijker opgenomen worden. 19

De plasmiden worden in oplossing toegevoegd aan de bacteriënsuspensie en gedurende 30 seconden wordt de temperatuur op 42°C gebracht. Nadien worden de behandelde bacteriën snel terug op ijs geplaatst en wordt er SOC (Super Optimal broth with Catabolic repression) medium toegevoegd om de bacteriën te laten herstellen van de hitteshock. Vervolgens wordt gedurende 1 uur geschud bij 37°C (200rpm). De bacteriën worden uitgeplaat op ampicilline bevattende TSA platen en worden een nacht op 37°C geïncubeerd. Omwille van het ampicilline resistentiegen van de vector zullen enkel bacteriën die de vector effectief hebben opgenomen op de platen groeien. 20 individuele kolonies worden de dag nadien gesuspendeerd in 25µL TSB. Nu zal een nieuwe PCR-gelelektroforese test met specifieke vectorprimers opgezet worden om na te gaan welke kolonies de vector mét geligeerd Trichomonas amplificatieproduct bevatten. De lengte van de PCR producten zal immers groter zijn met insert. De gebruikte PCR mix is samengesteld uit 0,25µL TOPO® vector specifieke primers p247 en p248 (10µM), 0,75µL MgCl2 (50mM), 2,5µL PCR buffer (10x), 2,5µL dXTP mix (2mM), 0,25µL Taq polymerase enzym (0,05 U/µL) en 16µL gepurifieerd water als eenheidsvolumes. Er wordt 22,5µL van deze mix gemengd met 2,5µL kolonie suspensie. De PCR bezit, op een annealingtemperatuur van 55°C na, hetzelfde temperatuurprofiel als deze die eerder al uitgevoerd werd bij het kloneren. Positieve kolonies, die dus de vector met het insert opgenomen hebben, ondergaan een T. vaginalis RT-PCR. 5µL kolonie suspensie wordt gemengd met 20µL mix die bestaat uit 12,5 µL TaqMan® Fast Universal PCR Mastermix en 7,5 µL PP mix. Deze Trichomonas singleplex PP mix bestaat uit 0,75µL primer 506 en 507 (10mM), 1µL probe 508 (5mM) en 5µL gepurifieerd water. Na interpretatie van de data zullen de meest geschikte kolonies, deze met de laagste Ct waardes, overnacht in tubes opgekweekt worden. Deze TSB tubes bevatten naast de koloniesuspensie zelf ook ampicilline om selectieve groei van de gewenste bacteriën te bekomen. Opgekweekte kolonies worden opgezuiverd met de Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System kit van Promega (California, USA). De overnacht geïncubeerde 20

tubes worden 15 minuten afgedraaid aan 4000rpm. De bekomen pellet wordt geresuspendeerd

met

250µL

Resuspension

Solution.

Daaropvolgend

wordt

achtereenvolgens 250µL lysis buffer, 10µL alkalisch protease oplossing en 350µL neutralisatieoplossing toegevoegd, telkens gescheiden door een incubatieperiode van 5 minuten. Deze handelingen zorgen er respectievelijk voor dat de bacteriën gelyseerd worden, de vrijgekomen endonucleases geïnhibeerd worden en dat de uiteindelijke oplossing geneutraliseerd wordt. Ook zal het bacterieel genomisch DNA gefragmenteerd worden, zonder aantasting van het plasmide DNA. Er wordt gecentrifugeerd op 14000rpm gedurende 10 minuten zodat een pellet met al het ongewenst materiaal bekomen wordt. Het supernatans, dat het gewenste plasmide DNA bevat, wordt overgebracht op een silicakolommetje. Nu wordt opnieuw kort gecentrifugeerd zodat het DNA kan binden aan de kolom. Er wordt met 750 µL en 250µL Column Wash Solution gewassen door respectievelijk 1 en 2 minuten kort af te draaien. Wanneer nu RNase/DNase vrij water op de kolom gebracht wordt en er wordt opnieuw gecentrifugeerd, dan zal het eluaat het gewenste plasmide DNA bevatten.xxxvi De hoeveelheid aan gepurifieerd DNA wordt via een optic density (OD) meting met het Nanodrop ND-1000 toestel gekwantificeerd (Isogen Life Science, Utrecht, Nederland). Met behulp van onderstaande vergelijkingen wordt de concentratie aan plasmide DNA weergegeven als het aantal kopieën plasmide DNA per mL. waarin: m= g, MW= g/mol en n= mol

(3.1)

waarin: NA= 6,022 1023 moleculen/mol

(3.2)

Er wordt een verdunningsreeks opgesteld met TE 1x als verdunningsmedium. In de eerste twee stappen wordt 1/100 verdund, vanaf 109 kopieën plasmide per mL is dat 1/10. Concreet wordt aan 5µL van de stock DNA oplossing (bij benadering 1013 kopieën plasmide DNA per mL) 490µL TE 1x toegevoegd, alsook 5µL Fish Sperm DNA (FS DNA). Het toevoegen van FS DNA dient om de aanwezige plasmiden te stabiliseren en om aspecifieke bindingen van de oligonucleotiden met oppervlakten te vermijden. Deze nieuwe oplossing van 1011 kopieën plasmide per mL wordt op dezelfde wijze nogmaals 21

verdund tot een oplossing die 109 kopieën plasmide per mL bevat. Aan 50µL van deze nieuw bekomen oplossing wordt opnieuw 5µL FS DNA toegevoegd en aangelengd tot 500µL met TE buffer 1x. Deze stap wordt herhaald tot een concentratie van 10 3 kopieën plasmide per mL bereikt wordt. Met deze aangelegde verdunningsreeks zal verder gewerkt worden tijdens de optimalisatie van de RT-PCR methode.

3.5 REAL-TIME PCR 3.5.1 Algemeen Allereerst wordt de PCR mix aangemaakt die de gewenste primers, probes en enzym bevat voor de RT-PCR. Op basis van het aantal stalen wordt volgens in een 5:3 verhouding per staal 12,5µL TaqMan® FAST universal Mastermix gemengd met 7,5 µL PP mix. Vervolgens kan dan per welletje 20µL van bovenstaande homogene mix uitverdeeld worden in de 96 well FAST platen (MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plates, Part No 4346906). 5µL van het gewenste DNA extract wordt toegevoegd aan de 20µL mix die reeds in het welletje aanwezig is. Naast de analyse van de stalen wordt altijd een positieve controle meegenomen die de amplificatie van het target in de RT-PCR controleert. Ook een negatieve controle, om eventuele contaminatie uit te sluiten en de specificiteit van de RT-PCR te bevestigen, wordt meegenomen op de plaat. Als positieve controle wordt 5µL plasmide extract van het target toegevoegd, terwijl een negatieve controle net geen target DNA bevat. De gevulde platen worden afgesloten met een doorzichtige ‘adhesive cover’ om verdamping en contaminatie te vermijden. De gevulde en afgedekte plaat wordt gedurende een paar seconden op de trilplaat gezet en ondergaat een korte spin om te verzekeren dat alle luchtbelletjes zich bovenaan het vloeistofoppervlak bevinden zodat de PCR niet gestoord wordt. De plaat wordt in een ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR toestel geplaatst en er wordt een ‘advanced setup’ gecreëerd. Er wordt gekozen voor een ‘quantitation run’ en in het venster van ‘plate setup’ worden de gewenste targets toegevoegd. Deze targets, meer

22

bepaald de 2kb specfieke repeat voor T. vaginalis, het 16S- en CP target voor C. trachomatis, het omp- en porA target voor N. gonorrhoeae en het PhHV target voor de interne controle, kunnen dan toegewezen worden aan welletjes in het venster van ‘plate layout’. De correcte ‘run method’ wordt gekozen waarna de run gestart kan worden. Initieel wordt de plaat 5 minuten op 50°C gehouden, waarna de temperatuur wordt opgetrokken en voor 20 seconden op 95°C gehouden wordt. Vanaf dan worden 45 cycli gestart: 3 seconden op 95°C en vervolgens 30 seconden op 65°C. Het resultaat wordt onmiddellijk via ‘real-time imaging’ weergeven in een amplificatieplot.xxxvii

3.5.2 Optimalisatie Zoals beschreven in ‘3.4 Kloneren’, wordt een plasmide verdunningsreeks aangemaakt ter optimalisatie van de T. vaginalis RT-PCR. Vervolgens wordt via trial and error naar de meest geschikte primer -en probeconcentraties gezocht. Verschillende samenstellingen worden uitgeprobeerd op de T2 verdunningsreeks. Een overzicht van de samenstelling van de PP mixen wordt weergeven in onderstaande tabel (Tabel 3.2). Tabel 3.2: Buffer en PP mix samenstellingen in de optimalisatie van de 6plex PCR (20µL totaalvolume)

Reagens

[stock]

Taqman Fast FP p506 RP p507 Probe p508 water

2x 10µM 10µM 5µM

Reagens

[stock]

Taqman Fast FP p506 RP p507 Probe p508 water

2x 10µM 10µM 5µM

150nM primer 200nM probe 12,50µL 0,375µL 0,375µL 1,00µL 5,75µL

100nM probe 12,50µL 0,75µL 0,75µL 0,50µL 5,50µL

100nM probe 12,50µL 1,50µL 1,50µL 0,50µL 4,00µL

600nM primer 150nM probe 12,50µL 1,50µL 1,50µL 0,75µL 3,75µL

300nM primer 150nM probe 12,50µL 0,75µL 0,75µL 0,75µL 5,25µL

200nM probe 12,50µL 0,75µL 0,75µL 1,00µL 5,00µL

200nM probe 12,50µL 1,50µL 1,50µL 1,00µL 3,50µL

900nM primer 200nM probe 12,50µL 2,25µL 2,25µL 1,00µL 2,00µL 23

Er wordt, na het bereiken van een optimum in samenstelling aan primers en probe, een grote hoeveelheid aan 6plex PCR PP mix aangemaakt (Tabel 3.3). Deze samenstelling kan bij succesvol afronden van de optimalisatie en validatie van de methode als definitief beschouwd worden. Tabel 3.3:Definitieve 6plex PCR PP mix samenstelling

primer

target

Conc.

volume

p 347

OMP

100 µM

3,75µL

p 351

OMP

100 µM

p352

OMP

p344

primer

target

Conc.

volume

p322

CHTR16S

10 µM

37,50µL

3,75µL

p323

CHTR16S

5 µM

25,00µL

5 µM

50,00µL

p324

CHTR CP

10 µM

37,50µL

PorA

100 µM

3,75µL

p325

CHTR CP

10 µM

37,50µL

p345

PorA

100 µM

3,75µL

p326

CHTR CP

5 µM

25,00µL

p346

PorA

5 µM

50,00µL

p506

TRIVAG

100 µM

3,75µL

p318

PhHV

10 µM

12,50µL

p507

TRIVAG

100 µM

3,75µL

p319

PhHV

10 µM

12,50µL

p508

TRIVAG

50 µM

2,50µL

p320

PhHV

5 µM

12,50µL

water

12,50µL

p321

CHTR16S

10 µM

37,50µL

totaal

375,00µL

Aangezien het T. vaginalis target niet het enige target is dat opgenomen wordt in de 6plex PCR methode, wordt ook van de andere targets een positieve controle verdunningsreeks opgesteld. Startmateriaal van de 16S en CP target voor C. trachomatis en de omp en porA target voor N. gonorrhoeae is reeds ter beschikking zodat de kloneringsprocedure voor deze positieve controles niet herhaald dient te worden. Net zoals de verdunningsreeks van T.vaginalis wordt ook nu 50µL oplossing aangelengd tot 500µL met TE buffer 1x, inclusief de 5µL FS DNA. De bekomen verdunningsreeksen zullen vervolgens gebruikt worden om vergelijkende testen uit te voeren tussen de nieuw ontwikkelde PCR en de huidige routine PCR’s. Ook worden er op analoge wijze verdunningsreeksen gemaakt van DNA extracten. Dit om de performantie van de PCR methode op reële stalen, in tegenstelling tot positieve controles, te kunnen beoordelen. De verdunningsreeksen van extracten worden onder andere gebruikt om de lineariteit van de 6plex RT-PCR te valideren, alsook om checkerboard analyses uit te voeren. Checkerboard analyses geven de gevoeligheid 24

van een RT-PCR assay weer in aanwezigheid van een bepaalde concentratie van een ander micro-organisme. Elk welletje op de 96 well plaat wordt zoals normaal gevuld met 20 µL TaqMan® FAST universal Mastermix – PP mix mengsel, waarbij nu niet langer 5µL DNA template toegevoegd wordt, maar 2,5µL van een bepaalde verdunning van het ene micro-organisme en 2,5µL van een bepaalde verdunning van het tweede (Tabel 3.4). De gehanteerde lettercode is gebaseerd op het principe dat ‘A’ de onverdunde oplossing voorstelt, zodanig dat bij aflopen van het alfabet er telkens tiendelig verdund wordt. Tabel 3.4: Voorstelling van een checkerboard setup tussen T. vaginalis (T reeks) en C. trachomatis (C reeks)

TA

TB

TC

CA

CB

CC

2,5 µL 1x T. vag

2,5 µL 1x T. vag

2,5 µL 1x T. vag

2,5µL 1x C. trach

2,5µL 0,1x C. trach

2,5µL 0,01x C. trach

2,5µL 0,1x T. vag

2,5µL 0,1x T. vag

2,5µL 0,1x T. vag

2,5µL 1x C. trach

2,5µL 0,1x C. trach

2,5µL 0,01x C. trach

2,5µL 0,01x T. vag

2,5µL 0,01x T. vag

2,5µL 0,01x T. vag

2,5µL 1x C. trach

2,5µL 0,1x C. trach

2,5µL 0,01x C. trach

3.5.3 Validatie De specificiteit van de methode wordt in drievoud nagegaan. Op vijf verschillende positieve stalen wordt een sequentie-analyse uitgevoerd, beschreven onder 3.7 Sequencing. Ten tweede worden een aantal positieve en negatieve stalen onderworpen aan gelelektroforese, aangehaald onder hoofdstuk 3.6, waarbij enkel de bandjes van het gewenste target zichtbaar mogen zijn. Er wordt ten derde ook nog een RT-PCR uitgevoerd op organismen die frequent voorkomen in genitale stalen, afkomstig van het labo microbiologie, om de specificiteit van de PCR voor T. vaginalis, N. gonorrhoeae en C. trachomatis te bevestigen. Om een idee te verwerven over de analytische accuraatheid, sensitiviteit en specificiteit van de ontwikkelde RT-PCR methode, worden de resultaten van een aantal geteste positieve stalen vergeleken met de resultaten afkomstig van gevalideerde 25

referentiemethoden. Er wordt gebruik gemaakt van 22 opgestuurde stalen vanuit Oostende, alsook van de resultaten die bekomen werden in de test met de verwante organismen. Ten derde worden alle routinestalen gedurende een week parallel geëvalueerd met de 6plex PCR. Ten slotte wordt ook de 2015 EQC (External Quality Control) reeks van C. trachomatis en N. gonorrhoeae onderworpen aan de ontwikkelde RT-PCR. Bij het bepalen van de lineariteit wordt teruggegrepen naar de eerder aangelegde verdunningsreeksen van DNA extracten. Echter, om een eventueel verlies aan gevoeligheid door de extractiestap op te merken wordt besloten om de verdunningsreeks van T. vaginalis aan te maken vanaf een positief staal zelf. Er wordt verdund in eSwab® medium. Van twee positieve stalen, TV 13 en TV 15 – Oostende, wordt zo’n verdunningsreeks opgesteld en in drievoud geëxtraheerd. Op die manier wordt vanuit een correct en volledig perspectief de lineariteit geëvalueerd. Zowel de verdunningsreeks van C. trachomatis, N. gonorrhoeae als die van T. vaginalis wordt in drievoud getest via RT-PCR, met zowel de 6plex PP mix als de referentie 5plex PP mix. Met als doel de intrarun precisie van de 6plex PCR te bepalen wordt gebruik gemaakt van staal TV13 – Oostende voor T. vaginalis detectie, van staal *7703 en *7708 voor respectievelijk C. trachomatis en N. gonorrhoeae. De interrun precisie wordt gekoppeld aan de test op houdbaarheid, waar positieve stalen (*1349, *9233, *7997, *9212 en *2214) via een strikt protocol geanalyseerd worden. Op gefixeerde data wordt een positief staal, bewaard op kamertemperatuur of in de koelkast, geëxtraheerd en onderworpen aan PCR. De stalen worden getest op de dag van afname, 4 dagen na afname, 8 dagen na afname en 15 dagen na afname.

3.6 GELELEKTROFORESE Het Mupid®-One elektroforesetoestel van Eurogentec (serienr. 072566) scheidt PCR producten onder invloed van een spanningsveld doorheen een agarosegel. De gel bevindt zich in 0,5x TAE buffer; Tris Acetaat EDTA buffer (10x) twintig maal verdund 26

(Sigma-Aldrich, catnr. T8280-1L). Tijdens de run wordt ook altijd een 100bp ladder meegenomen van Life Technologies (catn° 10488-058). Het te detecteren DNA wordt, vooraleer het geladen wordt op de gel, gemengd met een ladingsbuffer van Life Technologies (catn° 10482-028). Visualisatie nadien gebeurt met een VWR GenoView UV-lamp en fototoestel. 1,8g afgewogen agarose (Life Technologies, lotnr. 4041901) wordt opgelost in 100mL 0,5x TAE buffer. Hiertoe wordt de suspensie in de microgolfoven geplaatst op 360W, tot wanneer het kookpunt bereikt wordt. Aan de oplossing wordt vervolgens 10µL GelRed™ Red Stain 10000x (catnr. 41003) toegevoegd en uitgegoten in een mal om te stollen. De gestolde gel kan vervolgens in het toestel gebracht worden, waarbij het vloeistofniveau van TAE buffer de bovengrens van de gel moet overschrijden. Aan 10µL PCR product wordt 2µL ladingsbuffer toegevoegd en in de welletjes van de gel gepipetteerd. Eén welletje wordt ook gevuld met de 100bp ladder. De run wordt gestart en loopt gedurende 20minuten op 100V. Na de run worden de bandjes met behulp van UV licht zichtbaar gemaakt en wordt het beeld fotografisch vastgelegd. xxxviii

3.7 SEQUENCING Er wordt een klassieke PCR ingezet met p506 en p509 voor de stalen die gesequenced dienen te worden. Het temperatuurprofiel van de PCR is identiek aan deze die eerder al gebruikt werd bij het kloneren. De geamplificeerde producten worden allereerst op gel gezet om te verifiëren of de amplificatie goed verlopen is. De geamplificeerde DNA producten worden vervolgens opgezuiverd. DNA selectieve filters (Amicon R Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices) worden gevuld met 360µL TE buffer 1x (1/100 TE 100x catnr. 117K8612), waaraan 40µL amplificatieproduct toegevoegd wordt. Na centrifugatie bevindt het gewenste DNA zich in de filter. Het filtraat wordt weggegooid. Deze filters worden nu omgekeerd op nieuwe eppendorfs geplaatst die 15µL TE buffer 1x bevatten. Er wordt opnieuw gecentrifugeerd zodat het gefilterde DNA terechtkomt in de TE buffer 1x en beschikbaar is voor verdere handelingen. 27

3µL hiervan wordt aangelengd tot 15µL met water. 3µL van deze 1/5 DNA oplossing wordt samengevoegd met 1µL gewenste primer (3,33µM primer 509), 8µL water en 8µL DTCS (GenomeLab™ Dye Terminator Cycle Sequencing Quick Start Kit), wat resulteert in een totaalvolume van 20µL. Deze oplossing ondergaat een cycle sequencing programma van 30 cycli. Het GeneAmp PCR system 2400 toestel van Life Technologies (serienr. 803P5100308) zorgt voor een initiële verwarming tot een temperatuur van 96°C, zodat vanaf nu de cycli aangevat kunnen worden: 20 seconden op 96°C, vervolgens 20 seconden op 50°C en 4 minuten op 60°C. Nadien worden de geamplificeerde producten op 4°C gehouden. Na cycle sequencing wordt een alcoholprecipitatie uitgevoerd ter opzuivering van de bekomen fragmenten. Lege 1,5mL eppendorfs worden gevuld met 5µL neerslagmedium. Dit bevat 1µL glycogeen (Genome Lab™ DTCS Quick Start Kit), 2µL 3M natriumacetaat pH 5.2 en 2µL 100 mM EDTA (Sigma-Aldrich). De cycle sequencing producten worden vervolgens toegevoegd aan dit medium. Er wordt 60µL EtOH 100% toegevoegd en er wordt gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 4°C op 14000 rpm. De bekomen pellets worden gewassen met 200µL 70% EtOH, waarna kort afgedraaid wordt en deze stap herhaald wordt. Nadat de pellets minimaal 20 minuten aan de lucht gedroogd hebben, wordt aan elke pellet 40µL Sample Loading Solution (SLS) toegevoegd. De volledige inhoud wordt vervolgens overgepipetteerd naar de overeenkomstige welletjes van de plaat van de capillaire sequencer. Op alle vloeistofoppervlaktes wordt een druppel minerale olie aangebracht tegen verdamping.xxxix Naast de plaat die het DNA bevat, wordt een tweede 96-well plaat gevuld. In de overeenkomstige welletjes wordt een scheidingsbuffer (Beckman Coulter, California, USA) gepipetteerd. Beide worden in het toestel gebracht. De fluorescent gemerkte geamplificeerde DNA fragmenten worden gescheiden met behulp van het CEQ 8000 Genetic Analytic System toestel van Beckman Coulter (serienr. 3067187) via capillaire elektroforese. In het toestel bevinden zich acht capillairen waardoor in achtvoud gewerkt kan worden. 28

4. RESULTATEN 4.1 KLONEREN Volgens de procedure beschreven in ‘3.4 Kloneren’, zou bij een klassieke PCR van het T. vaginalis target een bandjeslengte van 84bp bekomen moeten worden. De bekomen resultaten bewezen deze veronderstelling (Figuur 3.1), waardoor beslist werd om verder te werken met staal *6762 zonder gebruik van DMSO en BSA in de mix. Na hybridisatie van de geamplificeerde producten in de kloneringsvector, heatshock in E. coli bacteriën en overnacht groeien op de selectieve TSA – ampicilline bodem worden de bacteriekolonies op de platen geëvalueerd. 20 zuivere kolonies worden opgepikt en gesuspendeerd in TSB medium, waarop een nieuwe PCRgelelektroforese test uitgevoerd wordt met specifieke vector primers zoals vroeger al aangehaald (Figuur 4.1). Bandjes met een lengte van 328bp komen overeen met de lengte van het beoogde product, i.e. het geamplificeerd stuk vector (244bp) met de insert (84bp). Bandjes die verder gemigreerd zijn bevatten hoogstwaarschijnlijk het insert niet, zodat deze ook niet in aanmerking komen voor de daaropvolgende RT-PCR. Onder andere kolonie 1 behoort tot deze laatste groep.

Figuur 4.1: vlnr. basenpaar ladder, positieve controle, negatieve controle en alle kolonies (1-14)

Kolonies 2 en 11 bleken na single RT-PCR analyse de twee meest belovende kolonies met respectievelijke Ct-waarden van 15,29 en 15,44. Na het overnacht opgroeien van deze kolonies en opzuivering van de plasmiden wordt de optische densiteit van het bekomen plasmide DNA gemeten (Tabel 4.1). Tabel 4.1: Gemeten absorbantie en concentratie van de opgezuiverde plasmiden, waarbij een 260/280nm ratio van 1,8 tot 2 zich in een voldoende zuivere DNA oplossing vertaalt.

Kolonie 2 Kolonie 11

Absorbantie (260nm) 2,053 1,760

260nm/280nm 1,88 1,89

conc. (ng/µL) 102,7 88,0 29

De opzuivering van kolonie 2 leverde 102,7 ng plasmide DNA op. Volgens vergelijking (3.1) en wetende dat het moleculair gewicht van één mol plasmide met T. vaginalis insert gelijk is aan 2,7

106 g, wordt een opbrengst van 3,81 10-14 mol

plasmide bekomen. Rekening houdend met het getal van Avogadro wordt via vergelijking (3.2) een totale opbrengst van 2,29 1010 kopieën per µL of 2,29 1013 kopieën per mL berekend. (kolonie 11: 1,96 1013 kopieën per mL). Om na te gaan of de positieve controles wel effectief het gewenste insert bevatten, wordt de nucleotidenvolgorde van het PCR product opgehelderd door sequencing. Zowel de T2 als de T11 positieve controle bevat het gewenste insert eenmaal. Het resultaat kan vervolgens nog eens via BLASTing bevestigd worden door de gevonden nucleotidensequentie te screenen ten opzichte van de databank van NCBI. Het resultaat wordt weergegeven in Figuur 4.2. De primer -en probe bindingsplaatsen vertonen bovendien geen enkele mismatch (100% match), wat de identiteit van het insert bevestigd als zijnde het T. vaginalis target.

Figuur 4.2: Gescreende sequentie van het insert (T2) ten opzichte van de T. vaginalis sequentie (acc.nr. L23861)

4.2 OPTIMALISATIE 4.2.1 Optimalisatie van singleplex RT-PCR voor T. vaginalis In een eerste optimalisatiestap wordt de concentratie aan primers gevarieerd in het PP mengsel, terwijl de probeconcentratie op 200nM constant gehouden wordt. Op de T2 T. vaginalis verdunningsreeks wordt met verschillende concentraties primer een RT-PCR uitgevoerd. Concentraties van 300nM en 600nM primer blijken de beste resultaten te geven. Binnen deze bekomen primerconcentraties wordt vervolgens de 30

concentratie aan probe gevarieerd van 100nM tot 200nM. De resultaten staan vermeld in Tabel 4.2. Naast de Ct waarden worden ook de R2, de procentuele efficiëntie en de maximale fluorescentie gerapporteerd. De R2 en efficiëntie spelen een grote rol in de mate van de lineariteit van de RT-PCR. De maximale fluorescentie is best niet te laag, wat een verminderde detectiekracht met zich meebrengt, of te hoog, wat de potentiële kans op interferentie met de andere signalen van de multiplex PCR vergroot. Tabel 4.2: Analyse verdunningsreeks T2 in optimalisatie van [primers en probe] (‘ng’ = niet gedetecteerd)

conc. primers

150nM

conc. probe verdunningsreeks 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 R2 Eff% max fluorescentie

200nM Ct 20,78 24,58 27,93 31,64 34,96 38,71 ng ng 1,00 91,05 1,40

300nM 100nM Ct 20,86 24,46 27,75 31,20 33,99 37,43 ng ng 1,00 101,64 1,10

150nM Ct 20,79 24,35 27,75 31,42 33,77 38,39 ng ng 1,00 95,82 1,55

600nM 200nM Ct 20,77 24,29 27,67 31,26 35,27 36,95 43,90 ng 0,99 98,63 1,85

100nM Ct 21,06 24,54 28,01 31,40 34,12 ng ng ng 1,00 100,99 1,10

900nM

150nM 200nM 200nM Ct Ct Ct 20,75 20,68 20,54 24,35 24,36 24,18 27,83 27,71 27,55 31,02 31,16 31,06 34,60 33,68 33,98 ng ng ng ng ng ng ng ng ng 1,00 1,00 1,00 95,39 101,75 97,92 1,85 2,30 2,35

De conditie waarbij gebruik gemaakt wordt van 300nM primers en 100nM probe blijkt de meest interessante te zijn. Deze veronderstelling is gebaseerd op het feit dat de Ct waarde idealiter stijgt met 3,3 eenheden per 1/10 verdunning. Dit omdat de tiendelige verdunning bij iets meer dan de 3e cyclus weggewerkt wordt door amplificatie. Het target wordt geamplificeerd tot respectievelijk een verdunning van 105 en 104 kopieën per mL bij 600nM en 300nM primers. Tevens is de fluorescentie bij een probeconcentratie van 100nM reeds voldoende hoog, wat ervoor zorgt dat een hogere probeconcentratie niet nodig is. Ook de R2 en de efficiëntie geven bij deze condities mooie cijfers weer, zodat met deze ‘300-100’ conditie verder gewerkt zal worden. Er wordt nu geprobeerd om bovenstaande ontwikkelde single RT-PCR bij een reeds bestaande 5plex RT-PCR voor C. trachomatis en N. gonorrhoeae te voegen. Deze 6plex 31

RT-PCR methode zal zowel ten opzichte van de zonet geoptimaliseerde singleplex RTPCR als ten opzichte van de reeds gevalideerde routine 5plex RT-PCR vergeleken worden.

4.2.2 Optimalisatie van 6plex RT-PCR 4.2.2.1 Vergelijking met singleplex RT-PCR Zowel de 6plex RT-PCR als de geoptimaliseerde referentie singleplex RT-PCR worden getest met de eerder aangemaakte T2 T. vaginalis plasmide verdunningsreeks. Resultaten staan in onderstaande Tabel 4.3. De  Ct waarden (Ct waarde van de 6plex PCR verminderd met de Ct waarde van de referentie PCR) geven negatieve resultaten weer, wat impliceert dat de 6plex RT-PCR op vlak van gevoeligheid zelfs iets beter scoort dan de singleplex RT-PCR. In absolute waarde verschillen de ΔCt’s maximaal 0,46 zodat de twee PCR methodes zo goed als vergelijkbaar geacht kunnen worden. 2

Tabel 4.3: Vergelijking tussen een singleplex PCR (R =0,998 en Eff%=100,2) als referentie en de 2 ontwikkelde 6plex PCR (R =1 en Eff%=95,2)(‘ng’ = niet gedetecteerd)

Singleplex RT-PCR (Ct)

6plex RT-PCR (Ct)

ΔCt

20,54 24,11 27,50 30,94 33,70 ng

20,38 23,93 27,31 30,79 34,16 ng

-0,16 -0,18 -0,19 -0,15 0,46 nvt

1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04

4.2.2.2 Vergelijking met 5plex RT-PCR Net zoals bij de vergelijking met de singleplex RT-PCR wordt er gebruik gemaakt van de aangemaakte plasmide verdunningsreeksen van alle aanwezige targets om de vergelijkende test uit te voeren. In Tabel 4.4 staan de bekomen resultaten. 2

Tabel 4.4: Vergelijking tussen een referentie 5plex PCR (R >0,99 en Eff%>80% voor alle targets) en de 2 ontwikkelde 6plex PCR met 16S target (R >0,99 en Eff%>80% voor alle targets)

5plex RT-PCR (Ct) verdunningsreeks 1,00E+09

16S 20,02

CP 16,86

omp 17,11

porA 19,80 32

Tabel 4.4: Vervolg

1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03

23,56 26,97 30,71 34,10 36,22 ng

verdunningsreeks 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03

16S 20,19 23,71 27,26 30,81 34,05 ng ng

verdunningsreeks 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03

16S 0,18 0,15 0,29 0,10 -0,05 nvt nvt

20,39 20,56 23,97 23,87 27,68 27,19 31,02 30,69 34,74 33,98 37,77 38,12 6plex RT-PCR (Ct) CP omp 16,28 16,86 19,73 20,15 23,15 23,63 26,76 27,00 30,14 30,32 33,45 34,42 38,01 38,07 ΔCt CP omp -0,58 -0,25 -0,66 -0,41 -0,81 -0,24 -0,92 -0,19 -0,88 -0,37 -1,29 0,44 0,24 -0,05

23,43 26,74 30,18 33,59 ng ng porA 18,45 22,06 25,34 28,82 31,61 35,94 ng porA -1,35 -1,37 -1,40 -1,37 -1,99 nvt nvt

Wanneer de verschillen tussen 5plex en 6plex RT-PCR geanalyseerd worden, valt op dat ook hier het verschil niet erg groot is; maximaal 1,99. Bij targets 16S en porA wordt bij een verdunning van 104 kopieën per mL afwisselend wel en geen signaal gedetecteerd door de 5plex- en 6plex RT-PCR. Vanaf 104 kopieën per mL leunt de methode dus dicht tegen de detectielimiet aan, wat zowel voor de 5plex als 6plex RTPCR gezegd kan worden. Ook dient opgemerkt te worden dat met de 6plex RT-PCR vaak een gevoeligere en dus lagere Ct waarde bekomen wordt dan met de vergelijkende 5plex RT-PCR. Deze resultaten impliceren bijgevolg dat de nieuwe methode onvoldoende afwijkingen bevat ten opzichte van de huidige diagnostiek om de methode te verwerpen.

33

4.2.2.3 Vergelijking met externe referentie In samenwerking met het klinisch labo van het AZ Damiaan in Oostende worden een aantal verdachte stalen door beide laboratoria geanalyseerd. Op die manier wordt een extra referentie ingebouwd inzake de kwaliteit van de ontwikkelde methode. Extractie van 22 stalen waarop vervolgens RT-PCR op uitgevoerd wordt levert volgende resultaten (Tabel 4.5). De resultaten tonen een accuraatheid (% correct gescoorde stalen ten opzichte van de referentiemethode) van 100%, zodat deze analyse de detectiekwaliteit van de geoptimaliseerde 6plex RT-PCR bevestigt. Slechts 1 staal werd in AZ Damiaan ook getest op C. trachomatis en N. gonorrhoeae. Ook dit resultaat sluit aan bij de resultaten die bekomen worden met de ontwikkelde 6plex RT-PCR. Tabel 4.5: Vergelijking tussen de Ct waarden van de PCR analyse Aalst en PCR analyse Oostende. (‘ng’ = niet gedetecteerd, ‘nu’ = niet uitgevoerd)

T.vaginalis staal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -> 22

Aalst (Ct) 24,89 28,67 ng 24,91 24,43 22,32 ng 24,54 23,48 ng 22,84 22,34 19,36 21,55 20,92 ng

Oostende (Ct) 23,66 25,58 ng 20,12 22,90 19,00 ng 20,05 18,94 ng 19,87 18,72 15,76 17,68 18,00 ng

C. trachomatis Aalst (Ct) ng ng ng ng ng ng ng 23,49 35,98 20,24 ng ng ng ng ng ng

Oostende (Ct) nu nu nu nu nu nu nu 22,26 nu nu nu nu nu nu nu nu

N. gonorrhoeae Aalst (Ct) ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng

Oostende (Ct) nu nu nu nu nu nu nu ng nu nu nu nu nu nu nu nu

4.2.2.4 Checkerboard analyses Het uitvoeren van checkerboard analyses is essentieel in het bepalen van eventueel gevoeligheidsverlies van de 6plex PCR wanneer alle primers en probes worden

34

samengevoegd in een gezamenlijke PP mix. Het geeft namelijk aan in welke mate de detectie van een bepaald target beïnvloed wordt door de aanwezigheid van andere targets en dus ook van andere amplificatieproducten. Eventuele inhibitie van de PCR kan op die manier uitgesloten worden. Er wordt een checkerboard analyse uitgevoerd voor T.vaginalis in combinatie met C. trachomatis (Tabel 4.6) en een tweede voor T.vaginalis in combinatie met N. gonorrhoeae (Tabel 4.7). De lettercodes worden verklaard in ‘3.5.2 Optimalisatie’. Tabel 4.6: Checkerboard analyse 1 (‘ng’ = niet gedetecteerd, ‘nu ‘= niet uitgevoerd)

Ct waarden van T. vaginalis bij 1/10 verdunningsstappen van C. trachomatis TA TB TC TD TE->TG blanco

CA CB CC CD CE CF CG->CH blanco

CA CB CC CD CE CF CG CH 24,23 24,74 25,16 25,06 25,11 25,32 25,14 25,27 28,42 28,48 28,62 28,86 28,63 28,92 28,73 29,14 33,95 32,99 32,77 31,86 32,19 31,85 31,97 32,22 ng ng ng ng ng 35,99 ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng Ct waarden van C. trachomatis bij 1/10 verdunningsstappen van T. vaginalis TA TB TC TD TE TF TG TH 19,13 19,13 19,39 19,29 19,27 19,31 19,33 nu 22,60 22,80 22,82 22,85 22,86 23,10 22,78 nu 26,04 26,27 26,34 26,34 26,37 27,08 26,27 nu 29,35 29,82 29,79 29,79 29,72 29,84 29,73 nu 33,54 33,47 33,09 33,33 32,88 33,39 33,24 nu 41,31 39,73 39,00 38,62 41,50 ng 37,59 nu ng ng ng ng ng ng ng nu ng ng ng ng ng ng ng nu

blanco nu 28,54 31,56 38,70 ng ng blanco 18,99 22,57 26,11 29,47 32,89 36,85 ng ng

Concluderend tonen de resultaten weinig tot geen verlies in gevoeligheid voor beide analyses. Bij elke concentratie aan C. trachomatis wordt per T. vaginalis verdunningsstap ongeveer eenzelfde Ct waarde voor T. vaginalis waargenomen. Deze conclusie is gerechtvaardigd tot verdunning TC; vanaf dan wordt het Trichomonas target niet langer gedetecteerd. Hetzelfde kan gezegd worden bij de Ct waarden voor C. trachomatis, tot verdunning CE. De laatste kolom geeft de waarden onvertekend weer aangezien hier geen invloed is van een aanwezig tweede DNA target. 35

Tabel 4.7: Checkerboard analyse 2 (‘ng’ = niet gedetecteerd, ‘nu‘= niet uitgevoerd)

Ct waarden van T. vaginalis bij 1/10 verdunningsstappen van N. gonorrhoeae GA GB GC GD GE GF GG GH blanco TA 17,98 20,16 20,85 20,92 20,87 20,89 20,96 21,01 20,86 TB 18,16 21,49 23,71 24,50 24,67 24,65 24,68 24,86 24,54 TC 18,19 21,62 24,79 27,16 28,14 28,21 28,26 28,58 28,14 TD 18,34 21,76 24,90 28,29 30,49 31,66 31,98 31,94 31,52 TE 18,26 21,82 24,99 28,44 31,40 34,57 35,52 36,12 34,97 TF 18,38 21,74 25,01 28,45 31,51 34,16 nu ng ng TG 18,28 21,70 24,94 28,50 31,52 34,87 40,39 ng ng blanco 18,30 21,75 24,95 28,40 31,58 35,24 38,77 ng ng Ct waarden van N. gonorrhoeae (omp) bij 1/10 verdunningsstappen van T. vaginalis TA TB TC TD TE TF TG TH blanco GA 17,95 17,98 17,96 18,06 18,07 18,09 18,10 nu 17,96 GB 21,21 21,57 21,62 21,69 21,75 21,68 21,62 nu 21,52 GC 24,66 24,67 24,89 24,85 24,92 24,93 24,85 nu 24,64 GD 29,20 27,95 28,18 28,50 28,29 28,48 28,36 nu 28,01 GE 34,92 32,98 31,97 31,56 31,65 31,90 31,67 nu 31,13 GF 44,06 42,42 41,11 36,68 35,27 36,31 36,14 nu 35,81 GG ng ng ng ng ng ng ng nu ng GH ng ng ng ng ng ng ng nu ng blanco ng ng ng ng ng ng ng nu ng

In tegenstelling tot Checkerboard 1 is deze tabel iets moeilijker te interpreteren. Er moet namelijk rekening gehouden worden met het dubbel karakter van de ‘Trichomonas’ detectietarget. Aangezien de probe van de porA target van N. gonorrhoeae ook een Cy5 reportermolecule bevat, zullen de uiteindelijke Ct waarden 2 reële waarden representeren; deze van T. vaginalis en die van N. gonorrhoeae. Toch zijn waardevolle inzichten te verwerven uit bovenstaande tabel. Met behulp van de blanco kolom kan bepaald worden van wanneer de 2e invloed precies begint te spelen. Het complex karakter van deze dubbele detectie wordt verder behandeld in ‘5. Discussie’, verderop in deze thesis. Eveneens is er slechts een minimaal effect van T. vaginalis op de detectie van het N. gonorrhoeae omp target. Hiermee rekening houdend kan besluitend gezegd worden dat er net zoals bij de resultaten in Tabel 4.6 geen verlies in detectiegevoeligheid waargenomen wordt wanneer T. vaginalis samen met N. gonorrhoeae in een staal voorkomt. 36

4.3 VALIDATIE 4.3.1 Technische validatie 4.3.1.1 Analyse van de specificiteit De specificiteit van de PCR wordt op drie verschillende manieren geëvalueerd. Er wordt in eerste instantie op 5 verschillende positieve stalen een sequentieanalyse uitgevoerd om de identiteit van het micro-organisme te bevestigen. De bekomen sequenties worden via BLAST gescreend ten opzichte van de gekende T. vaginalis repeat. Resultaten worden weergegeven in Tabel 4.8. De sequenties stemmen in grote mate overeen met de gekende T. vaginalis repeat, waardoor de specificiteit van de PCR bevestigd wordt. Tabel 4.8: Gelijkenis tussen cycle sequencing producten van positieve stalen met de T. vaginalis repeat

staal

TV 6

TV 11

TV 12

TV 14

TV 15

primer

p509

p509

p509

p509

p509

% match met T. vaginalis target

95%

94%

93%

95%

96%

Ten tweede worden een aantal verschillende positieve stalen onderworpen aan een agarosegelelektroforese (Figuur 4.3). De stalen die gebruikt worden zijn deze vanuit de TV 1- 22 reeks; de 22 stalen afkomstig van Oostende. De lengte van de bandjes op de gel dienen in overeenstemming te zijn met de specifieke vooropgestelde lengtes, wat een amplificatie van het correcte target impliceert. Geen enkele andere lengtes van bandjes mogen teruggevonden worden aangezien dat kan wijzen op aspecifieke amplificatie van nucleïnezuren. Vergelijking met de negatieve controle leert dat de bandjes effectief van gewenste lengte zijn, zijnde 84bp voor T. vaginalis en 212bp voor het 16S target van C. trachomatis. De interne controle, eveneens rond de 100 bp lang, geeft hier weliswaar een lichte vertroebeling van de resultaten, aangezien ook de negatieve controle een intens bandje oplevert.

37

Figuur 4.3: Gelelektroforese voor specificiteitsvalidatie: vlnr: ladder, positieve stalen TV13, TV14, TV15, TV9, TV12, TV10, negatieve stalen TV16, TV17, TV18, TV19 en controles. (T.vag= Trichomonas positief, CHTR= Chlamydia positief)

Er wordt als derde test ook nog een RT-PCR uitgevoerd op organismen die voorkomen in genitale stalen (Tabel 4.9). Geen enkel staal buiten de positieve controles gaf positieve resultaten, waardoor met voldoende zekerheid gezegd kan worden dat de ontwikkelde PCR methode specifiek is voor de beoogde targets. Tabel 4.9: Overzicht van geanalyseerde verwante micro-organismen

Staphylococcus epidermidis

Pseudomonas aeruginosa

Enterococcus faecalis

Candida glabrata

Gardnerella vaginalis

Escherichia coli

Streptococcus agalactiae

Herpes simplex virus (HSV)

Lactobacillus rhamnosus

Herpes simplex virus (HSV)

Candida albicans

Varicella zoster virus (VZV)

4.3.1.2 Bepalen van de analytische accuraatheid, sensitiviteit en specificiteit Op verschillende positieve en negatieve referentiestalen wordt de nieuw ontwikkelde PCR, de 6plex PCR, uitgevoerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de 22 opgestuurde stalen vanuit Oostende, van de test op genitale organismen, van verdachte C. trachomatis en N. gonorrhoeae routinestalen en van 2015 EQC stalen (WIV), eveneens positief aan C. trachomatis of N. gonorrhoeae. Op basis van deze resultaten wordt bijgevolg een berekening gemaakt van de sensitiviteit (% positieve stalen ten opzichte van alle positieve stalen met referentiemethode), de specificiteit (% negatieve stalen ten opzichte van alle negatieve stalen met referentiemethode) en de accuraatheid (% correct gescoorde stalen ten opzichte van de referentiemethode), waarbij voor allen

38

90% als de absolute ondergrens beschouwd wordt. De resultaten van bovenstaande testen worden gebundeld in onderstaande tabellen (Tabel 4.10 en Tabel 4.11). Tabel 4.10: Overzicht van testen voor bepaling van de accuraatheid, sensitiviteit en specificiteit

Test

aantal stalen

positief

positief gedetecteerd

aanwezig organisme

Stalen Oostende Genitale organismen Routine stalen EQC stalen TOTAAL

22 12 23 10 67

12 0 2 8 22

12 0 2 8 22

TRIVAG DIVERS CHTR en GONO CHTR en GONO

Tabel 4.11: Resultaten EQC stalen met referentie (5plex RT-PCR) en Trichomonas single bevestingingsPCR (‘ng’ = niet gedetecteerd, ‘*’ = 1 op 10 verdund staal)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5plex RT-PCR (Ct) CHTR omp porA ng ng ng ng 29,02 27,22 19,80 25,34 23,79 17,65 ng ng 21,45 30,70 28,51 15,76 ng ng 16,75 17,99 17,66 19,26 21,27 20,91 42,87 17,32 17,00 ng ng ng

6plex RT-PCR (Ct) CHTR omp TRIVAG ng ng ng ng 29,16 25,53 19,99 25,53 22,20 21,78 * ng ng 21,54 30,62 26,43 16,22 ng ng 17,11 18,43 16,00 19,64 21,65 19,32 ng 17,65 15,56 ng ng ng

Single RT-PCR (Ct) TRIVAG ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng

Zowel de sensitiviteit (22/22), specificiteit (45/45) als accuraatheid geven een waarde van 100%, waarbij één zeer zwak CHTR positief staal (EQC 9) buiten beschouwing gelaten wordt aangezien voor klinische stalen meestal een hogere titer geregistreerd wordt. Op de EQC stalen, waarvan sommige N. gonorrhoeae positief, wordt ook nog een Trichomonas single RT-PCR uitgevoerd (Tabel 4.11 – laatste kolom). Deze analyse bevestigt dat het bekomen ‘TRIVAG’ signaal van de 6plex RT-PCR afkomstig is van de porA target van N. gonorrhoeae en niet van T. vaginalis zelf.

4.3.1.3 Bepalen van de lineariteit De lineariteit van de PCR wordt bepaald door analyse van amplificatieplots afkomstig van aangemaakte verdunningsreeksen. Voor detectie van C. trachomatis en 39

N. gonorrhoeae wordt vertrokken van verdunningsreeksen van positieve staalextracten, terwijl voor T. vaginalis een verdunningsreeks gebruikt wordt vanuit een positief staal (TV 13) om ook de extractiestap te betrekken in de lineariteitsvalidatie. Een efficiëntie van 80-120%, een R2 van minstens 0,99 en een weinig afwijkende Δ Ct waarde waarbij vergeleken wordt met een referentiemethode zijn essentieel voor een voldoende sterke lineariteit van de RT-PCR. Alle resultaten die buiten bovengenoemde intervallen liggen, worden als te afwijkend beschouwd waardoor de methode niet in gebruik kan genomen worden. Zowel de 5plex als 6plex PCR worden telkens in triplo geanalyseerd (Tabel 4.12). Tabel 4.12: Overzicht van de lineariteitsanalyse: vergelijking met referentie 5plex PCR (‘/’ = geen waarde)

5plex

6plex

ΔCt

gem Ct

stdev

gem Ct

stdev

1x

21,85

0,05

21,88

0,06

0,03

0,1x

25,5

0,08

25,64

0,08

0,14

0,01x

29,04

0,12

29,22

0,08

0,18

0,001x

32,46

0,04

32,62

0,13

0,16

0,0001x

36,11

0,09

37,23

0,94

1,12

1x

20,65

0,18

20,8

0,02

0,15

0,1x

24,17

0,09

24,23

0,06

0,06

0,01x

27,65

0,2

27,7

0,12

0,05

0,001x

31,12

0,15

31,16

0,14

0,04

0,0001x

34,66

0,38

34,7

0,99

0,04

1x

20,66

0,08

20,18

0,03

-0,48

0,1x

24,03

0,04

23,52

0,01

-0,51

0,01x

27,33

0,09

26,95

0,07

-0,38

0,001x

30,78

0,24

30,17

0,18

-0,61

0,0001x

34,06

0,21

34

0,06

-0,06

1x

/

/

18,72

0,10

/

0,1x

/

/

22,29

0,22

/

0,01x

/

/

26,16

0,10

/

0,001x

/

/

29,97

0,35

/

0,0001x

/

/

33,93

0,96

/

CHTR

OMP

porA

TRIVAG

40

Wanneer de gemiddelden en de standaarddeviatie van de 5plex PCR methode vergeleken worden met de gemiddelden en standaarddeviaties van de 6plex PCR, valt op dat de verschillen minimaal zijn. Er is

bijgevolg

geen

extensieve

afwijking van de Δ Ct waarde ten opzichte van het nulpunt, waardoor aan één van de drie criteria, zijnde een weinig afwijkende Δ Ct, reeds voldaan is. Grafisch omzetten van deze Ct waarden in functie van een bepaalde

concentratie

verdunningsreeks

in

de

resulteert

in

(aantal kopieën per mL)

volgende figuur (Figuur 4.4). De (kopieën/mL)

grafieken worden met behulp van de

analysesoftware

van

Life Figuur 4.4: Voorbeeld van lineaire regressie van de T. vaginalis verdunningsreeks met ABI software

Technologies opgesteld.

De resultaten van deze lineaire regressiemodellen, meer bepaald de R2 en de efficiëntie, worden in een samenvattende tabel (Tabel 4.13) geplaatst om een correcte beoordeling van de lineariteit van de PCR methode te kunnen maken. Ook deze resultaten vallen net als de Δ Ct waarden binnen de vooropgestelde limieten waardoor besloten kan worden dat er in voldoende mate aan de lineariteit van de ontwikkelde 6plex PCR methode wordt voldaan. Tabel 4.13: Samenvattende resultaten van de lineaire regressiemodellen

R2 en Eff% over een gebied van 1x tot 0,0001x 6plex R

2

5plex Eff%

R

2

Limiet Eff%

CHTR

0,997

84,25

0,999

91,33

omp

1

94,1

1

93,43

porA

0,993

95,72

1

98,64

TRIVAG

0,999

83,03

/

/

R

2

> 0,990

Eff%

>80%

41

4.3.1.4 Bepalen van de intrarun precisie Een sterk (10x verdund) en een zwak (10 000x verdund) positief staal dienen voor de intrarun precisie in drievoud getest te worden binnen eenzelfde run. De verdunning van de sterk positieve stalen tot zwak positieven gebeurt voor C. trachomatis en N. gonorrhoeae na de extractieprocedure aangezien niet voldoende verse positieve stalen voor handen waren. In het verleden toonde het validatiedossier van de 5plex RTPCR echter aan dat de extractieprocedure voldoende stabiel is, zodat deze handeling gerechtvaardigd is. Voor T. vaginalis wordt wel gewerkt met verdunningen vanaf het staal zelf (TV 15). Alle verdunningen werden vervolgens in drievoud geëxtraheerd. Er wordt een intrarun precisie van maximaal 2 Ct getolereerd, die hier nooit overschreden wordt (Tabel 4.14). Tabel 4.14: De Ct waarden en het verschil op de waarden van staal TV15, *7703 en *7708 (Δ = grootste waarde – kleinste waarde) voor de intrarun precisie.

T. vaginalis 1 2 3 Δ

0,1x 20,94 21,10 21,03 0,16

C. trachomatis

0,0001x 33,25 33,41 33,60 0,35

0,1x 21,92 21,92 21,80 0,12

0,0001x 32,77 32,63 32,45 0,31

N. gonorrhoeae omp 0,1x 20,80 20,82 20,80 0,04

0,0001x 31,07 31,36 31,06 0,30

4.3.1.5 Bepalen van de houdbaarheid en interrun precisie In functie van de tijd worden een aantal stalen geanalyseerd op hun houdbaarheid. Op verschillende gefixeerde meetpunten wordt dan RT-PCR uitgevoerd. Eveneens wordt uit deze resultaten de interrun precisie bepaald (Tabel 4.15). Tabel 4.15: Analyse van de houdbaarheid van positieve stalen. (‘KT’ = kamertemperatuur, ‘2-8°C’ = koelkast)

Staal Eerste analyse (dag 0) Tweede analyse (dag 4) Derde analyse (dag 8) Vierde analyse (dag 15) Δ Ct

*1349 (CHTR) KT (24,57) KT (23,98) KT (24,02) KT (22,00) 2,57

*9233 (CHTR) KT (24,51) KT (24,14) 2-8°C (24,22) 2-8°C (23,97) 0,54

*7997 (TRIVAG) KT (22,34) 2-8°C (/) 2-8°C (21,40) 2-8°C (21,45) 0,92

*9212 (TRIVAG) KT (23,30) KT (/) KT (30,54) KT (34,62) 11,32

*2214 (GONO omp) KT (27,48) 2-8°C (/) 2-8°C (27,34) 2-8°C (23,35) 4,13

42

Voor staal *1349, *9233 en *7997 wordt de vooropgestelde limiet (Δ Ct van 3) niet overschreden, zodanig dat aan de houdbaarheidsvoorschriften en de interrun precisie voldaan wordt. Staal *9212 en *2214 voldoen duidelijk niet. De variatie op de waarden is ook beduidend kleiner wanneer het staal in de koelkast bewaard wordt.

4.3.2 Theoretische validatie: kostenanalyse en terugbetalingstarieven Het toevoegen van de primers en de probe voor T. vaginalis aan de 5plex RT-PCR mix resulteert in slechts een minimale meerkost (€0,05). De grootste kost bij RT-PCR blijkt, naast de extractieprocedure van €4,75 per staal, de 96 well plaat te zijn met €4,67 per plaat. Het uitvoeren van een multiplex PCR methode is daarom een financieel interessante optie aangezien de plaat optimaal benut wordt doordat op meerdere targets binnen dezelfde assay getest wordt. De totaalkost per staal wordt bekomen door bij deze reagentiakost de personeelskost te voegen: €21,00 + €7,45 = €28,45. Het RIZIV voorziet volgens artikel 24 een terugbetaling van respectievelijk €25,00; €10,00 en €5,00 voor volgende bepalingen: ‘Chlamydia trachomatis opzoeken door moleculaire amplificatie (550255, 550266)’,’Opsporen van Neisseria gonorrhoeae door een techniek van moleculaire amplificatie (5509115, 550922)’ en ‘Parasieten, opzoeken in andere dan faecesmonsters en dan bloed (550815, 550826)’.xl

4.4 METHODEVERGELIJKING Een commercieel beschikbare antigen sneltest, de OSOM® Trichomonas Rapid Test, wordt in de praktijk gebruikt om snel en eenvoudig een T. vaginalis infectie te kunnen diagnosticeren. Het gebruik van een NAAT, meer bepaald de 6plex PCR, geeft echter veel betere resultaten op vlak van gevoeligheid en specificiteit. Drie verdachte T. vaginalis stalen (*5333, *7997 en *9212) werden microscopisch bevestigd, waarop zowel met de 6plex PCR als met de sneltest een analyse uitgevoerd wordt. Na RT-PCR worden Ct waarden bekomen van respectievelijk 18,69 , 22,34 en 23,30. Alle drie de stalen gaven eveneens een positief resultaat met de sneltest. Op basis van deze resultaten kan dus geen onderscheid gemaakt worden inzake gevoeligheid tussen de twee methoden. 43

5. DISCUSSIE De aanmaak van de positieve plasmide controles en de keuze van welke kolonies er opgezuiverd dienen te worden steunen in eerste instantie vooral op de bekomen resultaten van de uitgevoerde klassieke PCR-gelelektroforese testen. Interpretatie van deze resultaten zijn niet altijd voor de hand liggend door het ontbreken van een numerieke waarde. Eveneens is het zo dat de hoeveelheid geladen DNA ervoor kan zorgen dat de migratie wordt beïnvloedt; meer bepaald het verder doormigreren van het bandje bij een grote hoeveelheid aan DNA. In dat opzicht verloopt de interpretatie van de data bekomen met RTPCR een stuk vlotter. Tijdens de optimalisatie wordt de T. vaginalis RT-PCR op punt gebracht en bij een reeds bestaande 5plex PCR gevoegd, waarbij het belangrijk is de data output van deze finale 6plex RT-PCR op een correcte manier te interpreteren. Doordat zowel het signaal van het porA target van N. gonorrhoeae als het signaal van het T. vaginalis 2kb target in hetzelfde kanaal terechtkomen, is het onmogelijk om te beslissen of het staal nu Trichomonas of N. gonorrhoeae positief is. Daarom zal altijd een bevestigende T. vaginalis single RT-PCR uitgevoerd moeten worden om te kunnen differentiëren. Een nieuw positief signaal bevestigt dan onvermijdelijk een T. vaginalis positief staal, zoniet is er sprake van een N. gonorrhoeae positief staal. Deze dualiteit in detectie wordt mooi geïllustreerd aan de hand van de uitgevoerde checkerboard analyse tussen T. vaginalis en N. gonorrhoeae (Tabel 4.7 ). Bij verdunningsstap TC van T. vaginalis, gepaard met een aanwezigheid verdunningsstap GA van N. gonorrhoeae, wordt een vertekende waarde van 18,19 gevonden. Deze waarde wordt verklaard aan de hand van het feit dat ook de N. gonorrhoeae verdunning een T. vaginalis positief signaal levert. De blanco kolom leert dat GA, omwille van het porA target, in afwezigheid van het T. vaginalis target zelf verantwoordelijk is voor een T. vaginalis positief signaal met een Ct van 18,30. Telkens wanneer de N. gonorrhoeae verdunningen een sterker T. vaginalis signaal geven dan de T. vaginalis verdunningsreeks zelf, zal het uiteindelijke signaal

44

overstemd worden. Pas wanneer de Ct waarde van T. vaginalis onder de blanco waarde van de N. gonorrhoeae verdunning ligt, zal deze reële waarde ook effectief te zien zijn. In de specificiteitsvalidatie wordt onder andere een sequentieanalyse uitgevoerd op de geamplificeerde producten van verschillende positieve stalen. De sequenties die initieel bekomen worden met p506 zijn niet gerapporteerd omdat deze te veel gestoord zijn. Waarschijnlijk worden door de aanwezigheid van repeated sequences in het genetisch materiaal van het micro-organisme meerdere cycle sequencing producten gevormd. Op die manier kunnen geen uniforme sequentie van de target oligonucleotides met bijbehorende fluorescentie meer afgelezen worden, zodat chaotische sequenties op de data ouput te zien zijn. Gebruik makende van p509 wordt deze storing enorm gereduceerd. Het percentage overeenkomst met de T. vaginalis sequentie in de NCBI databank bedraagt nu meer dan 92%, wat de identificatie van de geamplificeerde producten als T. vaginalis PCR product in grote mate bevestigt. De lineariteit van de ontwikkelde RT-PCR kan gegarandeerd worden tot een met een 10 000x verdunning van het oorspronkelijk staal. Vanaf dan blijkt het T. vaginalis target niet langer opgenomen te worden. Numeriek gezien betekent dit dat de bovengrens van detectie rond een Ct waarde van 34 ligt. In een poging deze bovengrens naar boven te verplaatsen, werd de samenstelling van de gebruikte PP mix opnieuw herbekeken. De in de optimalisatie bekomen ‘300-100’ conditie werd even opzij geschoven en er werd opnieuw geëvalueerd met 200nM T. vaginalis probe in plaats van 100nM. Deze nieuwe condities gaven echter geen betere resultaten, waarop besloten werd om de oude condities te behouden. Aangezien alle geteste T. vaginalis positieve stalen lage Ct waardes niet groter dan 25 opleveren, lijkt het dan ook slechts een kleine beperking van de ontwikkelde RT-PCR methode te zijn. Wanneer positieve stalen gedurende een gegeven tijdsperiode meerdere malen geëvalueerd worden, bestaat de mogelijkheid dat er een variatie op de bekomen waarden zit. Deze variatie wordt mooi geïllustreerd in de test op houdbaarheid voor C. trachomatis en N. gonorrhoeae. Vooraleer de stalen geëxtraheerd werden (*1349, *9233 en *2214) 45

ondergingen ze een vortexstap. Nu is het mogelijk dat veel van het gewenste materiaal zich in de wisser zelf bevindt, dat tijdens het vortexen in variabele mate vrijkomt. Op die manier zou de grote variatie in detectie, namelijk een ΔCt van 2,57 en 4,13, verklaard kunnen worden voor C. trachomatis en N. gonorrhoeae stalen. T. vaginalis stalen blijken, wanneer bewaard op kamertemperatuur, erg onderhevig te zijn aan degradatie. Deze degradatie, duidelijk merkbaar in de test op houdbaarheid, dient in de toekomst zeker nog verder geanalyseerd te worden. Het verhogen van de testfrequentie van een staal kan een voor de hand liggende oplossing zijn. Besluitend kan wel geconcludeerd worden dat wanneer de stalen bewaard worden op kamertemperatuur, de degradatie significant kleiner is. Een aantal routinestalen worden beschikbaar gesteld waarop de gevalideerde 6plex RTPCR nog getest kan worden. Met behulp van deze testen kunnen extra inzichten verworven worden over de performantie en karakteristieken van de ontwikkelde RT-PCR methode. Een cervicale en vaginale swab, beiden positieve T. vaginalis routinestalen afkomstig van dezelfde patiënt, worden ook met de 6plex RT-PCR geëvalueerd om de rol van het soort staal op de detectie te bepalen. Resultaten tonen dat de manier van staalname geen grote invloed heeft op de detectie van T. vaginalis, aangezien de Ct waarden van de twee bepalingen met respectievelijk 21,23 en 23,46 niet ver uiteen liggen. Een N. gonorrhoeae positief routinestaal wordt ook positief bevonden met de 6plex RT-PCR (Ct omp 27,48 en Ct TRIVAG 25,41). Omwille van de dubbele detectie in het ‘TRIVAG’ kanaal, dient de Trichomonas single RT-PCR aangewend te worden zoals vroeger beschreven. In deze RT-PCR wordt geen significante amplificatie van een target teruggevonden, wat erop duid dat het bekomen ‘TRIVAG’ signaal afkomstig is van het porA target van N. gonorrhoeae. De OSOM® Trichomonas sneltest en de ontwikkelde 6plex RT-PCR blijken even goed te scoren op vlak van sensitiviteit. Drie positieve T. vaginalis stalen gaven drie positieve signalen bij beide methodes. De hoeveelheid aan beschikbare stalen, met name 3 gedurende een aantal maanden, is echter zeer gering zodat dit resultaat hoogst waarschijnlijk vertekend is. Analyse van meerdere positieve stalen zou een oplossing kunnen zijn om de verwachte hogere gevoeligheid van de RT-PCR methode op de voorgrond te doen treden. 46

6. CONCLUSIE Om T. vaginalis infecties zo accuraat mogelijk op te kunnen sporen beschrijft deze thesis de ontwikkeling van een nieuwe multiplex RT-PCR methode. Deze NAAT zorgt ervoor dat een verdacht staal naast detectie van T. vaginalis, ook geëvalueerd kan worden op de aanwezigheid van C. trachomatis en N. gonorrhoeae. Op die manier wordt een grote stap vooruit gezet in de diagnostiek van de T. vaginalis parasiet en SOA’s in het algemeen. Met behulp van verdunningsreeksen van aangemaakte positieve plasmidecontroles wordt een T. vaginalis RT-PCR geoptimaliseerd. Condities waarbij in de aangewende PP mix 300nM T. vaginalis primers en 100nM T. vaginalis probe aanwezig zijn blijken de meest belovende, waardoor met deze concentraties ook verder gewerkt wordt. De T. vaginalis RT-PCR wordt bij een reeds bestaande RT-PCR gevoegd die screent op de aanwezigheid van C. trachomatis en N. gonorrhoeae. Vergelijkingsstudies tussen deze nieuwe 6plex RT-PCR en reeds in gebruik genomen referentiemethoden kunnen geen opmerkbare verschillen aantonen, zodat de ontwikkelde methode verder getest en aan een grondige validatie onderworpen wordt. De 6plex RT-PCR ondergaat een specificiteitsvalidatie in drievoud, waarbij sequencing aantoonde dat de geamplificeerde producten wel degelijk het gewenste Trichomonas target betreffen. Een test op andere genitale organismen en een PCR-gelelektroforese van positieve T. vaginalis stalen leerde dat de methode effectief specifiek is voor het bewuste organisme. De lineariteit van de methode wordt bevestigd over een gebied van 1x tot 0,0001x verdunning, met een gerapporteerde R2 en efficiëntie die groter is dan de beoogde 0,99 en 80%. De precisie en de houdbaarheid voldoen, met uitzondering van twee stalen, aan de vooropgestelde limiet die een afwijking van maximaal 3 Ct waarden als grens stelt. De analytische accuraatheid van de ontwikkelde RT-PCR wordt bepaald aan de hand van 67 geanalyseerde stalen en bedraagt 100%. De methodevergelijking met de antigen sneltest levert geen merkbare verschillen op tussen de twee methoden. Drie positieve T. vaginalis stalen, bevestigd via RMO, zorgen zowel met de RT-PCR als met de sneltest voor een positief signaal. Na succesvol afronden van de validatie van de ontwikkelde 6plex RT-PCR wordt de methode opgenomen in de routine PCR analyses.

47

7. LITERATUURLIJST i

Anderson MR, Klink K, Cohrssen A. Evaluation of vaginal complaints. JAMA 2004; 291:1368.

ii

Jane R. Schwebke, Donald Burgess. Trichomoniasis. Clin Microbiol Rev. 2004 Oct; 17(4): 794– 803. iii

Jack D Sobel, MD. Trichomoniasis. Up To Date. Sep 2014.

iv

World Health Organization (WHO). Department of Reproductive Health and Research. WHO, 2012. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections – 2008. v

Centers for Disease Control and http://www.cdc.gov/dpdx/trichomoniasis/lifecycle. (13/02/2015).

Prevention:

CDC.

vi

Grodstein F, Goldman MB, Cramer DW. Relation of tubal infertility to history of sexually transmitted diseases. Am J Epdemiol 1993; 137:577. vii

Zhang ZF, Begg CB. Is Trichomonas vaginalis a cause of cervical neoplasia? Results from a combined analysis of 24 studies. Int J Epidemiol 1994; 23:682. viii

McClelland RS, Sangare L, Hassan WM, et al. Infection with Trichomonas vaginalis increases the risk of HIV-1 acquisition. J Infect Dis 2007; 195:698. ix

Silver BJ, Guy RJ, Kaldor JM, et al. Trichomonas vaginalis as a cause of perinatal morbidity: a systematic review and meta-analysis. Sex Transm Dis 2014; 41:369. x

Workowski KA, Berman S. Centers for Disease Control and Prevention: CDC. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2010. MMWR Recomm Rep 2010; 59:1. xi

Hobbs, M.M. and A.C. Seña. Modern diagnosis of Trichomonas vaginalis infection. Sex Transm Infect, 2013; 89:434-8 xii

T Crucitti, E Van Dyck, A Tehe, S Abdellati, B Vuylsteke, A Buve, and M Laga. Comparison of culture and different PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis in self collected vaginal swab specimens. Sex Transm Infect. 2003 Oct; 79(5): 393–398. xiii

Huppert, J.S., et al. Use of an immunochromatographic assay for rapid detection of Trichomonas vaginalis in vaginal specimens. J Clin Microbiol, 2005. 43(2): p. 684-7. xiv

L. Campbell, V. Woods, T. Lloyd, S. Elsayed and D. L. Church. Evaluation of the OSOM Trichomonas Rapid Test versus Wet Preparation Examination for Detection

48

of Trichomonas vaginalis. Vaginitis in Specimens from Women with a Low Prevalence of Infection. J Clin Microbiol. 2008 Oct; 46(10): 3467–3469. xv

Bijsluiter OSOM® Trichomonas Rapid Test (Sekisui Diagnostics, Tokio, Japan).

xvi

Coleman, J.S., C.A. Gaydos, and F. Witter. Trichomonas vaginalis vaginitis in obstetrics and gynecology practice: new concepts and controversies. Obstet Gynecol Surv, 2013; 68(1) p. 4350. xvii

Jeanne Marrazzo, MD, MPH. Clinical manifestations and diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Up To Date. Jul 2014. xviii

Peter A Leone, MD. Epidemiology and pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae infection. Up To Date. Jun 2014. xix

Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990;28(3):495-503. xx

History of PCR. http://www.scienceisart.com/A_PCR/PCRhistory_2.html (8/04/2015)

xxi

PCR Method. Environmental Information. http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/node/8912 (8/04/2015) xxii

DNA structure. Bio-Physics wiki. http://www.bio-physics.at/wiki/index.php?title=DNA_Structure (8/04/2015) xxiii

Real-time PCR: The TaqMan method (Davidson college) http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Pierce/realtimepcr.ht m (23/02/2015) xxiv

Mahony JB, Luinstra KE, Tyndall M, Sellors JW, Krepel J, Chernesky M. Multiplex PCR for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genitourinary specimens. J Clin Microbiol. 1995 Nov;33(11):3049-53. xxv

7500 dyes. 7500 and 7500 Fast RT-PCR Systems support, Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/global/technicalsupport/images/7500-Dye.jpg (08/04/2015) xxvi

Source Molecular. Real-time PCR quantification. http://www.sourcemolecular.com/microbial-source-tracking/quantification.html.(24/02/2015).

49

xxvii

Schirm J, Bos PA, Roozeboom-Roelfsema IK, Luijt DS, Möller LV. Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR. J Microbiol Methods. 2007 Feb;68(2):243-7. Epub 2006 Sep 26. xxviii

W G Weisburg, S M Barns, D A Pelletier, and D J Lane. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 1991 Jan; 173(2): 697–703. xxix

Hermann B. Update on the new variant of Chlamydia trachomatis: prevalence and diagnostics. Eurosurveillance 2008; Volume 13, issue 26. xxx

Koebnik R, Locher KP, Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. Jul 2000;37(2):239-53. xxxi

Genetic Home References. http://ghr.nlm.nih.gov/gene/POR. (13/03/2015) How do we sequence DNA? The University of Michigan DNA Sequencing Core. http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/sequencing.html. (13/03/2015) xxxii

xxxiii

Vankeerberghen Anne. Werkinstructies OLV Ziekenhuis Aalst: NucliSens easyMAG (WI.MB.5). Sep 2014. xxxiv

QIAquick® Gel Extraction kit Manual: Gelextraction protocol.

xxxv

TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing: User Guide

xxxvi

Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Technical Bulletin: Complete Protocol.

xxxvii

Vankeerberghen Anne. Werkinstructies OLV Ziekenhuis Aalst:ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (WI.MB.12). Jan 2015 xxxviii

Vaeyens Freya. Werkinstructies elektroforesetoestel.(WI.MB.15). Apr 2013

OLV

Ziekenhuis

Aalst:

Mupid-One

xxxix

Vankeerberghen Anne. Werkinstructies OLV Ziekenhuis Aalst: CEQ 8000 Genetic Analytic System (WI.MB.1). Aug 2011 xl

NomenSoft RIZIV: Nomenclatuur van de geneeskundige verstrekkingen: Hoofdstuk V. Speciale technische geneeskundige verstrekkingen - Afdeling 11. Klinische biologie - Artikel. 24: § 1. Worden beschouwd als verstrekkingen waarvoor de bekwaming van geneesheer, specialist voor klinische biologie (P), vereist is - 5/ MICROBIOLOGIE (2010)

50

LECTURES UGENT 1. Research on the causes of human cancer and scientific strategies for cancer prevention and control (Dr. Inge Huybrechts) In general terms, cancer can’t be referred to as just one type of disease. In fact, a lot of different cancers have been identified, all having their specific characteristics. Cancer can be defined as an uncontrollable cell proliferation, caused by external events such as radiation or chemical exposure or genetic errors such as natural mutations. Eventually, the growing tumor can invade surrounding tissues or even worse, spread throughout the body using the bloodstream or lymphatic system. It is the leading cause of death worldwide, even outnumbering the death counts caused by malaria, TBV and HIV/AIDS combined. Lung, prostate and colorectal cancers are listed as the most common cancers in men, whereas breast, colorectum, cervix uterus and lung cancer are most common in women. When the major cancer risk factors are analysed, it is important to make a difference between genetic pre-disposition and environmental exposure. It is known that risk factors as ‘tobacco use’ and ‘obesity ‘are responsible for over 50% of the deaths from cancer. Data have also shown that there is a higher risk of getting cancer in less developed countries. In order to obtain and maintain awareness of the problem that is cancer, several organizations, even from governmental point of view, have been founded. The International Agency for Research on Cancer (IARC) is as research affiliate part of the World Health Organization (WHO) and it investigates mainly the causes of cancer. They also administer monographs, the IARC Monographs, in which is stated how strong the scientific evidence is for a cancer association. It is commonly referred as the encyclopaedia of carcinogens. All studies and summaries on that specific agent or topic are critically reviewed by working group members, specialists, representatives of (inter)national health agencies and observers. In order to reduce the lifetime risk of developing cancer significantly, scientific strategies for cancer prevention and control (e.g. NME cohorts) should be considered as very helpful. Maintaining a healthy weight, implementing a healthy diet and having enough exercise therefore are the primary goals in order to acquire that aforementioned objective. 2. The evolution of microbiology in cystic fibrosis (Prof. John LiPuma) Cystic fibrosis (CF) is caused by an autosomal mutation in both copies of the gene that is responsible for the production of a protein that acts as a regulator in transmembrane transport. The lungs are typically most affected. Common symptoms are difficulty in breathing and an excessive sputum production, besides poor growth, male infertility and clubbing of the fingers. Currently, there is no cure for CF. The often established lung infections can be treated with antibiotics, however the microbiology in cystic fibrosis is more complex than a normal acquired infection. The evolution of microbiology in CF can be summarized in three major eras. 1

In the pre-Pseudomonas era, studies showed an association between CF and Staphylococcus aureus. In addition, a lot of antibiotics were discovered and developed but also overused in order to treat the CF patients with lung infections. However, since the life expectancy of patients with CF was very poor in history, science managed to create a ‘new species’: adolescents and adults with CF. Later, a more damaging bacterium was found correlated to CF, starting a new era: the Pseudomonas aeruginosa era. As a matter of fact, P. aeruginosa as such is not that good in invading the lung. However the damaged lungs of a CF patient can easily be invaded. Microbiologists identified a mucoid variant, which is responsible for a much shorter life expectancy in comparison with other pathogens. Also an inter-spread of virulent epidemical clones is discovered, so susceptibility can be questioned. In the Pseudomonas 2.0 era, scientists try to take a closer look at bacterial communities in the lung. Because of the interbacterial quorum sensing, the virulence sometimes is unpredictable. Also, within a species there is a possibility of difference in phenotype, resulting in even more diversity. Today, research focusses not only on the structure of the bacterial communities, also the activity of the communities are evaluated during the several stages of sickness of the patient. 3. Zijn managementvaardigheden in farmaceutische zorg belangrijk voor de toekomst? Een kijk vanuit NederBelgisch perspectief (Apr. Hendrik de Rocker)

De laatste jaren is het verstrekken van farmaceutische zorg een belangrijke aanvulling geworden op het takenpakket van de huidige officina-apotheker. Deze evolutie uit zich op meerdere vlakken. Naast een shift in focus van geneesmiddel naar patiënt, moet de apotheker ook rekening houden met de financiële draagkracht van de maatschappij voor de gezondheidszorg. In essentie betekent dit preventie bieden waar mogelijk, zodat behandelen vermeden kan worden. Vanuit Nederland blijkt dat samenwerking tussen collega-apothekers en een geïntegreerde visie eveneens een gunstige invloed teweeg kan brengen. Deze zogenaamde geïntegreerde farmaceutische zorg (GFZ) zou verkeerd medicijngebruik moeten voorkomen, de effectiviteit moeten verhogen en de medicijnkosten moeten verlagen. Managing van de zorg, en meer in detail managing van de medicatie, maakt het mogelijk een standaard werkwijze toe te passen waarin de medicatie voor elke patiënt als geschikt, effectief en veilig beschouwd kan worden. Van medicatiemanagement is het slechts een kleine stap naar farmaceutische patiëntenzorg (FPZ). Hier wordt gestreefd naar het optimaal geneesmiddelengebruik van de individuele patiënt, met als doel de kwaliteit van het leven te verbeteren. De bovenvermelde GFZ is hier een praktisch voorbeeld van. Besluitend kan gezegd worden dat de apotheker, naast zijn verantwoordelijkheid als verstrekker van farmaceutische zorg, zich ook een functie moet aanmeten in het managen en beperken van de ontwikkeling van chronische ziekten op de populatie. De apotheker is de enige, geschikte persoon die dit veelvoud aan taken op een optimale manier kan uitvoeren. 2

3

4

5

6