FACULTEIT TOEGEPASTE WETENSCHAPPEN VAKGROEP ELEKTRONICA EN INFORMATIESYSTEMEN Voorzitter: prof. dr. ir. J. Van Campenhout _________________ Academiejaar 2004-2005
Ontwikkeling van een visualisatietool als uitbreiding van een webgebaseerde PCR primerdatabank door
ir. Jelle Verspurten
Promotor: prof. dr. ir. P. De Neve Studiebegeleiders: ir. F. Pattyn en dr. ir. J. Vandesompele
Scriptie ingediend tot het behalen van de academische graad van
MASTER IN DE TOEGEPASTE INFORMATICA
FACULTEIT TOEGEPASTE WETENSCHAPPEN VAKGROEP ELEKTRONICA EN INFORMATIESYSTEMEN Voorzitter: prof. dr. ir. J. Van Campenhout _________________ Academiejaar 2004-2005
Ontwikkeling van een visualisatietool als uitbreiding van een webgebaseerde PCR primerdatabank door
ir. Jelle Verspurten
Promotor: prof. dr. ir. P. De Neve Studiebegeleiders: ir. F. Pattyn en dr. ir. J. Vandesompele
Scriptie ingediend tot het behalen van de academische graad van
MASTER IN DE TOEGEPASTE INFORMATICA
Woord vooraf
Woord vooraf Een aanvullend jaar, nieuwe faculteit, nieuwe proffen, nieuwe vrienden en natuurlijk een nieuwe thesis. Het maken van zo een thesis vergt veel van een student, maar zou nog veel moeilijker te verwezenlijken zijn zonder de hulp en steun van een aantal mensen. Via dit voorwoord zou ik dan ook graag deze mensen willen bedanken. Vooreerst zou ik professor De Neve willen bedanken voor de kans die u mij gaf om onder uw hoede te mogen werken en de andere leden van de jury voor uw interesse en het lezen van m’n thesis. Grote dank gaat ook uit naar de mensen van het Centrum voor Medische Genetica die mij hebben bijgestaan bij het vele werk en altijd klaar stonden voor het geven van goede raad. Meer in het bijzonder Filip, Jo en Piet die op elke vergadering mij steeds overlaadden met al hun wensen en ideeën, maar vervolgens al even snel met oplossingen en hints kwamen aandraven. Ik ben er van overtuigd dat het mooie resultaat zeer zeker een gevolg is van jullie gedrevenheid en motivatie. Tot slot zou ik ook mijn ouders willen bedanken om mij de kans te geven om me, na mijn eerste opleiding, nog een jaartje achter de schoolbanken te laten plaatsnemen en deze aanvullende studie te laten volgen. Het was een interessant en leerrijk jaar waarbij ik ontzettend veel heb bijgeleerd. __________________________ De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and the promoters give permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis. Gent, Datum ir. J. Verspurten
Overzicht
Overzicht Ontwikkeling van een visualisatietool als uitbreiding van een webgebaseerde PCR primerdatabank door ir. Jelle Verspurten __________ Scriptie ingediend tot het behalen van de academische graad van Master in de Toegepaste Informatica Academiejaar 2004-2005 __________ Promotor: prof. dr. ir. P. De Neve Studiebegeleiders: ir. F. Pattyn en dr. ir. J. Vandesompele __________ Universiteit Gent Faculteit Toegepaste Wetenschappen Vakgroep Elektronica en informatiesystemen Voorzitter: prof. dr. ir. J. Van Campenhout
Samenvatting: In het Centrum voor Medische Genetica werd in 2002 een publieke databankapplicatie opgestart voor het bewaren en het opvragen van gevalideerde real-time PCR primer- en probesequenties. Als uitbreiding hierop werd via Scalable Vector Graphics (SVG) een visualisatietool ontwikkeld om de primers voor te stellen t.o.v. de transcripten waarop ze aligneren. Het zoeken naar de posities van de primers in de sequentie van het transcript is geautomatiseerd en de RTPrimerDB databank werd met de nieuwe informatie opgevuld. Een aantal nieuwe pagina’s werden aangemaakt op de website om een overzicht te geven van alle geninformatie en de gemaakte figuren te presenteren.
Trefwoorden: SVG, PHP, oracle, primerdatabank
Inhoudsopgave
Inhoudsopgave Woord vooraf Overzicht Inhoudsopgave Lijst met afkortingen........................................................................................ 1 Hoofdstuk 1: Inleiding ..................................................................................... 2 Hoofdstuk 2: Achtergrond............................................................................... 3 2.1 Inleiding .................................................................................................................3 2.2 DNA .......................................................................................................................3 2.3 Genstructuur ...........................................................................................................3 2.4 PCR ........................................................................................................................5 2.4.1 Algemeen ........................................................................................................5 2.4.2 Real-time PCR (Pattyn F., 2002) .....................................................................6
Hoofdstuk 3: Visualisatie met Scalable Vector Graphics............................... 7 3.1 Inleiding .................................................................................................................7 3.1.1 Doel ................................................................................................................7 3.1.2 Wat is SVG? ....................................................................................................7 3.1.3 Korte bespreking SVG structuur......................................................................7 3.1.4 SVG en webpagina’s .......................................................................................9 3.1.5 SVG en PHP....................................................................................................9 3.2 Overzichtsfiguur transcript (svggene.php, zie appendix I.a)...................................10 3.2.1 Doel ..............................................................................................................10 3.2.2 Data ophalen.................................................................................................10 3.2.3 Instellen parameters......................................................................................11 3.2.4 Schrijven van de SVG figuur..........................................................................12 3.2.5 Voorbeeld: MYCN, transcript ENST00000281043.........................................22 3.3 Overzichtsfiguur amplicon (primer.php, zie appendix I.b).....................................23 3.3.1 Doel ..............................................................................................................23 3.3.2 Data ophalen.................................................................................................23 3.3.3 Instellen parameters......................................................................................23 3.3.4 Schrijven van de SVG figuur..........................................................................24 3.3.5 Voorbeeld: MYCN.........................................................................................29
Hoofdstuk 4: RTPrimerDB (website)............................................................ 30 4.1 Inleiding ...............................................................................................................30 4.2 Overzichtspagina van een assay (assay_report.php) ..............................................31 4.2.1 Inleiding........................................................................................................31 4.2.2 Invoegen figuur .............................................................................................31 4.2.3 Andere aanpassingen ....................................................................................33 4.3 Overzichtspagina van een gen (gene_report.php) ..................................................36 4.3.1 Inleiding........................................................................................................36 4.3.2 Invoegen figuur .............................................................................................36 4.3.3 Andere eigenschappen gene_report.php ........................................................37
Inhoudsopgave
Hoofdstuk 5: Databankstructuur .................................................................. 40 5.1 Inleiding ...............................................................................................................40 5.2 Primerdatabank .....................................................................................................40 5.2.1 Inleiding........................................................................................................40 5.2.2 Alignering .....................................................................................................40 5.2.3 Databankstructuur ........................................................................................44 5.3 Bespreking overige tabellen ..................................................................................50 5.3.1 Informatie over gen en transcript (zie appendices IV.b en IV.c) .....................50 5.3.2 Informatie over de exonen (zie appendices IV.d)............................................50 5.3.3 Informatie over de SNP’s (zie appendices IV.e) .............................................50 5.3.4 Informatie over de proteïne domeinen (zie appendices IV.f en IV.g)...............51
Hoofdstuk 6: Besluit....................................................................................... 52 Appendices...................................................................................................... 53 Referenties ...................................................................................................... 75
Lijst met afkortingen
Lijst met afkortingen A
Adenine
C
Cytosine
CSS
Cascading Style Sheet
DNA
Deoxyribo Nucleic Acid
G
Guanine
GXP
Gene Expression Quantification/Detection
HTML Hypertext Markup Language mRNA messenger RNA NCBI
National Center for Biotechnology Information
PCR
Polymerase Chain Reaction
PHP
PHP Hypertext Preprocessor
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
SVG
Scalable Vector Graphics
T
Thymine
1
Inleiding
Hoofdstuk 1: Inleiding In het Centrum voor Medische Genetica van het UZ Gent wordt genetisch onderzoek verricht naar genetische afwijkingen bij de mens, verantwoordelijk voor erfelijke ziekten of kankers. Het grootste deel van de gebruikte labo-technieken is gebaseerd op het gebruik van PCR (meer in het bijzonder real-time PCR), een moleculair biologische methode om kleine stukjes DNA te kopiëren en kwantificeren. Deze techniek en andere genetische termen worden toegelicht in het tweede hoofdstuk. Het volgende hoofdstuk bevat de informatie met betrekking tot het visualiseren van de primers op een transcript. Hiertoe wordt gebruik gemaakt van Scalable Vector Graphics (SVG), een taal die het mogelijk maakt om afbeeldingen samen te stellen via het meegeven van coördinaten. De algemene werking wordt kort besproken, waarna uitgelegd wordt hoe de twee overzichtsfiguren werden samengesteld. De informatie hiertoe werd immers gehaald uit de eigen RTPrimerDB en andere op het Web beschikbare databanken. In hoofdstuk 4 staat vervolgens geschreven hoe de reeds bestaande website wordt aangepast om de gemaakte figuren voor te stellen. Een overzichtspagina per gen wordt aangemaakt waarbij naast de figuur ook een tabel komt met alle assay-informatie. Ook een aantal andere veranderingen werden uitgevoerd en zijn besproken. Hoofdstuk 5 tenslotte, bevat alle informatie met betrekking tot de structuur en het opvullen van de databanken. De posities van de primers, ingegeven door de submitters van de RTPrimerDB website, zijn immers niet gekend en dienen te worden berekend. Hiertoe wordt een aligneringsscript geschreven dat rekening houdt met invoerfouten en omwisselingen. Met deze posities worden ook een aantal andere waarden uitgerekend en weggeschreven in enkele nieuwe tabellen in de RTPrimerDB databank om het gebruik voor het visualiseren te vereenvoudigen.
2
Achtergrond
Hoofdstuk 2: Achtergrond 2.1 Inleiding Het Centrum voor Medische Genetica van het UZ Gent staat in voor het toegepast en fundamenteel genetisch onderzoek naar genetische afwijkingen bij de mens, die verantwoordelijk zijn voor erfelijke ziekten of kankers. Via zowel klinische als moleculaire methoden kunnen genetische afwijkingen worden opgespoord. Een groot deel van de labotechnieken is gebaseerd op het gebruik van PCR (meer in het bijzonder real-time PCR), een krachtige moleculair biologische methode om kleine stukjes DNA te kopiëren en kwantificeren (Pattyn F., 2002). De achtergrond van deze techniek wordt beknopt uitgelegd, om verdere zaken in deze scriptie te kunnen begrijpen. Enkele andere genetische termen worden eveneens besproken.
2.2 DNA DNA is een afkorting voor Deoxyribo Nucleic Acid (desoxyribonucleïnezuur), een voor het leven zeer belangrijke chemische verbinding. In DNA staat namelijk de complete erfelijke informatie van het organisme. DNA bevindt zich in de celkern waarvan bijna iedere lichaamscel er één heeft. Het DNA bestaat, naast de ruggengraat van ribose (een suiker) die de stukjes bij elkaar houdt, slechts uit vier verschillende bouwstenen (nucleotiden): Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) en Guanine (G), vier verschillende zogenaamde basen die meestal worden aangeduid met hun eerste letter. De A in een streng past tegenover de T in de tegenoverliggende streng en de G past tegenover de C. De twee strengen die precies op elkaar passen en het DNA-molecule vormen, worden complementaire strengen genoemd. Deze strengen samen vormen een dubbele helix met de vorm van een spiraal of wenteltrap (Figuur 1).
2.3 Genstructuur Een gen is een streng van genetisch materiaal (DNA) dat de informatie bevat voor het uitvoeren van bepaalde functies zoals het aanmaken van een specifiek eiwit. Het bestaat in hoofdzaak uit intronen en exonen. De intronen zijn stukjes DNA die weggeknipt worden na het afschrijven van het gen. Het gevormde mRNA (messenger RNA) bestaat enkel uit exonen
3
Achtergrond en bevat nu de code voor de vertaling in een eiwit (Figuur 2). Een gen kan verschillende transcripten hebben voor het aanmaken van verschillende eiwitten. Een andere belangrijke genetische term in het kader van deze scriptie is een SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Dit is een variatie die optreedt in een DNA-sequentie als één enkel nucleotide (base) veranderd is. Die set van variaties zorgen voor de verscheidenheid aan individuen binnen een organisme.
Figuur 1: DNA-stuctuur (bron: http://whyfiles.org/075genome/)
Figuur 2: Transcriptie van genomisch DNA naar mRNA gevolgd door translatie in een eiwit (bron: http://laxmi.nuc.ucla.edu:8888/Libraries/Images/MOLECULAR_BIOLOGY/gene_structure.gif)
4
Achtergrond
2.4 PCR 2.4.1 Algemeen De polymerase-kettingreactie, vaak afgekort tot PCR (Polymerase Chain Reaction), is een manier om uit zeer kleine hoeveelheden DNA (enkele moleculen) specifiek een of meer gedeeltes te vermenigvuldigen tot er genoeg van is om het te analyseren. PCR gebruikt een natuurlijk eiwit dat ervoor zorgt dat een DNA streng met een zeer hoge kwaliteit wordt gemaakt (Verspurten J., 2004). Twee zaken zijn dan echter zeker nodig om dit mogelijk te maken: •
In de eerste plaats dient er een DNA streng te zijn om te vermenigvuldigen, als het ware een voorbeeld-DNA of een sjabloon (template).
•
Ten tweede is het nodig om twee kleine DNA strengen te hebben die het complement zijn van een bepaald deel van het sjabloon, zodat deze kunnen gebruikt worden als startplaats voor de PCR reactie. Deze DNA sequenties noemt men primers. De ene noemt men de forward primer, de andere de reverse primer. Het verloop van de reactie kan worden uitgelegd aan de hand van een aantal stappen
die in elke cyclus worden doorlopen. •
Stap 1: denaturatie Hierbij worden de strengen van het oorspronkelijke DNA (sjabloon) uit elkaar
gehaald, door te verwarmen tot de denaturatietemperatuur (typisch 90°C).
•
Stap 2: annealing Dit is de stap waarin de kleine stukjes DNA (de primers) op juiste plaats (daar waar ze
complementair zijn) zich aanhechten aan de doelwitsequentie. Dit gebeurt bij de annealing temperatuur (bvb. 50-60°C)
5
Achtergrond •
Stap 3: elongatie Vervolgens wordt met behulp van een polymerase-enzym de streng gekopieerd, te
beginnen vanaf de primer (typisch bij 72°C). Een polymerase is een enzym dat het aanmaken van nieuwe basen katalyseert, een voorbeeld is Taq-polymerase.
Door het telkens herhalen van deze stappen zal na een aantal cycli een héél grote hoeveelheid DNA-fragmenten ontstaan. Deze fragmenten (ook wel amplicons genoemd) beginnen dus bij de forward primer en eindigen bij de reverse primer (bron figuren: http://www.patho.unibas.ch/molpath/english/diagmethoden/PCR/method.htm).
2.4.2 Real-time PCR (Pattyn F., 2002) Real-time PCR is een techniek om met behulp van PCR het kwantificeren en detecteren van DNA en RNA te bewerkstelligen. Tijdens elke cyclus wordt de amplificatie gevolgd door de toename te meten van de fluorescentie-intensiteit van intercalerende stoffen of sequentiespecifieke probes. Intercalerende stoffen (zoals SYBR green) zijn kleurstoffen die fluorescent worden wanneer zij binden met het dubbelstrengig DNA. Probes zijn (net als primers) enkelstrengige DNA moleculen met een specifieke basensequentie die complementair is aan een deel van het fragment. De probes dragen een fluorescente molecule om na hybridisatie (dit is het aanhechten van de probes aan de streng) te worden aangetoond. Er zijn drie verschillende soorten fluorescentieprobes die regelmatig gebruikt worden, nl. hybridisatie probes (ook FRET probes genoemd), hydrolisatie probes (TaqMan probes) en molecular beacons.
6
Visualisatie met Scalable Vector Graphics
Hoofdstuk 3: Visualisatie met Scalable Vector Graphics 3.1 Inleiding 3.1.1 Doel Het belangrijkste doel van de scriptie is het visualiseren van de verschillende primers ten opzichte van het bijhorende transcript. Hiertoe diende eerst alle informatie te worden verzameld uit de eigen RTPrimerDB databank, maar eveneens uit andere databanken, beschikbaar op het Internet (vnl. NCBI, National Center for Biotechnology Information en Ensembl). Het afhalen en verwerken van de informatie wordt op een andere plaats in dit eindwerk besproken. De keuze werd gemaakt om voor de visualisatie te werken met Scalable Vector Graphics (SVG).
3.1.2 Wat is SVG? SVG staat voor Scalable Vector Graphics. Het is een taal om tweedimensionale tekeningen en grafische toepassingen in XML te beschrijven. SVG, een volledig open standaard, aanbevolen en ontwikkeld door het World Wide Web Consortium (W3C), biedt een grote waaier aan mogelijkheden op vlak van interactiviteit zoals het reageren op user events (bijvoorbeeld
,
,…). Omdat er gebruik gemaakt wordt van
vectortekenen is er geen kwaliteitsverlies bij het aanpassen van de grootte. Eén van de grootste voordelen t.o.v. de grootste concurrent (FLASH), is de compatibiliteit met andere standaarden (vb. XSL en DOM). FLASH steunt op een technologie die niet open bron is. Om de SVG documenten te kunnen afbeelden dient de client momenteel nog een plugin te installeren (beschikbaar via Adobe of Corel), maar in de toekomst zouden SVG interpreters standaard in de browsers worden ingebouwd.
3.1.3 Korte bespreking SVG structuur Het principe van SVG bestaat erin dat al de af te beelden elementen worden beschreven via coördinaten. Op deze manier kunnen lijnen, rechthoeken (en andere geometrische vormen), maar ook tekst worden weergegeven in een figuur. Hierna volgen enkele voorbeelden van welke objecten getekend kunnen worden, waarbij de nadruk vooral wordt gelegd op de in deze scriptie van toepassing zijnde elementen.
7
Visualisatie met Scalable Vector Graphics 3.1.3.1
Algemene structuur SVG file Bovenaan elke SVG-file staat de XML-versie en de documentinformatie vermeld. De
Public Identifier (PUBLIC "-//W3C//DTD SVG 1.0//EN") en de System Identifier (http://www.w3.org/Graphics/SVG/DTD/svg10.dtd) worden meegegeven. De start van de SVG-figuur op zich wordt aangeduid door de
tag, waarin
verschillende attributen dienen te worden gedefinieerd. Zo worden de hoogte en de breedte meegegeven, alsook de coördinaten van de viewbox, dit is het deel van de figuur dat initieel zal worden getoond. Lijnen, teksten,… die samen een groep gerelateerde elementen vormen kunnen worden bijeengezet binnenin een containerelement via de
tags. Aan een groep elementen,
evenals aan individuele objecten op zich, kan een naam worden meegegeven via een attribuut. Dit kan allerlei doeleinden hebben met betrekking tot animaties en hergebruik. Samengevat zal de algemene structuur ongeveer eruit zien als onderstaande code. !"#$%& 2
%'()*"
34++555 55 2 7 3 2 4
++,-"++ #
34++555 5+8 2 34++555 5-
3
./0
+#6+./0+ # + 2 2 3
9
:
++&1 5(
7
+ +
+
9
+ +
3.1.3.2
Lijnen in SVG Het ligt voor de hand dat het tekenen van lijnen een belangrijk aspect vormt van de
figuur. Een lijn wordt in SVG bepaald door een aantal parameters. Vooreerst dient de positie te worden bepaald. Dit gebeurt met behulp van 4 coördinaten: x1, y1 (beginpunt), x2 en y2 (eindpunt). Ook de dikte (
2)
5
en de kleur (
) van de lijn wordt meegegeven
als attribuut. Een bijkomende mogelijkheid is het tekenen van stippellijnen (
2
:)
waarbij de lengte van achtereenvolgens de lijntjes en de gaatjes worden meegegeven. Het volgende stukje code levert de onderstaande figuur op (Figuur 3). :
4
:
4
:
49
;
5
248
:
8
:8
8
+ ;
5
24-
:
8
:8
-
+ ;
5
24
5
24 ;
8
:
8
<
:8
+ : :
8
8
<
4 :8
:; 8 +
2
:48=8
8
8
Visualisatie met Scalable Vector Graphics
Figuur 3: Voorbeeld van lijnen in SVG
3.1.3.3
Tekst in SVG Het weergeven van tekst in SVG is mogelijk door deze mee te geven tussen de
tags. Hierbij wordt via x,y coördinaten bepaald waar het schrijven begint en kan via allerlei attributen de tekstkleur, font en grootte worden gewijzigd. Zoals verder wordt vermeld, zal de opmaak van de tekst worden beschreven in een aparte Cascading Style Sheet (CSS, zie 3.2.4.2).
3.1.4 SVG en webpagina’s Er zijn verschillende manieren volgens welke de inhoud van een SVG file kan worden getoond in webpagina’s. De twee voornaamste worden hier kort besproken. Een stand-alone SVG webpagina, is het voorstellen van het document in een webbrowser als een op zichzelf bestaande pagina. ‘Embedding’ is het integreren van de figuur in een andere pagina (HTML, PHP,…). Deze tweede methode wordt meer in detail besproken in 4.2.2.
3.1.5 SVG en PHP De mogelijkheid bestaat om een SVG-bestand te creëren waarbij de output volledig afhangt van de waarden opgehaald uit een databank. Dit kan “on-the-fly” gebeuren, aangezien dit snel genoeg gebeurt. Hierbij wordt het schrijven van de SVG stap voor stap gedaan en kan de PHP functionaliteit gebruikt worden om berekeningen te maken, lussen te doorlopen en parameters te gebruiken. In de volgende paragrafen wordt de opbouw van de SVG figuren met behulp van PHP en informatie uit de databank meer in detail besproken.
9
Visualisatie met Scalable Vector Graphics
3.2 Overzichtsfiguur transcript (svggene.php, zie appendix I.a) 3.2.1 Doel Het doel van de figuur is een overzicht te geven van alle primers, peptidedomeinen en SNP’s in relatie tot een transcript. Dit transcript bestaat uit verschillende exonen, waarvan een deel coderend en een deel niet coderend is (enkel het coderende deel wordt vertaald in een functioneel eiwit). De data (posities, lengtes, sequenties,…) wordt gehaald uit een aantal tabellen van een Oracle databank (inhoud zie Hoofdstuk 4:). De figuur wordt gemaakt per transcript en is ingebed in het gene_report (zie 4.3.2).
3.2.2 Data ophalen Om de juiste data op te halen uit de databank, wordt bovenaan het PHP script de ‘query’ gedaan. De
>
(een id die de figuur uniek maakt) wordt meegegeven via
3
de methode GET. Het ophalen gebeurt telkens volgens dezelfde manier, bijvoorbeeld voor de transcriptinformatie: >?
: G>
>
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D#6E1."6*%# ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G ; !"*3
H>
H>
I;
!"* > !"*J
5
!"*A H>
2.
= >?
:I;
H>
=>
I;
I;
Hierbij wordt de informatie weggeschreven in een array (> aantal rijen heeft (>
5
) die een
). De volgende queries zijn steeds gelijkaardig en halen elk een
specifiek deel van de databank op, nodig voor het tekenen van de figuur. >?
:
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D*
:
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D&K!1 ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D*
:
3 G !6 &6 ($ 6E1L ; .&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D0&1&
G>
3
>? G> >?
G !6 &6 ($ EB%)*"!1D(&0*1 ;
C/6.%'6# &1.D !BE*1D/*&, &1.D%6!#D* G> >?
: G>
De >
3
>3
&1.D%6!#D*
= C/6.%'6# &1.D#6E1."6*%#
&1.D0&1&D*
=
&1.D0&1&D*
&1.D#6E1."6*%#D*
3 G ; .&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D.1% ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D*
informatie ,
,F&6&
G !6 &6 ($ .1%D#6E1."6*%#D.#E6# ;
wordt en
weggeschreven >
3
in
respectievelijk
>3
,
. Tot slot wordt een controle uitgevoerd om
connectieproblemen te melden en wordt de connectie gesloten. J H>
J
I M
10
Visualisatie met Scalable Vector Graphics 2 2
3
9
9
J N
!"*)
3
323N
9
!JJH>
+
9
+A!1#
:
9 +(
0 +%
;
I;
; O !"*)
!JJH>
I;
3.2.3 Instellen parameters Alvorens van start te gaan met het tekenen van de SVG, worden allerlei waarden ingesteld die later gebruikt kunnen worden. De variabele
>
2
2
(de hoogte van het
beeld) werd meegegeven met de methode GET (de reden wordt uitgelegd in 4.2.2), >
5
2
(de breedte van het beeld) wordt vast ingesteld op 800 (d.i. pixels). De lijnen (met name het transcript) zullen lopen van
tot
>9
>
(krijgen vaste waarden mee), en samen met de
lengte van het transcript kan zo de breedte van 1 base worden berekend. >9 >
; P
> >9
;
2 > H>
QG" 1ED)&10#FGRQ R; I+> 2;
>9
Vervolgens worden de waarden van de verschillende “J “
5
2
S
” en de verschillende
” in variabelen gestoken zodat ze later bij het definiëren van de stijlen
gemakkelijk kunnen gebruikt worden. Tenslotte worden de y-waarden (de hoogtes) bepaald waarop elke lijn moet worden getekend. Hierbij is
>
de hoogte van 1 lijn (20) en wordt de hoogste primerlijn op de
T
eerste lijn geschreven. Al de andere y-waarden worden berekend van onder naar boven, telkens ten opzichte van de onderliggende rij (met
>
J :, >
:, >
3:, >
:
en
>3
:,.de
hoogtes van respectievelijk de infolijn, de schaal, het transcript, de SNP-posities en de peptidedomeinen). Bij
:,
3:,
:
en 3
de verticale streepjes vastgelegd. Tot slot is >3 >
T
3: >
>3
: >
>
J : >
>
: >
:
de hoogte van de onderste primerlijn.
T +8; T ; 2
2
J : 8@>
:9 >
> : > 3: >
>
werden ook de waarden voor het tekenen van
8 ;
>
>
:
:U>
>
T ;
T ; T +7;
> :9U> T ; : > T ;
>
3:
>
3:U>
T + ;
>
3:9 >
3: >
T + ;
: > 3: > T ; > : > :U> T +7; >
:9 >
: >
T +7;
11
Visualisatie met Scalable Vector Graphics >3
: >
: >
T ;
>3
:
>3
:U>
>3
:9 >3
: >
>3
:
>3
: >
T +7; T +7; T ;
3.2.4 Schrijven van de SVG figuur 3.2.4.1
Hoofding en informatie Bovenaan de PHP pagina wordt de nodige informatie neergeschreven en de
tag
bevat naast de gebruikelijke attributen ook de hoogte en de breedte van zowel de SVG als de viewbox. Deze waarden worden meegegeven via de eerder gedeclareerde variabelen. De XML-header wordt geprint via PHP, omdat er anders een conflict zou optreden met de symbolen die het onderscheid tussen PHP en SVG aanduiden. 323 2
H " 2 2
:3 4 !"#$%&
N 2
34++555 52
2
2 >
3.2.4.2
> 2
+
N N %'()*" N
U
I;
N ++,-"++ #
+#6+./0+ # +
34++555 5+8 2 2 ; 3
N
+ 5(
5
N
;
;
2 >
> 5
5 2; 2;
3
2 ;
Definiëring stijlen De verschillende stijlen zijn gedefinieerd tussen
J
N N ++&1N
./0
tags en
J
tags. Het
:
element is een container element voor alle elementen naar waar gerefereerd wordt in
de rest van de SVG, het
:
De informatie wordt in een
element laat toe om een stylesheet te embedden in de SVG. " E#E
sectie gezet omdat de vreemde karakters dan worden
genegeerd door de parser. De attributen zijn dezelfde als bij HTML. Er zijn 2 stijlen voor het beschrijven van de lettertypes. De algemene stijl is weergeven van tekst. Het attribuut om de tekst duidelijk leesbaar te maken. Bij
J
, deze wordt steeds gebruikt voor het
is ingesteld op 3
is het
2
3
S )
op
:,
9
dit is
gezet, om zo
het primerid te centreren boven het amplicon. Ook de verschillende lijnen worden in stijlen gedefinieerd. De ingesteld m.b.v. de corresponderende variabele. Het attribuut
5 34
2
wordt bij
enkele stijlen zorgt ervoor dat de lijnen op het einde worden afgerond en geen rechthoekig uitzicht hebben. J :
:3
+
Q" E#EQ
12
Visualisatie met Scalable Vector Graphics J J
MJ
5
:4GE 3
J
2 4
G;
M
2
4V8
;
49
3 M 34
+
J
3.2.4.3
5
24 5
?
; ;
49
24
5
4 49 49
;
24
;
24
;
;J
> > > >
9
:;O
O
;
O O
24 ; 3;
S )
O
; O >3 ;
5 24 24
5 2
>3
>3 9; >J 24
; 5 5
;
:;O
>3
4 3 24
5
;
M M 3 M
RR :
5
4 :; 4V ""<<;
;J
;
<
J 3
;
9
S 4
4
4
>J
S )
;J
3 9 M M M
S 4 4 3
5
M
+
;J
G; MJ
:4GE 3
2 4
>
;
; O 3;
O 34
O
;
:48=8O
Javascript nodig voor het tonen van de info Omdat met een mouseover-functie wordt gewerkt, waarbij informatie wordt
weergegeven (zie o.a.3.2.4.4) over het element, is er een klein javascript in de SVG toegevoegd. Het bestaat uit twee kleine functies. De eerste functie
* J H
I,
wordt in
de SVG opgeroepen op het moment dat de muis zich over een bepaalde lijn bevindt. Het element met id “Info” (zie 3.2.4.9) wordt gezocht en de meegegeven tekst wordt erin geplaatst. De functie
* J HI
zorgt ervoor dat bij het weghalen van de muis van het
gebied de “info” tekst opnieuw wordt leeggemaakt. 3
:3
Q" E#EQ J
+T
3
* J H
I M
A O J
& HI
(:* H * J H I;
I;
"2
& HI
(:* H * J H I;
I;
"2
* J HI M A
O RR +
3.2.4.4
3
Tekenen van de amplicons Probleemstelling Een amplicon bestaat steeds uit een sequentie met aan het begin een forward primer en
op het einde een reverse primer. Op het fragment kunnen dan ook eventueel 1 of 2 probes aanwezig zijn. Omdat bij sommige transcripten tientallen primers beschikbaar zijn, is het wegens esthetische redenen niet verantwoord om voor elke primer een nieuwe lijn te nemen. 13
Visualisatie met Scalable Vector Graphics In plaats daarvan wordt bij het uitschrijven telkens eerst gekeken of er nog plaats is op de onderste primerlijnen om de primers af te beelden. Begin en einde In het begin komt er een controle om te kijken of er wel degelijk af te beelden primers zijn. In het andere geval zal er niets worden getekend en er meteen worden doorgegaan naar de volgende groep. De hoofding van de groep van de primers krijgt een id en de visibility wordt ingesteld op visible. Een eerste tekststring zorgt ervoor dat links van de bovenste rij het woord assays komt te staan. 323 J H>3
5
I M
3
9 >3
:
: :U>
9 T +7
J
:
+
3 + 323 O
Berekening plaats van de amplicons Er wordt een array voorbehouden (>
) die telkens van elke rij zal bijhouden tot
waar het laatste amplicon komt. In het begin wordt de array gereset en wordt de eerste waarde op nul gezet (er is immers nog geen enkele primer getekend). Het berekenen en tekenen zal voor elke primer apart gebeuren. H> > J
I;
Q R ; H> ; > >3
5 ; > UUI M
Bij aanvang van het berekenen van de plaats worden eerst de x-coördinaten bepaald. >9
3J
en
>
3J
staan voor het respectievelijk begin en einde van de forward primer (3
wijst op reverse primer en
J
op fragment). Hiervoor worden de waarden uit de databank
gebruikt. De positie (de hoeveelste base) ingegeven in de databank wordt vermenigvuldigd met de dikte van 1 base en opgeteld bij het begin. Bij
>9
3J
en
>9
wordt van de
3
positie 1 afgetrokken omdat de eerste base begint op positie 0. >9 > >9
3J >9 3J >9 3
>9
UH>3 U>3 UH>3
>
3
>9
U>3
>9 >
J > J >9
3J; 3 ;
QGA!6,E6 D(&0*1GRQ> R QGA!6,E6 D&1 GRQ> R@>9
I@>9 ;
;
QG6&/&6.&D(&0*1GRQ> R
I@>9
;
QG6&/&6.&D&1 GRQ> R@>9
;
14
Visualisatie met Scalable Vector Graphics Bij het bepalen van de y-waarde van de primers is getekend (te beginnen vanaf de onderste primerlijn, 3 (>9
3J)
kleiner is dan de waarde op rij
>T
de lijn waarop zal worden
). Indien het begin van de forward
:
in de array
>T
, dan gaan we controleren op
>
een hogere rij (>TUU) en de positie één lijn verhogen (>3
:
>
T
). Indien de lijn voor de
eerste keer wordt zal worden gebruikt, dan wordt de eindwaarde op nul gezet. Indien de juiste rij is gevonden (while-lus wordt verlaten), wordt de nieuwe eindwaarde ingesteld op het einde van de reverse + 2 basen (om te voorkomen dat twee amplicons te dicht bij elkaar worden afgebeeld). Tenslotte wordt ook de plaats van het primernummer vastgelegd. >T
;
>3 52
: >3 H>9 >TUU; >3 :
:
>
J H>
; 3J >
Q>TRI M
T ; Q>TR
I >
Q>TR
;
O > >
Q>TR > 3 H>
>
3 : >3
3 U8@>9 ; 3 U>9 3JI+8; : >
T +7;
Tekenen van de primers De eerste lijn met betrekking tot het tekenen van de primers is het neerschrijven van het primerid en er een link aan toevoegen naar het bijhorende assay report. De zijn omsloten door de methode ‘get’ het 3
tags waarin
2
J
het adres bevat (assay_report.php) waarbij via
wordt meegegeven. De
3
tags
van de
is ingesteld als
(zie eerder). Hier wordt ook voor de eerste keer de mouseover animatie gebruikt. Indien
men met de muis over het primerid gaat, dan komt de tekst (“RTPrimer DB assay primerid – click to view assay details”) tevoorschijn via de functie verlaten van de muis van het gebied, wordt de functie
* J H * J HI
I
(zie 3.2.4.3). Bij het
opgeroepen waardoor de
infotekst wordt leeggehaald. 42 J * GRQ> R >3 >3
:D
3
323 6#% > 3
:
* J HG6#% ( QG%6*B&6D* GRQ> R * J HI QG%6*B&6D* GRQ> R
(D* >
>3 3 :
QG%6*B&6D 3
: 5 +
:
GI
+
Vervolgens gebeurt het tekenen van de forward primer, het tussenliggende DNA fragment en de reverse primer. Dit komt overeen met het tekenen van lijnen, met specifieke dikte en met een infotekst die beschrijft welke primer het is, wat de sequentie ervan is en welke de posities zijn van begin- en eindbase.
15
Visualisatie met Scalable Vector Graphics >9 :8
Q
>3
3J
:
>3
:
:
8
QG%6*B&6D* GRQ> R
>3 >3
QGA!6,E6 GRQ> R QGA!6,E6 D(&0*1GRQ> R
>3
:8
>3
>9 :
J
>9
3
: J
3 >3
5
:
3
4
93RGI
+ :
8
>
:
8
>
J
:
>3
3
* J HG6#% QG%6*B&6D* GRQ> R QG6&/&6.&GRQ> R
>3
(
+
:
>3 >3 Q
J
QGA!6,E6 D&1 GRQ> R * J HI >3
3J
* J HG6#%
>3
:8
>
(
:
3
4
QG6&/&6.&D(&0*1GRQ> R
>3
QG6&/&6.&D&1 GRQ> R * J HI
3
93RGI
+
Tekenen van de probes Het spreekt voor zich dat de probes slechts dienen te worden getekend indien er voldoende informatie over beschikbaar is (d.w.z. als het probe begin gekend is). Het tekenen op zich is heel gelijkaardig aan het tekenen van de primers. Eerst worden begin en einde bepaald en vervolgens wordt een lijn getekend (class
3 9).
Omdat bij sommige detectie
technieken (Taqman, Molecular Beacon) slechts één probe gebruikt wordt, is er een klein stukje PHP geschreven in de tekst van de functie weergegeven
indien
H>3
QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R J H>3 >9
er
3 9 >9
:8
>3
I
U>3 >9
probe
aanwezig
3 9
:
>3 : * J HG3
QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R QG%6!(& GRQ> R
>3 >3
is
(
J
).
2
QG%6!(& D&1 GRQ> R@>9
:
H>3 >3 Q
tweede
QG%6!(& D(&0*1GRQ> R I M UH>3 QG%6!(& D(&0*1GRQ> R
3 9 >9
>
een
waarbij het getal 1 enkel wordt
* J
8 I
2
;
;
> 323 J
9
I@>9
3 9
4
QG%6!(& D(&0*1GRQ> R QG%6!(& D&1 GRQ> R 93RGI
* J HI
3 9 + 323 J H>3 >9 >
3 98 >9 3 98 >9 >9
:8 Q
>3
:
>3 >3
QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R I M UH>3 QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R
I@>9
U>3
;
QG%6!(&8D&1 GRQ> R@>9 3 98
:
>3 : 8 * J HG3 9 84
>
;
3 98
QG%6!(&8GRQ> R QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R
>3
QG%6!(&8D&1 GRQ> R
93RGI
* J HI
3 9 + 323
16
Visualisatie met Scalable Vector Graphics O O
3.2.4.5
Tekenen van de peptidedomeinen Probleemstelling De meeste proteïnen bevatten één of meer karakteristieke peptidedomeinen. Dit is niet
steeds het geval, dus dient ook hier slechts de tekening te worden gemaakt indien er minstens één is. De peptidedomeinen worden gekenmerkt door een begin en een einde, een Pfam id en een korte beschrijving. Tekenen van de peptidedomeinen Vooreerst wordt gekeken of er wel degelijk domeinen te tekenen zijn (H>3
I),
5
vervolgens wordt de kop uitgeschreven. Voor elk domein worden de variabelen gedeclareerd en wordt een lijn uitgeschreven. De lijn bevat eveneens een link naar www.sanger.ac.uk waarbij het >3
wordt meegegeven, het attribuut target is gezet op blank zodat een nieuw
venster wordt geopend. Zowel het id als de korte beschrijving worden bij mouseover weergegeven in de infobalk. J H>3
5
I M
3
9 :
323 J H> >9 I@>9 >
; > 3 ; 3
>3 >
>9
U H>3
3 3
+
QG !BE*1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9
;
QG%AEBD* GRQ> R; QG.F!6#D &."6*%#GRQ> R;
>3 8 N > N
J
QG !BE*1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R
U >3
42
N
T +7
5 ; > UUI M
>3 >3
+%J + N >3 :N
9 :U>
>3
>9
2 9 :
: >3
J N 2 N 3
* J HG3 3 * J HIN
34++555 N
+
N D9 :8 N >3 N 3
N :N
4 > N +
N >9
+
Q* 4 >3 N ;
3
N
RGIN
O + 323 O
17
Visualisatie met Scalable Vector Graphics 3.2.4.6
Tekenen van het transcript Probleemstelling Een transcript bestaat uit verschillende exonen die al dan niet geheel of gedeeltelijk
coderend zijn. Er dient dus een onderscheid gemaakt te worden tussen de verschillende exonen (verticaal streepje) en het al dan niet coderend zijn (kleurverschil). Van elk exon is de (hoeveelste exon in transcript) en het id gekend, alsook begin en einde van zowel het exon als het coderend gedeelte (indien aanwezig). Begin en einde De hoofding van de groep “gen” en enkele woorden worden uitgeschreven. Voor de lijn komt 5’ en erna komt 3’, dit slaat op de oriëntatie van het transcript (zie 2.3). 9
:
: >9
9
>
:U> T +7 : >
:U>
J T +7
3 J
+ G +
3 >
3
:
>
:U>
T +7
J
-G +
+
Tekenen van het transcript Voor elk exon wordt vervolgens de lus doorlopen voor het tekenen ervan. In het begin worden alle variabelen gedeclareerd. >9
,
>
en >9
,
zijn begin en
>
einde van respectievelijk het exon en het coderend gedeelte. Indien een coderend gedeelte dus enkele exonen bevat (wat meestal het geval is) zal het dus voorkomen dat de beginposities en de eindposities gelijk zijn. In de array
>
wordt telkens het einde van het exon
bijgehouden om later de verticale streepjes te kunnen tekenen. 323 J H>
; >
>9 >
>9
>9 >
>9 >9
>
5 ; > UUI M UH>
QG&K!1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R
U>
QG&K!1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9
UH> U>
>
> >
>
>9
QG"! *10D.#E6#GRQ> R QG"! *10D&1 GRQ> R@>9
I@>9 ;
I@>9
;
; ;
QG&1.D&K!1D* GRQ> R;
>
QG6E1LGRQ> R;
QR >
;
Het tekenen op zich wordt onderverdeeld in twee delen. In het eerste gedeelte wordt ervan
uitgegaan
(>
dat
er
een
QG"! *10D.#E6#GRQ> R
coderend WW),
gedeelte
aanwezig
in het tweede deel (
is
in
het
exon
) is het volledige exon
niet-coderend. 18
Visualisatie met Scalable Vector Graphics Bij de eerste mogelijkheid wordt steeds gekeken of het begin van exon en codon (respectievelijk het einde) niet samenvallen. In dit geval dient het niet coderende gedeelte niet te worden neergeschreven (want het is er dan ook niet). Elk deeltje van het exon wordt apart getekend, telkens met een passende infotekst en kleur (class J H>
QG"! *10D.#E6#GRQ> R
J H>9 8 N >9
N
H
I Q&
>
8 N > H
N N
RGIN J H>
N I
>
N :8 N > I Q& 9
N
N + N
N >9 N : N * J HG RGIN
N >9 :N
: N > * J HG
N :N >
* J HIN 2
:N 4 >
)
WWI M
I 2 :N
9 4 > N + N ;
N 2 :8 N >
>9 :8 N >
en
N I Q&
N N
N
* J HG N
N > >
:N H
RGIN
:N
* J HIN
8 N > H
N >
N > >
9
4
N + N ; : N > :N > * J HIN
;
O 2 :8 N >
N >9 N
:N
4 >
RGIN
N : * J HG
N
* J HIN
8 N >
N I Q&
N
N + N
9 ;
O
Als alle exonen zijn getekend zal achteraf na elk exon (behalve na het laatste) een verticaal streepje worden gezet. Op deze manier staat het ook boven de exonen getekend op de voorgrond. J
H>
; >
>
2 :8 N >
3.2.4.7
5
; > UUI
N > :9N
Q> RN N
N + N
8 N >
Q> RN
:
N >
: N
;
Tekenen SNP’s Probleemstelling Het tekenen van de SNP’s bestaat erin verticale streepjes te zetten op de positie
waarop ze voorkomen. Allerlei informatie zoals het chromosoom, de chromosomale positie, het id, en het allel dienen te worden meegegeven in de infobalk. Omdat er transcripten zijn waarop geen SNP’s liggen dient ook hier deze mogelijkheid te worden opgevangen (en dus geen SNP lijn te worden getekend). Begin en einde Er wordt dus zoals gezegd enkel getekend indien er minstens 1 SNP moet worden afgebeeld (>
3
). De hoofding spreekt voor zich en vooraan wordt “SNP positions”
5
geschreven. J H>
3
5
I M
19
Visualisatie met Scalable Vector Graphics 3
9
:
:
>
9 3:U>
T +7
J
.1% 3
+
.1%X + 323 O
Tekenen van de SNP’s Het chromosoom is voor alle SNP’s hetzelfde, maar de andere variabelen worden binnen de lus (voor elke SNP apart) vastgelegd. Het snpid, het allel, de chromosomale positie alsook de genomische positie worden meegegeven als tekst in de informatiebalk. 323 > 2 >3 J H> ; >
>
> >
3 >9 39 >
> >
3
> 2
QG"F6!B!.!B&GRQ R; 3 5 ; > UUI M
UH> 3
3
> 3 > 3 3
>
QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R;
I@>9
;
QGE))&)&GRQ> R; QG (.1%D* GRQ> R; 3
QG.1%D"F6!BD.#E6#GRQ> R;
2 42
J N 2
N D9 :8 N > 3:9N H 2 > 3
34++555
9
N
2
N > N
3
4
RGIN
+.1%+
3 N : N > * J HG.1% 3
2 > 2 4> 2 3 N * J HIN
3D
3: N
I
J
4 > 3N +
N
>
8 N > 4 > 39 +
3
N
3 N 93 Q J.1% * 4 N ;
O
3.2.4.8
Tekenen van de schaal Probleemstelling Omdat er verschillende groottes zijn van transcripten en amplicons, is het nodig een
eenvoudige schaal onderaan de figuur te zetten. Hierop dienen op gelijke afstanden het aantal basenparen te worden gezet, met een verticaal streepje. Begin en einde De hoofding spreekt opnieuw voor zich, achteraan de schaal wordt “bp” gezet (algemene afkorting voor basenpaar), de lijn wordt steeds getrokken vanaf het begin tot het einde (dit is dus de volledige lengte van het transcript). 2 :8
>
9 >9 :;
: ;
9 :
>
:;
>
: ;
8
>
;
+
2 >
3
;
:
J
93 +
+
20
Visualisatie met Scalable Vector Graphics Tekenen schaal De schaal wordt getekend door telkens het basenaantal met een bepaalde factor te verhogen, en hiermee de positie (
) te berekenen. Deze factor hangt af van de lengte van
het transcript en is zodanig genomen dat steeds ongeveer tussen de 5 en 10 streepjes worden gezet. Het tekenen gebeurt zolang de positie niet de positie van
overschrijdt. Omdat aan
>
het begin het eerste basenpaar staat (1bp) wordt dit voor de lus geschreven. >
>9
;
2
N
:
N >
:N
N
N +
N >
N > N 3N + ;
:
N >
3:N
N
2 2
N > 2
N
J H>
N N
2 G
: N > +
N
:9N
N
N J
:8 N >
:N
N
;
GI >J
2 G
8
;
GI >J
J H>
;
2 G >J
GI >J ;
8
;
;
>
>9
52
H>
UH>93 >
I@>9
;
I M N >
2 N
N +
N
3N + ; N >
2
N
N
>93 >93U>J >9
N
:
N >
:N
N
:
N >
3:N
8 N >
N
:8 N >
:9N
; N >
2
>
:8 N >
;
2 G8
J H>
2
N
8 N >
: N
GI >J
J H>
>93 >J
8 N >
;
N
: N >
>93 +
N
8 N >
: N
N J
N
:8 N >
:N
N
;
; UH>93
I@>9
;
O
3.2.4.9
Tekenen infolijn Onderaan de SVG is plaats vrijgehouden voor een infolijn. Dit is de informatie die via
mouseover tevoorschijn dient te komen met betrekking tot het peptidedomein, de primers, het exon,… Het uitschrijven is heel eenvoudig, enig belangrijk aspect is het feit dat de id hier “Info” is, want hier wordt naar gezocht door het javascript (zie 3.2.4.3). Initieel is de tekst leeg. * J * J
>9
:
>
J :
J
+
+
21
Figuur 4: Een voorbeeld figuur gegenereerd door svggene.php met als transcriptid één van de transcripten van een voorbeeldgen MYCN (http://medgen.ugent.be/~jvrspurt/rtprimerdb/svggene.php?transcriptid=ENST00000281043&svgheight=280 )
Visualisatie met Scalable Vector Graphics
3.2.5 Voorbeeld: MYCN, transcript ENST00000281043
22
Visualisatie met Scalable Vector Graphics
3.3 Overzichtsfiguur amplicon (primer.php, zie appendix I.b) 3.3.1 Doel De tweede belangrijke figuur wordt aangemaakt door svgprimer.php. Het doel hiervan is dat het primerpaar, besproken in de assay, wordt afgebeeld op het transcript en dat slechts die informatie wordt aangeduid die binnen de grenzen van de figuur valt. De figuur wordt opnieuw gemaakt per transcript en is ingebed in het assay report (zie 4.2.2). In de volgende paragrafen wordt dezelfde structuur behouden als in 3.2, maar enkel de belangrijkste verschillen worden vermeld.
3.3.2 Data ophalen Het ophalen van de data is volledig gelijklopend met svggene, behalve de query voor het verkrijgen van de primerinformatie. Hierbij wordt enkel de record opgehaald waarbij de primerid gelijk is aan de meegeleverde >3
(via de GET methode). Het resultaat is dus
slechts één rij. >3 >?
>D0&#Q 3 R; .&)&"# @ A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 ,F&6& %6*B&6D*
: E1
&1.D#6E1."6*%#D*
G>
3
G>3
G
G ;
3.3.3 Instellen parameters De variabele
>
2
2
(de hoogte van het beeld) wordt hier niet meegegeven, maar
staat vast op 160, dit omdat er toch steeds één amplicon wordt afgebeeld. De totale lengte van het amplicon wordt bepaald, en afhankelijk daarvan wordt de dikte berekend van één base (de lengte voorbehouden voor het amplicon is 550). >
2 >3
>9
QGEB%)*"!1D)&10#FGRQ R;
+>
2;
De waarden van de stijlen zijn gelijk gehouden om een mooie uniformiteit te bekomen, enkel de dikte van een SNP wordt ingesteld op 1 >9
. De y-waarden (de hoogtes)
worden op een andere manier berekend, maar steunend op hetzelfde principe. Er wordt gestart bovenaan en telkens 1 lijn naar onder geschoven. >3
>
:U>
T ;
>3
: >3 :
>3
:U>
T +7;
>3
:9 >3
: >
T +7;
: >3 :U> T ; > : > :U> T +7; >
>
:9 >
3: >
:U>
: >
T +7;
T ;
23
Visualisatie met Scalable Vector Graphics > > >
3:
>
3:U>
T + ;
3:9 >
3: >
T + ;
: > > >
>
3:U>
:9 > : >
J : >
T ; :U> T +7; :9U> T ;
:U8@>
T ;
3.3.4 Schrijven van de SVG figuur 3.3.4.1
Hoofding, informatie, stijlen en javascript Het volledige begin van de SVG is gelijk aan dat van svggene.php script. Ook de
stijlen zijn hetzelfde gehouden en het javascript wordt opnieuw gebruikt voor de mouseover effecten. 3.3.4.2
Tekenen van het amplicon Probleemstelling De bedoeling is om het amplicon af te beelden over een groot deel van de breedte van
de figuur. Zowel voor het begin als na het einde wordt een beetje plaats overgelaten. De beginbase en eindbase moeten worden bijgehouden, om zo later te kunnen berekenen welk deel van het peptide, en transcript moet worden afgebeeld. Berekening variabelen Het grote verschil met svggene is het bepalen van de variabelen en de plaats van het amplicon (en de primers). De eerste en laatste basen van zowel het amplicon als van de figuur worden berekend. Het begin van het amplicon is op een vaste afstand na
>9
(50)
ingesteld, en ook het einde ligt vast. >9 > >
9
>3
9
QGA!6,E6 D(&0*1GRQ R;
>3 9
H>9
>
9
>9 >
3J >9 3J >9
> >9
3 > 3 >
3
>9 >
J > J >9
3J; 3 ;
>
3
>
3 : >3
H>
H> U ; 3JUH
QG6&/&6.&D&1 GRQ R; 9 +>9 I; 9
U
+>9
I;
H>3
QGA!6,E6 GRQ RI@>9
I;
H>3
QG6&/&6.&GRQ RI@>9
I;
; H
3 U>9 : >
3JI+8;
T +7;
24
Visualisatie met Scalable Vector Graphics Tekenen van de primers en probes Het tekenen op zich gebeurt volledig analoog aan svggene, behalve dan het feit dat er slechts één amplicon wordt getekend (0e rij) en dat er geen link naar het assay report is. 3.3.4.3
Tekenen van de peptidedomeinen Probleemstelling Omdat er slechts een deel van het transcript wordt getoond, is het ook nodig om te
bepalen welke peptidedomeinen (en welk deel ervan) moeten worden afgebeeld. Enkel het stuk dat tussen >9
en >
valt wordt getekend.
Het tekenen van de peptidedomeinen Net zoals bij svggene wordt opnieuw gekeken of er wel degelijk domeinen te tekenen zijn. Dit is niet zo vanzelfsprekend. De variabele en slechts valt (
>
wordt initieel op
53 3
J
gezet
indien het begin of het einde van het peptidedomein binnen het tekengebied
HH>9
3
>
IYYH>
3
II).
>9
Vervolgens wordt de kop uitgeschreven,
worden voor elk domein de variabelen gedeclareerd en wordt de lijn uitgeschreven. De lijn bevat eveneens een link naar www.sanger.ac.uk waarbij het attribuut
is gezet op
>3
wordt meegegeven, het
zodat de link wordt geopend in een nieuw venster. Zowel
9
het id als de korte beschrijving worden bij mouseover weergegeven in de infobalk. >
53 3
J
H>
J ; >
>9 3 I@>9 >
5 ; > UUI M
>9
UH>3 9 @>9
>
3
>
;
>3
>9 9
;
U>3
@>9
J H HH>9
QG !BE*1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R QG !BE*1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9
;
3
>
IYYH>
3
>9
III >
53 3
;
O J H>
53 3
I M
3 3 O
Het tekenen op zich is niet fundamenteel verschillend, alleen wordt het begin en het einde van het peptidedomein ingesteld op respectievelijk $begin of $eind indien het buiten de grenzen valt. J H HH>9 J H>9 J H>
3 3 3
> >9 >
IYYH> I >9 I >
3
3 3
>9 >9 >
III M ;
;
3 3 O
25
Visualisatie met Scalable Vector Graphics 3.3.4.4
Tekenen van het transcript Probleemstelling Ook het tekenen van het transcript verschilt niet veel van svggene, maar opnieuw moet
een controle worden ingebouwd om enkel dat deel van het transcript te tekenen dat binnen de grenzen valt. Tekenen van het transcript Het bekijken of er het exon moet getekend worden, gebeurt op dezelfde manier als bij het peptidedomein (
HH>9
>
IYYH>
II).
>9
Net zoals bij SVG wordt
onderscheid gemaakt tussen het al dan niet aanwezig zijn van het coderend gedeelte (>
). Net zoals bij peptidedomeinen worden de
QG"! *10D.#E6#GRQ> R
parameters ingezet op de grenzen indien ze er buiten vallen. Het tekenen op zich gebeurt als bij svggene. J H>
QG"! *10D.#E6#GRQ> R
J H HH>9
>
IYYH>
J H HH>9
>9
J H>9 J H> J H>9
>
I >9 I >
>9 >
J H>9 J H>
III M
IZZH> > >9
J H>
I M
>9
III M
> >9
I >9
; >9
I >
>
>9 I >9 > I >
;
>9 ;
>
;
; ;
O J H>9 8 N >9 H
>9 I N :8 N > I Q&
9
N N J H>
RGIN N
: >
N > H
* J HIN >
8 N > H
I
N :8 N > I Q& 9
N
N : * J HG N
N > >
:N
* J HIN
;
N >9 * J HG
N
N >9 N
4 >
N + N
2
2 :N
N + N
:N
8 N > I Q&
N
N + N
2
N >
:N 4 >
N
N :8 N > :N 4 > RGIN
9
; N
:
* J HG N
RGIN
N >
:N
> * J HIN
;
O O
J H HH>9 J H>9 J H> 2 :8 N > 4 >
:N RGIN
> >9 >
IYYH> I >9 I > N >9 N N
>9 >9 > N
III M ;
; :
N >
* J HG > * J HIN
:N
8 N >
H N
N I Q& 9 N + N ;
O
26
Visualisatie met Scalable Vector Graphics Als alle exonen zijn getekend, zullen opnieuw de verticale streepjes worden getekend om het onderscheid te maken tussen de exonen. Hierbij worden ook enkel deze streepjes gezet die binnen het bereik vallen. J
H> ; > > 5 ; > UUI J HH> Q> R >9 IZZH> 8 N >
3.3.4.5
Q> RN
:
N >
Q> R >
: N
:8 N >
II
2
N >
:9N
N
Q> RN
N + N
;
Tekenen SNP’s Probleemstelling Het enige wezenlijke verschil met svggene is opnieuw het invoeren van een controle
voor het al of niet aanwezig zijn van SNP’s in het gebied. Tekenen van de SNP’s De controle is eenvoudigweg kijken of er een SNP-positie is die ligt tussen >9 >
en
. >
5
J
3 J
H> > >
3
;
; >
>
>9 9
UH> @>9
3 ;
>9
I ZZ H>
J HH>
3
3
5 ; > UUI M QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R 3
>
II >
5
3
I@>9
;
O J H>
5
3I M
.1%X O
3.3.4.6
Tekenen van de schaal Probleemstelling Het probleem bij het tekenen van de schaal voor primersvg is dat de eerste base niet
steeds 1 is, maar dat deze steeds varieert. Het zou dus voldoende zijn indien een aantal maatstreepjes kunnen worden getekend die op regelmatige afstand van elkaar staan. Tekenen schaal Voor het tekenen van de schaal is hetzelfde principe gehandhaafd als bij svggene, maar H>93 >
worden 9
alle
basen
;>93 >
doorlopen ;>93UUI)
9
door de factor (>93[>J
van
begin
tot
einde
(J
en wordt er gecontroleerd of ze deelbaar zijn
). De factor hangt af van de lengte van de schaal (dus het
verschil tussen de eerste en de laatste basen. > 2 J H>
> 2
J H>
9 I >J 2 J H>
8
> I >J
2
9 ;
; 8 ;
I >J
;
27
Visualisatie met Scalable Vector Graphics >J J
H>93 >
; 9
;>93 >
J H>93[>J >
>9
U>93@>9 N >
2 N
N +
>
N > N
;>93UUI M
3N +
2 N
N
:
9 N >
@>9 :N
N
:
N >
3:N
; 8 N >
N
:8 N >
:9N
;
2
2
9
I M
N
; N >
N
: N >
>93 +
N
: N
8 N > N J
N
:8 N >
:N
N
;
O O
3.3.4.7
Tekenen infolijn De infolijn is identiek aan svggene.
28
Figuur 5: Een voorbeeld figuur gegenereerd door svgprimer.php, met als primer id één van de primers van een transcript van MYCN (http://medgen.ugent.be/~jvrspurt/rtprimerdb/svgprimer.php?primerid=1197&transid=ENST00000281043)
Visualisatie met Scalable Vector Graphics
3.3.5 Voorbeeld: MYCN
29
RTPrimerDB (website)
Hoofdstuk 4: RTPrimerDB (website) 4.1 Inleiding Real-time PCR (zie 2.4.2) wordt een als maar meer populaire methode voor nucleïnezuur (DNA) detectie en/of kwantificering. Omdat primer/probe design en experimentele evaluatie tijdrovend is, werd in het Centrum voor Medische Genetica in 2002 een publieke databank applicatie opgestart voor het bewaren en het opvragen van gevalideerde real-time PCR primer- en probesequenties (Pattyn F., 2002). De volledigheid en de correctheid van de data werd bekomen door controles en linken via andere databanken. RTPrimerDB levert vrije publieke toegang via het web om zoekopdrachten te vervullen en eigen informatie door te sturen om de bestaande databank uit te breiden. Primer/probe records kunnen worden gezocht op allerlei criteria (officieel symbool van het gen, soort applicatie, organisme, detectiemechanisme,…) en elke record is gelinkt naar LocusLink, dbSNP of PubMed om zo meer informatie te verstekken (Pattyn F., 2002). Momenteel bevat de databank vooral primer/probe informatie over de mens (meer dan 75%), de muis en de rat (samen 99% van de databank). Een eerste belangrijke doelstelling is het aanpassen van de pagina waarin een overzicht wordt gegeven van de primer/probe sequenties ingegeven door één bepaalde submitter. Dergelijke assays worden besproken in een assay report. De bedoeling is dat naast het aanpassen van enkele kleine details een duidelijke figuur (svgprimer.php) wordt weergegeven waarin de primer/probe sequenties worden gemapt op de transcriptinformatie (indien voorhanden). Vervolgens is het nodig een nieuwe pagina aan te maken waarbij gen-informatie wordt samengevat in een tabel en natuurlijk in een figuur (svggene.php). Hierbij wordt voor elk transcript een overzichtsfiguur weergegeven waarop duidelijk te zien is welke primer/probes vallen binnen het gebied. Tenslotte dient ook te worden gekeken op welk vlak de website in het algemeen kan worden aangepast, qua functionaliteit, layout en inhoud.
30
RTPrimerDB (website)
4.2 Overzichtspagina van een assay (assay_report.php) 4.2.1 Inleiding De assay_report.php pagina was een reeds bestaande samenvatting van alle informatie omtrent een ingegeven primerpaar. Bovenaan staan de eigenschappen vermeld van het desbetreffende gen, gevolgd door de informatie over de gebruikte detectiemethode en applicatie, evenals het template. Vervolgens staan de primer/probe sequenties uitgeschreven. Onder dit deel van de pagina komt voor elk van toepassing zijnde transcript een grafische voorstelling (svgprimer.php). Bovenaan elke figuur komt een lijn met informatie over het transcript en onder de figuur komt een link naar een venster waarin de ampliconsequentie wordt voorgesteld. De sequenties van de forward en reverse primers en eventueel de probe(s) worden afgebeeld. Het voorstellen van de primers op het transcript dient enkel te gebeuren voor de assays van die beschikbaar zijn in de Ensembl databank en waarbij Gene Expression Quantification/Detection (afkorting GXP) als toepassing werd ingegeven door de gebruiker. Tenslotte worden onderaan de pagina de eventuele opmerkingen toegevoegd van de submitter alsook de publicatie waarin de assay in meer detail beschreven staat. Als laatste wordt ook de informatie over de submitter meegegeven.
4.2.2 Invoegen figuur Voor het invoegen van de figuur zijn een aantal aanpassingen gemaakt. Vooreerst wordt bovenaan naast de gewone bevraging van de fpattyn databank ook ingelogd in de nieuwe databank, zodat de berekende informatie kan worden gebruikt. >
T
3
;
>3 >
5
7
>?
:8 .&)&"# &1.D#6E1."6*%#D* = &1.D0&1&D* A6!B C/6.%'6# &1.D0&1&
8
!"*)
; H>
=>3
5
=>
D
C/6.%'6# &1.D#6E1."6*%# ,F&6& 3 %6*B&6D* &1.D#6E1."6*%#D* 3 &1.D#6E1."6*%#D* E1 >
G>)!"'.)*1LD* G !6 &6 ($ 8 !"*% H>
!"*& > 5 8 > !"*A
H> !"*A 8 .
8I; 2. :D H>
&1.D#6E1."6*%#D* 8=>? :8I; H>
9
D? 8I;
8=> D
I;
" 1ED)&10#F= " .D)&10#F= = C/6.%'6# %6*B&6.8 3= >6#% (D* E1 &1#6&\D0&1&D* ;
8I; J
H>
8I;
31
RTPrimerDB (website) De layout van de reeds bestaande pagina wordt zoveel mogelijk behouden. Indien aan de juiste voorwaarden voldaan is (applicatie GXP, gen-informatie beschikbaar in Ensembl en minstens één transcript te tekenen), komt onder de assay details een informatielijntje waarbij transcipts in meervoud wordt geschreven indien er meer dan één transcript van toepassing is. 323 J HH>E%%DE((6&
G0K%GIZZH>*1D&1.&B()IZZH>
5 8
II M
#6 # J
.#$)& 5
J
S 4 3 3 323
#2 J H>
3 5 8
3 I 3
3
J ;
3 4 (6
J (6
2 +#
+#6
Voor H>
;>
Vermits
elk
transcript
5 8;> UUI).
>
per
wordt
de
informatie
opgehaald
(J
De translationlength is gelijk aan het aantal aminozuurresiduen.
aminozuur
>
afzonderlijk
2 >
drie
basen
nodig
zijn
is
de
berekening
, waarbij CDS_LENGTH de lengte is
8QG" .D)&10#FGRQ> R+-
van het coderende gedeelte. Het aantal exonen dat het transcript telt wordt berekend en meegegeven aan de variabele $countexon. 323 J
H>
;>
>
>
3
> >
3
>?
:-
5 8;> UUI M > 8QG&1.D#6E1."6*%#D* GRQ> R; 2 > 2 >
8QG" 1ED)&10#FGRQ> R; 8QG" .D)&10#FGRQ> R+-
.&)&"# "!'1#H@I E. "!'1#&K!1 A6!B C/6.%'6# &1.D&K!1
,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* > !"*3 H> !"* > 5 > !"*A
;
H> !"*A .
>
G>
-I; 2.
H>
:D H> >
3 8= >?
9
D? -I;
G 06!'% ($ &1.D#6E1."6*%#D* :-I;
-=> D
;
-I; J
H>
-I;
-QG"!'1#&K!1GRQ R;
Er wordt gebruik gemaakt van het
element, waarbij als titel (legende) de
J
link staat naar de transcriptinformatie op www.ensembl.org alsook de transcript en translatie lengte worden meegegeven. De link bevat de variabele
>
9
, dit is de Latijnse naam
waarbij een spatie werd vervangen door een underscore (>
9
D
3
H
= D =>!60E1*.BD)E#*1I). J F6&A >
: 2
34++555 3
G
9
49 +
D9
;G
>
E 9
>
+ 3
5 +E
3 H&
4
32
RTPrimerDB (website) >
= # 24
#
3
24
>
>
3 2
I
2 +
93=
Tenslotte wordt de figuur afgebeeld. Hiertoe wordt de embed methode gebruikt. Het element wordt veel gebruikt om multimedia objecten in te sluiten in een HTML-
&B(&
document. Het kan gaan om geluidsfragmenten, maar bijvoorbeeld ook om QuickTime filmpjes (mov), Shockwave Flash animaties (swf) en dus ook SVG-files. Adobe verkiest het gebruiken van de EMBED methode boven andere mogelijkheden zoals OBJECT of IFRAME. Als verplichte attributen is er natuurlijk 2
2
waar de bron wordt weergegeven en
5
2
en
. Deze laatste twee kunnen eenvoudig worden meegegeven aangezien de grootte van de
svgprimer-afbeeldingen steeds even groot is. Ook het type wordt meegegeven via het
:3
attribuut. #E()& #6 # 3
&B(& 3
2
5 2 >%6*B&6D* :3
2 Z +
34++555 2 3;
9
+
<
+
3 +&B(&
+
+
2
323 3
>
U
5
3 +#
+#6
3
HS
I
+#E()& +J 323 O O
4.2.3 Andere aanpassingen Naast het embedden van de figuur werden ook nog een paar kleine aanpassingen gedaan aan de pagina die hier kort worden besproken. 4.2.3.1
Toevoegen links Naast
de
reeds
aanwezige
link
naar
Entrez
Gene
van
NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) en de link die werd ingevoegd aan het transcript id (zie vorige paragraaf), wordt ook een link gelegd naar www.ensembl.org en naar het gene_report (indien het organisme in de RTPrimerDB databank zit en beschikbaar is in Ensembl). 323 J H>*1D&1.&B()I M #6
33
RTPrimerDB (website) # & 9 0 F6&A 2 34++555
* 4 9
>&1.D0&1&D* +#6
E +
>
9
D9
+
5
>&1.D0&1&D*
+E
#
#6 #
323 3
F6&A N 3
D
E 3 :
323 5
+E
;
>)!"'.)*1LD* N +#
6#%
(
+#6 323 O
4.2.3.2
Weergeven van het amplicon Per transcript wordt een voorstelling beschikbaar gesteld van het amplicon. Hiervoor
wordt een link naar de pagina amplicon.php geschreven binnenin de fieldset (zie eerder). Een groot aantal parameters wordt meegegeven om zo via verschillende kleuren de primers en probes af te beelden. De berekening van de parameters gebeurt voor elk transcript afzonderlijk. De relatieve posities van begin en einde van de primers en probes t.o.v. het ampliconbegin worden in variabelen gestoken. >?
:7
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 3 ,F&6& 3 &1.D#6E1."6*%#D*
G>
3
>
G E1
7
!"*3
H>
!"* > 5 7
H> !"*A
7I; 2.
>
7
!"*A
:D
.
> 3 >J 5 >
3 %6*B&6D* 8= >? H> 9
H> >
:7I;
7=> D
(D* G ;
7I; J
H>
7I;
7I; 7QGEB%)*"!1GRQ R; 7QGA!6,E6 D&1 GRQ R >
> 9
D?
G>6#%
>
7QGEB%)*"!1D(&0*1GRQ R;
7QG6&/&6.&D(&0*1GRQ R
7QGEB%)*"!1D(&0*1GRQ R; >3 >3
9 9
9
>3
9 89
>3
9 8
>
7QG%6!(& D(&0*1GRQ R > 7QG%6!(& D&1 GRQ R >
7QGEB%)*"!1D(&0*1GRQ R; 7QGEB%)*"!1D(&0*1GRQ R;
>
7QG%6!(&8D(&0*1GRQ R >
7QGEB%)*"!1D(&0*1GRQ R;
> >
7QG%6!(&8D&1 GRQ R >
7QGEB%)*"!1D(&0*1GRQ R;
De waarden worden samen met de ampliconsequentie via de GET-methode meegegeven aan amplicon.php. Het weergeven gebeurd via een functie 1
5/
EH]I
dat
reeds op de site werd gebruikt en waarbij de hoogte en breedte van het pop-up scherm kan worden meegegeven. #6 323 3
#
F6&A N 9 9
3
323 >
Z
E
3;3
3 9
9 89
? > 3 Z 3;3 9 >3
9 89
Z 9
3;J 5 >3 9 Z
3;3
9
9 8
>J Z
5 3;3
>3
9 8
Z
3;
9
>3 Z
3;3
34
RTPrimerDB (website) >%6*B&6D* Z N 1 5/ >J Z
5 3;3
>3
9 8
Z
9
Z
3;3 ;N
> 323
3
9 >3
Z
3 EHG
3;
9 J
3;
> 3;3
9 9 89
>%6*B&6D* Z 3; N 5N E 3
3
3 N ? > 3 Z
3;3 9 >3 9 89 3
Z 9 Z > +E
?
3;J
5
>3 3;3
9 9 9 8 3
GI;
+#
+#6
Pagina voor het voorstellen van het amplicon (amplicon.php) Het voorstellen van het amplicon gebeurt in een kleine tabel, waarbij verschillende kleuren worden gebruikt om het onderscheid tussen primers, probes en rest van het amplicon duidelijk voor te stellen. Eerst worden alle variabelen opgehaald via de GET-methode en de hoofding van de tabel geschreven. Vervolgens wordt de ampliconsequentie base per base uitgeschreven, waarbij telkens wordt gekeken of het niet gaat om een begin of een eindbase van een primer of een probe. In dit geval wordt de stijl aangepast waardoor de kleuren veranderen. Per
basen wordt een nieuwe lijn genomen. Tenslotte wordt een
>
kleurlegende onderaan de tabel gezet. 323 > 3 ? >D0&#QG 3 ?GR; >J 5 >D0&#QGJ 5 > >3
9
>3 >3
9 9 89
>3 >3
9 8
> >
9 9
>D0&#QG >D0&#QG3
GR; 9
9
GR; GR;
9
>D0&#QG3 9 GR; >D0&#QG3 9 89 GR; >D0&#QG3 >D0&#QG3 3
9 8
>D0&#QG H> 3
3
GR; GR; 3
GR;
?I;
#E()& #6 # 323 > J
; H> ;> > 3 J H> I 2
;> UUI M "! & .#$)& N
J H> J H>
> >3
9
J H>
>3
9 89
2 J H> J H>
>
3 >3 >3
9 9
4 V8
<
;
I I
2 2
+"! & "! & .#$)& N +"! & "! & .#$)& N
4 V8 4
I
2
+"! &
4
"! & .#$)& N
<
;
?M> O; 9 9 8
I I
2 2
+"! & +"! &
"! & .#$)& N "! & .#$)& N
4 4
:N :N
; ;
35
RTPrimerDB (website) J H>
>J
J H> [> J H> >
5 7 I 3
I
2
2 I
2
(6
+"! &
"! & .#$)& N
; +"! &
;
4
:N
;
O +# +#6 +#E()& (6 (6 #E()& #6 #
9
V8
.#$)& # 9
4 V8
.#$)& # 9
4
.#$)& ?
4
<
Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3; +#
#
<
; J J :4 E 3 9 +# Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3;Z 9 3; +#
:; J
J
:4 E
# #
3
+#
+#6 +#E()&
4.3 Overzichtspagina van een gen (gene_report.php) 4.3.1 Inleiding De meeste zaken die besproken zijn in vorige paragraaf worden ook gebruikt in het gene_report. De aandacht wordt vooral gevestigd op de verschillen. De bedoeling van deze pagina is om een overzicht te geven van alle assays die werden ingegeven in de databank voor een specifiek gen, alsook een afbeelding waarop alle primers worden gemapt op de verschillende transcripten van het gen. Bovenaan komt net zoals in het assay report de geninformatie, gevolgd door de afbeeldingen. Onderaan komt een overzichtstabel waarin alle assays zijn samengevat.
4.3.2 Invoegen figuur Het invoegen van de figuur in de gene report pagina gebeurt op een analoge manier aan assay report. Het belangrijkste probleem is hier echter dat de juiste hoogte niet gekend is. Zoals in 3.2.4.4 vermeld, is het aantal primerlijnen niet steeds hetzelfde en ook niet eenvoudig te berekenen uit het aantal assays per transcript. De volledige berekening wordt dus in het gene report gedaan om zo een svgheight te kunnen berekenen en mee te geven aan de SVG. Er wordt gekeken of de primers op dezelfde lijn passen en indien dit niet het geval is, wordt er 36
RTPrimerDB (website) een nieuwe lijn voorzien. De uiteindelijke svgheight is de som van de hoogste primerrij en 7 lijnen (gebruikt voor andere aspecten van de figuur, zie 3.2.4.4). >?
:<
.&)&"# A!6,E6 D(&0*1= 6&/&6.&D&1
&1.D#6E1."6*%#D* > !"*
<
!"*3 H>
>3
G>
H>
5
!"*A
2.
!"*A >9
. <
T
H> +>
>3
D?
<=>3 D
I;
J
H>3
I;
2;
:
I; ; >
T ;
J H>3 J
9
8 ; H> Q R
>
:
H>
:D
A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 ,F&6&
G !6 &6 ($ A!6,E6 D(&0*1 ;
8= >?
>3
>
3
5
H> >9
I M
; > >3 3J >9 U>3
>
3
>9
5 ; > UUI M QGA!6,E6 D(&0*1GRQ> R@>9
U>3
>T
;
>3 52
: > T ; H>9 3J >
QG6&/&6.&D&1 GRQ> R@>9
;
Q>TRI M
>TUU; >3
:U >
J H>3 J H>
T ; : >3 : Q>TR
I >3 I >
:
>3 :; Q>TR ;
O >
Q>TR >
3 U8@>9
;
O O >
2
2
>3
:
UP@>
T ;
4.3.3 Andere eigenschappen gene_report.php 4.3.3.1
Toevoegen overzichtstabel Onderaan de pagina komt een overzicht van alle assays die ingevoerd zijn. Naast het
id, wordt ook de applicatie, de detectiemethode, de template, het al dan niet aanwezig zijn op de figuur en eventuele opmerkingen weergegeven. De titellijn en de hoofdingen van de tabel spreken voor zich. De tabel wordt enkel weergegeven indien er assays beschikbaar zijn, in het andere geval wordt een foutmelding weergegeven (zie onder). #6 9 # +#6
V .#$)&
J
"" S 4
3
( 6#%
(
:
+(
+#
323 J H>
5
I M
37
RTPrimerDB (website) #6 #
J
#E()&
#6 9
V 6#%
# # #
E33
# #
# E
#
6
J
"" ( *
+#
+# +# 3 : /
+# 5
+#
+#
+#6
Rij per rij (d.i. assay per assay) wordt de tabel gevuld, steeds met een link naar de assay reports en een informatieschermpje dat tevoorschijn komt indien er over de applicatie, detectie, assay viewer of remarks wordt gegaan. Hiervoor wordt een script gebruikt dat reeds in de website werd gebruikt en is overgenomen en aangepast aan de juiste omstandigheden. Om te bepalen of een assay van in de tabel op minstens één transcript gealigneerd is, werd binnenin de lus een opvraging gedaan van de databank. #6
# 3 323 J H >
; >
3
>
5 ; > UU I M
H> 3
I; #6 N
;
>%6*B&6D* > >E%%DE((6& >
QG%6*B&6D* GRQ> R; QGE%%DE((6&GRQ> R;
>E%%D(0 >
QGE%%D(0GRQ> R;
> &#&"DE((6& >
)
F6&A N
N
:D
QG &#&"D(0GRQ> R; QG6&BE6L.GRQ> R;
>#&B%)E#& >
QG#&B%)E#&GRQ> R;
N 2
2
N
N
N N 5
3
N
(D*
( >%6*B&6D*
+(
HIN ;N
:
2
N
N
5
N 3 3 4 3 "!)!6 N 52 N N >?
:P
N
HIN
N
>%6*B&6D* N +E
+#
#
N +#6
+#E()& +# # N > &#&"D(0N
;9 #E()& N
N
N 3 3 38HG &#&"GIN N
4
;N A!1# > &#&"DE((6& +A!1# >#&B%)E#& +#
N
N
E :
: #E()&
4
A!1# "!)!6 N 52
2 N - N
) E
N >E%%D(0N N N N 3 3 38HGE%%GIN
E
>E%%DE((6& +A!1# +E +# N N #6 # 9 2
N
323 6#% #6 # 9 2 N - N
N 3 3 4
N
#
3
4
QG &#&"DE((6&GRQ> R;
> &#&"D(0 > >6&BE6L. >
3 N
"
+E
+#
+#6
;9 +#E()&
+#
#
;
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 ,F&6& %6*B&6D*
G>%6*B&6D* G ; >
P
!"*3
H>
8= >?
:PI;
38
RTPrimerDB (website) !"* > 5 !"*A
2.
:D
H> 9
D?
D
H>
P=> > 5
5
J !"*A
H> .
J H>
PI;
5 I; 5
I; H>
PI;
5 5 I M >/*&, $&. ; >E..E$/*&,D(0 M
O
;
>/*&, 1! ; >E..E$/*&,D(0
;
O 3 N >E..E$/*&,D(0N
9 5
2 N - N E N 3 3
4 3 >/*&, +A!1#
HIN
;N +E +#
#
#E()& N
:
N
3
N 3 3 4V8
HIN
N N
N
:
N
J N
;
E
I;
N 3 3 38H> IN
N
4 4
3 ;N H>6&BE6L.I
J H 3
#
;9
3 :H>6&BE6L.II M > 3 9 H>6&BE6L.= =
<
#6
N ;
#
3 ;
N 2
N 3 3 38HGE..E$/*&,GIN N 4
A!1# "!)!6 N 52 +#6 +#E()& +#
J H
2
+E
> 3 ; I 3
=
;
;
O 3 3
+# ; + */ ;
O
+# +#E()& +#6
+ +#6
+#
323 O
M #6 # +#6
( 1
:
J
J
2
+(
+#
323 O
39
Databankstructuur
Hoofdstuk 5: Databankstructuur 5.1 Inleiding Om het visualiseren te kunnen verwezenlijken is het noodzakelijk om over voldoende en juiste informatie te beschikken. Een aantal nieuwe tabellen zijn aangemaakt om deze informatie te bewaren en de opbouw ervan is steeds in functie van de afbeelding. De belangrijkste tabel is primers2, waarin alle primerinformatie zit bevat. De inhoud ervan diende te worden berekend door een aligering uit te voeren van de gegeven sequenties op elk transcript. Tenslotte wordt de structuur van al de andere tabellen kort besproken. De opvulling ervan is na grondige bespreking en overleg gebeurd door Filip Pattyn.
5.2 Primerdatabank 5.2.1 Inleiding Voor het voorstellen van de amplicons op het transcript en het leveren van voldoende informatie is een grote hoeveelheid data nodig. Van elke assay wordt samen met de id’s bijgehouden wat de forward en reverse primers zijn, alsook de mogelijke probes. Deze informatie is reeds door de submitters ingegeven en aldus in RTPrimerDB aanwezig, maar een aantal zaken dienden te worden berekend. Zo werd de positie van deze primers nooit eerder bepaald en was de amplicon lengte in vele gevallen ontbrekend of incorrect. Omdat de assays steeds handelden over een bepaald gen (en niet over een transcript) werd voor elk gentranscript dat gekend is elke primer getest op aanwezigheid. Het ophalen van de transcriptsequentie diende dus ook geautomatiseerd te worden. De functies die gebruikt worden zijn gebundeld in alignfunctions.inc, het aligneringsscript heeft de naam alignprimers.php. In volgende paragrafen worden beide bestanden toegelicht.
5.2.2 Alignering 5.2.2.1
Ophalen transcriptsequentie Alvorens een alignering uit te voeren moest geweten zijn op welke sequentie getest
diende te worden. Hiertoe werd een functie geschreven gegeven transcript ID (>
) en organisme (>
2. ?
H>
I,
om met een
) de sequentie van dat transcript op te halen
40
Databankstructuur op www.ensemble.org. De waarde van het organisme bestaat uit de latijnse naam, waarbij de spaties vervangen werden door “_” (zie 5.2.3.1). Het exacte adres wordt meegegeven in de variabele >
.
>
2 >
34++555
9
+W >
W+
5
9
Z
3
;
Via J
wordt de pagina geopend (enkel lezen) en vervolgens de informatie scherm
3
per scherm weggeschreven in een string
>2
. De eigenlijke ophaling van de juiste
D3
informatie gebeurt met behulp van een reguliere expressie. Al de tekst die tussen de W
3
3W
>
2
3 >
D
en
+3
tags staat dient te worden bewaard.
+ 3
N
2H>
2= >2
>
Q R;
?
3
3
3N
D3
HQ^NJRUI N+3
= >
De juiste informatie (opgeslagen in >
+
;
I;
) diende nu enkel nog te worden ontdaan
?
van een aantal tussenliggende tags. Hiertoe werd opnieuw via reguliere expressie de juiste vervanging gedaan. > > >
5.2.2.2
2 3 ?
:H + Q^ RU + 3
: H = D 3
= +N +
I; H>
2= >
I; 3
= >
?
I;
Zoeken van een exacte match Eens de juiste sequentie gevonden is, kan men de primers en de probes testen of ze
voorkomen op het transcript. Over de primerparen werd door de submitters immers meegegeven op welk gen het voorkomt, de aanwezigheid op de verschillende transcripten dient dus te worden nagegaan. Een aantal primers zullen slechts op één transcript voorkomen en enkel hierop worden afgebeeld. Bij het zoeken naar de primers werd eerst uitgegaan van het feit dat het gaat om een exacte match. Zoals in 2.4 werd besproken kan een ingegeven primer zowel een forward of een reverse primer zijn. Omdat bij het ingeven van de data door de submitters een omwisseling kon gebeurd zijn tussen de twee werd voor elke primer ervan uitgegaan dat deze zowel forward als reverse kan zijn. Een forward primer zal een perfecte gelijkenis hebben met een bepaald deel van de sequentie, maar bij een reverse primer diende het reverse complement te worden genomen. Hiertoe werd met behulp van de functie
3
H>
?
I
de sequentie eerst
omgedraaid en vervolgens elke T omgezet in een A (en omgekeerd) en een G in een C (en omgekeerd). J
3
H>
?
I M
41
Databankstructuur >
H> J
H>
?
; >
5
H>
2 H>
I; ?
I; > UUI M
M> OI M >
E4
M> O #; ;
"4
9 >
;
#4
9 >
;
04
9 > 9
;
M> O 0; M> O E; M> O ";
O O >
;
O
Zo wordt bvb. een sequentie ACTACTACGGGC eerst omgedraaid tot CGGGCATCATCA en vervolgens omgezet in het uiteindelijke reverse complement GCCCGTAGTAGT. Het zoeken op zich is dus eigenlijk eerst het testen op de aanwezigheid van de forward en indien dit niet het geval is testen of de reverse aanwezig is. Dit werd geïntegreerd in de functie
2H>
=>3
:I.
=>
Hierbij wordt bij een match de informatie
weggeschreven en meegegeven in een array. Deze informatie is het begin en einde van de primer (forward of reverse) alsook een bevestiging dat de primer is gevonden. J
2H> >J
5
=>3
9
J H>J 5 9 > :QGJ 5 >
:QGJ
5
>
:QGJ
5
>
:QGJ M
5
O
=>
3
H>
GGI M 9 GR >J
5
J
;
GR GR >J
GR >3
>
9
5
9 > >
:QG :QG :QG
>
:QG
I; 9
;
9
U
H>3
I
;
; 3
J H>
>
:I M = >3
H>
=
3
H>3
II;
GGI M 9 J
GR > GR
9 ;
GR > GR >3
;
9
U
H>3
I
;
;
O O >
:;
O
Op een gelijkaardige manier als bij de primers, kunnen ook de probes worden gealigneerd op het transcript. Hiertoe dient er slechts een kleine aanpassing te gebeuren aan de
2H>
=>3
=>
:I
functie.
42
Databankstructuur Het resultaat, nl.
23
9 H>
=>3
=>
:I
verschilt enkel in het feit dat
zowel de exacte match als de reverse match aanvaard worden. Oorspronkelijk werd zelfs gedacht enkel de forward te controleren, rekenend op het feit dat de submitters de probe in de juiste richting hadden toegevoegd, maar ervaring leerde dat dit niet steeds het geval is, dus dat een reverse controle noodzakelijk is. 5.2.2.3
Zoeken van match indien er één base verkeerd is Tot nu toe werd er steeds van uitgegaan dat er steeds een exacte alignering is tussen de
primer (respectievelijk probe) en de sequentie. Nochtans blijkt dit uit ervaring soms niet het geval te zijn. Zo kan het dat er zich bij het intypen van de sequenties in de databank een vergissing is gebeurd of dat er zich op het transcript een verandering heeft voorgedaan van een base door een mutatie of de aanwezigheid van een SNP (zie 2.3). Ondanks het feit dat er dus een schijnbaar verschil is tussen de twee sequenties zal in werkelijkheid de aanhechting toch gebeuren en dient de aanwezigheid van een klein aantal fouten te worden ingecalculeerd. Hiertoe werd een nieuwe functie gemaakt waarbij de gewone zoekfunctie wordt opgeroepen. Hierbij wordt echter eerst de primer (of probe) sequentie aangepast door telkens één karakter te veranderen door een ander. Op deze manier krijgt men dus voor elk karakter drie
nieuwe 2 J
sequenties
H>
=>3
die =>
moeten :I
worden
getest.
Als
voorbeeld
wordt
gegeven. Dit is de zoekmethode voor het vinden van
de eerste primer. Hierbij wordt steeds verdergezocht tot wanneer de forward of de reverse is gevonden. J J
H>T
2 J ; >T
> T J H > M
T :QGJ > >
H> =>3 => :I M H>3 I; >TUUI M
>3 5
; J
T :
GRZZ >
T M>TO #; 2H>
:QG
=>
T
J
T =>
GRZZH>3
M>TO
G#GII
M>TO
GEGII
M>TO
G0GII
:I;
O J H > M
:QGJ > >
5
J
T :
GRZZ >
T M>TO E; 2H>
:QG
=>
T
J
T =>
GRZZH>3
:I;
O J H > M
:QGJ >
5 T
J
GRZZ >
:QG
J
GRZZH>3
T M>TO 0;
43
Databankstructuur >
:
QGJ
5
2H>
=>
T
T =>
:I;
O J H >
J
GRZZ >
:QG
J
GRZZH>3
M>TO
G"GI
I M >
T
>
T M>TO "; :
2H>
=>
T
2 J
8H>
=>3
T =>
:I;
O O >
:;
O
De
functie
=>
:I
is
volledig
identiek
aan
voorgaande, met als enig verschil dat hier zal verdergezocht worden totdat zowel forward als reverse
werden
gevonden.
.
23
9
J
H>
=>3
9 =>
:I
tenslotte
volgt
eveneens dezelfde structuur en zal doorgaan totdat de probe is gevonden. 5.2.2.4
Zoeken van match indien er meerdere basen verkeerd zijn Ondanks het feit dat dit slechts héél uitzonderlijk het geval is, werd eveneens rekening
gehouden met het feit dat ook een tweede fout kan ingeslopen zijn in de sequenties (de kans op meerdere fouten is verwaarloosbaar en meer dan twee fouten zou tot het gevolg kunnen hebben dat de primers hun functionaliteit verliezen). Net zoals in vorige paragraaf werden 3 functies 28J 23
gemaakt, H> 9 8J
elk
=>3 H>
met
gelijkaardige
:I,
=> =>3
een
9 =>
28J :I).
structuur
8H>
=>3
(respectievelijk =>
Hier worden echter de “
2 J
:I
en
”-functies
opgeroepen i.p.v. de search functie.
5.2.3 Databankstructuur 5.2.3.1
Opvullen van de databank In een algemeen PHP-script, nl. alignprimers.php werd alle samengevoegd, zodat het
opvullen van de databank met de nodige informatie kan gebeuren. Hiertoe werd telkens per transcript gekeken welke primers die ingegeven waren voor het desbetreffende gen van toepassing zijn. Het opvullen gebeurde tot nu toe voor de mens, de muis en de rat (samen goed voor 99% van de databank). De transcriptsequentie wordt opgehaald zoals hierboven besproken met de functie >
?
2. ?
H>
3
I.
Een aantal waarden worden opgehaald uit de result-array en in variabelen gestoken, zodat het verderwerken hiermee gemakkelijker verloopt. De forward en de reverse ingegeven door de submitter worden hier respectievelijk
>3
en
>3
8
genoemd dit om te 44
Databankstructuur anticiperen op het feit dat bij het invullen van de databank een verwisseling kan zijn opgetreden. >3
D
>
>3
QG%6*B&6D* GRQ> R;
>
QGA!6,E6 GRQ> R;
8 > >
QG6&/&6.&GRQ> R; QG%6!(& GRQ> R;
>3 >3
9
>3
9 8 >
QG%6!(&8GRQ> R;
Vervolgens wordt via de functie
H>
I
de result-array (waar de assay-
informatie in terecht komt) leeggemaakt en worden alle variabelen op nul gezet. Als controle wordt bij zowel de primers als bij de probes bijgehouden of er effectief een match is en of er al dan niet een aanpassing is nodig geweest van een basepaar. Dit wordt telkens bewaard in afzonderlijke variabelen.
,
>3
>3
,
8
>3
en
9
>3
9 8
zijn
leeg indien er niet naar gezocht is, 0 indien er een perfecte match was, 1 indien er een fout aanwezig was, 2 indien er 2 fouten waren en 3 indien er geen match opgetreden is. De laatste controlevariabele
> 5
is leeg indien reverse of forward niet perfect matchen, 0 indien ze
2
correct waren ingegeven door de submitter en 1 indien er een omwisseling is opgetreden. Het aanpassen van de variabelen gebeurt tijdens de alignering. Het aligneren van de primers kan nu gebeuren. >3
wordt ingesteld op 0 en
de eerste primer wordt gezocht (exacte match) op de sequentie van het transcript en het resultaat wordt in de array
geschreven. Indien
>
noch als reverse noch als
>3
forward werd herkend, zal gezocht worden met toelaten van 1 fout en
>3
op 1
worden gezet. Indien dit nog geen resultaten oplevert, worden 2 fouten toegelaten en tevens aangepast. Tot slot wordt opnieuw gecontroleerd of er daadwerkelijk een
>3
match is (reverse of forward) en de rest van de lus wordt enkel uitgevoerd indien dit het geval is (enkel tijdverlies indien men zou verderzoeken, want de aanwezigheid van zowel forward als reverse is noodzakelijk). >3 >
; 2H>
J H >
QGJ
>
?=>3 5
J
2 J
>3
=>
GRZZ > H>
I; QG
?=>3
J =>
GRI M I;
;
O J H >
QGJ
5
>
28J
>3
8;
J
GRZZ > H>
QG
?=>3
J =>
GRI M I;
O J H > >3
QGJ
5
J
GRZZ >
QG
J
GRI M
-;
45
Databankstructuur O
M
S
Nu wordt ook de tweede primer gezocht op gelijkaardige wijze. Het zoeken zal nu worden voortgezet totdat zowel reverse als forward zijn gevonden. Opnieuw is er een aanpassing van de controlevariabele (>3 >3
8
;
> J H >
2H> QGJ 5
>
J
2 J
>3
8 QGJ
>
8H>
5
J
28J 8 QGJ
5
8
O
I; QG
?=>3
J 8=>
GRI M I;
GRYY >
QG
8H>
?=>3
J 8=>
GRI M I;
8;
O J H > >3
?=>3 8=> GRYY >
;
O J H > >3
).
8
J
GRYY >
QG
J
GRI M
-;
M
Slechts indien zowel de forward als de reverse zijn teruggevonden, worden de resultaten worden in de juiste variabelen gestoken en wordt de door de ingegeven primers (>3 en >
en
8)
>3
> 5
2
variabele berekend
te vergelijken met de berekende
>J
5
. >J
5
>J
5
>J >
5
>
QGJ
9
>
QGJ
>
>
3H>J 2
9
GR; GR;
QG
>
> 5
5 5 GR;
QG
9
J HH
GR;
QGJ
> >
>
5
9
QG
GR; GR;
5
=>3
I
IZZH
3H>
=>3
8I
II
5
=>3
8I
IZZH
3H>
=>3
I
II
;
J HH > 5
2
3H>J ;
Indien de informatie gekend is, dan kunnen de ampliconeigenschappen worden berekend. De sequentie van het amplicon (hier bewaard in $amplicon) is een substring van de transcript sequentie die loopt vanaf het begin van de forward tot het einde van de reverse. >
3
> >
3 3
>
3
9
H>J
5
9
H>J 5 2 > 3 9
H>
=> => > 3
?= >
3
9 9 9
I;
I; ; = >
3
2I;
46
Databankstructuur Het zoeken naar de probes (indien groter dan 5 basen lang) en het wegschrijven van de resultaten verloopt identiek aan het zoeken naar een primer, maar met dat verschil dat slechts doorgedaan wordt met zoeken totdat de probe is gevonden. J H
H>3 >3
9
I
I M
9
>
; 3
9
J H >
3 >
23
9
J
9 3
9 H> 9 J
?=>3
9
=>
3
9
I;
GRI M
9
H> >3
23 QG3 ?=>3
9
9
=>
3
9
I;
9
I;
;
O J H >
3 >
23
9 8J
9 3
QG3
H>
?=>3
>3
9
>3
9
9 J
GRI M
9 9
=>
3
8;
O J H >
3
9
QG3
9 J
GRI M
-;
O >3
9
>3
9
>3
9
9
>
3
> >
3 3
9
9 9
QG3 QG3
QG3
9 9 9
GR; GR;
9 GR;
O
Idem voor de tweede probe. Het wegschrijven van de data in de tabel
C/6.%'6# %6*B&6.8,
gebeurt met een insert
query. >
*1.&6# *1#! C/6.%'6# %6*B&6.8 /E)'&. HG>3 G>J G> G>3 G>3
5
G= G>J 9
5
9
G= G>
9 G= G>3 9 9 8 G= G>
> !"* J
5.2.3.2
5
G= G> 9 3
.$. E#&=G>3 9 8
G= G>J G= G>3 9 9 G=G> G=G>3
D
G= G> 3
G= G>
3
G=G> 5
G=
2G=
G= G>3 9 8G= G>3 3 G=
8
G= G>
G=
2G=G>3
9
9 89
G= G=G>3
G I ; !"*3 H>
H> I; H>
= >
I;
I;
Bespreking opvullen databank Via verschillende SQL statements te testen werd het opvullen van de databank
bekeken en de noodzakelijkheid van de veiligheden die zijn ingebouwd in de zoekfuncties. Een beknopt overzicht wordt hier gegeven.
47
Databankstructuur Vergelijking forward en reverse primers Het totale aantal records dat ingevuld werd in de nieuwe tabel (jvrspurt.primers2) is 4785, waarvan er 2904 een identieke primer_id hebben (soms meerdere transcripten per primerpaar). Dit werd berekend aan de hand van onderstaande SQL code: H3T 3 3T 3 D
52
H J3
:
D
I J 3J 3
T D
3T 3 D 3J 52 3T 3
3
3 I J D
3 7P T
8 3T= J3 3 3J 3
3
:
3
3J
8 3T= 8 7
D
Van deze 2904 werden er 2588 exact ingevoerd door de submitters (d.i. 89%), dit wijst er enerzijds op dat de alignering correct werkt (het percentage ligt voldoende hoog), maar anderzijds dat de uitgevoerde controles hun nut hebben (om andere 11% op te vangen). H J3 : 3 3T J 5
3T 3 3J 52 3J J 5
D 3T 3 3T
I J
T
D
3
3
3J 3
8 3T= D
3J
8
P
Van de 316 verkeerdelijk ingegeven primers, werden in 104 gevallen de primers gewoon omgekeerd (d.i. 3,5 % van het totaal). In al de andere gevallen werd dus 1 of 2 basen verkeerd ingegeven. Voor primer 1: 150 met 1 fout en 15 met 2 fouten, voor primer 2: 158 met 1 fout en 21 met 2 fouten (opgelet: het kan zijn dat er primers zijn waarbij zowel primer1 als primer2 fouten bevat). H J3 3T
: 5
3 2
3T 3 3J 52 G G
:
3T
3T 3
3
3J 52
3
G G H
J3
:
3T
3T 3
3
3J 52
3 :
3T
3 3
:
3 3
3
3
3J 3
8 3T= D
D 3T 3 D
I J
T
D I J
3
3
3J 3 T
3T 3
D
3T 3 D 3J 52 3T 3
I J D
T
I J
T
3
8 3T= D
3
3J 3
8 3T= D
3 3J 3
3
8 3T= D
8 G G H
J3 3T
T
D
G8G H
J3
I J
7
H J3
D 3T 3
3T 3 3J 52 8 G8G
D 3T 3 8
D
3 3J 3
3
8 3T= D
Vergelijking probes Van de assays waarvan zowel forward als reverse primer waren teruggevonden, kan men nu ook gaan kijken naar de efficiëntie van de alignering van de probes. Bij probe 1 zijn er 1104 correcte matchen, 42 met 1 fout en 0 met 2 fouten. 58 probes1 werden evenwel niet teruggevonden.
48
Databankstructuur H J3
:
3T
3T 3 D 3J 52 3T 3
3 3
9
G G
H J3 3T
:
3 3
3J 52 G G
9
J3
:
3T
3 3
9
:
3 3
D
I J
T
3T 3 78
D
3T 3 D 3J 52 3T 3
I J D
T
3 3J 3
3
8 3T= D
I J
T
3
3
3J 3
8 3T= D
3 3J 3
3
8 3T= D
G8G
H J3 3T
T
7 3T 3
H
I J D
3T 3 3J 52 G8G
9
D 3T 3
D
3
3
3J 3
8 3T= D
Idem voor probe2: 15 correct, 2 met 1 fout, 0 met 2 fouten en 3 niet teruggevonden. Vergelijking amplicon lengte Van de 2904 verschillende records, waren er oorspronkelijk 2310 (d.i. 79,5%) waarvan een ampliconlengte was meegegeven. Voor de overige 594 was de berekening dus reeds een verbetering, want hiervoor was nog geen lengte beschikbaar. H J3 3J
: 3
3T 3
3
3J 52 2
D
D
I J
3T 3 1'))
T
D 8-
3
3
3J 3
8 3T= D
Het feit dat er van de ingevulde ampliconlengte slechts 162 fout zijn ingegeven (d.i. 7%), bevestigt de correctheid van het berekenings algoritme, maar tevens de noodzaak tot het controleren van de ingegeven lengtes. Een aantal van deze fouten zijn gemakkelijk te verklaren. 54 van de ingegeven lengtes zijn net 1 base kleiner is dan de berekende waarde, dit is het gevolg van een veel voorkomende fout. Een amplicon dat bvb. begint bij base 5 en eindigt bij base 7 is niet 2 (2=7-5) maar 3 basen lang (5, 6 en 7), hier is waarschijnlijk een foutje ingeslopen. De waarden waarbij de amplicon lengtes niet veel verschillen (slechts 1 of 2 basen) kunnen dus als correct worden aanschouwd, bij de andere is er waarschijnlijk een andere reden die niet binnen het kader van deze thesis past. H J3 H3T
: 3 3
1')) J3 H3T
D
D
3T 3 3
3T 3
D
D
3J 52 3T 3 2 H3J 3
<8 H : 3 3 1'))
5.2.3.3
3T 3 3J 52 2 3J
I J
T
D D
3
2I
I J D D
3
3J 3
T
8 3T= D
3J 3
3 3
3J 3 2U II
D
2
8 3T= D 3J
3
D
2
-7
Structuur De uiteindelijke structuur is te zien in de appendices (IV.a). 49
Databankstructuur
5.3 Bespreking overige tabellen 5.3.1 Informatie over gen en transcript (zie appendices IV.b en IV.c) De informatie betreffende het gen en het transcript zit vervat in twee tabellen. In de eerste tabel (ens_gene) wordt de link gelegd tussen twee soorten id’s die een gen beschrijven. Enerzijds is er een Entrez-gene id, vroeger ook wel LocusLink id genoemd. Dit cijfer, afkomstig van het NCBI, is ook de oorspronkelijke id die gebruikt werd om genen te identificeren in de RTPrimerDB databank. Het tweede id is het Ens-gene id, afkomstig van Ensembl, waarvan de eerste drie letters steeds ENS zijn, gevolgd door een G voor de mens en een afkorting van de Latijnse naam en een G voor andere organismen (vb. MUSG voor de muis en RNOG voor de rat). Naast de twee id’s is vooral het chromosoom belangrijk voor gebruik bij de visualisatie. Deze informatie wordt immers meegegeven in de figuur. Van elk gen (gekenmerkt door het ens-gene id) worden alle transcripten samengevat in een tabel (ens_transcript). Een proteine id (ens-prot id) is aanwezig alsook de cDNA en de CDS lengte. Het Ensembl transcript id en het Ensembl prot id beginnen net zoals het Ensembl gen id waarbij respectievelijk T en P in de plaats komen van de G. De CDNA lengte is de totale lengte van het transcript (dus de som van alle exonen samen), terwijl de CDS lengte overeenkomt met het coderende gedeelte.
5.3.2 Informatie over de exonen (zie appendices IV.d) De informatie over de eigenlijke structuur van het transcript (dus over de exonen) zit bevat in 1 tabel (ens_exon). Per exon is er een record aangemaakt, waarbij naast de exon id ook een link zit naar het transcript waarop het zich bevindt (via transcript id). De waarden van het begin en het einde van zowel het exon als het coderend gedeelte wordt weergegeven op transcript niveau. Dit houdt in dat de positie relatief is ten opzichte van het begin van het transcript, deze is berekend uit de chromosomale positie. Ook een nummer dat de volgorde van de exonen beschrijft (rank) en het type exon is aanwezig.
5.3.3 Informatie over de SNP’s (zie appendices IV.e) Over de SNP’s is al de informatie verzameld in ens_snp. Het dbSNP id is meegegeven en per transcript wordt de chromosomale en de transcript start weergegeven. Deze transcript 50
Databankstructuur start waarde is dus de relatieve positie van de SNP (slechts één base). Ook het type van de SNP en het soort allel (welke base) dat een wijziging onderging is in de tabel ondergebracht.
5.3.4 Informatie over de proteïne domeinen (zie appendices IV.f en IV.g) De informatie over de proteïnen is bevat in twee tabellen. In ens_domain zit per ensprot id begin en einde van het domein (relatief ten opzichte van de start van het proteïne, dus eigenlijk het begin van het coderende gedeelte) opgelagen. Het Pfam id is een id eigen aan het interprodomein, afkomstig van Sanger. Via het interpro_id en het ens_prot_id kan de link worden gelegd naar de ens_interpro tabel, waar de informatie over het soort proteïne is samengevat via een korte en een uitgebreide beschrijving. Ook de waarde van de start van het proteïne is weergegeven. Omdat er een berekening nodig is voor het bepalen van start en einde van de domeinen op transcriptniveau is een view aangemaakt in de databank (ens_domain_view) om de opvraging van de juiste gegevens in de SVG te vergemakkelijken (zie 3.2.2). De query zorgt ervoor dat de juiste start en eindpositie wordt berekend. T T HT
3
T
3
3
3
D D D
D
D 3J
3
D 3
3 D D
3 = T D
3
= T
D 3
T
3
D
3
2
D
T
3
D
3
52
T
3
D
3
T
3
3 D
D
3
T
= D3
3
D 3 T
D
U
3 =
3
D
D T
3 D
I
J
3
3 D D3 D
=
I
D 3 D D
D
U
3 D 3
T
D
3
D D
3 D
D = HT
3
3
3 3
D
= D D3
D
51
Besluit
Hoofdstuk 6: Besluit De hoofddoelstelling van dit eindwerk was het ontwikkelen van een visualisatietool voor het voorstellen van primerparen op een transcript. Na allerlei aanpassingen en testen is aan deze doelstelling tegemoet gekomen. Hierbij werden gegevens uit een Oracle databank gebruikt om de figuur samen te stellen. De primers, peptidedomeinen en de SNP’s worden op de juiste positie weergegeven. Via een mouseover functie kan aan de gebruiker voldoende informatie worden weergegeven met betrekking tot de figuurelementen. Zowel de overzichtsfiguur van het transcript als de detailtekening van het primerpaar leveren een waardevolle aanvulling aan de reeds beschikbare gegevens. Op de website zijn een aantal pagina’s toegevoegd om de figuren op een goede manier in de context te plaatsen. Naast de figuur wordt een samenvatting gegeven van alle assays en kan via links naar andere websites meer informatie bekomen worden. Bij het assay report staat eveneens een link naar een kleine webpagina waarin het amplicon wordt afgebeeld in verschillende kleuren om onderscheid tussen primers, probes en het fragment te maken. Een serieuze verbetering van de data in de RTPrimerDB databank werd bekomen door van alle ingegeven primers en probes de posities op de verschillende transcripten te berekenen. Hiertoe werd een aligneringsscript geschreven waarbij rekening werd gehouden met de mogelijkheid dat fouten in de sequenties waren geslopen. Ook de ampliconlengte en – sequentie werden op deze manier berekend en in de databank opgeslagen. Dit zijn allemaal gegevens die voordien nergens beschikbaar waren. Tot nu toe is de primer- en probe-informatie verwerkt van de mens, de rat en de muis (samen goed voor 99% van de RTPrimerDB databank). In de toekomst dient worden gekeken hoe de uitbreiding kan gebeuren naar de andere organismen. Doordat via het aligneringsscript fouten zijn ontdekt in de primer/probe sequenties, is het nodig om de fouten aan te passen, maar ook om de submitters ervan op de hoogte te brengen.
52
Appendices
Appendices I.
PHP-bestanden voor aanmaken SVG’s.................................................. 54 I.a. I.b.
II. II.a. II.b. II.c. II.d. II.e.
III.
Svggene.php .........................................................................................................54 Svgprimer.php ......................................................................................................62
PHP-bestanden voor aanmaken webpagina’s..................................... 70 Gene_report.php ...................................................................................................70 Assay_report.php ..................................................................................................70 Amplicon.php .......................................................................................................70 Layout.php............................................................................................................70 Functions.php .......................................................................................................70
PHP-bestanden voor de alignering van de primers............................ 71
III.a. Alignprimers.php ..................................................................................................71 III.b. Alignfunctions.php............................................................................................71
IV.
Databankstructuur............................................................................... 72
IV.a. Primers2............................................................................................................72 IV.b. Ens_gene...........................................................................................................72 IV.c. Ens_transcript ...................................................................................................73 IV.d. Ens_exon ..........................................................................................................73 IV.e. Ens_snp ............................................................................................................73 IV.f. Ens_domain ..........................................................................................................74 IV.g. Ens_interpro......................................................................................................74
53
Appendices
I.
PHP-bestanden voor aanmaken SVG’s Omdat dit de voornaamste zijn, werden enkel de php-scripten die gebruikt werden
voor het aanmaken van de SVG’s, als illustratie in deze bijlage uitgeschreven. Voor de overige bestanden verwijs ik graag naar bijgevoegde CD-ROM.
I.a. Svggene.php 323 2
H "
:3 4
2 2
!"#$%&
N 2 ++
+
N
5
N
++,-"++ #
./0
+#6+./0+ # +
2 3
I; N
%'()*" N
34++555 5-
>
U
N
N
N
;
++&1N N
;
5
>D0&#Q
2 3
0&#
R;
++@@@@@@@@@@@@@@@F&#@EAFE)&1@/E1@ &@ E#E@@@@@@@@@ ++
J
>
T
>3 >
3
;
5
7 !"*)
++ :
>
!"*3
H>
H>
I;
!"* > !"*J
5
!"*A H>
++ :
!"*3
H>
!"*
H>
I;
>3 !"*J
5
!"*A H>
++
2.
= >?
:I;
:
H>
=>
!"*3
H>
H>
I;
!"* > !"*J
I;
J
3
= >? 2. I;
:I;
H>
=>3
I;
J
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D&K!1 ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G !6 &6 ($ 6E1L ;
G> >
I;
I;
9
>?
9
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G !6 &6 ($ EB%)*"!1D(&0*1 ;
G> >
=
J
9
>?
5
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D#6E1."6*%# ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G ;
G>
>?
=>3
9
>?
++
; H>
5
!"*A
2. H>
= >?
:I;
H>
=>
I;
I; 9
J
: .&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D0&1& = C/6.%'6# &1.D#6E1."6*%# C/6.%'6# &1.D !BE*1D/*&, ,F&6& &1.D0&1&D* &1.D0&1&D*
=
54
Appendices
G>
&1.D%6!#D* 3
> !"*
&1.D%6!#D*
!"*3 H>
>3 !"*J
5
&1.D#6E1."6*%#D*
G ; H> I;
!"*A
= >?
:I;
H>
=>3
2. H>
I;
I;
++
9
>?
:
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D.1% ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G !6 &6 ($ .1%D#6E1."6*%#D.#E6# ;
G> > !"*
!"*3 H>
> 3 !"*J
5
H> I;
!"*A
= >? 2.
H>
H>
++J 3
2 J N !"*) !JJH>
3
I;
9
+A!1#
2 J 9
9
=>
I;
9 T
J H> 2
:I;
I M 3
323N
9
+
:
9 +(
0 +%
;
I;
; O ++
9
!"*) !JJH> I; ++@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@F&#@EAFE)&1@/E1@ &@ E#E@@@@@@@@@ ++2 > 2
2 9 >D0&#Q
2
++9
2
>
5
++ >9
5
2
2 9
9 P
T
;
3
++9 >
>
H
I
++9
>9
>
R;
;
;
> >9
2
++ ++
; U
;
9
++ 9 QG" 1ED)&10#FGRQ R;
2 >
++
2 >9 ++ >J >3 ++
H>
>9
5
I+>
2; 2
8;
2
>3 7; >3 9 7;
++ ++
>J >3
++ ++
8; 7;
J ++ 5 ++J
; 5
++ S
T
I
J 2 5
3 3
HS
9
3 2
HS
T
I
9 3
3
55
Appendices > >
; 8;
++ ++
> >
3 8; 3 ;
++ ++
++ > >
: 5
9 3
T 8 ; 3: > T +8;
J : >
T ;
++2
: > J : 8@> T ; > :9 > :U> T +7;
++2 ++
> > > >
>
3
> :9U> T ; : > T ;
3: > 3:9 >
3:U> 3: >
:9 > : > T +7; : > : > T ;
++ ++2
>3
:
>3 >3 :
3 >3
:U>
2 >
> 2
93 9 T
3T
3T 3T H__
3
T I T +7;
T
++
3T
++
3T
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@
34++555 5+8 2 2 ; 3
2 ; @@@@@ 2
T
3
:9 >3 : > T +7; >3 : > T ;
2
T
3T
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ 9 2
2
3 3
++2 ++
>3
J
++ ++
: > 3: > T ; : > :U> T +7;
>
T
T
++2 ++2
T + ; T + ;
+
T 33
>
5
9
__
>
> : > 3: >
2
=
T
2
++2
2
T = +
++ ++
T 2 : > T ;
>3
3 33
J
+ 5(
5
2
> 5
>
`
T
5 2; 2;
3
@@@@@
J :
:3
+
Q" E#EQ J J
:4GE
J
:4GE
MJ
5
2 4
G; 3
MJ
5
G;
2
3 M 3 9 M
4V8 4
J 3
4 :; 4V ""<<;
M M M
4
9
>J
;
49
;J ;
4 3 5 5 5
; 4
;
:;O S 4 >3
24 24 24 5
5 ;
?
;J
S )
9
:;O
>3 ; O >3 9; O
>J 24 24
; O >3 ; > 5
49
;
5
24
>
49 49
; ;
5 5
24 24
>
; 24 ;
O O >
;
O
;
O 3 M 3 M
34
S 4
S ) ;J
<
M M 34
;J
4 3 2 4
;
2
3; >
O 3; ;
:48=8O
RR
56
Appendices
+
+ : J @@@@@ T
3
3 :3 Q" E#EQ J
2
+T
3
* J H
I M & A
J
(:* H * J
"2
HI
@@@@@
I;
H
I;
O J
* J HI M & A
"2
(:* H * J
HI
H
I;
I;
O RR +
3 323
J H>3
5
I M @@@@@ E 9
3 :
>3
3 :
:U>
5
2
@@@@@
9 T +7
J
:
+
323 H> Q R
>
I; ;
++ ++
: 5
5 5
: 5
3
S J H> ; > >3 5 ; > UUI M ++ 3 ++@@@@@@@@@@@@@@@@@(&6&L&1*10@%)EE#.@%6*B&6.@@@@@@ >9 ++9 > J
5
>9
3J >9 J
3J >9 3 3
++9 > 3
5
UH>3 3
QG6&/&6.&D(&0*1GRQ> R
J
3
I@>9
;
;
++
I@>9
;
3 >9
U>3
QG6&/&6.&D&1 GRQ> R@>9
;
3 J > J >9
>T
;
>3
: >3
52
H>9 >TUU; >3 : J H> =
QGA!6,E6 D&1 GRQ> R@>9
UH>3
++ >9 >
QGA!6,E6 D(&0*1GRQ> R
U>3
>9
5
3J; 3 ;
++9 ++
J J
++ :
; 3J >
>
Q>TRI M
T ; Q>TR 3
J
++2
++ I >
++ 3 Q>TR
;
T
T T = ++
5 T
J
3
9 TS T
S
O
57
Appendices
>
Q>TR >
>
3
H>
3 U8@>9 3 U>9
;
++
5
2
3JI+8;
++3
5
3
3 H2
> 3 : >3 : > T +7; ++3 3 ++@@@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@(&6&L&1*10@%)EE#.@%6*B&6.@@@@@@
S
I
H
I
++@@@@@@@@@@@@@@@@@#&L&1&1@\&)A@/E1@ &@%6*B&6.@@@@@@@@@
42 J * GRQ> R
:D
:
:8
>3
>9 :
3J
:
>3
(D* >
>3 3 : 5
+
: 8 * J HG6#%
>3 >3
QGA!6,E6 D(&0*1GRQ> R QGA!6,E6 D&1 GRQ> R 93RGI
:8
>3
: >9
:8
>3
:
3
J :
3
J
>
QG%6*B&6D* GRQ> R QGA!6,E6 GRQ> R
* J HI J :
5
GI
3J (
:
3
4
+
>3
:
8
>
>3
:
8
>
J
+
>3
* J HG6#% QG%6*B&6D* GRQ> R
>3 >3
QG6&/&6.&GRQ> R QG6&/&6.&D(&0*1GRQ> R
>3
:
+
>3 >3
>9
QG%6*B&6D 3
:
* J HI QG%6*B&6D* GRQ> R
>3
Q
323 6#% > 3
* J HG6#% ( QG%6*B&6D* GRQ> R
>3
Q
3
QG6&/&6.&D&1 GRQ> R * J HI 3 +
3 ( 3
: 4
93RGI
323 ++@@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@#&L&1&1@\&)A@/E1@ &@%6*B&6.@@@@@@@@ ++@@@@@@@@@@@@@@@(&0*1@#&L&1&1@/E1@ &@%6!(&.@@@@@@@@@@@@@@ J H>3 >9
QG%6!(& D(&0*1GRQ> R I M UH>3 QG%6!(& D(&0*1GRQ> R
3 9 >9
>
3 9 >9
:8
>3
U>3
>9 :
H>3 >3 Q
QG%6!(& D&1 GRQ> R@>9
3 9
:
>3
: 8 * J HG3 9
QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R QG%6!(& GRQ> R
>3 >3
I
> 323 2
I@>9
;
;
3 9 J 4
QG%6!(& D(&0*1GRQ> R QG%6!(& D&1 GRQ> R 93RGI
* J HI
3 9 + 323 J H>3 >9 >
3 98 >9 3 98 >9
QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R I M UH>3 QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R
I@>9
U>3
;
QG%6!(&8D&1 GRQ> R@>9
;
58
Appendices
:8 Q
>9 :
>3
3 98
:
>3 : 8 > * J HG3 9 84
>3 >3
QG%6!(&8GRQ> R QG%6!(&8D(&0*1GRQ> R
>3
QG%6!(&8D&1 GRQ> R
3 98
93RGI
* J HI
3 9 + 323 O O O ++@@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@#&L&1&1@/E1@ &@%6!(&.@@@@@@@ + 323 O J H>3
5
@@@@@ 3
I M 3 3 9 :
5 9
: >3
:U>
@@@@@
T +7
J
3 3
+
323 J
H> >9
I@>9 >
; > >3 3 >9 ; 3
>9
>3 >
U>3
>3 >3
QG !BE*1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9
;
QG%AEBD* GRQ> R; QG.F!6#D &."6*%#GRQ> R;
2 9 :
5 ; > UUI M UH>3 QG !BE*1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R
42
+%J + N >3 :N
J N 2
>3 8 N > N
34++555
N 3
N
* J HG3 3 * J HIN
N
+
N D9 :8 N >3 N 3
N :N
4 > N +
N >9
+
Q* 4 >3 N ;
3
N
RGIN
O + 323 O @@@@@
3 3
@@@@@ /
5 :
9 : >9 323 J H> >9 > >9 >
; >
>
>
>9 >9 >9 >9
@@@@@
2 9
3
:U> T +7 : >
:U>
@@@@@
J T +7
3 J
+ G +
5 ; > UUI M UH> U> UH> U>
QG&K!1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R QG&K!1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9 QG"! *10D.#E6#GRQ> R QG"! *10D&1 GRQ> R@>9
I@>9 ;
I@>9 ;
;
;
59
Appendices
>
>
> >
> QR >
QG&1.D&K!1D* GRQ> R; QG6E1LGRQ> R; ;
J H>
QG"! *10D.#E6#GRQ> R
J H>9 8 N >9
>9 N :8 N >
H
I Q&
9 4 > N + N ;
N 2 :8 N > >
N N
RGIN J H>
8 N > H
N I
>
N :8 N > I Q& 9
N
N
: N > * J HG
:N >
N I Q&
N
2
N >
* J HG N
RGIN
:N
9
4
N + N ; : N > :N
N
N
N > >
* J HIN
8 N > H
* J HIN
:N 4 >
N + N
N >9 N : N * J HG RGIN
N >9 :N
I M
I 2 :N
> * J HIN
;
O 2
N >9 N * J HG
N >
RGIN
:
N > >
N
:N
8 N > I Q&
H * J HIN
N 9
:8 N > 4
N
:N
N + N
;
O J
H>
; >
2 :8 N >
>
5 N >
:9N >
; > UUI Q> RN 8 N > N N + N ;
3
:
>
:U>
Q> RN
:
N >
T +7
: N
J
-G +
+ 323 J H>
3
5
I M
@@@@@ / 3
5 9
:
:
>
323 > 2 >3 J
H>
2
@@@@@
3:U>
T +7
J
.1% 3
+
QG"F6!B!.!B&GRQ R; ; >
>
> >
3 >9 39 >
> >
3
> 2
.1%G 9
3
UH> 3
> 3 > 3 3
>
5 ; > UUI M 3
QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R;
I@>9
;
QGE))&)&GRQ> R; QG (.1%D* GRQ> R; 3
QG.1%D"F6!BD.#E6#GRQ> R;
2 42
J N 2
N D9 :8 N > 3:9N H 2 > 3
3 RGIN
34++555 N
9 N > N
4
2
+.1%+
3 N : N > * J HG.1% 3
2 > 2 4> 2 3 N * J HIN
3D
3: N
I N
J
>
8 N > 4 > 39
4 > 3N +
+
3
N
3 N 93 Q J.1% * 4 N ;
60
Appendices O + 323 O @@@@@ / 2
5 >9 +
2
9
:
9
;
:
>
:;
S
8
@@@@@
>
;
:8
>
:;
323 >
>9
;
2 N 2 N
N
:
N >
:N
N
:
N >
3:N
3N + N >
2 2
N > N + ; N >
N
J H>
N
: N > +
>
:8 N >
:N
N J
N
; GI >J
2 G J H>
UH>93
H>
>
2
8
GI >J 2 G
; ;
GI >J
8
;
;
I@>9
N
:
N >
:N
; N >
N
:
N >
3:N
N
N +
N
3N + ; N >
2 N
N
>93 >93U>J > >9
;
I M N >
2
2
N
:9N
;
>9
52
:8 N >
;
>J >93 >J
8 N >
: N
N
GI >J 2 G8
J H>
N
;
N
2 G J H>
8 N >
N
: N >
>93 +
; UH>93
I@>9
8 N > 8 N >
: N
N
N N
N J
:8 N >
:9N
:8 N >
:N
N
;
;
O >
3
;
:
>
: ;
J
93 +
+ @@ # * J * J
5
3 >9
T :
>
J 9
J :
T J
S
@@ +
+ + @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@
61
Appendices
I.b. Svgprimer.php 323 2
H " 2 2
34++555 5-
5
+
I;
N ++,-"++ #
N
2
N N ++&1N
./0
+#6+./0+ # +
2 2
>3 >
U
N N %'()*" N
!"#$%&
N 2 ++
:3 4
3
N
;
;
5
0&#
>D0&#Q 3 3 >D0&#Q
R; R;
++@@@@@@@@@@@@@@@F&#@EAFE)&1@/E1@ &@ E#E@@@@@@@ ++ >
J T
>3 >
3
;
5
7 !"*)
++
=>3
9
>?
: E1
!"*3 H>
>3 !"*J
=
9
J
H> I;
5
= >?
!"*A H>
2. I;
++ :
!"*3 H>
> !"*J
G>3
G
:I; =>3
I;
J
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D&K!1 ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G !6 &6 ($ 6E1L ;
G> > !"*
I;
3
H>
9
>?
5
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# %6*B&6.8 ,F&6& %6*B&6D* &1.D#6E1."6*%#D* G> 3 G ;
> !"*
5
H> I; !"*A
2. H>
= >?
:I;
H>
=>
I;
I;
++ >?
; H>
9
J
: .&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D0&1& = C/6.%'6# &1.D#6E1."6*%# C/6.%'6# &1.D !BE*1D/*&, ,F&6& &1.D0&1&D* &1.D0&1&D* G>
&1.D%6!#D* 3
> !"*
!"*3 H>
>3 !"*J
5
&1.D%6!#D*
=
&1.D#6E1."6*%#D*
G ; H> I;
!"*A
2. H>
++
= >?
:I;
H>
=>3
I;
I; 9
>?
: G>
> !"* > 3 !"*J
.&)&"# @ A6!B C/6.%'6# &1.D.1% ,F&6& &1.D#6E1."6*%#D* 3 G !6 &6 ($ .1%D#6E1."6*%#D.#E6# ; !"*3 H>
5
H> I;
!"*A
= >? 2.
H>
H>
:I; =>
3
I;
I;
62
Appendices
++J
9 T
J H> 2
3
9
2 J N !"*) !JJH>
2 J 9
323N
I M 3 9
+
9
+A!1#
:
9 +(
0 +%
;
I;
; O ++ !"*)
9 !JJH>
I;
++@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@F&#@EAFE)&1@/E1@ &@ E#E@@@@@@@ ++9 2 9 > 5 ++2
2
>
2
2
++9 >9
; 2
9
< ;
++
2
T ;
> >9
P
; >9
>
++ 9
3
++ >
>
; U
; 2 3 QGEB%)*"!1D)&10#FGRQ R;
2 >3
>9
+>
++ >J
5 8;
++ >3
5 7;
2;
++ J
3 S
2 HS
T
2
3
I 5
2
HS
T
I
>3 9 7; >J 8; >3 > > >
7; ; 8; 3 >9
>
3
++ > T >3 > >3
; ; 5
9 3
8 ;
: >3 :U> T ; >3 : >3 :U> T +7;
> >
: > :9 >
3: > > 3:
9
:U> : >
:U> T ; > 3:U> T + ;
3:9 > 3: > T + ; : > 3:U> T ;
3 5
++2
33
H__
T
++
3T
++
3T
++2
T +7; T +7;
+ T
++2 ++2
>3 :9 >3 : > T +7; > : >3 :U> T ;
>
T
++2
: > T ; 3: > T +8;
> >
+
H__
T
++ ++ ++2
T 3
I
3
I
3T 3T 3
++
3
++
3
++2
63
Appendices > > >
:9 > : >
:U> T +7; :9U> T ;
3T J : > :U8@>
++ ++2
T ;
3T 93 9 T
++2
J
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ 9 2 2
2 > 2 @@@@@ T
T
T
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@
34++555 5+8 > 2 2 ; 3
+ 5(
5
2
> 5
>
5 2; 2;
3
2 ; 3
3 :3 Q" E#EQ J
2
+T
3
* J H
I M
J
& A
"2
(:* H * J
HI
H
@@@@@
I;
I;
O J
* J HI M & A
"2
(:* H * J
HI
H
I;
I;
O RR +
3 @@@@@ 2
J
`
T
@@@@@
J :
:3
+
Q" E#EQ J J
:4GE
MJ
5
2 4
;J
G;
4 3
3 M 3 9 M
4V8 4
J 3
4 :; 4V ""<<;
M M M
<
49 M
M 34
S ) 5 5 5
; 4
>J
9
:;O
24 24 24 5
5 ;
?
S 4
;
;J
>3 ; O >3 9; O
>J 24 24
; O >3 ; > 5
; 24
49
;
5
24
>
;
49 49
; ;
5 5
24 24
>
3;
O O >
;
O
;
O 3 M 3 M
34
;
2
>
O 3; ;
:48=8O
RR + : + J @@@@@
3
3 : 323 ++9 >9 >
5
@@@@@
9 : 9 >3 :U> T +7 9
9 9
>3 >3
J 9
3 2
+ 3
QGA!6,E6 D(&0*1GRQ R; QG6&/&6.&D&1 GRQ R;
64
Appendices ++9 >
9 9
H>9
9
H>
9 9
> ++
9
>9 >
3J >9 3J >9
> >9
3 > 3 >
3
>9 >
J > J >9
3J; 3 ;
>
3
>
3 : >3
5
H>
U ; 3JUH
U
5
+>9
I;
+>9
I;
J
3
+
9
2
3
H>3
QGA!6,E6 GRQ RI@>9
I;
H>3
QG6&/&6.&GRQ RI@>9
I;
; H
3 U>9 : >
3JI+8;
T +7;
++@@@@@@@@@@@@@@@(&0*1@#&L&1&1@/E1@ &@%6*B&6.@@@@@@@
:8
Q
>3
>9 :
:
>3
: 8 * J HG6#%
>3 >3
QGA!6,E6 D(&0*1GRQ R QGA!6,E6 D&1 GRQ R 93RGI
:8
>3
: >9
:8
>3
:
J
:
3
J :
5
4
* J HI
>3
:
8
>
>3
:
8
>
>3 >3 >3
QG6&/&6.&GRQ R QG6&/&6.&D(&0*1GRQ R QG6&/&6.&D&1 GRQ R 3
:
3
J
+
* J HG6#% QG%6*B&6D* GRQ R
>3
3J (
QG%6*B&6D* GRQ R QGA!6,E6 GRQ R
+ >9
J
>
>3 >3
3
Q
3J
3 ( 3
: 4
93RGI
* J HI
+
323 ++@@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@#&L&1&1@/E1@ &@%6*B&6.@@@@@@ ++@@@@@@@@@@@@@@@(&0*1@#&L&1&1@/E1@ &@%6!(&.@@@@@@@ J H>3 >9 > >
3 9 >9
9 @>9 ; 3 9 >9 U>3
>
9
:8
>3
@>9 >9 :
H>3 >3 Q
QG%6!(& D(&0*1GRQ R I M UH>3 QG%6!(& D(&0*1GRQ R QG%6!(& D&1 GRQ R@>9
; 3 9
:
>3
: 8 * J HG3 9
QG%6!(&8D(&0*1GRQ R QG%6!(& GRQ R
>3 >3
I@>9
I
> 323 2
QG%6!(& D(&0*1GRQ R QG%6!(& D&1 GRQ R 93RGI
3 9 J 4
* J HI
3 9 + 323 J H>3
QG%6!(&8D(&0*1GRQ R
I M
65
Appendices >9 >
9 >
3 98 >9 UH>3 @>9 ;
>
3 98 >9 9 @>9
:8
>3
U>3
I@>9
QG%6!(&8D&1 GRQ R@>9
;
>9
Q
QG%6!(&8D(&0*1GRQ R
3 98
:
>3
:
:
8
* J HG3
>
3 98
9 84
>3
QG%6!(&8GRQ R
>3 >3
QG%6!(&8D(&0*1GRQ R QG%6!(&8D&1 GRQ R 93RGI
* J HI
3 9 + 323 O O ++@@@@@@@@@@@@@@@&*1 &@#&L&1&1@/E1@ &@%6!(&.@@@@@@@ + 323 >
53 3 H>
J ; >
; >3
>9 I@>9
3 >
>9
J
>
9
3 9
>
5 ; > UUI M UH>3 @>9
>9 @>9
QG !BE*1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R ;
U>3
QG !BE*1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9
;
J H HH>9
3
>
IYYH>
3
>9
III >
53 3
;
O J H>
53 3
@@@@@ 3
I M 3 3 9 :
5 9
: >3
:U>
@@@@@
T +7
J
3 3
+
323 J
H> >9
; > >3 3 >9
I@>9 > 3
> >9
9 @>9 U>3
> >3
9 @>9 >3
>
>3
9
2 +%J
:
N >3
; QG !BE*1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9
; QG%AEBD* GRQ> R; QG.F!6#D &."6*%#GRQ> R;
J H HH>9 J H>9 J H>
5 ; > UUI M UH>3 QG !BE*1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R
3 3 3
> >9 > 42 >3
+ :N N N
IYYH> I >9
3 3
>9 >9
I >
3
J N 2 N
34++555 N D9
8 N > 3 N * J HG3 3 * J HIN
>
III M ;
; + N
N >9
:8 N >3 :N 4 > N 3
N +
Q* 4 >3 +
N
3
N
RGIN
;
O O
66
Appendices + @@@@@
3 3
@@@@@
323 O @@@@@ /
5 9
2
:
:
>
:U>
>9
@@@@@
9 T +7
:
>
:U>
J
3
T +7
J
+ G +
323 >9
>9 ; H> ; > >
J
>9 I@>9
5 ; > UUI M
>9
UH> 9 @>9
>
> >
9
>9 @>9
U> ;
9
>9 @>9
;
9
>9 @>9
U> ;
>9 > > > > >
QG&K!1D#6E1."6*%#D&1 GRQ> R@>9 UH>
>
QG"! *10D.#E6#GRQ> R
I@>9
QG"! *10D&1 GRQ> R@>9 QG&1.D&K!1D* GRQ> R; QG6E1LGRQ> R;
>
>
QG&K!1D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R ;
QR >
;
J H>
QG"! *10D.#E6#GRQ> R J H HH>9 > J H HH>9
IYYH> >9
I M >9 IZZH>
III M >
J H>9 J H>
> >9
J H>9 J H>
>9 I >9 > I >
J H>9 J H>
I >9 I >
>9
> >9
>
; ;
>9 ;
>
I >9 I >
>
III M
;
>9 ;
;
O J H>9 :
N >
>
:N
>9
8 N >9 N * J HG
RGIN 2
:8 N > :N > RGIN :
N >
>
J H> :N 8 N >
H N
2
N >9
:8 N > > H
I Q&
* J HIN N :
N N
* J HG * J HIN
N 9 ;
I 2 :8 N > 4 >
N
:N
N N >9
>
I Q& N + N
I N
N N >
:N
>
9
4
N + N 8 N >
H
I Q& N + N
N N >
; N 9
4
;
N
:N
N
RGIN
* J HG N
* J HIN
O O
J H HH>9
>
J H>9 J H> 8 N >
N
2 :8 N >
IYYH>
>9
III M
>9 I >9 > I >
>9 ;
;
N >9 :N
> N N
:
N > :N * J HG
>
67
Appendices H
I Q&
9 4 > N + N ;
N
RGIN
N
* J HIN
O O J H> ; > > HH> Q> R >9
5 ; > UUI J IZZH> Q> R >
2 :8 N >
N > N
:9N >
3
Q> RN N + N :
II
8 N > ;
>
:U>
Q> RN
:
T +7
N >
: N
J
-G +
+ @@@@@ / 323 > 5 J
5
3 J
H> > 3
2
@@@@@
;
; > >9
> 3 5 ; > UUI M UH> 3 QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R
> 9 J HH> 3 O J H>
.1%G
5
@>9 >9
; I ZZ H>
3
>
II >
5
3
I@>9
;
3I M 3
9 :
: >
9
3:U>
T +7
J
.1% 3
+
323 > 2 J >
>3 H> 3
> >
QG"F6!B!.!B&GRQ R; ; > >9
> 3 5 ; > UUI M UH> 3 QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R
9
> >
@>9 3
39
>
3
> 3 > 3
:8 N > H 2 >
3
; QG.1%D#6E1."6*%#D.#E6#GRQ> R; QGE))&)&GRQ> R; QG (.1%D* GRQ> R;
> 2 3 > 3 J HH> 3 >9 42
I@>9
QG.1%D"F6!BD.#E6#GRQ> R; I ZZ H> 3 > II 2
J N 2 34++555 N D9 N
9 N >
3:9N 3
2 3 N :
N 2 > 2
4
RGIN
N
+.1%+ 3D N > 3: N
* J HG.1% 3 4> 2 3 I * J HIN
J 8 N >
4 > 4 >
39
N
3N +
+
S
@@@@@
> 3 3 N Q N
N
93 J.1% * 4 ;
O + 323 O @@@@@ #
5 > >9 +
3
9 ;
2 : :
9 >
: ;
;
:
>
:;
9
>
9
;
J 8
>
93 + ;
:8
>
:;
323 >
2
>
68
Appendices J H>
2 J H>
I >J 2
J H>
2
8
>J J
H>93 > J H>93[>J >
>9 N
9
U>93@>9 N >
>
N > 3N +
2 N
;>93UUI M
N
:
9 N >
@>9 :N
N
:
N >
3:N
; 8 N >
N
:8 N >
:9N
;
2
2
;
;>93 > I M
N +
N
8 ;
I >J ;
9
2
; I >J
N
; N > >93 +
N
: N > N
: N
8 N > N J
N
:8 N >
:N
N
;
O O + 0
3.2 5* J * J
>9
:
>
J :
J
+
+ +
69
Appendices
II. PHP-bestanden voor aanmaken webpagina’s Wegens de omvang van de scripten en omdat de belangrijkste zaken reeds op de juiste plaats in de thesis zijn weergegeven, is geopteerd voor de broncode enkel mee te geven op de bijgeleverde CD-ROM. Hierna volgt een korte uitleg over de verschillende meegeleverde bestanden.
II.a. Gene_report.php Het script verantwoordelijk voor het aanmaken van de overzichtspagina van een gen. Deze pagina is nieuw aangemaakt om de figuur in z’n juiste context te plaatsen en gebruikt een aantal functies en elementen van reeds bestaande pagina’s van de RTPrimerDB website. De lay-out en functionaliteit is zoveel mogelijk in de lijn van de site gehouden.
II.b. Assay_report.php Het script verantwoordelijk voor het aanmaken van de overzichtspagina van de assay. Deze pagina bestond al en is hier aangepast om de figuur te kunnen weergeven.
II.c. Amplicon.php De data, die meegekregen wordt via de get-methode, wordt verwerkt om in een klein kadertje de ampliconsequentie op een goede manier weer te geven.
II.d. Layout.php De reeds bestaande pagina, meegegeven als bijlage, omdat er regelmatig van gebruik gemaakt wordt om o.a. de hoofding en onderschrift van de webpagina’s weer te geven.
II.e. Functions.php Een pagina die de voornaamste functies bevat die op de website worden gebruikt. Omdat ook in de nieuwe pagina’s wordt gebruik gemaakt ervan, is dit script meegegeven als bijlage.
70
Appendices
III. PHP-bestanden voor de alignering van de primers Wegens de omvang van de scripten en omdat de belangrijkste zaken reeds op de juiste plaats in de thesis zijn weergegeven, is geopteerd voor de broncode enkel mee te geven op de bijgeleverde CD-ROM. Hierna volgt een korte uitleg over de verschillende meegeleverde bestanden.
III.a. Alignprimers.php Dit script bevat alle functionaliteit om van elk gen uit de databank op elk transcript alle bijhorende primers/probes achtereenvolgens te controleren op de aanwezigheid. Alle data wordt vervolgens samen met foutencodes weggeschreven in de databank.
III.b. Alignfunctions.php De functies zoals searchprimer en complement, die worden gebruikt in alignprimers.php zijn gebundeld in dit script.
71
Appendices
IV. Databankstructuur IV.a. Primers2 Overzicht van de structuur van de primertabel. Slechts de eerste drie records zijn gegeven van MYCN (Locuslink_id is 4613). Query: @ J %6*B&6D*
<<
T
3
3
8 52
)!"'.)*1LD*
)!"'.)*1LD* 7< -
A!6,E6 #""E0"E0E#0""E"E#EE00
7< 7< -
""000"E#0E#"#0"EE 0E#0EE0E#0E#0EE0E00EE0E#
6&/&6.& "0"EEEE0""E""#"#"E##E
A!6,E6 D(&0*1 A!6,E6 D&1 8 < --
6&/&6.&D(&0*1 6&/&6.&D&1 P
""0""0EE0#E0EE0#"E#"## 8-
8 P
"E#"0###0E00E#"E0"#"
EB%)*"!1D)&10#F
%6!(&
G7< -G
P
EB%)*"!1 #""E0"E0E ####0"0 ""000"E#0
"00"00
0E#0EE0E#
0""0E#0
%6!(& D(&0*1 %6!(& D&1
1')) 1')) "EE"E""EE00"#0#"E""E"E##
P<
%6!(&8
%6!(&8D(&0*1 %6!(&8D&1
1')) 1')) E""E#"E"#0#0"0#"""EE0EE
-8
E)*01 E#& E#& &66!6%6*B&6 8 BE$ 8 8
P
-
EB%)*"!1D(&0*1 &1.D#6E1."6*%#D* &1.# 8 7< &1.# 8 7--
&66!6%6*B&68 .,*#"F&
&1.#
&66!6%6!(&
8
7-
&66!6%6!(&8
BE$ BE$
IV.b. Ens_gene Structuur van de tabel waarin de link wordt gelegd tussen de verschillende gen-id’s, de record is gegeven waar het entrez_gen_id (ook wel locuslink_id genoemd) gelijk is aan dat van MYCN (4613). Query: @ J
T
3
D
52
SD
D
G7< -G
72
Appendices &1.D0&1&D* &1#6&\D0&1&D* &1.0 -7-8- 7< -
"F6!BD.#6E1
"F6!B!.!B& (E1 8 387 -
IV.c. Ens_transcript Structuur van de tabel waarin de transcriptinformatie zit bevat, de records zijn gegeven van de transcript van MYCN (met ens_gene_id gelijk aan ENSG00000134323). Query: @ J
T
G&1.0
3
D
3
52
D
&1.D#6E1."6*%#D* &1.# 8
&1.D0&1&D* &1.D0&1&D* &1.D%6!#D* &1.0 -7-8- &1.% 8
&1.# &1.#
&1.0 &1.0
8 -8
D
-7-8-G
7-
-7-8- &1.% -7-8- &1.%
8 -
" 1ED)&10#F " .D)&10#F -P< --
7- 877 88 -
-
IV.d. Ens_exon Structuur van de exontabel, de records zijn gegeven voor één bepaald transcript van MYCN (ens_transcript_id = ENST00000281043) Query: @ J G&1.#
T 8
&1.D&K!1D* &1.& 87 &1.&
-
3
D
52
D
3 D
7-G &1.D#6E1."6*%#D* &1.# 8 7-
< - &1.#
8
&K!1D"F6!BD.#E6# &K!1D"F6!BD&1 < -8<77 < -- P7
7-
< -<8 -
&K!1D#6E1."6*%#D.#E6# &K!1D#6E1."6*%#D&1 -8
877
< -PP8
"! *10D.#E6# "! *10D&1 78 -8
6E1L
#$%& D D3
8
D-
-<
D3
IV.e. Ens_snp Structuur van de snptabel, de records zijn gegeven voor één bepaald transcript van MYCN (ens_transcript_id = ENST00000281043) Query: @ J G&1.#
T 8
3
D
3 52
D
3 D
7-G
73
Appendices (.1%D* 7 8< 8 < 88
&1.D#6E1."6*%#D* &1.# 8 7-
.1%D"F6!BD.#E6# .1%D#6E1."6*%# .1%D#6E1."6*%#D.#E6# D.#E6# #$%& E))&)& < -P
&1.#
8
7-
< -P< -
8-88
-
"+#
&1.# &1.#
8 8
77-
< -P < -P
88 P <
-
E+" "+#
IV.f. Ens_domain Structuur van de domaintabel, de records zijn gegeven voor één bepaald proteïne van MYCN (ens_prot_id = ENSP00000281043) Query: @ J
T
&1.%
8
*1#&6%6!D* *%6 8
%AEBD* %A
*%6
%A
87
3
D
52
D3
D
G
7-G
&1.D%6!#D* &1.% 8 7-
< &1.%
8
!BE*1D#6E1."6*%#D.#E6# 77
7- 8
!BE*1D#6E1."6*%#D&1 7
IV.g. Ens_interpro Structuur
van
de
interprotabel,
waarbij
het
ens_prot_id
gelijk
is
aan
ENSP00000281043 (MYCN proteïne). Query: @ J *1#&6%6!D* *%6
8
T
3
.F!6#D &."6*%# F)FD9
( 2
D
3
)!10D &."6*%# 2 3
52
D3
D
G&1.%
%6!#D#6E1."6*%#D.#E6#
8
7-G
&1.D%6!#D*
78
&1.%
8
7-
78
&1.%
8
7-
9F)F *%6
87
#ADB:
#
3 B:
74
Referenties
Referenties Referenties: PATTYN, F. (2002). Creatie van een publieke databank voor real-time PCR primers. Scriptie Universiteit Gent, 135p. VERSPURTEN, J (2004). Cryopreservatie van Hydrangea serrata cv. ‘Bluebird’. Scriptie Universiteit Gent, 86p. De eigen website: Homepage: http://medgen.ugent.be/~jvrspurt/rtprimerdb/ Voorbeelden gene report en assay report: http://medgen.ugent.be/~jvrspurt/rtprimerdb/gene_report.php?genid=4613 http://medgen.ugent.be/~jvrspurt/rtprimerdb/assay_report.php?RTPrimerDB_ID=1197 Andere websites: http://laxmi.nuc.ucla.edu:8888/Libraries/Images/MOLECULAR_BIOLOGY/gene_str ucture.gif http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/ http://medgen.ugent.be/SQL/ http://nl.wikipedia.org/wiki/Hoofdpagina http://whyfiles.org/075genome/ http://www.carto.net/papers/svg/samples/ http://www.ensembl.org http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed http://www.patho.unibas.ch/molpath/english/diagmethoden/PCR/method.htm http://www.php.net/ http://www.sanger.ac.uk http://www.w3.org/TR/SVG/
75
