A pha1 és pha2 géncsoport szerepe Agrobacterium tumefaciensben Diplomamunka
Készítette: Csoknya Julianna biológus hallgató
Témavezetı: Dr. Putnoky Péter
PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
PÉCS, 2008.
2
TARTALOMJEGYZÉK 1. Irodalmi áttekintés
4
1.1. Bevezetés 1.2. Az Agrobacterium tumefaciens és az általa okozott tumorképzıdés folyamata 1.3. A tumorképzıdésben szerepet játszó gének 1.4. A pha gének szerepe
4 4 6 6
2. Célkitőzések
9
3. Alkalmazott anyagok és módszerek
10
3.1. Baktériumok, plazmidok 3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése 3.3. Összes DNS izolálása 3.4. Polimeráz láncreakció 3.5. Fragment izolálás 3.6. DNS ligálás, transzformálás 3.7. Plazmid DNS izolálása 3.8. Emésztés restrikciós endonukleázokkal és agaróz gélelektroforézis 3.9. Transzpozonos mutagenezis 3.10. DNS-szekvencia meghatározás 3.11. Baktériumok keresztezése, mutánsok elıállítása 3.12. Tesztnövények fertızése 3.13. Agrobaktériumok visszaizolálása tumorszövetbıl 3.14. Fiziológiai kísérletek
10 10 11 11 13 13 14 14 14 15 15 15 15 16
4. Eredmények és megvitatásuk
17
4.1. A pha1 és pha2 szekvenciák izolálása 4.2. Mutáció elhelyezése a phaA1 és a phaA2 szekvenciákban 4.3. A pha mutációk klónozása konjugatív vektorba 4.4. A pha mutánsok elıállítása homológ rekombinációval 4.4.1. A phaA2 mutánsok elıállítása 4.4.2. A phaA1 mutáns elıállítása 4.4.3 Újabb phaB1 és phaE1 mutációk elıállítása 4.5. A phaA2 mutáns fiziológiai jellemzése 4.6. A phaA2 mutáns és a tumorképzıdés
17 17 19 20 21 21 23 24 26
5. Összefoglalás
28
6. Irodalomjegyzék
29
7. Köszönetnyilvánítás
32
3
1. Irodalmi áttekintés 1.1. Bevezetés Napjainkban a genetikai munkát nagymértékben elısegíti a genomprojektek elırehaladása. Baktériumok közül már több mint 300 törzsnek meghatározták a teljes genomszekvenciáját. Az így nyert adatok kiindulópontjai lehetnek a különbözı kutatási témáknak. A pontos nukleotidszekvencia meghatározásával és különbözı bioinformatika eszközökkel, internetes adatbázisokkal való összehasonlítás útján, információkat kaphatunk arról, hogy mi lehet az adott gének feltételezett funkciója. A feltételezések helyességének bizonyítására el kell készíteni a vizsgálni kívánt gének mutáns alléljait, és segítségükkel tanulmányozható a gének tényleges szerepe. Ez a folyamat a „fordított genetika”. 2001-ben elkészült az Agrobacterium tumefaciens genomszekvenciája is (10). Ez nagymértékben hozzájárult ahhoz, hogy az A. tumefaciens génekrıl többet megtudjunk, valamint rávilágított arra is, hogy milyen géncsoportok vizsgálatával érdemes a késıbbiekben foglalkozni.
1.2. Az Agrobacterium tumefaciens és az általa okozott tumorképzıdés folyamata Az A. tumefaciens a Rhizobiaceae családba tartozó, Gram-negatív, spórát nem képzı, aerob mikroorganizmus. Talajbaktérium, amely a kétszikő növényeket sebzési helyeken fertızi. A fertızött növényeken tumorszövet alakul ki. Ez a daganatos elváltozás már a XIX. század óta ismert növényi betegség, amely súlyos károkat okoz a növénytermesztésben. A betegség eredetét, a tumorképzıdés folyamatát már régóta vizsgálják mind biokémiai mind genetikai szempontból. A
fertızést
a
sebzett
növényi
szövetekbıl
felszabaduló
fenolvegyületek
(pl.:
acetosziringon) indukálják (22). A lejátszódó folyamat során az Agrobacterium genetikailag transzformálja a növényi sejtet. A pathogén agrobaktérium törzsek rendelkeznek egy nagymérető, körülbelül 200 kilobázis nagyságú plazmiddal, amelyet a funkciója alapján Ti (tumort indukáló) plazmidnak neveztek el (1. ábra). A Ti plazmid egy része a T-DNS (transzfer DNS), amely a fertızés során bejut a növényi sejtmagba és beépül a növény kromoszómájába (8, 29, 37). A T-DNS egy jobb és egy bal oldali határoló szekvenciával rendelkezik (LB, left border; RB right border), amelyek 25 bázispár nagyságúak. A határolószekvenciák közötti régióban lokalizálódnak a tumoros növekedésért és az opinszintézisért felelıs gének. A tumorszövet kialakításában szerepet
4 játszó gének növényi növekedési hormonok bioszintéziséért felelıs fehérjéket kódolnak. Ezek túltermelése felborítja a normális növényi sejtosztódási folyamatokat, és tumoros növekedést indít el (9, 35). Az egyik ilyen hormon az auxin (indol-3-ecetsav, IAA), melynek bioszintéziséért az iaaM és az iaaH gének által kódolt enzimek, a triptofán-mono-oxigenáz és az indol-3-acetamid-hidroláz a felelıs (7). A másik hormon a citokinin, amelynek képzıdését az AMP-izopentenil transzferáz enzim irányítja, amelyet az ipt gén kódol. A keletkezı vegyület az izopentenil-AMP, amelyet a növény által kódolt enzimek alakítanak át citokininné.
1. ábra Az agrobaktérium fertızés folyamata (A) A talajban élı baktériumok a növényeket a sebzési helyeken fetızik; (B) Az A. tumefaciens sejtekben található Ti-plazmid tartalmazza a növényt transzformáló T-DNS szekvenciát, amely auxin és citokinin bioszintézis géneket hordoz; (C) A transzformált növényi sejtbe beépül a T-DNS; (D) A transzformáció következtében kialakult tumor vagy „gyökérgolyva”.
A másik lényeges változás a növény anyagcseréjében az, hogy az agrobaktérium a fertızött növénnyel opinokat termeltet. Ezek a vegyületek tumorsejtekbıl választódnak ki, eljutnak a környezı szövetekbe, illetve a gyökéren keresztül a környezetbe (23, 24, 31). A különbözı Agrobacterium törzsek csak az általuk felhasználható opinokat termeltetik a növénnyel, szénés nitrogénforrásként hasznosítják ıket, és ezzel kizárólag saját fennmaradásukat segítik elı (5). Az opinok aminosav származékok, egy aminosav és egy szerves sav vagy egy aminosav és egy cukor összekapcsolódásával keletkeznek (4). Példaként említhetjük az oktopint, amely
5 az arginin és a piruvát, vagy a nopalint, amely az arginin és az α-ketoglutarát kondenzációjával jön létre.
1.3. A tumorképzıdésben szerepet játszó gének A T-DNS növényi sejtmagba való transzportálásában a kromoszomális (chv) valamint a Ti plazmidon található (vir) virulencia gének vesznek részt. Ha a vir gének nem mőködnek, akkor nem játszódik le a tumorképzés folyamata. A vir (virA-virH) gének különbözı Vir fehérjéket kódolnak, amelyek egymás után aktiválódva elısegítik a T-DNS növényi sejtmagba való átjutását. A nukleáris importban a nukleáris lokalizációs szignáloknak (NLS) van fontos szerepe. A kromoszómába való integrálódáshoz a H2A-1 hiszton is szükséges, amely a fertızött növény által termelt fehérje (25). Az integráció random módon történik, mivel a magasabbrendő növények genomjában nincsenek homológ T-DNS szekvenciák, ezért ezt a folyamatot nem-szabályos („illegitimate”) rekombinációnak nevezték el (16, 34). A kromoszomális virulencia gének (chvA, chvB) a baktériumok növényi sejtfalhoz való kötıdésében fontosak (20), illetve a megfelelı ozmotikus viszonyok kialakításában játszanak szerepet. A chvB fehérje a β1,2-glükán nevő poliszaharid szintézisében (36), a chvA pedig ennek a transzportjában (2) vesz részt. A termelt poliszaharidok nagy mennyiségben találhatók a periplazmatikus térben, és az ozmotikus adaptációt segítik. A chv gének mellett ismertek más baktériumokból olyan gének, amelyek a környezethez való jobb alkalmazkodást teszik lehetıvé. Ilyenek a pha gének is.
1.4. A pha gének szerepe Elıször egy alkalofil Bacillus törzsben, majd Bacillus subtilis esetében is leírtak egy géncsoportot, amely a NADH ubiquinon oxidoreduktáz (komplex I) membránba ágyazott alegységeihez hasonló fehérjéket kódol, és fontos a pH-homeosztázis fenntartásában. A mutánsok fiziológiai jellemzésébıl kiderült, hogy e géneknek szerepe van a Na+transzportban is, és feltehetıen egy Na+/H+ antiporter alegységeit kódolják (11, 19, 32). Azóta számos baktériumban találtak hasonló gécsoportokat, amelyek különbözı elnevezést kaptak, így hívják ıket mrp (multiple resistance and pH adaptation), mnh (multisubunit Na+/H+ antiporter) vagy sha (sodium/ hydrogen antiporter) géneknek is (12, 15, 18). Sinorhizobium meliloti 41 baktérium törzsbıl is izoláltak egy hasonló géncsoportot, amely a pha elnevezést kapta a „pH adaptation” kifejezés rövidítéseként (28). E géncsoport érdekessége, hogy a mutánsok, szemben az összes többi esettel, a K+-transzportban hibásak és nem képesek szimbiózist kialakítani a megfelelı gazdanövényekkel. Fiziológiai vizsgálatok,
6 így az iontranszport-kísérletek mind arra utalnak, hogy a pha géncsoport (phaABCDEFG gének) egy K+-efflux rendszer alegységeit kódolja, amely feltehetıen egy K+/H+ antiporter. Az S. meliloti 1021 és az A. tumefaciens c58 törzsek teljes DNS-szekvenciájának meghatározása után kiderült, hogy kettı, hasonló felépítéső pha géncsoport is van mindkét genomban (2. ábra). A már jellemzett, K+-transzportban szerepet játszó géncsoport a pha1, míg a másik, még ismeretlen funkciójú csoport, a pha2 elnevezést kapta (3, 6, 10).
2. ábra: Az A. tumefaciens pha1 és pha2 géncsoport felépítése A phaA1 gén egy fúziós fehérjét kódol, amely a PhaA és PhaB fehérjéket meghatározó leolvasási keretek fúziója révén jött létre. A kísérleteinkben PCR segítségével izolált DNS-szakaszok helyzetét a szürke csíkok jelzik.
A tanszékünkön történt szekvencia elemzések szerint, az egy genomon belüli két csoport által kódolt, homológ fehérjék között nem túl nagy a hasonlóság (3. ábra). Az S. meliloti pha1 mutánsok fenotípusa (K-érzékenység) is arra utal, hogy a két csoport funkciója – legalábbis S. melilotiban, – nem lehet azonos. Bár a két géncsoport több más baktériumban is együtt fordul elı (3. ábra), az elemzés alapján nem rendezhetık a funkciót tükrözı két elkülönülı +
+
csoportba. A bizonyítottan Na /H antiportert kódoló B. subtilis gének köré sem szervezhetı +
+
egy elkülönült csoport, és nem különíthetık el a K /H antiportert kódoló pha1 géncsoport homológjai sem. Valószínő, hogy az pha gének elterjedésében szerepet játszó horizontális géntranszfer (17) okozhatja ezt az ellentmondást. Azt feltételezhetjük, hogy ha két géncsoport +
+
+
+
található egy baktérium genomon belül, akkor az egyik Na /H , a másik pedig K /H antiportert határoz meg.
Munkánk kezdetekor az A. tumefaciens mindkét géncsoportjának valódi funkciója még ismeretlen volt. Ezért döntöttünk úgy, hogy a „fordított genetika” eszközeivel elkészítjük a pha1 és a pha2 régióban hibás mutáns törzseket, és segítségükkel megpróbáljuk igazolni a gének általunk feltételezett funkcióit. Elképzeléseink szerint a pha1 régió egy K+/H+-, a pha2 régió pedig egy Na+/H+ antiporter felépítésében játszik szerepet. Ezek alapján azt várjuk, hogy
7 a pha1 mutáns K+-, a pha2 mutáns pedig Na+- érzékeny lesz. Feltételeztük azt is, hogy az A. tumefaciens pha1 mutáns - a megfelelı S. meliloti mutánsokhoz hasonlóan - esetleg képtelen lesz a növényi szöveteken belüli szaporodásra, vagy a tumorképzésre.
3. ábra: A PhaA fehérjék rokonsági fokát mutató törzsfa Atu: Agrobacterium tumefaciens, Bfi: Bacillus firmus, Bha: B. halodurans, Bsu: B. subtilis, Bme: Brucella melitensis, Lin: Listeria innocua, Lmo: L. monocytogenes, Sau: Staphylococcus aureus, Sme: S. meliloti, Vch:Vibrio cholerae. Az ábra nem a baktériumok rokonsági fokát tükrözi, mert a pha gének horizontális géntranszferrel is bekerülhettek az egyes törzsekbe (17).
8
2. Célkitőzések Munkánk során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy mi a szerepük a pha géncsoportoknak az Agrobacterium fertızés során? Ennek érdekében a következı célokat tőztük ki magunk elé:
1. mutációk létrehozása az A. tumefaciens pha1 és pha2 géncsoportokban, 2. a mutációk iontranszportra gyakorolt hatásának vizsgálata, 3. a mutációk tumorképzésre, a baktériumok tumorszövetben való szaporodására kifejtett hatásának vizsgálata.
9
3. Alkalmazott anyagok és módszerek 3.1. Baktériumok, plazmidok A munkánk során alkalmazott baktériumtörzsek, valamint plazmidok jellemzıit az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat: Baktériumok, plazmidok Törzs Jellemzık
Forrás
Escherichia coli XL1 blue recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,lacZ ∆M15,TcR CsJ4380 XL1 blue pBS EcoRV::phaA1 PCR fragment, A.t.c58, AmpR CsJ4381 XL1 blue pBS EcoRV::phaA2 PCR fragment, A.t.c58, AmpR CsJ4393 XL1 blue p4380::ET-KanR-3, AmpR, KmR CsJ4394 XL1 blue p4381:: ET-KanR-3, AmpR, KmR CsJ4395 XL1 blue p4381:: ET-KanR-3, AmpR, KmR CsJ4396 XL1 blue pPAG160 phaA1::ET-KanR-3(4393), SpcR, KmR CsJ4397 XL1 blue pPAG160 phaA2::ET-KanR-3(4394), SpcR, KmR
(1) ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka
Agobacterium tumefaciens PP4398 A.t.c58 RifR CsJ4422 PP4398 phaA2::ET-KanR-3(4397), KmR, RifR, NaS CsJ4450 PP4398 phaB1::pCU999, RifR, KmR, SmR CsJ4451 PP4398 phaE1::pCU999, RifR, KmR, SmR
Putnoky P. ez a munka ez a munka ez a munka
Plazmidok pBS pBluescript SKII(+/-), klónozó vektor, AmpR pCU101 CmR helper plazmid - pPAG160 pPAG160 konjugatív vektor, pSEM155 származék, SpR/StrR pCU999 kanamicin rezisztenciagén mutagenezishez Transzpozon származékok ET-KanR-3 Mu Entranceposon KanR-3 (F779), TGS-II kit
STRATAGENE,
USA (33) Papp Péter (27)
FINNZYMES, Fi
A.t. = A. tumefaciens,
3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése A vad típusú Agrobacterium tumefaciens törzset TA (26) komplett táptalajon növesztettük két éjszakán át. Az Escherichia coli törzsek felnövesztése LB (30) táptalajon történt egy éjszakán át. A mutáns A. tumefaciens törzsek esetében speciális LBTA (1% Bacto tryptone, 0,5% Yeast extract, 20 mM Tris (pH:7,2), 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 1,5% agar) táptalajt használtunk. A táptalajokhoz megfelelı koncentrációjú antibiotikumot adtunk (2. táblázat). Az Agrobacterium törzseket 28oC-on, az E. coli törzseket 37oC-on szaporítottuk.
10
2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk (µg/ml) Antibiotikum Ampicillin Rifampicin Kanamycin Tetracyclin Spectinomycin Chloramphenicol
E. coli 100 30-100 15 100 10
A. tumefaciens 40 30-100 15 -
3.3. Összes DNS izolálása 1,5 ml éjszakán át növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük és 300 µl TE oldatban (50 mM Tris HCl, 20 mM EDTA, pH:8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37oC-os inkubálás után 500 µl fenol oldattal összeráztuk, majd centrifugálás után a felülúszót újabb Eppendorf-csıbe pipettáztuk át. A mőveletet 500 µl fenol – kloroform (25 tf. fenol: 24 tf. kloroform:1 tf. izoamil-alkohol) és 500 µl kloroform oldattal (24 tf. kloroform: 1 tf. izoamil-alkohol) megismételtük. A vizes fázistból a DNS-t 1000 µl 96%-os etanollal csaptuk ki. A kocsonyás csapadékot pipettahegy segítségével 500 µl 70%-os etanolt tartalmazó Eppendorf csıbe tettük át. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követıen, a DNS csapadékot 100 µl steril desztillált vízben oldottuk fel (21).
3 4. Polimeráz láncreakció A pha1 és a pha2 géncsoport egy részét magába foglaló DNS-szakaszt sokszoroztuk fel polimeráz láncreakció segítségével. A primerek tervezéséhez a genom adatbázisokban található DNS-szekvenciákat vettük alapul (gén név: phaA vagy AGR_C_885, locus tag: Atu0512, - gén név: phaA2 (mnhA) vagy AGR_C_1658, locus tag Atu0909). A felhasznált PCR programokat és primereket a 3. és 4. táblázatok tartalmazzák. Az 2. ábrán (1.4. fejezet) is feltüntettük az érintett szakaszokat.
11 3. táblázat: Alkalmazott primerek és jellemzıik. Primer
Régió
A1At-fw
phaA1
A1At-rev A1At51
phaB1
1160 bp ATCGTCGGCATCGTTCC 1493 bp GCTTTTGCGGCTTCAGG
phaA2
A2At-rev E1At51
GGCGGCGTGCTGAAATATGATGTG GGCTTGGGCCCGAAGAACACC
A1At31 A2At-fw
PCRtermék
Bázissorrend
CGCCGGCCCTCGTGAAAAGGTT 1071 bp CAAGTGCGGCGGCGAAGGTGAT
phaE1
E1At31
CATGCCCGCCACCATTG 1350 bp GCATGCAGGCGCTCATAGAA
F756 MuEnd F755 pUC rev
GTTTTTCGTGCGCCGCTTCA változó TTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT
pag51
GCTTGCGAGGGTGCTACTTA pPAG
pag31
1076 bp CGGTTACGAGATCCATTTGCT
omga51
GCGCGATTTTGCCGGTTACT pPAG
omga31
655 bp GATGTTACGCAGCAGGGCAGTC
4. táblázat: Alkalmazott PCR reakciók. AGROI
PP-PHAB1
PP-PHAE1
PP-MU-End
PAG-160
1.
1:30 94oC
1:30 94oC
1:30 94oC
1:30 95oC
1:30 94oC
2.
0:30 94 C
0:30 94 C
0:30 94 C
0:30 95 C
0:30 94 C
3.
0:40 62oC
0:30 60oC
0:30 56oC
0:15 68oC
0:30 50oC
4.
1:00 72oC
1:30 72oC
1:30 72oC
1:30 72oC
1:00 72oC
5.
33xgo to 2
33x go to 2
33x go to 2
30x go to 2
33x go to 2
6.
end
end
end
end
end
primerek
A1Atfw A1Atrev A2Atfw A2Atrev
F756 F755
pag51 pag31 omga51 omga31
o
o
A1At51 A1At31
o
E1At51 E1At31
o
o
12
3.5. Fragment izolálás A PCR terméket agaróz gélelektroforézis segítségével választottuk el. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk, és 20 perces 60 V feszültség melletti elektroforézis után a fragment a papírra került. A papírt Eppendorf csıbe tettük, és a DNS-t kétszer egymás után 100 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS kicsapása 20 µl 3M Naacetát oldattal (pH:7,0) és 120µl izo-propanollal történt. A csapadékot 20 perc, -20oC inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 20µl steril desztillált vízben oldottuk fel.
3.6. DNS ligálás, transzformálás A ligálási reakciókat 20-25 µl térfogatban, 50-100 ng vektor és fragment DNS, és 1xT4 DNS ligáz puffer (40 mM TrisHCL, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, pH 7,8) segítségével végeztük el. A reakciókhoz ragadós végek esetén 0,01 U, tompa végek összekapcsolása esetén 0,5 U T4 DNS ligáz enzimet (FERMENTAS) használtunk. Az elegyet transzformáció elıtt legalább 2 órán át, szobahımérsékleten (22oC) inkubáltuk. A kompetens sejt készítéshez XL1-Blue törzset használunk. 200 ml SOB tápoldatban (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, pH:7,0) éjszakán át növesztett baktérium kultúrát 10 percre jégre tettük. A 10 perces centrifugálással (4000 rpm) összegyőjtött sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES, 1,5 mM CaCl2, 250 mM KCl,
pH:6,7) szuszpendáltuk.
10
percig jégen
inkubáltuk,
majd
centrifugálással
összegyőjtöttük a sejteket, és 20 ml TB pufferben ismételten szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1,5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf csövekbe szétosztva -80oC-os hőtıben fagyasztottuk és tároltuk a transzformációig (13). Egy transzformáláshoz 200 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80oC -ról jégre tettük. 15 perc eltelte után hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 20 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37oC-os hısokkot alkalmaztunk. A hısokk után 800 µl LB oldatot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37oC-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra tettük. A pBluescript vektorba való klónozás esetén az inszert beépülése inaktiválja a vektoron található lacZ gént (α-fragment). A telepek enzimaktivitását 40 µg/ml X-gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)
és
40
µg/ml
IPTG
(isopropyl-β-D-thio-
galactopyranoside) jelenlétében teszteltük. A fehér telepekkel dolgoztunk tovább.
13 3.7. Plazmid DNS izolálása A plazmid DNS-t E. coli esetén 3-3 ml LB, A. tumefaciens esetén 3-3 ml TA tápfolyadékban, a megfelelı antibiotikum jelenlétében egész éjszakán át növesztett sejtekbıl Ish-Horowicz és Burke szerint alkalikus lízissel preparáltuk (14). 1,5 ml kultúrát Eppendorf csıben 20 másodpercig centrifugáltunk, majd a leülepedett baktériumokat 100 µl TEG oldatban (50 mM glükóz, 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pH:8,0) szuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük, óvatos keverés mellett. A mintákat 5 percig 0oC-on inkubáltuk, majd 160 µl 0oC-os NaAc (3 M NaAc, pH:4, 8) bemérése után erısen összeráztuk ıket, míg pelyhes csapadék keletkezett, majd megismételtük az elıbbi inkubálást. A kivált SDS csapadékot centrifugáltuk és a felülúszóból (kb. 400 µl) i-propanollal kicsaptuk a DNS-t. Centrifugálás után a csapadékot 70%-os etanollal mostuk, majd szárítottuk. Ezt követıen a csapadékot 100 µl Tris-Acoldatban (50 mM Tris, 100 mM NaAc, pH:8,0) feloldottuk, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. 5 perc 0oC-on való inkubálás után centrifugáltunk, ezután ismételten mostuk ill. szárítottuk a csapadékot. Az így kapott DNS-t 30 µl RNaseA enzimet (50-100 µg/ml) tartalmazó steril desztillált vízben oldottuk fel.
3.8. Emésztés restrikciós endonukleázokkal és agaróz gélelektroforézis A DNS-minták emésztését a
FERMENTAS
cég termékeit használva a megadott protokollok
szerint végeztük. Az emésztési reakciók után agaróz gélelektroforézissel ellenıriztük a mintákat. A fragmentek elválasztására 1%-os vagy 1,5%-os agaróz gélt és TBE puffert használtunk az általánosan alkalmazott módszerek szerint (30). Kontrollként PstI enzimmel emésztett λ-DNS-t vagy 100 bp Ladder DNS-t alkalmaztunk.
3.9. Transzpozonos mutagenezis A pBluescript plazmidba klónozott pha1 illetve pha2 PCR-fragmentek mutagenezisét a TGSII Kit segítségével (FINNZYMES) végeztük. Ez egy in vitro, Mu transzpozázt felhasználó inszerciós mutagenezisre alkalmas rendszer. A reakcióelegyeket a kit leírásnak megfelelıen mértük össze, a KanR-3 Mu entranceposon (F779) felhasználásával. A mintákat XL1 blue kompetens sejtekbe transzformáltuk, kiválogattuk az AmpR, KmR telepeket, amelyekbıl plazmid DNS preparátumot készítettünk, majd a KanR-3 inszerció beépülési helyét PCRreakció, illetve restrikciós enzimek segítségével határoztuk meg. A PCR-reakcióban a MuEnd és pUC reverse, vagy a MuEnd és pUC forward primereket alkalmaztuk. A PCR-termék
14 nagysága a KanR-3 inszert beépülési helyének távolságát mutatta a reverse illetve az univerzális primer helyektıl.
3.10. DNS-szekvencia meghatározás A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját a megfelelı oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/ChromasPro.html) program segítségével ellenıriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program segítségével illesztettük össze.
3.11. Baktériumok keresztezése, mutánsok elıállítása A donor, a recipiens és a helper baktériumokat komplett táptalajon növesztettük a megfelelı antibiotikumok jelenlétében, egy ill. két éjszakán át. A felnıtt populációkból LBTA táptalajban szuszpenziót készítettünk, majd LBTA lemezen azonos arányban összecseppentve 28oC-on 24 órát inkubáltuk azokat. Az így felnıtt exkonjugáns baktériumokat szuszpendáltuk, és különbözı hígításban a megfelelı antibiotikumot tartalmazó szelektív lemezre szélesztettük.
3.12. Tesztnövények fertızése LBTA tápoldatban baktériumszuszpenziót készítettünk (OD590= 0,2-0,5), majd az ezzel átitatott lándzsatő segítségével két helyen megszúrtuk a 4-6 hetes Kalanchoe tubiflora növények szárát. A ferzızött növényeket növénynevelı kabinba (20oC, napi 14 óra megvilágítás) helyeztük, és további 4-6 hétig neveltük a tumorteszt kiértékelése elıtt.
3.13. Agrobaktériumok visszaizolálása tumorszövetbıl A tumorszöveteket szike segítségével kivágtuk a növényekbıl. Elıször 96%-os alkohollal majd LBTA tápoldattal leöblítettük ıket. Ezután steril mozsárban szétdörzsöltük a szövetdarabokat, végül a mintákat 1 ml LBTA oldatban szuszpendáltuk. Különbözı hígításokban a megfelelı szelektív táptalajokra kentük ki a szuszpenziókat és 28oC-on 48 órát inkubáltuk azokat. A felnıtt bakériumtelepeket replika plating technikával megvizsgáltuk Naérzékenységre 100 mM NaCl tartalmú LBTA illetve LBTA kontroll lemez segítségével.
15 3.14. Fiziológiai kísérletek A phaA2::ET-KanR-3 (CsJ4422) A. tumefaciens törzs Na+- és pH-érzékenységét jellemeztük fiziológiai kísérletekben, hasonló módszerekkel a már elızıleg publikáltakhoz (28). Minden kísérletben egy csökkentett tápanyagtartalmú alap táptalajt (YETM) használtunk, melynek összetétele a következı volt: 0,2 % yeast extract, 2 mM MgSO4, 10 mM MES-TRIS puffer. A pH-értéket a MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid hydrate) és TRIS (Tris hydroxymethyl aminomethane hydrochloride) oldatok különbözı arányú keverésével állítottuk be. A Na+-érzékenység vizsgálatára különbözı mennyiségő NaCl oldatot adtunk az
YETM (pH:7,25) tápfolyadékhoz. A pH-érzékenység vizsgálatához
kölönbözı pH-értékő tápfolyadékokat készítettünk (5,6; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 8,8), amelyek pontosságát sterilezés után ellenıriztük. 3-3 ml tápfolyadékot 0,1 ml YETM (pH:7,25) folyadékban szuszpendált (OD590= 0,05) baktériumkultúrával fertıztünk be, majd 22 oC-on, 24 óráig rázattuk. A kultúrák denzitását fotométerrel, 590 nm-en határoztuk meg.
16
4.Eredmények és megvitatásuk 4.1. A pha1 és pha2 szekvenciák izolálása Ahhoz, hogy a pha1 és a pha2 régiókban mutációkat helyezzünk el, izolálnunk kellett a megfelelı DNS-szakaszokat. Ezt PCR-technika segítségével kívántuk megoldani. Elıször oligonukleotid primereket terveztünk a phaA1 és phaA2 gének mintegy 1,1 kb nagyságú szakaszainak felsokszorozására (1.4. fejezet, 2. ábra) és tisztított A. tumefaciens c58 DNS felhasználásával elvégeztük a reakciókat. Mindkét esetben megkaptuk a várt PCR-terméket (4. ábra), amelyeket izoláltunk és a pBluescript plazmid EcoRV helyére klónoztunk be.
4. ábra: A phaA1 és a phaA2 PCR fragmentek. Kontroll: lambda DNS PstI restrikciós enzimmel vágva A megfelelı, X-gal jelenlétében fehér kolóniákból plazmid DNS-t tisztítottunk, majd a konstrukció létrehozásának sikerességérıl ellenırzı PCR kísérletekkel, és PvuII restrikciós enzimmel végzett emésztéssel bizonyosodtunk meg. A kiválasztott mintákat DNS-szekvencia meghatározás segítségével is ellenıriztettük. Ezek alapján elmondhatjuk, hogy a régiók izolálása sikerült, és következhetett a mutációk elhelyezése a megfelelı szakaszokon.
4.2. Mutáció elhelyezése a phaA1 és a phaA2 szekvenciákban A mutációk létrehozása in vitro transzpozonos mutagenezissel történt, a Mu transzpozáz enzim és egy kanamicin rezisztenciát hordozó 1195 bp hosszú DNS-fragment (ET-KanR-3) segítségével. A reakció során az enzim a lineáris fragmentet beépíti a reakcióelegybe adott, mutagenizálni kívánt cirkuláris plazmid molekulába. A beépülés helye véletlenszerő. A reakció kivitelezése után az elegyet transzformáltuk és kiválogattuk az ampicillin, kanamicin rezisztens kolóniákat.
17 A következı lépés a plazmidon található inszerciók helyzetének megállapítása volt. Célunk az volt, hogy olyan klónokat találjunk, ahol az ET-KanR-3 inszert nagyjából a phaA1 ill. a phaA2 klónozott génszakasz közepén helyezkedik el. Erre azért volt szükség, hogy a késıbbiekben megkönnyítsük a homológ rekombináció lejátszódását. BamHI emésztést és PCR reakciókat is végeztünk a megfelelı klónok kiválasztására. A kapott restrikciós fragmentek, ill. PCR-termékek nagysága alapján eldöntöttük, hogy melyik mintákban történt meg kedvezı pozicióban az ET-KanR-3 inszert beépülése. A térképezés folyamatáról készült fotó a 5. ábrán látható.
5. ábra: Az ET-KanR-3 inszert pozíciójának megállapítása (A) L: 100 bp ladder DNS marker fargmentek nagysága (bp). PCR: 1-6: a MuEnd és pUC reverz primerekkel végzett PCR-reakció eredménye jelzi az egyes ET-KanR-3 inszerciók beépülésének helyét a mutagenizált pha fragment egyik végétıl. Ez a 3. minta esetében 400 bp, a 4. minta esetében 700 bp. BamHI: Az ET-KanR-3 inszerciókat tartalmazó plazmidok BamHI emésztési képe. Az ET-KanR-3 szekvencia mindkét végén tartalmaz egy-egy BamHI hasítóhelyet, amely minden esetben egy 1 kb nagyságú fragmentet eredményez. A 3. és 4. minta esetében egy ennél kisebb, a képen rosszul látható, fragment jelzi az inszert pozícióját. (B) A ET-KanR-3 DNS-szakasz beépülésének egy lehetséges (a kísérletekben elérni kívánt) módja. A kísérletekben alkalmazott restrikciós enzimek hasítóhelyein kívül feltüntettük a MuEnd és pUC reverz primerek helyzetét is (Mu, rev)
A térképezés alapján megállapítottuk, hogy a kiválasztott mintáinkban a phaA1 esetében a beépült kanamicin gén 500, a phaA2 esetében pedig 400 bázispárnál helyezkedik el. Ezek a klónok megfelelınek tőntek a további munkához, mivel mindkét fragment körülbelül 1,1
18 kilobázis nagyságú, tehát az inszerció ténylegesen a régiók közepén helyezkedik el. Tehát sikerült mindkét régióban izolálnunk a megfelelı mutációt. 4.3. A pha mutációk klónozása konjugatív vektorba Mivel a pBS alapú, mutációt hordozó konstrukciókat nem lehet konjugációval bejuttatni Agrobacterium háttérbe, ezért szükségünk volt még egy klónozási lépésre. A pBS vektorból át kellett építenünk a konstrukciókat a pPAG160 vektorba (6.B. ábra). A pPAG160 egy konjugatív plazmid, amely nem képes replikálódni Agrobacterium törzsekben. Ez azért fontos, mert a kanamicin rezisztenciát hordozó mutáció csak akkor marad meg a genomban, ha homológ rekombináció révén beépült a megfelelı géncsoportba. Így, amikor a konjugáció után a kanamicin rezisztens utódokra szelektálunk, elvben a mutációt hordozó utódokat kell megkapnunk (lásd 4.4.).
6. ábra: Az ET-KanR-3 mutációt hordozó pha szekvencia átépítése pPAG160 vektorba (A) Az ET-KanR-3 mutációt hordozó pha szekvencia izolálása EcoRI-KpnI kettıs emésztéssel. Az 1. és 4. mintával dolgoztunk tovább, ahol, a pBS plazmid 2,9 kb fragmentje mellett, megjelent az átépíteni kívánt 2 kb körüli fragment. (B) A klónozás sematikus rajza A kísérletekben alkalmazott restrikciós enzimek hasítóhelyeit és a pPAG160 plazmid fontosabb régióit jeleztük. Spc/Sm: spektinomicin és streptomicin rezisztenciagén; pCU1 oriT: konjugációs transzfer origó; pSC101 ori: replikációs origó.
19 A mutációt hordozó phaA1 és phaA2 régiókat mindkét esetben, EcoRI és KpnI restrikciós enzimekkel való emésztés után, egy fragmentként tudtuk izolálni a pBS vektorból (6.A. ábra), és az így nyert kanamicin rezisztens fragmenteket az EcoRI és KpnI enzimekkel emésztett pPAG160 vektorba egyszerően be tudtuk építeni (6.B. ábra). Néhány kanamicin és spektinomicin rezisztens transzformáns kolóniából izoláltuk a plazmid DNS-t, és EcoRI-KpnI kettıs emésztéssel ellenıriztük, hogy valóban a teljes klónozni kívánt fragmentet hordozzáke. Egy-egy megfelelı emésztési képet mutató származékkal dolgoztunk tovább (CsJ4396, CsJ4397). 4.4. A pha mutánsok elıállítása homológ rekombinációval A pPAG160 vektorba klónozott, kanamicin inszerciót hordozó phaA1 és phaA2 fragmenteket már be tudtuk juttani egy rifampicin rezisztens vad típusú A. tumefaciens törzsbe (PP4398), a pCU101 helper plazmid segítségével. Mivel a keresztezett partnerek közül csak az A. tumefaciens törzs rifampicin rezisztens, és a kanamicin rezisztens pha mutációt hordozó plazmid nem képes ezekben a sejtekben replikálódni, csak azok a származékok lesznek mindkét antibiotikummal szemben rezisztensek, ahol a mutáció (pha::ET-KanR-3) homológ rekombinációval beépül az agrobaktérium kromoszómájába (7. ábra)
7. ábra: A KmR mutáció beépülésének két változata, homológ rekombináció esetén Magyarázat a szövegben. (wt): vad típusú szekvencia; (ori): agrobaktériumban nem funkcionáló replikációs origó.
20 Ez az esemény két módon mehet végbe: i) kétszeres rekombináció révén csak a beépíteni kívánt pha::ET-KanR-3 mutáció integrálódik a kromoszómába, a plazmid többi része, és a rekombináció által kiejtett vad típusú szekvencia elvész (7.A. ábra), ii) egyszeres „crossing over” által az egész pPAG-származék beépül a kromoszómába („kointegrát” képzıdés, 7.B. ábra). Csak az elsı esetben jön létre a számunkra értékes mutáns, a második esetben a vad típusú gén és a mutáció együtt vannak jelen, így általában nem alakul ki mutáns fenotípus. A fent elmondottak miatt fontos, hogy a RifR, KmR mutáns jelölteket több szempontból is megvizsgáljuk és bizonyítsuk, hogy kettıs homológ rekombinációval jöttek létre, ezért pPAG160 vektor szekvenciát nem tartalmaznak. A pPAG160 jelenlétére, a kointegrát létrejöttére, két módon is következtethettünk. Egyrészt abból, hogy ha a keletkezett baktériumok streptomicin rezisztensek, mivel ez a marker a vektoron található. Másrészt pPAG160 specifikus primerek és PCR segítségével megvizsgálhatjuk, hogy a feltételezett homológ rekombinánsok tartalmaznak-e vektor szekvenciát. Minden esetben így jártunk el.
4.4.1. A phaA2 mutánsok elıállítása Mivel az elızetes szekvencia elemzések alapján feltételeztük, hogy a pha2 régió egy +
Na /H+ antiportert kódol, aminek hiánya Na-érzékeny mutánsokat eredményez, ezért a keresztezést Na-mentes, 100 mM KCl tartalmú LBTA táptalajon végeztük el. Éjszakán át történt inkubáció után a keresztezett populációt többféle szelektív táptalajra is kiszélesztettük, hogy a mutánsok keletkezésérıl már ebben a lépésben is legyen információnk. Az 5. táblázatból látható, hogy a vártaknak megfelelıen, a Na-tartalmú táptalajon egyetlen kolónia sem nıtt, míg ugyanannyi baktériumból százas nagyságrendben keletkeztek telepek a Ktartalmú szelektív lemezen.
5. táblázat: phaA2::ET-KanR-3 mutánsok létrehozása táptalaj LBTA 100 mM NaCl LBTA LBTA 100 mM KCl
felnıtt telepek száma(1) Na-érzékeny telep(2)
StrR telep(2)
0
0
0
85(3)
20/20
0/20
93
20/20
0/20
(1) 100 µl keresztezett populációból (körülbelül 106 baktérium); (2) 20 telepet tovább oltottunk 100 mM NaCl illetve streptomicin tartalmú LBTA táptalajra; (3) a telepek lassabban nıttek, mint a K-tartalmú lemezen.
21 Ez azt jelezte számunkra, hogy olyan mutánsok keletkeztek a folyamat során, amelyek Naérzékenyek. Ezt igazolta a feltételezett mutánok késıbbi vizsgálata is, mert valóban nem voltak képesek NaCl jelenlétében növekedni, és streptomicin érzékenyek voltak (5. táblázat). PCR-reakció segítségével is megbizonyosodtunk arról, hogy nem integrálódott a pPAG160 szekvencia a mutáns jelöltekbe, mivel a reakció segítségével nem tudtuk kimutatni a vektor jelenlétét. Tehát elmondhatjuk, hogy az A. tumefaciens phaA2 mutáns elıállítása sikerült, és az a várakozásoknak megfelelı fenotípussal rendelkezett.
4.4.2. A phaA1 mutáns elıállítása A phaA1 mutáns elıállítása ugyanolyan elvek szerint történt, mint a phaA2 mutáns esetében. A keresztezés után K-érzékeny mutánsok megjelenését vártuk, de már a szelekciós kísérletek eredményébıl (6. táblázat) sejteni lehetett, hogy ez nem sikerült. A K-tartalmú szelektív lemezen is hasonló számú telepet kaptunk, mint a többin. A telepek egy részét megvizsgálva, azok streptomicin rezisztensnek bizonyultak, és PCR segítségével is ki lehetett mutatni az izolátumokban a pPAG160 vektor jelenlétét. Tehát mindegyik csak kointegrát származék, nem valódi mutáns.
6. táblázat: phaA1::ET-KanR-3 mutánsok létrehozása táptalaj
felnıtt telepek száma(1) K-érzékeny telep(2)
StrR telep(2)
LBTA 100 mM NaCl
54
0/20
20/20
LBTA
48
0/20
20/20
LBTA 100 mM KCl
62
0/20
20/20
(1) 100 µl keresztezett populációból (körülbelül 106 baktérium); (2) 20 telepet tovább oltottunk 100 mM KCl illetve streptomicin tartalmú LBTA táptalajra.
A keresztezést többször megismételtük, más szelekciós körülményeket is kipróbálva a mutánsok kiválogatására. Így alkalmaztunk LBTA (pH: 6,5) és GTS minimál táptalajt, de nem jártunk sikerrel. Mivel a pPAG160 vektorral, a tanszéken folyó más kísérletekben is változó arányban kaptunk kointegrát származékot és valódi mutánst, ezért nem zárhattuk ki, hogy az elhelyezett mutáció környezetében lévı DNS-szekvencia befolyásolja a folyamat hatékonyságát. Ezért elhatároztuk, hogy másik két pha1 génszakasz segítségével is megpróbáljuk a mutáns elıállítását.
22 4.4.3 Újabb phaB1 és phaE1 mutációk elıállítása A phaB1 és a phaE1 gén szekvenciájának izolálásához terveztünk primereket (1.4. fejezet, 2. ábra), és sikeresen el is végeztük PCR segítségével ezek felsokszorozását (8. ábra) és klónozását, a már leírt módszerek szerint. A mutáció elhelyezését ez alkalommal nem transzpozíciós mutagenezis segítségével oldottuk meg, mert a primereket eleve úgy terveztük, hogy legyen egy egyedi restrikciós hasítóhely a felsokszorozott szekvenciák közepén. Ide terveztünk beépíteni egy szintén kanamicin rezisztenciát hordozó DNS-fragmentet a pCU999 plazmidból. A phaB1 gén végét képviselı fragmentnél elıször elvégeztük az átklónozást a pPAG160 vektorba, EcoRI-KpnI enzimek segítségével, és csak ezután építettük be a kanamicin rezisztenciagént. Ezt azért oldottuk meg így, mert a KmR mutáció elhelyezésére a PCRfragmen közepén lévı SmaI helyet szerettük volna felhasználni, de ilyen hasítóhely a pBS vektoron is található. A klónozott phaB1 szekvenciát tartalmazó pPAG160 vektorban már csak egy SmaI hasítóhely van, és erre a helyre egy HincII enzimmel létrehozott, szintén „tompa végeket” tartalmazó DNS-fragmenten már be tudtunk építeni a mutációt jelentı KmR gént.
8. ábra: A phaE1 és a phaB1 fragmentek. Kontroll: lambda DNS PstI restrikciós enzimmel vágva.
A phaE1 fragment esetében elıször beépítettük a KmR gént és csak utána végeztük el az átklónozást pPAG160 vektorba. A pBS vektorban található konstrukcióból készített plazmid DNS mintákat EcoRV, a KmR gént tartalmazó plazmidot HincII enzimmel emésztettük meg.
23 Mindkét enzim ún. tompa véget hoz létre, ezért a fragmentek könnyen összeépíthetık. A rezisztencia gén beépítése után a szokásos EcoRI-KpnI kettıs emésztést követıen klónoztuk át a fragmentet pPAG160 vektorba. A 4.4.1. fejezetben ismertetett módon végeztük el a pPAG160 vektorba klónozott mutációk bejuttatását a vad típusú Agrobacterium törzsbe és szelektáltunk a mutáció beépülésére. A KmR, RifR mutánsjelöltek egyike sem volt K+-érzékeny, viszont mindegyik streptomicin rezisztensnek bizonyult, ami arra utalt, hogy ismét csak pPAG160 vekort is tartalmazó kointegrát származékokat sikerült izolálnunk. Ezt erısítették meg a pPAG160 vektor specifikus primerekkel végzett PCR kísérletek is, mivel a vektor szekvencia jelenlétét ezen az úton is ki tudtuk mutatni. A phaA1, phaB1 és phaE1 mutánsok elıállítása tehát nem sikerült, hiába próbáltuk meg azt több szekvencia felhasználásával is. Valószínő, hogy az alkalmazott szelekciós körülmények között (LBTA, LBTA (100m M NaCl), minimál GTS táptalaj) a mutáns nem életképes, a mutáció letális. Ez nem várt eredmény, hiszen a homológ géncsoportban hibás S. meliloti törzs az alkalmazott körülmények között életképes, és hasonló ütemben növekszik, mint a vad típusú baktérium (28). Ezek alapján egyik lehetséges magyarázatként feltételezhetı, hogy az S. meliloti baktériumban a pH- illetve az ion-homeosztázis fenntartásában olyan kiegészítı mechanizmusok is létezhetnek, amelyek az A. tumefaciens sejtekbıl hiányoznak. Ennek bizonyítására a jövıben, elsı lépésként, egy kondícionális letális phaA1 mutációt kísérlünk meg létrehozni.
4.5. A phaA2 mutáns fiziológiai jellemzése A phaA2::ET-KanR-3 mutáns A. tumefaciens törzsek az elızetes kísérletekben Naérzékenynek bizonyultak. További fiziológiai kísérletekben szerettük volna részletesebben jellemezni a mutánsok Na+- és pH-érzékenységét. Ehhez egy speciális táptalajt használtunk, melynek alacsony volt a tápanyag koncentrációja és pH-értékét 5,6 és 8,8 között tudtuk beállítani MES-TRIS puffer segítségével. A csökkentett tápanyagtartalomra azért volt szükség, hogy a bevitt Na- és K-vegyületek koncentrációja kisebb legyen, valamint a táptalaj puffer kapacitása is jelentısen csökkenjen. A mutáns Na-érzékenységét jellemzi a 9. ábra. Jól látható, hogy a vad típusú baktérium a Na-koncentráció emelkedésével egyre jobban nı, míg a mutáns baktérium egyre kevésbé képes erre, és 30 mM NaCl már gátolja a szaporodását.
24
9. ábra A phaA2 mutáns Na-érzékenysége A vad típusú (wt) és a mutáns baktériumot YETM(pH7,25) tápfolyadékban növesztettük 24 órán át, a feltüntetett NaCl koncentrációk mellett, majd megmértük a kultúrák optikai denzitását.
Vizsgáltuk azt is, hogy mutatkozik-e különbség a mutáns és a vad típusú baktérium növekedésében a különbözı pH-értékő táptalajokban. Különbséget nem tudtunk igazolni (10. ábra). Végül arra kerestük a választ, hogy a mutáns növekedését pH: 7,25 értéknél felére csökkentı Na-koncentráció hatása (10 mM) hogyan változik a pH függvényében, azaz a Na+ ionok jelenléte hogyan hat a pH-toleranciára. Amint a 10. ábrán látható, a mutáns baktérium szélsıséges pH értékek közelében, mind a savas, mind a lúgos tartományban, rosszul viseli a Na+ ionok jelenlétét. Ez arra utal, hogy ezen szélsı értékek közelében lehet szerepe a pha2 régió által kódolt feltételezett antiporternek, mert hiányában erıteljesen csökken a baktériumok szaporodási képessége.
25
10. ábra: A phaA2 mutánsok Na-érzékenysége és pH-toleranciája A vad típusú (wt) és a mutáns baktériumot különbözı pH-értékő YETM tápfolyadékban növesztettük 24 órán át, NaCl nélkül, vagy 10 mM NaCl jelenlétében, majd megmértük a kultúrák optikai denzitását.
4.6. A phaA2 mutáns és a tumorképzıdés A phaA2 mutáns agrobaktérium törzsek tumorképzı képességét Kalanchoe tubiflora növényeken teszteltük. A növényeket a vad típusú (PP4398), és a mutáns törzzsel (CsJ4422) fertıztük. Kontrollnak steril lándzsatővel sebzett növényeket használtunk. A 11. ábrán látható a fertızések eredménye. A tumorok nagyjából 2 hét alatt alakulnak ki a baktériumokkal fertızött növényeken. A kísérletek kiértékelését 4-6 héttel a fertızés után végeztük. Az 11. ábrán is látható, hogy a mutáns ugyanakkora tumort volt képes létrehozni, mint a vad típusú baktérium. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a pha2 régió mutációja a tumorképzés folyamatát nem befolyásolja. Ezek után arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a phaA2 mutáns képes-e ugyanúgy túlélni és szaporodni a tumorszövet belsejében, mint a vad típusú baktérium? Ennek megválaszolásához szükség volt arra, hogy a kialakult tumorszövetekbıl visszaizoláljuk az agrobaktériumokat. A kísérlet eredményeit a 7. táblázat foglalja össze.
26
11. ábra: A vad típusú és a phaA2 mutáns baktériumok tumorképzése A baktériumok szuszpenzióival kalanchoe növényeket fertıztünk sebzési helyeken és 4-6 hét után dokumentáltuk a kifejlıdött tumorokat. K: sebzett, fertızetlen kontroll; C58: A. tumefaciens C58 törzs által létrehozott tumorok; phaA2::KmR: A. tumefaciens Na-érzékeny mutánsa által létrehozott tumorok. Jobb oldal: a fertızıtt növény képe.
A vad típusú és a mutáns baktériumokat hasonló számban sikerült visszaizolálni a megfelelı tumorszövetbıl. Különbözı szelektív táptalajok felhasználásával igazoltuk, hogy valóban a fertızésre használt baktériumok szaporodtak el a tumorokban. A vad típusú törzs rifampicin rezisztens, NaCl jelenlétében képes növekedni és kanamicin szenzitív. Ezzel szemben az általunk létrehozott phaA2 mutáns Na-érzékeny, kanamicin és rifampicin rezisztens. A 7. táblázatból látszik, hogy a visszaizolált baktériumok, kivétel nélkül, ugyanezeket a tulajdonságokat hordozták. 7. táblázat: Az Agrobacterium törzsek visszaizolálása tumorszövetbıl A. tumefaciens törzs
CFU/ ml(1)
Rif(2)
Km(2)
NaCl(2)
vad típus (PP4398) phaA2::ET-KanR-3 mutáns (CsJ4422)
3x105
20/20 (R)
0/20 (S)
20/20 (R)
2x105
20/20 (R)
20/20 (R)
0/20 (S)
(1) a szétdörzsölt szövetet azonos térfogatú LBTA táptalajban szuszpendáltuk és ebbıl különbözı hígításokat LBTA táptalajra szélesztettünk; (2) Az LBTA lemezen felnıtt baktériumok közül 20-20 telep növekedését vizsgáltuk a jelzett anyagokat tartalmazó LBTA táptalajon. 20/20 = minden vizsgált baktérium nıtt az adott körülmények között, azaz rezisztensek voltak (R)
A kísérletek alapján elmondható, hogy a pha2 régióban mutációt hordozó baktériumok ugyanúgy képesek a növényben való szaporodásra, mint a vad típusú baktériumok, tehát a pha2 géneknek nincs szerepe a növények fertızése során. A baktériumok tumorszövetben való szaporodásához nincs szükség a pha2 régió által kódolt feltételezett Na+/H+-antiporterre.
27
5. Összefoglalás A Rhizobiaceae családba tartozó Gram-negatív Agrobacterium fajok a kétszikő növényeket sebzési helyeken fertızik, és tumorfejlıdést, ill. hajszálgyökeresedést okoznak. A tumorképzıdés összefügg a tumort indukáló (Ti) plazmid jelenlétével, aminek egy része, az ún. transzfer vagy T-DNS, a fertızés során átkerül a növényi sejtekbe, és stabilan integrálódik a sejtmag DNS állományába. A sikeres fertızéshez a Ti-plazmid virulencia génjei (vir) és egyéb kromoszómális gének (chvAB) egyaránt szükségesek. Az agrobaktériumokkal rokon, szimbioikus gümıt létrehozó rhizobiumoknál a növény belsejében való szaporodáshoz szükséges a pha géncsoport is, amelynek szerepe van a pH homeosztázis fenntartásában. A Sinorhizobium meliloti pha génjeinek vizsgálata során bizonyították, hogy azok egy K+/H+-antiportert kódolnak, amely lúgos külsı pH esetén proton transzporttal segít a belsı, savasabb pH érték megırzésében. Ha a pha gének hibásak, a baktérium K+-érzékeny lesz, és nem képes a szimbiotikus partner inváziójára. Bacillus subtilis baktériumban szintén található egy pha homológ géncsoport (mrp), amirıl viszont azt bizonyították, hogy Na+/H+-antiportert kódol és a génekben hibás baktérium Na+-érzékeny. A genomszekvenálások során kiderült, hogy mind A. tumefaciens, mind S. meliloti baktériumban két pha géncsoport is található. Feltételezhetı, hogy az egyik K+/H+-, a másik Na+/H+-antiportert kódol. Annak a vizsgálati célkitőzésnek az érdekében, hogy bizonyítsuk az A. tumefaciens pha géncsoportok funkcióját és megvizsgáljuk esetleges szerepüket a növény fertızése során, PCR segítségével felsokszoroztuk a pha1 és a pha2 régió egy-egy szakaszát, majd ezekbe egy kanamicin rezisztencia gént ültetve elkészítettük a gének mutáns változatait. A mutációt hordozó régiókat visszajuttattuk a vad típusú A. tumefaciens C58 törzsbe, és a létrejött feltételezett homológ rekombinánsokat különbözı kísérletekben jellemeztük. A pha2 mutáns esetében bizonyítottuk, hogy az Na+-érzékeny, ami a Na+-transzportban bekövetkezett hibára utal. Növényi tesztek segítségével megállapítottuk, hogy a mutáció a tumorképzés folyamatát és a baktériumok növényen belüli szaporodását nem befolyásolja. A pha1 mutáns létrehozását kétféle módszerrel kíséreltük meg. De egyik esetben sem jártunk sikerrel, hiába próbáltuk meg azt több szekvencia felhasználásával is Valószínő tehát, hogy az alkalmazott szelekciós körülmények között a mutáns nem életképes, a mutáció letális.
28
6. Irodalomjegyzék 1. Bullock, W. O., J. M. Fernandez, and J. M. Short. 1987. Xl1-blue: A High Efficiency Plasmid Transforming RecA Es. Biotechniques 5:376-379. 2. Cangelosi, G. A., G. Martinetti, J. A. Leigh, C. C. Lee, C. Theines, and E. W. Nester. 1989. Role of Agrobacterium tumefaciens ChvA protein in export of b-1,2-glucan. J Bacteriol 171:1609-1615. 3. Capela, D., F. Barloy-Hubler, J. Gouzy, G. Bothe, F. Ampe, J. Batut, P. Boistard, A. Becker, M. Boutry, E. Cadieu, S. Dreano, S. Gloux, T. Godrie, A. Goffeau, D. Kahn, E. Kiss, V. Lelaure, D. Masuy, T. Pohl, D. Portetelle, A. Puhler, B. Purnelle, U. Ramsperger, C. Renard, P. Thebault, M. Vandenbol, S. Weidner, and F. Galibert. 2001. Analysis of the chromosome sequence of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti strain 1021. Proc Natl Acad Sci U S A 98:9877-9882. 4. Dessaux, Y., A. Petit, S. K. Farrand, and P. J. Murphy. 1998. Opines and opine-like molecules involved in Plant-Rhizobiaceae interactions. In H. P. Spaink, A. Kondorosi, and P. J. J. Hooykaas (ed.), The Rhizobiaceae: Molecular Biology of Model PlantAssociated Bacteria. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht-Boston-London. 5. Dessaux, Y., A. Petit, and J. Tempé. 1993. Chemistry and biochemistry of opines, chemical mediators of parasitism. Phytochemistry 34:31-38. 6. Galibert, F., T. Finan, S. Long, A. Puhler, P. Abola, F. Ampe, F. Barloy-Hubler, M. Barnett, A. Becker, P. Boistard, G. Bothe, M. Boutry, L. Bowser, J. Buhrmester, E. Cadieu, D. Capela, P. Chain, A. Cowie, R. Davis, S. Dreano, N. Federspiel, R. Fisher, S. Gloux, T. Godrie, A. Goffeau, B. Golding, J. Gouzy, M. Gurjal, I. Hernandez-Lucas, A. Hong, L. Huizar, R. Hyman, T. Jones, D. Kahn, M. Kahn, S. Kalman, D. Keating, E. Kiss, C. Komp, V. Lelaure, D. Masuy, C. Palm, M. Peck, T. Pohl, D. Portetelle, B. Purnelle, U. Ramsperger, R. Surzycki, P. Thebault, M. Vandenbol, F. Vorholter, S. Weidner, D. Wells, K. Wong, K. Yeh, and J. Batut. 2001. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science 293:668-672. 7. Gaudin, V., T. Vrain, and L. Jouanin. 1994. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiol. Biochem 32:11-29. 8. Gelvin, S. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Ann Rev Plant Physiol 51:223-256. 9. Gheysen, G., P. Dhaese, M. van Montagu, and J. Schell. 1985. DNA flux accross genetic barriers: the crown gall phenomenon, p. 11-47. In B. Hohn and E. S. Dennis (ed.), Genetic Flux in Plants, Advances in Plant Research, vol. 2. Springer, Vienna. 10. Goodner, B., G. Hinkle, S. Gattung, N. Miller, M. Blanchard, B. Qurollo, B. S. Goldman, Y. Cao, M. Askenazi, C. Halling, L. Mullin, K. Houmiel, J. Gordon, M. Vaudin, O. Iartchouk, A. Epp, F. Liu, C. Wollam, M. Allinger, D. Doughty, C. Scott, C. Lappas, B. Markelz, C. Flanagan, C. Crowell, J. Gurson, C. Lomo, C. Sear, G. Strub, C. Cielo, and
29 S. Slater. 2001. Genome Sequence of the Plant Pathogen and Biotechnology Agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science 294:2323-2328. 11. Hamamoto, T., M. Hashimoto, M. Hino, M. Kitada, Y. Seto, T. Kudo, and K. Horikoshi. 1994. Characterization of a gene responsible for the Na+/H+ antiporter system of alkalophilic Bacillus species strain C-125. Mol. Microbiol. 14:939-946. 12. Hiramatsu, T., K. Kodama, T. Kuroda, T. Mizushima, and T. Tsuchiya. 1998. A putative multisubunit Na+/H+ antiporter from Staphylococcus aureus. J Bacteriol 180:6642-6648. 13. Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28. 14. Ish-Horovicz, D., and J. F. Burke. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9:2989-2998. 15. Ito, M., A. A. Guffanti, Bauke Oudega, and T. A. Krulwich. 1999. mrp, a multigene, multifunctional locus in Bacillus subtilis with roles in resistance to cholate and Na and in pH homeostasis. J. Bacteriol. 181:2394-2402. 16. Koncz, C., K. Németh, G. Rédei, and J. Schell. 1994. Homology recogniotion during TDNA integration into the plant genome, p. 167-189. In J. Paszkowszki (ed.), Homologous recombination and gene silencing in plants. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherland. 17. Koonin, E. V., K. S. Makarova, and L. Aravind. 2001. Horizontal gene transfer in prokaryotes. Annu. Rev. Microbiol. 55:709-742. 18. Kosono, S., Y. Ohashi, F. Kawamura, M. Kitada, and T. Kudo. 2000. Function of a principal Na+/H+ antiporter, ShaA, is required for initiation of sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol 182:898–904. 19. Krulwich, T. A., J. Cheng, and A. A. Guffanti. 1994. The role of monovalent cation/proton antiporters in Na+- resistance and pH homeostasis in Bacillus: An alkaliphile versus a neutralophile. J Exp Biol 196:457-470. 20. Matthysse, A. G., H. Yarnall, S. B. Boles, and S. McMahan. 2000. A region of the Agrobacterium tumefaciens chromosome containing genes required for virulence and attachment to host cells. Biochim Biophys Acta 1490:208-212. 21. Meade, H. M., S. K. Long, G. B. Ruvkun, S. E. Brown, and F. M. Ausubel. 1982 Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J. Bacteriol. 149:114-122 22. Melchers, L. S., A. J. G. Regensburg-Tuink, R. A. Schilperoort, and P. J. J. Hooykaas. 1989. Specificity of signal molecules in activation of Agrobacterium virulence gene expression. Mol Microbiol 3:969-977. 23. Messens, E. 1985a. Agrocinopine A, a phosphorilated opine is sectered from crown gall cells. EMBO J 4:571-577.
30
24. Messens, E., A. Lenaerts, M. van Montagu, and R. W. Hedges. 1985b. Genetic basis for opine secretion from crown gall tumor cells. Mol Gen Genet 199:344-348. 25. Mysore, K. S., J. Nam, and S. B. Gelvin. 2000. An Arabidopsis histone H2A mutant is deficient in Agrobacterium T-DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:948-953. 26. Orosz, L., Z. Svab, A. Kondorosi, and T. Sik. 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125:341- 350. 27. Papp, P. P., and V. N. Iyer. 1995. Determination of the binding sites of RepA, a replication initiator protein of the basic replicon of the IncN group plasmid pCU1. J Mol Biol 246:595-608. 28. Putnoky, P., A. Kereszt, T. Nakamura, G. Endre, E. Grosskopf, P. Kiss, and A. Kondorosi. 1998. The pha gene cluster of Rhizobium meliloti involved in pH adaptation and symbiosis encodes a novel type of K+-efflux system. Mol. Microbiol. 28:1091-1101. 29. Rossi, L., B. Tinland, and B. Hohn. 1998. Role of virulence proteins of Agrobacterium in the plant, p. 302-330. In H. P. Spaink, A. Kondorosi, and P. J. J. Hooykaas (ed.), The Rhizobiaceae. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 30. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 31. Savka, M. A., R. C. Black, A. N. Binns, and S. K. Farrand. 1996. Translocation and exudation of tumor metabolites in crown galled plants. Mol Plant-Microbe Interact 9:310313. 32. Seto, Y., M. Hashimoto, R. Usami, T. Hamamoto, T. Kudo, and K. Horikoshi. 1995. Characterization of a mutation responsible for an alkali-sensitive mutant, 18224, of alkaliphilic Bacillus sp strain C-125. Biosci. Biotech. Biochem. 59:1364-1366. 33. Thatte, V., D. E. Bradley, and V. N. Iyer. 1985. N conjugative transfer system of plasmid pCU1. J Bacteriol 163:1229-1236. 34. Tinland, B., F. Schoumacher, V. Gloeckler, A. M. Bravo-Angel, and B. Hohn. 1995. The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome. EMBO J 14:3585-3595. 35. Zambryski, P., J. Tempé, and J. Schell. 1989. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ti and Ri plasmids in plants. Cell 56:193-201. 36. Zorreguieta, A., R. A. Geremia, S. Cavaignac, G. A. Cangelosi, E. W. Nester, and R. A. Ugalde. 1988. Identification of the product of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence gene. Mol Plant-Microbe Interact:121-127. 37. Zupan, J. R., and P. Zambryski. 1997. The Agrobacterium DNA transfer complex. Crit Rev Plant Sci 16:279-295.
31
7. Köszönetnyilvánítás Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Hálával tartozom a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelı hátteret biztosítottak terveim megvalósításához.
Külön köszönettel tartozom témavezetımnek, Dr. Putnoky Péter egyetemi tanárnak munkám irányításáért és sok segítségéért, hasznos tanácsaiért.
Szintén köszönöm Pálvölgyi Adriennek, Galambos Anikónak, Deák Veronikának, Garai Krisztinának és Bertusz Juditnak a kísérletek kivitelezésében nyújtott segítségét.
