A pha2 géncsoport izolálása
Készítette: NAGY RÉKA Biológia szakos hallgató
Témavezető: Dr. Putnoky Péter Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
PÉCS, 2004.
NR_DIP04.doc
2
1. Irodalmi áttekintés .............................................................................................................3 1. 1. Bevezetés ...................................................................................................................3 1. 2. Rhizobiumok..............................................................................................................3 1. 3. Szimbiózis és nitrogénkötés.......................................................................................4 1. 3. 1. Invázió, az endoszimbiózis kialakulása .............................................................5 1. 3. 2. Az invázió baktériumgenetikai háttere ..............................................................7 1. 3. 2. 1. Sejfelszíni poliszacharidok ........................................................................8 1. 3. 2. 2. A környezethez való alkalmazkodást kialakító gének...............................9 1. 4. A pha- gének szerepe...............................................................................................10 1. 6. Szimbiotikus gének a gazdanövényben ...................................................................14 2. Célkitűzések.....................................................................................................................15 3. Alkalmazott anyagok és módszerek ................................................................................16 3. 1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok .................................................................16 3. 2. Táptalajok és a baktériumtörzsek növesztése ..........................................................17 3. 3. Plazmid-DNS izolálása ............................................................................................17 3. 4. Összes DNS izolálás ................................................................................................18 3. 5. Restrikciós emésztés ................................................................................................18 3. 6. Baktériumok keresztezése........................................................................................18 3. 7. Hőérzékenységi teszt ...............................................................................................19 3. 8. Bakteriofágok szaporítása........................................................................................19 3. 9. Fágtitrálás.................................................................................................................19 3. 10. Tn phoA mutagenezis ............................................................................................20 3. 11. Polimeráz láncreakció............................................................................................20 3. 12. DNS agaróz gélelektroforézis................................................................................21 4. Eredmények és kiértékelésük...........................................................................................22 4. 1. Előkísérletek a pha2 régiót tartalmazó DNS-szakasz izolálásához .........................22 4. 2. A pha2 géncsoportot tartalmazó kozmidklón izolálása a 123. géntárcsoportból ....26 4. 3. A kozmidklónok elemzése EcoRI, SalI és BamHI enzimekkel...............................27 4. 4. A pha2A és a pha2G szekvenciát is tartalmazza a pRN4209 kozmid .....................30 4.5. A pha2 régió mutagenizálása....................................................................................31 4. 5. 1. Mutagenezisre alkalmas törzs konstruálása .....................................................31 4. 5. 2. A λTnphoA mutagenezis .................................................................................32 5. Összefoglalás ...................................................................................................................34 6. Irodalom...........................................................................................................................35 7. Köszönetnyilvánítás.........................................................................................................38
NR_DIP04.doc
2
3
1. Irodalmi áttekintés 1. 1. Bevezetés
Földünk légkörének 78%-át nitrogéngáz alkotja. A légköri nitrogén megkötése és ammóniává alakítása fontos szerepet tölt be a biológiai rendszerekben a nitrogénkörforgás révén (Burns and Hardy, 1975). A talajba került szerves nitrogénvegyületeket a lebontó szervezetek ammóniává alakítják át (ammonifikáció). A nitrogénkötő baktériumok a légköri nitrogén nagy részét megkötik (fixálják), ammóniává redukálják. A redukált ammónia egy részét a talajban élő nitrifikáló baktériumok nitritté, végül nitráttá alakítják. Ez a folyamat a nitrifikáció. Az ily módon megkötött nitrogént a növények is képesek felvenni gyökérszőreiken keresztül a talajból. A nitrát denitrifikáció során nitrogéngázzá alakulhat és visszakerülhet a légkörbe.
1. 2. Rhizobiumok
A
Rhizobiaceae
család
a
baktériumok
Eubacteriales rendjébe tartozik. A család Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Rhizobium (1. ábra), Shinorhizobium
nemzetségeibe
tartozó
fajokat
összefoglaló néven rhizobiumoknak nevezzük. Ezek a talajbaktériumok egyedi módon biztosítják maguknak a megfelelő életteret; képesek átprogramozni bizonyos növények
differenciálódási
és
anyagcserefolyamait
szignálcsere útján. A
változás
következtében
a
gazdanövény
gyökerén új növényi szerv keletkezik, a szimbiotikus gümő. A gümő belsejében élő baktériumok védve vannak a külvilág hatásaitól és tápanyagot kapnak a
1. ábra: Rhizobium sp. elektronmikroszkópos képe
növénytől, az ebből származó energiát felhasználva képesek a légköri nitrogént ammóniává redukálni. Az így megkötött és átalakított nitrogén a gazdanövény számára is
NR_DIP04.doc
3
4 hasznosítható, tehát az endoszimbiózis mindkét fél számára előnyös (Allen and Allen, 1981). A rhizobiumok kutatása során azon gének megismerése helyezik a hangsúlyt, amelyek a szimbiózis kialakításában, vagy a kialakult gümő anyagcseréjében játszanak szerepet.
1. 3. Szimbiózis és nitrogénkötés
A légköri nitrogéngáz hasznosítására képes diazotróf fajok kivétel nélkül a prokarióta szervezetek közül kerülnek ki. Megkülönböztethetünk úgynevezett szabadonélő nitrogénkötőket
(pl.
Azotobacter,
Clostridium,
Klebsiella
fajok)
melyeknek
a
nitrogénredukció végbemeneteléhez csupán a megfelelő fiziológiai feltételek illetve körülmények szükségesek. Más diazotróf fajok laza kapcsolatot alakítanak ki bizonyos növényekkel.
Ezek
endoszimbiotikus
az
asszociatív
nitrogénkötők
nitrogénkötők
egy
(pl.
meghatározott
Azospirillum gazdanövénnyel
fajok).
Az
szorosan
együttműködve, annak szervezetébe bejutva képes a nitrogén megkötésére. A növények nagy része nitrogénszükségletét általában a talajban oldott nitrogéntartalmú vegyületek (NO3 - - nitrát, NH4+ - ammóniumion) formájában veszik fel. Az alacsony nitrogén tartalmú talajokon ezek a növények csak korlátozott mértékben képesek fejlődni, szaporodni. A nitrogénkötő baktériumokkal szimbiózisban élő fajok számára
azonban
a
nitrogénszegény
környezet
nem
jelent
hátrányt,
mivel
nitrogénháztartásuk a levegő nitrogéntartalmára épül. Ezáltal függetleníteni tudják fejlődésüket a talajban található nitrogénvegyületek mennyiségétől. Rossz minőségű talajokon tehát ezek a fajok kimeríthetetlen nitrogénforrásuk révén előnyt élveznek az ilyen szimbiontákat nélkülöző növényekkel szemben. Ilyenfajta együttélés szinte kivétel nélkül csak a hüvelyes növények (Leguminosae) és a Rhizobiaceae baktériumcsalád tagjai között figyelhető meg.
NR_DIP04.doc
4
5
1. 3. 1. Invázió, az endoszimbiózis kialakulása
Mint azt az előzőekben említettük a rhizobiumok a légköri nitrogén megkötését a szimbiotikus gümőn belül végzik. A többnyire a gazdanövény gyökerén kialakuló gümő új növényi szerv (2. ábra), amely minden esetben csak a megfelelő baktériumfaj hatására indukálódik. A szimbiózis kialakulása összetett, molekuláris jelcserék sorozatának segítségével valósul meg. Elsőként a növény flavonoid típusú vegyületeket bocsát ki a talajba (Redmond et al., 1986). A kialakult pozitív kemotaxis hatására a gazdanövény rhizoszférájában megnő a baktériumkoncentráció (Currier and Strobel,
1974).
A
fajspecifikus
szerkezetű
flavonoidok (Bladergroen and Spaink, 1998) aktiválják a baktériumok úgynevezett nodulációs génjeinek (nod) expresszióját. Ennek következtében a baktérium egy un. Nod faktort választ ki a növény felé (Schultze et al., 1994), mely indukálja a szimbiotikus gümő kialakulását is. A gümő kialakulása
a
baktériumok
behatolásával,
az
invázióval veszi kezdetét. E folyamat során a baktériumok specifikusan kötődnek a gyökérszőr 2. ábra: Gyökérgümők Phaseolus vulgaris gyökérzetén
sejtjeihez (Mills and Bauer, 1985) (3. ábra/A).A tapadást a növényi lectinek biztosítják (Diaz et al.,
1989). Ezután a gyökérszőrsejt a megtapadt baktériumokkal ellentétes oldalon erőteljes növekedésnek indul ennek következtében jellegzetesen meggörbül (3.ábra/ B). A fertőzési folyamat csak a gyökérszőrök töredékénél sikeres. Sikeressége függ a gazdanövény fiziológiai állapotától és a fertőzési helyek sűrűségétől is. A baktériumsejtek extracelluláris enzimeikkel a sejtfalat feloldják és behatolnak a gyökérszőrbe. A növény az újonnan kialakuló belső sejtfalból egy új, belső csőszerű képletet hoz létre, az infekciós fonalat (3. ábra/C). Ez a cső segíti a baktériumsejtek bejutását a gyökérszőrsejt belsejébe (3. ábra / CD) és később elágazva a gümősejtekbe (3. ábra/E-F).
NR_DIP04.doc
5
6
. 3 ábra: Rhizobium sejtek inváziója a gyökérszőrsejteken keresztül.
A fertőzési ponttól több sejtrétegnyi távolságra az osztódóképességüket visszanyert belső kéregsejtek egy csoportjából kialakul a gümőprimordium, ezzel új osztódószövet keletkezik, a gümőmerisztéma. Néhány nappal később a kialakuló gümő már mikroszkóppal látható a gyökér felszínén, merisztematikus zónájában pedig infekciós fonalhálózat figyelhető meg, amelyen keresztül tömegesen jutnak a baktériumok a gümősejtekbe. A gümő kéregrészében húzódó szállítónyalábokon keresztül jutnak a gümősejtek a fotoszintézis során keletkezett szerves tápanyagokhoz, és bennük szállítódik a megkötött nitrogén a növény különböző részeibe. Az ammónia a glutaminsav-glutamin bioszintézis úton épül be a szerves vegyületekbe. A gümő szövettanilag három zónára osztható. Ezek a folyamatosan működő gümőmerisztéma, a korai és késői szimbiotikus zóna és az öregedési NR_DIP04.doc
6
7 zóna. A fent leírtak elsősorban az úgynevezett indeterminált gümő felépítésére vonatkoznak. A rhizobiumok gümősejtbe jutása endocitózis révén valósul meg. A növényi sejtmembrán lefűződik, miközben egy vagy több baktériumot magába foglal s az így kialakult vezikulumok a sejt belsejébe kerülnek (Mellor and Werner, 1987 ). A peribakteroid membránnal (PBM) körülvett baktériumok osztódnak, majd fiziológiai és morfológiai változások után bakteroidokká alakulnak. Ez az ”átmeneti sejtorganellum” csak nitrogénhiányban jut be, ill. alakul ki a gazdanövény szervezetében. A baktériumok differenciálódását követően megindul a nitrogenáz enzimkomplexet kódoló régió expressziója, s ezáltal a gümő alkalmassá válik a légköri nitrogén megkötésére (Newcomb, 1981 ).
1. 3. 2. Az invázió baktériumgenetikai háttere
Ahhoz, hogy a szimbiózis kialakuljon, nagy számú bakteriális és növényi gén összehangolt működése szükséges. Ennek rendkívül bonyolult szabályozása állandó kommunikációt kíván meg a partnerek között. A gének szintjén történő tanulmányozáshoz eredményes génátviteli rendszerre és szimbiózisban hibás mutánsokra van szükség. Megjelenésük alapján két csoportba sorolhatjuk a baktériummutánsokat. A Nodmutánsok valamely gümőképző, azaz nodulációs (nod) génben hibásak és így nem képesek gümő létrehozására. A Nod-faktornak (mint már említettük) fontos szerepe van a szimbiotikus gümő kialakításában. Hatására a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció jön létre és egy új osztódószövet, a gümőmerisztéma alakul ki (Dudley et al., 1987). Szintén a Nod-faktor okozza a gyökérszőrök görbülését (Catoira et al., 2001) és az infekciós fonal növekedését is (Gage and Margolin, 2000). A Nod- fenotípusú, azaz nod génekben hibás mutánsok nem képesek a gümőképződés iniciálására. A növényi flavonoidok által közvetített szignált a NodD fehérje fogja fel, majd aktiválja a többi nod gént. A mutánsok másik csoportját azok a baktériumok alkotják, amelyeknél a gümő kifejlődik ugyan, de nem képes a légköri nitrogén megkötésére (Fix- mutánsok). Az ilyen mutációt okozó hibás géneket fixációs géneknek (fix) nevezték el. A hetvenes évek végére több rhizobiumnak is elkészült a kromoszómatérképe. Ezeknél a fajoknál azonban sok, a szimbiózist érintő mutációt nem tudtak elhelyezni a kör alakú térképen. Fény derült arra, hogy a rhizobium genomban gyakori a mintegy 100 kb NR_DIP04.doc
7
8 méretet is meghaladó plazmid. Genetikai adatok utaltak arra, hogy a különböző baktériumtörzsekben a nod és a fix gének legalább egy része extrakromoszómálisan helyezkedik el. A szimbiotikus baktérium bejutása a gümő belsejébe felismerési lépések sorozatán keresztül valósul meg. A fertőzési folyamatokban kiemelkedő szerepe van a baktérium különböző felszíni poliszacharidjainak és a növényi környezethez való alkalmazkodási mechanizmusoknak.
1. 3. 2. 1. Sejfelszíni poliszacharidok
A baktériumok felszíni poliszacharidjainak a sejtfelszínhez ill. a környezethez való viszonya alapján három csoportját különböztetjük meg. A lipopoliszacharidok (LPS) a külső membránba ágyazódnak, a kapszuláris poliszacharidok (KPS vagy CPS) a felszínhez szorosabb kapcsolatot alakítanak ki. A harmadik csoportot a környezetbe kiválasztott exopoliszacharidok (EPS) képviselik (Spaink, 2000). A poliszacharidok feladata a baktérium védelme a külső környezet hatásaival szemben, de ennél fontosabb funkciójuk a felismerési folyamatokban nyilvánul meg (Reuhs et al., 1998). A különböző poliszacharidok szerepét baktériummutánsokkal vizsgálták. Ilyen például a gümőinvázióra képtelen, infekcióban hibás (Inf-) mutánsok, melyek üres gümőt hoznak létre, mivel a létrehozott új szervbe nem képesek bejutni. Az exopoliszacharidok a sejtfelszínen halmozódnak fel. Szerepük van a különböző felszínekhez
való
megtapadásban,
a
környezeti
stressztűrésben.
A
megtapadás
befolyásolása miatt fontos szerepük van patogén és szimbiotikus kapcsolatok kialakításában is. Az S. meliloti által termelt
szukcinoglükán hét glükóz és egy
galaktózmolekulából épül fel (Reuber and Walker, 1993 ), s egy heteropolimer, az EPSI (savas EPS) része (Fraysse et al., 2003). Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil oldalláncok találhatóak. Savasságát az uronsav, piruvát és szukcinát elemek beépülésének köszönheti. Az exopoliszacharidok alapvető szerepe a gümő létrehozásában és az infekciós fonal kialakításában van (Cheng and Walker, 1998; Gonzáles et al., 1998). Az EPS termelésben hibás baktérium nem képes az invázióra (Exo-, Inf- fenotípus), az infekciós vonalak abortálódása miatt (Müller et al., 1988).
NR_DIP04.doc
8
9 Léteznek olyan rhizobiumok, melyek nem termelnek exopoliszacharidokat, mégis képesek szimbiózis kialakítására. Ezek a baktériumok olyan rhizobiális kapszuláris poliszacharidot (KPS) termelnek, mely helyettesíteni képes a hiányzó exopoliszacharidot a szimbiózisban. Ilyen pl. a S. meliloti 41 törzs exoB mutánsa (Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). A KPS kapszulaként veszi körül a baktériumsejtet, mely védelmet biztosít egyes fágokkal ill. a kiszáradással szemben. Fontos szerepet tulajdonítanak neki a szimbiotikus felismerés korai szakaszában (Becquart-de Kozak et al., 1997). A kapszuláris poliszacharidok a baktériumok felszínéhez kötöttek, erős immunogének lehetnek, ezért Kantigéneknek is nevezik őket. .Rhizobiumoknál az első felfedezések a KPS jelenlétéről R. Carlson laboratóriumából származnak (Reuhs et al., 1993). Lipopoliszacharidok
a
Gram-negatív
baktériumok
sejtfelszínének
külső
membránjához kapcsolódó alkotók. Három jellegzetes szerkezeti egységre oszthatók (Reuhs et al., 1998): a membránba ágyazódó lipidA, a konzerválódott „core” oligoszacharid régió és az ismétlődő oligoszacharid egységekből álló O-antigén (Kannenberg and Brewin, 1994). Az LPS mutáns S. meliloti törzsek endoszimbiózis kialakítására képesek a gazdanövénnyel, de az invázió és a gümőképződés mechanizmusa lassabban megy végbe (Lagares et al., 1992). Egyes rhizobium fajoknál csak az LPS bizonyul lényeges tényezőnek az EPS-sel ill. a KPS-sel szemben (Kannenberg and Brewin, 1994).
1. 3. 2. 2. A környezethez való alkalmazkodást kialakító gének
Ismertek olyan bakteriális gének is, melyek kizárólag a környezethez való alkalmazkodást segítik mind a szimbiózisban, mind azon kívül. E gének meghibásodása esetén a mutáns baktérium szintén elakad a fertőzési folyamat valamely lépésénél. Ilyen például a ndvAB géncsoport, melyről bizonyították, hogy szerepük van a növény-baktérium kapcsolatok kialakításában. Ezt a géncsoportot az Agrobacterium kromoszomális virulenciagénjeinek (chvAB) segítségével azonosították. A géncsoport meghibásodása esetén a S. meliloti mutánsok Inf- fenotípust mutatnak, s nem termelik a Rhizobiaceae családra jellemző ciklikus β-1,2-glükánt, mely nagy mennyiségben található a periplazmatikus térben. Az NdvB fehérje a ciklikus B-1,2-glükán szintézisében, míg az NdvA a transzportban vesz részt. Az invázió szempontjából azonban nem a termelt NR_DIP04.doc
9
10 poliszacharid milyenségén van a hangsúly. A mutáns baktériumok ozmotikus toleranciája megváltozik, elveszítik hipoozmotikus adaptációs képességüket (Dylan et al., 1986; Dylan et al., 1990a). Az e területen kísérleteket végző Dylan és munkatársai az ndv mutánsok között olyan pszeudorevertánsokat találtak, amelyek visszanyerték ozmotikus adaptációs és szimbiotikus képességüket, de nem termeltek β-glükánt. Ez a felfedezés arra utal, hogy a fertőzés kialakulásában nem a poliszacharid jelenléte lényeges, hanem a baktérium alkalmazkodóképessége az infekciós fonalban lévő fiziológiai körülményekkel szemben (Dylan et al., 1990b). A Sinorhizobium meliloti esetében már azonosítottak számos olyan fix mutációt, melyben az invázió gátolt volt (Putnoky et al., 1988). E mutáció segítségével azonosított pha1ABCDEFG génekben (korábban fix-2 régió) minden Tn5 inszerció K+-ionokkal szembeni érzékenységet okoz. Ez a megfigyelt szenzitivitás lúgos körülmények között fokozódik, tehát ennek a géncsoportnak is a környezethez való alkalmazkodásban van szerepe. A fiziológiai kísérletek alapján valószínű, hogy a pha1 régió egy K+effluxrendszer felépítését határozza meg (Putnoky et al., 1998). A rhizobiumok genomprojektjei segítségével felgyorsultak a vizsgálatok a szimbiózisban szerepet játszó gének megismerésére. A feltételezett géncsoportokat összevetve a meglévő adatbázisokkal számos olyan szekvencia felfedezhető, amelynek szimbiotikus szerepe lehet.
1. 4. A pha- gének szerepe
A fix-2 kromoszomális géncsoportok növényi invázióban betöltött szerepe bizonyítottá vált, mivel a régióban mutációt hordozó baktériumok nem képesek behatolni a kialakuló gümő belsejébe. Meghatározó felismerés volt a mutáns baktériumok K+- ion koncentrációra való érzékenysége, különösen lúgos pH értékek mellett. Kísérleti körülmények között a mutánsokra már 10 mM KCl jelenléte is letálisnak bizonyult. Ezzel szemben a ”normál”, kontroll sejtek akár 500 mM KCl koncentráció mellett is képesek osztódni. Az eredmények arra utaltak, hogy a mutációt szenvedett baktériumok hibásak valamilyen K-transzportot érintő s egyben a környezet kémhatásához való alkalmazkodást kialakító és elősegítő mechanizmusban. Direkt Tn5 transzpozonos mutagenezis segítségével megállapították, hogy a fix-2 régió 6 kilobázispár kiterjedésű s ezen a szakaszon belül minden egyes Tn5 inszerció NR_DIP04.doc
10
11 azonos fenotípusú. A ”pH-adaptáció” kifejezés után a génszakasz a pha elnevezést kapta, ezzel is utalva a régió génjeinek funkciójára. Az előző kísérletek alapján feltételezhető, hogy a pha régiónak a K-transzportban van szerepe. Ebből arra lehet következtetni, hogy az itt elhelyezkedő gének transzmembrán fehérjéket kódolnak. A bizonyításhoz alkalikus foszfatáz (phoA) transzlációs fúziókat kellett létrehozni a TnphoA transzpozon segítségével. A kapott TnphoA fúziós termék csak akkor lesz működőképes, ha az eltalált idegen génben legalább egy transzmembrán domént vagy szignálpeptidet meghatározó kódoló génszakasz található a fúziós pont előtt. Fontos az is, hogy a TnphoA transzpozon által hordozott phoA szekvencia a megfelelő orientációban és ”in frame” csatlakozzon. A megmutatkozó aktivítás bizonyítja, hogy a vizsgált fehérje transzportálódik a priplazmatikus térbe, vagy egy része belenyúlik abba. A pha régióra jellemző, hogy benne azonos irányultságú, aktív phoA transzlációs fúziókat lehet izolálni. Ezek igazolták a feltételezést. A hipotézis megerősítést nyert, mikor elkészült a régió nukleotidszekvenciája és a TnphoA fúziós pontok szekvenciaelemzése. A pha géncsoport fizikai-genetikai analízise kimutatta, hogy hét, egymást szorosan követő cisztron alkotja (phaABCDEFG), melyek feltételezett termékei jellegzetes transzmembrán doméneket hordozó fehérjék. A régióban kódolt leghosszabb fehérje a PhaA , amely valószínűleg 17, míg a PhaD fehérje 13 transzmembrán domént tartalmaz. A gének a phaA gén előtti promóterről íródnak át és egy transzkripciós egységet alkotnak. Valószínű az is, hogy a gének termékei ugyanannak a komplexnek az alegységei. A kezdeti transzportkísérletek kimutatták, hogy csak a K+-transzport sérült meg a mutáns baktériumokban, a Na+-forgalom nem változott. Alkalikus pH-értékeknél a sejtek belső pH értéke lúgos irányba tolódik el, mivel a neutrális amin a sejtbe bejutva felvesz egy protont, s ezzel csökkenti a belső H+-koncentrációt. Ilyenkor válik fontossá a K+/H+ antiporter, mely protonokat juttat a sejt belsejébe K+-ért cserébe, s így helyreállítja a belső optimális pH-értéket. Ha vad típusú S. meliloti törzset dietanol-aminnal (DEA) kezeltek, a sejtek képesek voltak K+ kiáramoltatására, igazolva ezzel egy belső pH-t szabályozó mechanizmus meglétét. A phaA génben Tn5 inszerciót hordozó mutáns belső K+ -koncentrációja DEA adása után tovább emelkedett, ezzel jelezve a pH- és az ionegyensúly felborulását. Ezek a kezdeti iontranszport-kísérletek és a mutánsok fiziológiai vizsgálata arra utaltak, hogy a pha géncsoport egy pH regulációban szerepet játszó K+ -effluxrendszer alegységeit kódolja, amely feltételezhetően egy K+/H+ antiporter (Putnoky et al., 1998). NR_DIP04.doc
11
12 A feltételezett alegységek szekvenciája nagy hasonlóságot mutat a Bacillus subtilisben leírt Na+/H+ antiporter alegységeinek szekvenciájához (Hamamoto et al., 1994; Krulwich et al., 1994; Seto et al., 1995). Figyelemreméltó, hogy a PhaA és PhaD fehérjék hasonlítanak a NADH-ubiquinon oxidoreduktáz (komplex I) eukarióták esetében a mitokondriális genomban kódolt ND4 és ND5 alegységeihez. Ezek a bakteriális NuoL és NuoM alegységeknek felelnek meg. A komplex I esetében ugyanúgy hétféle alegység található a membránba ágyazódva, mint a Pha komplexben (Friedrich et al., 1995). Mivel mindkét esetben protontranszlokáció történik, és a nagyobb alegységek is homológok, feltételezhető, hogy a komplex I membránba ágyazódó része egy valamikori antiporterből alakul ki (Friedrich and Weiss, 1997). Érdekes az a tény, hogy az S. meliloti 1021 törzs genomjában két azonos felépítésű pha géncsoport található. A pha1 a kromoszóma 3143729. bázisánál kezdődik, a pha 2 szekvencia (4. ábra) a 1085034. bázisnál kezdődően helyezkedik el a kromoszómán. A két géncsoport által kódolt fehérjék között azonban nem nagy a hasonlóság.
4. ábra: A S. meliloti 1021 pha2-régiójának térképe (citromsárga)
Az S. melilotival rokon baktériumfaj, az Agrobacterium tubemefaciens szintén két pha régióval rendelkezik. Az egyik pha régió által kódolt fehérjék nagyobb hasonlóságot mutatnak az S. meliloti pha1 géncsoport termékeivel, mint az A. tumefaciensben fellelhető másik csoport tagjaival. Ez a megállapítás az S. meliloti esetében is igaz, ami azt jelenti, hogy a két géncsoport funkcionális differenciálódása jóval előbb megtörtént, mint ahogy az Agrobacterium és a Rhizobium nemzetségek elváltak egymástól.
NR_DIP04.doc
12
13
5. ábra: A PhaA1- és PhaA2 fehérjék összehasonlításából származó törzsfa /Atu:Agrobacterium tumefaciens, Bfi:Bacillus firmus, Bha:B. halodurans, Bsu:B. subtilis, Bme:Brucella melitensis, Lin: Listeria innocua, Lmo:L. monocytogenes, Sau:Staphilococcus Aureus, Sme:S. meliloti, Vch:Vibrio cholerae/
Bár a két géncsoport több más baktériumfajban is együtt fordul elő (5. ábra), a pha1 ill. pha2 régiók nem különíthetők el a funkciót tükröző két csoportra. Valószínűsíthető, hogy az ellentmondás okozója a horizontális géntranszfer (Koonin et al., 2001) és a gének eltérő idejű megjelenése. Feltételezhetően az egy baktériumon belül megjelenő két géncsoport egyike Na+/H+, míg a másik egy K+/H+ antiportert határoz meg.
NR_DIP04.doc
13
14
1. 6. Szimbiotikus gének a gazdanövényben
Ahhoz, hogy megértsük a szimbiózis kialakulásának folyamatát és eseményeit, elengedhetetlen a gazdanövény vizsgálata is. Az első értékes eredményeket azok a biokémiai eredmények hozták, amelyekben a nodulinokat, mint gümőspecifikus növényi fehérjéket jellemezték (Legocki and Verma, 1980 ). Később lehetőség nyílt a gümőben expresszálódó növényi gének megismerésére és azonosítására. Több éve ismertek már nodulációban vagy a szimbiózis valamely lépésében hibás mutánsok. L. japonicus esetében izoláltak elsőként ”igazi” nodulációs gént (Schauser et al., 1999). Az e génben hibás mutánsok genetikai és fiziológiai jellemzésével a Nodfaktor szignál transzdukciós útja több lépésre bontható. A baktériummutánsok egy része nem reagált a Nod-faktor kezelésre, és gombákkal való szimbiózisra is képtelen volt. A mutációk térképezésével azonosították az első Nod-faktor érzékelésében fontos növényi géneket, melyek a szignáltranszdukciós úton elsőként jut szerephez. A noduláció kezdetén nagy szerepe van a növényi lektineknek. Ezeket a fehérjemolekulákat tartották ugyanis a baktériumok felszíni poliszacharidjai mellett a gazdaspecifítás fő meghatározójának Ezek a szénhidrátkötő fehérjék képesek specifikus módon elősegíteni a gazdanövénynek megfelelő baktérium megtapadását a gyökérszőrön. Azokban a kísérletekben, amelyekben a gazdanövényből származó lektingént idegen pillangósokba vitték át, elő lehetett segíteni a lektinre specifikus baktérium gümőképződését a transzgenikus növényen. Tehát a lektinek által meghatározott és közvetített felismerési reakciónak szerepe van a baktérium-növény kapcsolatban (Hirsch, 1999; Kijne et al., 1997).
NR_DIP04.doc
14
15
2. Célkitűzések
Az előzetes kísérletek során felmerült az a gyanú, hogy az S. meliloti baktériumban található két pha géncsoport egyike Na+/H+, míg a másik egy K+/H+ antiportert határoz meg. Mivel a pha1 régióról már korábban bizonyították, hogy a K+-transzportban játszik szerepet feltételeztük, hogy a pha2 géncsoportnak a Na+-homeosztázisban van jelentősége. Munkánk célja az volt, hogy az említett pha2 géncsoportot hordozó régiót egy S.meliloti géntárból izoláljuk, majd a szekvencián belül transzpozonos mutagenezissel mutációkat hozzunk létre a gének funkciójának bizonyítására.
NR_DIP04.doc
15
16
3. Alkalmazott anyagok és módszerek
3. 1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok
A munkánk során alkalmazott baktérium és bakteriofágtörzsek, valamint plazmidok jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok Baktériumok Törzs Jellemzők Sinorhizobium meliloti RM41 S. meliloti vad típusú (Exo+, Nod+, Fix+) AK631 RM42 Exo-, Exo bEscherichia coli PP211 JF 754 (pRK 2013) NeoR ( KmR) PP513
NM 512 (λcIHAI)
LE 392
F- supE44 supF58
NM512
F – rec- sup(0)
RN4209 RN4210 RN4253 RN4254 Fágok λ::TnphoA Plazmidok pRK2011 pRN4209 pRN4210
NR_DIP04.doc
HB101 (pLAFR1:: RM41 génbank klón No37. =pRN4209) HB101 (pLAFR1:: RM41 génbank klón No40 = pRN4210) PP513 RifR PP513 (pLAFRI pha2régió, 37. klón
Forrás
SzendeK. Kondorosi Á. Putnoky P. Putnoky P. (deBruijn and Lupski, 1984) (deBruijn and Lupski, 1984) ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka
b221 cI857 rex::TnphoA Pam3
(Beringer et al., 1978)
KmR helper plazmid pLAFR1:: RM41 génbank klón No37 pLAFR1:: RM41 génbank klón No40
(Ditta et al., 1985) ez a munka ez a munka
16
17
3. 2. Táptalajok és a baktériumtörzsek növesztése
A Shinorhizobium meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) komplett vagy GTS ( Kiss et a., 1979) minimál táptalajon növesztettük egy éjszakán át. Az Escherichia coli törzsek felnövesztésére LB (Sambrook et al., 1989) táptalajt alkalmaztunk. A táptalajokhoz a megfelelő mennyiségű és koncentrációjú antibiotikumot adtuk (2. táblázat). A rhizobium törzseket, valamint a hőérzékeny lambda lizogén törzseket (1. táblázat) 32◦C-on, a többi baktériumot 37◦C hőmérsékleten szaporítottuk
2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk (µg/ml) Escherichia coli
Sinorhizobium meliloti
Tetracyclin (Tc)
15
15
Kanamycin (Km)
30-60
200
Rifampicin (Rif)
50
-
3. 3. Plazmid-DNS izolálása A 3-3 ml LB folyékony táptalajban frissen növesztett kultúrából a plazmid (esetünkben kozmid) DNS-eket Ish-Horowicz és Burke módszere szerint (Ish-Horovicz and Burke, 1981), alkalikus lízissel preparáltuk. 1,5 ml felnövesztett kultúrát Eppendorf csőben lecentrifugáltunk, majd a leülepedett baktériumokat 100 µl TEG oldatban (50 mM glükóz, 25mM Tris, 10 mM EDTA, pH=8) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0.2 N NaOH, 1 % SDS) hozzáadásával végeztük, óvatos keverés mellett. A mintákat 5 percig 0◦C-on inkubáltuk, majd 160 µl NaAc (3 M NaAc, pH=4.8) bemérése után erősen összeráztuk őket, míg pelyhes csapadék keletkezett, majd megismételtük az előbbi inkubálást. A kivált SDS–es csapadékot lecentrifugáltuk és a felülúszóból (kb. 400 µl) i-propanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. Centrifugálás után a csapadékot 75 %-os etanollal mostuk, szárítottuk. Ezt követően a csapadékot 100 µl TRIS-Ac oldatban (50 mM Tris, 100 mM NaAc, pH=8.0) feloldottuk, majd 200µl
NR_DIP04.doc
96-100%-os etanollal ismét kicsaptuk. 5 perc
17
18 szobahőmérsékleten való állás után lecentrifugáltuk a csöveket (5 perc), ezután az előzőhöz hasonlóan mossuk ill. szárítjuk a csapadékot. Az így kapott DNS-t 30 µl H2ORNase (50-100µg/ml) oldatban oldottuk fel, s a restrikciós emésztésekhez 10-15µl-t használtunk fel (a pLAFR1 kozmid származékok esetében).
3. 4. Összes DNS izolálás
A PCR kísérletekhez gyors DNS izolálási technikát alkalmaztunk. Az előzőleg felnövesztett és vizsgálni kívánt baktériumtörzset 100 µl steril desztillált vízben felszuszpendáltuk. A mintát 5 percig 100◦C-on forraltuk, majd szintén 5 percig 0◦C-on inkubáltuk. 5 perc centrifugálás után, a felülúszót új csőbe pipettáztuk, és a reakcióhoz megfelelően higítottuk.
3. 5. Restrikciós emésztés
A kapott DNS- minták emésztését Maniatis és mti. szerint végeztük (Maniatis et al., 1982) EcoRI( H puffer), BamHI (M puffer)
és SalI restrikciós endonukleázok
segítségével. A reakcióelegy 14µl plazmid DNS-t, 1.5 µl 10×puffert és 0.5 µl enzimet tartalmazott. Az emésztés 1-2 órán keresztül, 37◦C-on megy végbe. A reakció befejeződése után a mintákhoz 4-4 µl 5×STOPot adtunk. A fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt és 0.5 TBE puffert használtunk.
3. 6. Baktériumok keresztezése
A donor, a recipiens és a helper plazmidot tartalmazó baktériumokat komplett táptalajon növesztettük a megfelelő antibiotikumok jelenlétében, egy éjszakán át. A felnőtt populációkból 0.9%-os NaCl-oldattal híg szuszpenziót készítettünk TA lemezen azonos arányban összecseppentve az oldatokat 32◦C-on 24 órát inkubáltuk. Az így felnőtt
NR_DIP04.doc
18
19 exkonjugáns baktériumokat újra felszuszpendáltuk, és különböző higításban a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó szelektív lemezekre szélesztettük.
3. 7. Hőérzékenységi teszt
A keresztezés során kapott és tisztított exkonjugáns baktériumokat 0.9%-os NaCl oldatban felszuszpendáltuk, majd
2 darab antibiotikumos LB lemezre szélesztettük.
Kontrollként hőérzékeny PP513 baktériumot alkalmaztunk. Az egyik lemezt 32◦C-on, a másikat 42◦C-on inkubáltuk 16-24 órán át.
3. 8. Bakteriofágok szaporítása
Bemértünk 10 ml LB MgSO4 (5mM) oldatot lombikba, majd egy fágplakkot helyeztünk el benne. A lombikot egy éjszakán át 37 ◦C-on rázattuk. Az inkubációs idő letelte után egy csepp kloroformot adtunk az elegyhez. 10 ml LB MgSO4 (5mM) oldatba 0.5ml frissen felnövesztett baktériumkultúrát adtunk. Az elegyet 37◦C-on rázattuk, míg optikai denzitása (OD) 590nm-en 0.4-ig növekedett (kb.1-1.5 óra). Ezután 2 ml egy lépéses nagy multiplicitással fertőzött fáglizátumot adtunk az oldathoz, s 37◦C-on 1,5-2 órán át rázattuk, ezalatt az összes baktérium lizált.
3. 9. Fágtitrálás
A felnövesztett fágból SM higítópufferben 10-2-10-7 koncentrációjú higításokat készítettünk.0.2 ml egy éjszakán át felnövesztett baktériumot, 0.1 ml megfelelően higított fágot és 4-4 ml (meleg) LB TOPot összemértünk. Az így kapott elegyet LB lemezre öntöttük ki, majd dermedés után 24 órára 37◦C-os termosztátba tettük.
NR_DIP04.doc
19
20
3. 10. TnphoA mutagenezis
A De Bruijn és Lupski által leírt módszer (deBruijn and Lupski, 1984) módosított változatát használtuk (Putnoky et al., 1990), melynek lényege a következő.A lizogén PP513 törzs egy Tc-rezisztenciagént is hordozó kozmid klónon tartalmazza a mutagenizálni kívánt régiót. Ezt a baktériumtörzset egy olyan λ-fággal fertőzzük, amely Km-rezisztenciagént tartalmazó Tn5 transzpozont hordoz, de az adott baktériumban nem képes fennmaradni. Így Tc és Km rezisztenciára szelektálva csak azok a telepek fognak túlélni, amelyeknél a Tn5 áthelyeződött a baktériumgenomba. A mutagenizáló ágens, a λTnphoA felszaporítását a LE392-es törzsön végeztük. A fágtitrálás körülbelül 1010 plakk/ml koncentrációt mutatott. A mutagenizálandó baktériumot a megfelelő antibiotikum jelenlétében 12 -16 órán át növesztettük tápfolyadékban, 32◦C-on. Az inkubációs idő letelte után a felnőtt törzset 50-100×-osára higítottuk vissza, 5-20 ml LB MgSO4 (5mM) oldatban. Az előzőekben leírtak alapján összeállított elegyet tartalmazó lombikot 30 ◦C-on rázattuk OD600=0.6-0.8-ig. A kívánt érték elérése után az így frissen felnövesztett baktériumtenyészet 1 mléhez 0.5-1.0 ml λTnphoA fágot adtunk és 15 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk a fágmegtapadás eredményes lejátszódása érdekében. A baktérium-fág elegyet 45 percig 32◦C-on rázattuk hogy a rezisztenciagének megfelelően expresszálódhassanak. Végül LB Tc15Km60 lemezekre 100-100 µl kultúrát kentünk ki. A lemezeket 32◦C-on, 48 órán át növesztettük.
3. 11. Polimeráz láncreakció
A pha2 géncsoportot, illetve ennek egy részét magába foglaló DNS –szakaszt igyekeztünk sokszorosítani polimeráz láncreakció segítségével. A felhasznált primereket és programokat a 3. és 4. táblázatok tartalmazzák:
NR_DIP04.doc
20
21 3. táblázat: Alkalmazott primerek és jellemzőik Primer a2-13 a2-15 a2-23 a2-25 g2-31 g2-51 5A1 3A1
Régió phaA2 (S. meliloti) phaA2 (S. meliloti) phaA2 (S. meliloti) phaA2 (S. meliloti) phaG2 (S. meliloti) phaG2 (S. meliloti) nuoA1 (S. meliloti) nuoA1 (S. meliloti)
Bázissorrend
PCR termék
GCAGGCCGCCGAGCTTCGTCAG
1410 bp GTCAGCGCTGCCCGCCACTCCTC AAGCGACAGCGCGATCGAACTGAT
1495 bp TCGGCTTCGCGATCGCTCTAAAAC GGCCGCAAAGAGCAGCAGAC
794 bp GGTCGCGGTTCTGGTTCTCC GGGTACCTTTGGAGCGTGC
811 bp CGAAAGGAGCGACCAGAAGT
4. táblázat: Alkalmazott PCR reakciók Program neve és lépései 1. lépés 2. lépés 3. lépés 4. lépés 5. lépés 6. lépés Felhasznált primerek
PHA1
PHA66
PHA58
3 min. 94°C 30 sec. 94°C 30 sec. 62°C 1 min. 72°C 33-szor a 2. lépésre End a2-13/a2-15, a2-23/a2-25, g2-31/g2-51
3 min. 94°C 30 sec. 94°C 30 sec. 66°C 1 min. 72°C 33-szor a 2. lépésre End
3 min. 94°C 30 sec. 94°C 30 sec. 58°C 1 min. 72°C 33-szor a 2. lépésre End
a2-13/a2-15
a2 23/a2-25, g2 31/g2-51
3. 12. DNS agaróz gélelektroforézis
A fragmentek elválasztására 1 %-os agarózgélt használtunk. Az elválasztandó DNS- mintához 5×STOP-oldatból (20 ml-hez: 2g ficoll, 10ml 0.5M EDTA (pH=8), 40 mg brómfenolkék (BFB)) a végtérfogat 1/5-ének megfelelő mennyiséget adtunk. Az elektroforézist a gél méretétől függően 60-120V-on végeztük. Kontrollként PstI-enzimmel emésztett λDNS-t alkalmaztunk.
NR_DIP04.doc
21
22
4. Eredmények és kiértékelésük
4. 1. Előkísérletek a pha2 régiót tartalmazó DNS-szakasz izolálásához
Első feladatunk az volt, hogy izoláljuk a pha2 régiót tartalmazó géntár klónt. Ehhez a S.meliloti 41 pLAFR1 vektorban készített géntárat használtuk. A géntár 25-30 kilobázisnyi (kb) rhizobiális DNS-t tartalmaz egy kozmidklónon, mely E. coli baktériumban található. A 2000 klónt tartalmazó génbank 200 db csövet tartalmaz, melyekben 10-10 S. meliloti klón található. Elsőként ezeket a tízes csoportokat használtuk a szükséges régiót tartalmazó klón azonosítására. A megszokott hibridizációs módszer helyett a PCR technikát alkalmaztuk. Ennek oka az, hogy problémát jelentett volna az izotóppal való meghatározás, mivel erre alkalmas felszerelés nem áll rendelkezésünkre intézetünkben. Szükséges volt előkísérleteket végeznünk annak érdekében, hogy megtudjuk alkalmas-e a klón izolálására az általunk alkalmazni kívánt polimeráz láncreakció. A S. meliloti klóntárral folytatott korábbi hibridizációs kísérletekben kimutatták a nuo géncsoport jelenlétét több génbank csoportban is. Ezen eredményekből tudtuk, hogy az általunk a tesztkísérletben felhasználni kívánt 50-es és 55-ös minták tartalmazzák, míg az 51-es és 56-os csoportokban nem található meg az említett szekvencia. Kíváncsiak voltunk azonban, hogy PCR reakcióval is ki tudjuk-e mutatni a nuoA1 szakaszt a megfelelő klóncsoportokból. Ennek érdekében az előbbi négy csoportból teljes DNS-t izoláltunk, majd annak 10x-es és 50x-es hígításával PCR kísérletet hajtottunk végre. Az 3. táblázatban szereplő 811 bp nagyságú S.meliloti nuo DNS szakaszok felszaporításához nuo3A1 és nuo5A1 primert alkalmaztunk. A reakció után agaróz gélen választottuk szét a fragmenteket. A PCR reakciónál kontrollként S. meliloti totál DNS szolgált (6. ábra). Mind a 10x-es, mind az 50x-es hígításban jól látható, megfelelő magasságban elhelyezkedő fragmenteket kaptunk az 50-es és az 55-ös bankcsoport esetében, míg az 51es és 56-os csoportokban a szekvencia nem volt kimutatható. A megfelelő klóncsoportokban (50,55) kapott szekvenciák nagysága 810 bp körüli, ami megfelel a várt nuo szekvencia méretének. NR_DIP04.doc
22
23
10X
R
λ 50 52 55 56
50X
λ
50 52 55 56
λ
6.ábra Az S. meliloti génbank csoportok nuo kontrollja A S. meliloti PCR kontroll DNS-ében (R) kimutatható fragment szolgál kontrollként a nuoA1 géncsoport géntárklón mintákból (50, 52, 55, 56) történő kimutatásához. Jól látható, hogy a tízszeres hígítás erősebb képet ad, mint az 50-szeres. A λ DNS a PST I-gyel emésztett molekula kontroll.
Ezek az eredmények az elvárásainknak megfeleltek, így arra következtettünk, hogy az általunk a klónkiszedéshez használni kívánt PCR reakció eredményes lesz. Az előzőekben már alkalmazott csoportokkal újabb kontrollkísérletet végeztünk. Pha a2-13 és a2-15 primerpárral végeztük el a PCR reakciót, majd a DNS-t szintén agarózgélen választottuk szét. PCR kontrollként totál rhizobium DNS-t alkalmaztunk, melyben a nuo és az általunk keresett pha2 szekvencia is jól kimutatható (7. ábra). A kapott gélkép nem mutatta ki a pha2 régió jelenlétét az 50, 51, 55, 56 géncsoportok esetében. A gélre kontrollként felvitt, 1µl totál S. meliloti DNS-el ”szennyezett” ugyanazon négy csoport azonban pozitív reakciót adott. Ezzel igazoltuk, hogy ha a vizsgált csoportok valóban tartalmaznák a pha2 régiót, akkor a pozitív eredmény a PCR reakció után a gélképen látható volna.
NR_DIP04.doc
23
24
R1 R2
λ
50 52 55 56
50 52 55 56
λ
7.ábra: Pha2 régiók kimutatása pha a2-13 és a2-15 primerek segítségével, génbank csoportok (50,52,55,56) totál DNS-éből.R1: S meliloti totál DNS nuo kontrol.R2: S. meliloti totál DNS pha2 kontroll, a λ DNS a PST I-gyel emésztett molekula kontroll.
Az ily módon kipróbált és eredményesnek tűnő módszerrel elkezdtük vizsgálni a géntár tízes csoportjait (8. ábra).
K1 K2 λ 1 2
3
4
5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 K2
8.ábra: Az S. meliloti génbank csoportok totál DNS-ének tesztelése pha2 primerekkel (1-20)
Sajnos az 1-100-as csoportok vizsgálatával nem kaptunk pozitív eredményt. Ez meglepett minket, hiszen a vizsgált 100 csoportból 6-8 esetben számítottunk a régió reprezentáltságára. Két hibalehetőség merült fel: - a reakciókörülmények nem megfelelőek, így a reakció nem működik - a teljes géntárból hiányzik a keresett régió
NR_DIP04.doc
24
25 Az első feltételezést elvethetjük, mivel a kontrollként felvitt mintában tisztán látható a keresett szekvencia. Annak érdekében pedig, hogy megtudjuk, tartalmazza-e a teljes klóntár a pha2 régiót, újabb kontrollkísérletre volt szükség. A géntár teljes állományából plazmid- és teljes DNS preparátumot is készítettünk. A preparátumok 10x-es és 50x-es hígításaival pha a2-23 és a2-25 primerek jelenlétében PCR reakciót végeztünk, melynek segítségével sokszorosítottuk a géntárban feltehetően jelenlévő pha2 régiót. Nuo kontroll mellett a gélkép pozitív klónt jelzett, ami bebizonyította, hogy a géntár tartalmazza a keresett szekvenciát (9. ábra). Mivel a plazmid preparátumok erősebb jelet mutattak, a további kísérletekben azzal dolgoztunk. Kontrollként itt is S. meliloti totál DNS-t alkalmaztunk.
λ R1 1 2
3 4
λ R2 5 6 7
8
λ
9.ábra: A pha2 géncsoport kimutatása az S. meliloti génbank össz DNS-éből (R1: S. meliloti totál DNS nuo kontroll R2: S. meliloti totál DNS pha2 kontroll 1-4: nuo kontroll, 1: 10X-es higítású génbank plazmid DNS, 2: 50 X-es higítású génbank plazmid DNS, 3: 10X-es higítású génbank totál DNS, 4: 50 X-es higítású génbank totál DNS, 5-8: pha2 kontroll 5: 10 X-es higítású génbank plazmid DNS, 6: 50 X-es higítású génbank plazmid DNS, 7: 10 X-es higítású génbank totál DNS, 8: 50 X-es higítású génbank totál DNS, a λ DNS a PST I-gyel emésztett molekula kontroll.)
NR_DIP04.doc
25
26 Annak tudatában, hogy a génbankunk biztosan tartalmazza a keresett klónt, tovább folytattuk a bankcsoportok tesztelését. A 200 db klóntárcsoportból csak a 123. adott pozitív eredményt (10. ábra).
123
λ
R
uvp 172. ábra: 10.ábra: Génbankcsoportok tesztelése, közöttük a pozitív képet adó 123. csoport, R: S. meliloti totál DNS pha2 kontroll, λ: DNS a PST I-gyel emésztett molekula kontroll.
4. 2. A pha2 géncsoportot tartalmazó kozmidklón izolálása a 123. géntárcsoportból
A 123. génbank csoport 10db különböző klónt tartalmaz. Szükség volt tehát az egyes klónok különválasztására, azért hogy megtudjuk, melyikben található meg a keresett pha2 régió. A pozitív eredményt mutató génbankcsoport tartalmát LB lemezen szétválasztottuk kb 80 részre, és felnövesztettük úgy, hogy különálló, egyes telepeket kapjunk. A felnőtt telepek közül 24 db-ot vizsgáltunk. A kiválasztott 24 mintából plazmid DNS-t izoláltunk, majd PCR reakció után agaróz gélen szétválasztottuk a szekvenciákat. Nagy meglepetésünkre ugyanazon csoporton belül (123.) két pozitív, de egymástól eltérő klónt is találtunk (37 és 40), melyek tartalmazták a pha2 szekvenciát, vagy annak egy részét. Meg kellett pontosan határoznunk, hogy a két kozmid klón milyen mértékben hordozza a keresett génszakaszt. Ezt fizikai térképezéssel próbáltuk kideríteni.
NR_DIP04.doc
26
27
4. 3. A kozmidklónok elemzése EcoRI, SalI és BamHI enzimekkel
Mindkét komid klónból plazmid DNS-t izoláltunk, majd azokat háromféle enzimmel emésztettük. Az emésztések után a fragmanteket agaróz gélen választottuk szét. Az így kapott emésztési kép alapján (11. ábra) a meghatároztuk a fragmentek nagyságát. (Az egyes emésztések során kapott fragmenteket a 2. táblázat mutatja.) Az Eco fragmenteket a génszekvenálási projectből ismert S..meliloti 1021 törzs megfelelő szakaszának fizikai térképével vetettük össze (12. ábra).
λ
46
40/Sal 40/Bam 40/Eco 37/Sal 37/Bam 37/Eco
λ
11.ábra: A 37-es és 40-es kozmidklónok emésztési képe. Alkalmazott enzimek: EcoRI, SalI, BamHI, λ: DNS a PST I-gyel emésztett molekula kontroll.
12 ábra: A pha2régió elhelyezkedése a különböző emésztési térképekhez viszonyítva, kiemelve az EcoRI fragmenteket NR_DIP04.doc
27
28 A SalI ill.a BamHI emésztések során a mért értékeket nem tudtuk megfeleltetni az elméletileg várható adatoknak. A nagy mértékű eltérést nem tudjuk magyarázni, mert legalább egy, megközelítőleg azonos vagy hasonló nagyságú szekvenciát kellett volna kapnunk.
6. táblázat: A különböző enzimekkel történt emésztések során elvárt és kapott DNS szakaszok nagysága. Piros háttérrel azok a fragmentek szerepelnek, melyek hordozzák a 25 kb nagyságú pha2 régiót. A kozmidklónok esetében az emésztés után kapott, az elvárthoz hasonló nagyságú szekvenciák egymás alatt találhatók a táblázatban. Alkalmazott enzim: EcoRI Várt fragmentek és sorrendjük S. meliloti 1021 esetén
6688
A 37. kozmidklón emésztéssel kapott fragmenjei A 40. kozmidklón emésztéssel kapott fragmenjei
6226
45
85
2807
481
3601
5800
?
?
2650
?
3900
6400
6200
3925
1142
24
10445
1616
9900
1870
4900
2800
Alkalmazott enzim: BamHI Várt fragmentek és sorrendjük S. meliloti 1021 esetén A 37. kozmidklón emésztéssel kapott fragmenjei
1246
15
3519
1287
10615
323
4300
A 40. kozmidklón emésztéssel kapott fragmenjei
5300
6100
2300
2400
3400
Alkalmazott enzim: SalI Várt fragmentek és sorrendjük S. meliloti 1021 esetén A 37. kozmidklón emésztéssel kapott fragmenjei A 40. kozmidklón emésztéssel kapott fragmenjei
NR_DIP04.doc
3283
46
3182
982
261
8217
5126
3700
3200
5850
2700
1800
3900
3300
3200
5200
2100
4200
2000
28
29 A kis szakaszoktól eltekintve a 37. számú klón (továbbiakban pRN4209) Eco RI fragmentjei gyakorlatilag fedésbe hozhatók a pha2 régiót hordozó S.meliloti 1021 EcoRI emésztése során kapott szekvenciákkal (lsd.6. táblázat). Ennek alapján elképzelhető, hogy a klón Eco térképe megegyezik a 1021-es törzsével. A feltételezést alátámasztja, hogy az emésztési kép szerint a 37. klónban megtalálható a pha2 régió eleje és vége is, így valószínűleg az egész szakaszt magába foglalja (a kis fragmentektől azért tekinthetünk el, mert azok az emésztési képen nem láthatóak). Mutageneziskor a három nagyobb méretű Eco fragment közül a 2,8 kb nagyságú belső fragment jöhet szóba leginkább, mivel ez biztosan tartalmazza a pha2 régiót. Ha λTnphoA mutagenezis során ide épül be az inszerció, biztosan eltaláljuk a pha2 géncsoportot. A 40-es számú klón esetében sem tudunk magyarázatot adni az eltérésekre. Lehetséges, hogy ez a klón egy deléciós műtermék, vagy a részleges emésztés során egy kisebb fragment ligált egy pha géncsoportot részben tartalmazó fragmenttel, majd ”becsomagolódott” kozmidklónná.
NR_DIP04.doc
29
30
4. 4. A pha2A és a pha2G szekvenciát is tartalmazza a pRN4209 kozmid
Fizikai térképezés során kiderült, hogy a pRN4209 kozmid tartalmazza a pha2 szekvencia elején és végén található régiókat. Ezért joggal feltételezhetjük, hogy a teljes géncsoport megtalálható a kozmidon. Még más módszerrel is meg szerettünk volna bizonyosodni arról, hogy a teljes pha2 géncsoport a kezünkben van, ezért a pha2G szekvenciához tervezett két oligonukleotid primerrel is PCR kísérletet végeztünk. A 13. ábra mutatja, hogy a pRN4209 kozmid valóban tartalmazza a pha2G szekvenciát is, mivel megkaptuk a gén jelenlétét jelző 794 bp nagyságú specifikus fragmentet.
R
λ
1
2
3
λ 11 kb 4.7 kb 2.8 kb 2.5 kb 2.1 kb 1.7 kb
13.ábra: A pha2A és pha2G szekvenciák kimutatása specifikus primerek segítségével a pRN4209 kozmidon. R: S. meliloti totál DNS, a2 13/15 primerekkel való PCR reakció után, λ: DNS a PST I-gyel emésztett molekula kontroll, 1: a pRN4209 kozmid a g2 31/51 primerekkel, 2: a pRN4209 kozmid a a2 23/25 primerekkel, 3: a pRN4209 kozmid a a2 13/15 primerekkel való PCR reakció után. Az 1. és a 3. mintában jól látható fragmenteket kaptunk megfelelő magasságban.
Ez a kozmid tehát hordozza a teljes pha2 géncsoportot, így jól használható a régió mutagenizálására, majd a mutációk S. meliloti genomba való bejuttatására.
NR_DIP04.doc
30
31
4.5. A pha2 régió mutagenizálása
Az emésztéssel kapott pha2 fragmentek nagysága és elhelyezkedésük sorrendje arra utal, hogy a pRN4209 biztosan tartalmazza a pha2 szekvenciát. Mutagenezis során a három nagyobb méretű EcoRI fragment közül a 2,8 kb nagyságú belső fragment jöhet szóba leginkább, mivel ez biztosan tartalmazza a pha2 régiót. Ha ebben a szekvenciában hozunk létre mutációt, biztosan megsértjük a pha2 géncsoportot egy szakaszát.
4. 5. 1. Mutagenezisre alkalmas törzs konstruálása
A mutagenezis megkezdése előtt szükség volt egy recipiens törzs létrehozására, amelybe a pRN4209 kozmidklón konjugációval átjuttatható és ott λTnphoA rendszerrel mutagenizálható. Ehhez egy rifampicin antibiotikumra rezisztens PP513 törzset készítettünk (RN4253). A PP513 nem hordoz szupresszor mutációt, lambda lizogén és így alkalmas genetikai hátteret biztosít a mutagenezishez. A λTnphoA (Pam) ugyanis csak olyan törzsön képes szapporodni, amelyben amber szupresszor mutáció (supF) található. Ennek hiányában csak az a törzs lesz kanamicin rezisztens, amelyben a TnphoA transzpozon áthelyeződött a kromoszómára, vagy a mutagenizálni kívánt kozmidra. Az izolált rezisztens törzset kereszteztük RN4209 baktériummal a PP211 helper törzs jelenlétében. A keresztezés célja a kozmidklón (pRN4209) átjuttatása volt a lizogén E.coli törzsbe (RN4253), melynek eredményeként a recipiens baktérium Tc rezisztensé vált. Tehát azokra a telepekre volt szükségünk, amelyek Tc és Rif rezisztenciát hordoztak, és meg kellett győződnünk arról, hogy valóban a pRN4209 plazmidot tartalmazzák-e. Egyegy telep tisztítása során nyert utódokból plazmid DNS preparátumot készítettünk, majd EcoRI-el emésztettük. A 4. 3. fejezetben leírt emésztési képet kaptuk, a gélképen jól láthatóan megjelent a konjugáció során átjutott pha2 régió, melyet a kozmidklón hordozott. Az indukálhatóság ellenőrzéseképpen a keresztezés során nyert törzzsel elvégeztük a hőérzékenységi tesztet 32 és 42 ◦C-on, mely szintén pozitív eredményt adott és az így nyert,
mutagenezisre
alkalmas
baktériumtörzset
RN4254
néven
eltettük
a
törzsgyűjteménybe.
NR_DIP04.doc
31
32 Az előbbi kísérletekkel párhuzamosan λTnphoA transzpozont tartalmazó λ fágot szaporítottunk fel LE392 törzsön, míg a fágtiter a 109-1010 fág/ml nagyságrendet el nem érte. A megfelelő titerű fággal és a kozmidot tartalmazó Tc rezisztens törzzsel megkezdtük a mutagenezist. 4. 5. 2. A λTnphoA mutagenezis
A pha2 régió analízise érdekében a pRN4209 kozmidklónt hordozó E.coli törzs kultúráját Km rezisztenciát hordozó TnphoA transzpozonnal mutagenizáltunk. A folyamat során az előzőekben konstruált E.coli RN4254 törzs kultúráját a TnphoA transzpozont tartalmazó λ-fággal fertőztük. Mivel ez a fág ebben a baktériumtörzsben nem képes fennmaradni, csak azok a telepek nőnek fel a Tc/Km tartalmú táptalajon, amelyekben a Km rezisztenciagént hordozó TnphoA áthelyeződött a genomba. A mutagenezis során minden Km rezisztens telepben egyedi transzpozíciós esemény történik. A transzpozon az E.coli kromoszómális DNS-ébe és a pha- géneket hordozó plazmidra is áthelyeződhet. A felnövekvő Km rezisztens sejtek nagy része a kromoszómán hordozza a transzpozont. Az eddigi tapasztalatok szerint a mutagenezis eredményeképpen nyert telepek körülbelül 1%-ában található a kozmidon a TnphoA. A mutagenezis eredményeként Km rezisztens ”mutáns populációkat” nyertünk, amelyekben az egyes baktériumok különböző helyeken hordozák a transzpozont. A felnőtt populációkat (kb 15000 telepenként) összemostuk és konjugáció segítségével a mutagenizált kozmid populációt bejuttattuk az S. meliloti (AK631) baktériumtörzsbe. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a kozmidklónok milyen arányban hordozzák az inszerciót, és az érinti-e a pha2 régiót. A kozmidot hordozó baktériumokat a GTSTc táptalajon, míg a pRN4209::TnphoA kozmidszármazékokat tartalmazó baktériumokat GTSTcKm táptalajon tudtuk megszámolni. A Tc ill. TcKm rezisztens törzsek számát és egymáshoz való arányukat a 7. táblázat mutatja. A kapott TcKm rezisztens törzsek mindegyikében a pRN4209 plazmid hordozza Km rezisztenciát okozó TnphoA transzpozont.
NR_DIP04.doc
32
33 7. táblázat: Tc illetve Tc/Km rezisztens törzsek száma. Tc rezisztens
TcKm rezisztens
TcKm:Tc
1. populáció (kb. 18000 telep)
~800 telep
~50 telep
1/16
2. populáció (kb. 15000 telep
~600 telep
~100 telep
1/6
3. populáció (kb. 15000 telep)
~800-1000 telep
~100 telep
1/10
A táblázatból látható, hogy nagy számú független transzpozíciós esemény során megközelítőleg minden 20. kozmid hordozzaa beépült tanszpozont, feltehetően különböző helyeken. A továbbiakban fizikai térképezéssel ki kell válogatni azokat, amelyeknél a transzpozon beépülése a pha2géncsoportot érintette. Ezek alkalmasak lesznek a megfelelő gének mutánsainak létrehozására.
NR_DIP04.doc
33
34
5. Összefoglalás Korábbi vizsgálatok kimutattak egy pha géncsoportot, mely a K+-transzportban vesz részt és feltételezhető egy K+/H+-antiportert kódol. Genomszekvenálás során a S. meliloti és az A. tumefacies baktériumok esetében kiderült, hogy a két rokon faj genomjában ezeknek a géncsoportoknak egy homológja is megtalálható, amelyről feltételezhető, hogy más funkcióval rendelkezik. Elképzelésünk szerint a második géncsoport a Na+-transzportban játszik szerepet, és így talán egy Na+/H+-antiportert kódol. Munkánk során célul tűztük ki, hogy ezt a második, pha2 nevű génszakaszt génbankból izoláljuk, és benne mutációkat hozzunk létre. A mutációk S.meliloti baktériumba juttatásával, azaz a pha2 mutáns baktérium létrehozásával lehetőség nyílik majd a gének szerepének tisztázására. Első lépésben régióspecifikus primerek és PCR-reakciók segítségével sikerült izolálnunk az S. meliloti 41 pLAFR1 vektorban készített géntárból az RN4209 számú klónt. Restrikciós endonukleázokkal történt emésztések segítségével megállapítottuk, hogy a kozmidklón fizikai térképe nagy hasonlóságot mutat a S.meliloti 1021 törzsben a genomszekvenálás során megismert pha2 régió restrikciós mintázatával. A pha2A és pha2G primerek és PCR reakciók segítségével bebizonyítottuk, hogy az pRN4209 számú klón valószínűleg tartalmazza az egész pha2 régiót. A régiót tartalmazó pNR4209 rezisztens kozmidot konjugációval a λTnphoA mutagenezisre alkalmas E.coli baktériumtörzsbe juttattuk A konjugáció eredményeként kapott RN4254 törzset kanamicin rezisztenciát hordozó λTnphoA fággal transzpozonos mutagenezisnek vetettük alá. A felnőtt mutáns populáció kozmidjait S.meliloti törzsbe juttattuk vissza egy újabb keresztezés során. Több olyan populációt is izoláltunk, amelyekben TnphoA transzpozont hordozó kozmidok is találhatóak. Eredményeink szerint a konjugációval vizsgált mutáns populációkban legalább a kozmidok 1/20 része KmR inszerciót tartalmaz. A további kísérletekben fizikai térképezés után ki kell válogatni a pha2 génekben létrejött transzpozon beépüléseket, melyek segítségével mutáció juttatható be a pha2 genomba. A későbbiekben ezen mutációk hatását szeretnénk majd vizsgálni.
NR_DIP04.doc
34
35
6. Irodalom Allen, O.N., and Allen, E.K. (1981) The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation Madison: The University of Wisconsin Press. Becquart-de Kozak, I., Reuhs, B.L., Buffard, D., Breda, C., Kim, J.S., Esnault, R., and Kondorosi, A. (1997) Role of the K-antigen subgrup of capsular polysaccharides in the early recognition process between Rhizobium meliloti and alfalfa leaves. Mol. PlantMicrobe Interact. 10: 114-123. Beringer, J.E., Beynon, J., Buchanan-Wollaston, A.V., and Johnston, A.W.B. (1978) Transfer of the drug resistance transposon Tn5 to Rhizobium. Nature 276: 633- 634. Bladergroen, M.R., and Spaink, H.P. (1998) Genes and signal molecules involved in the rhizobia-Leguminosae symbiosis. Current Opinion Plant Bio 1: 353-359. Burns, R.C., and Hardy, R.W.F. (1975) Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. New York: Springer Verlag. Catoira, R., Timmers, A.C.J., Maillet, F., Galera, C., Peumetsa, R.V., Cook, D., and Denarie, J. (2001) The HCL gene of Medicago truncatula controls Rhizobium-induced root hair curling. Development 128: 1507-1518. Cheng, H.P., and Walker, G.C. (1998) Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. J Bacteriol 180: 5183-5191. Currier, W.M., and Strobel, G.A. (1974) Chemotaxis of a Rhizobium spp to a glucoprotein produced by birdsfoot trefoil roots. Science 196: 434-436. deBruijn, F.J., and Lupski, J.R. (1984) The use of transposon Tn5 mutagenesis in the rapid generation of correlated physical and genetic maps of DNA segments cloned into multicopy plasmids - a review. Gene 27: 131-149. Diaz, C.L., Melchers, L.S., Hooykaas, P.J.J., Lugtenberg, B.J.J., and Kijne, J.W. (1989) Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis. Nature 338: 579-581. Ditta, G., Schmidhauser, T., Jacobson, E., Lu, P., Liang, X.-W., Finlay, D.R., Guiney, D., and Helinski, D.R. (1985) Plasmids related to the broad host range vector pRK290 useful for Gene cloning and for monitoring gene expression. Plasmid 13: 149-153 Dudley, M.E., Jacobs, T.W., and Long, S.R. (1987) Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta 171: 289-301. Dylan, T., Ielpi, L., Stanfield, S., Kashyap, L., Douglas, C., Yanofsky, M., Nester, E., Helinski, D.R., and Ditta, G. (1986) Rhizobium meliloti genes required for nodule development are related to chromosomal virulence genes in Agrobacterium tumefaciens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4403-4407. Dylan, T., Helinski, D.R., and Ditta, G.S. (1990a) Hypoosmotic adaptation in Rhizobium meliloti requires B-(1-2)-glucan. J. Bacteriol. 172: 1400-1408. Dylan, T., Nagpal, P., Helinski, D.R., and Ditta, G.S. (1990b) Symbiotic pseudorevertants of Rhizobium meliloti ndv mutants. J. Bacteriol. 172: 1409-1417. Fraysse, N., Couderc, F., and Poinsot, V. (2003) Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis. Eur. J. Biochem. 270: 1365-1380. Friedrich, T., Steinmüller, K., and Weiss, H. (1995) The proton-pumping respiratory complex I of bacteria and mitochondria and its homologue in chloroplasts. FEBS Letters 367: 107-111. Friedrich, T., and Weiss, H. (1997) Modular evolution of the respiratory NADH:ubiquinone oxidoreductase and the origin of its modules. J. Theoret. Biol. 187: 529-541. NR_DIP04.doc
35
36 Gage, D.J., and Margolin, W. (2000) Hanging by thread: invasion of legume plants by rhizobia. Current Opinion Microbio 3: 613-617. Gonzáles, J.E., Semino, C.E., Wang, L.X., Castellano-Torres, L.E., and Walker, G.C. (1998) Biosynthetic control of molecular weigth in the polymerization of the octasaccharide subunits of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. PNAS 95: 13377-13482. Hamamoto, T., Hashimoto, M., Hino, M., Kitada, M., Seto, Y., Kudo, T., and Horikoshi, K. (1994) Characterization of a gene responsible for the Na+/H+ antiporter system of alkalophilic Bacillus species strain C-125. Mol. Microbiol. 14: 939-946. Hirsch, A.M. (1999) Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation. Curr Opin Plant Biol 2: 320-326. Ish-Horovicz, D., and Burke, J.F. (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 2989-2998. Kannenberg, E.L., and Brewin, N.J. (1994) Host-plant invasion by Rhizobium : the role of cell-surface components. Trends Microbiol 2: 277-283. Kijne, J.W., Bauchrowitz, M.A., and Diaz, C.L. (1997) Root lectins and rhizobia. Plant Physiol 115: 869-873. Koonin, E.V., Makarova, K.S., and Aravind, L. (2001) Horizontal gene transfer in prokaryotes. Annu. Rev. Microbiol. 55: 709-742. Krulwich, T.A., Cheng, J., and Guffanti, A.A. (1994) The role of monovalent cation/proton antiporters in Na+- resistance and pH homeostasis in Bacillus: An alkaliphile versus a neutralophile. J Exp Biol 196: 457-470. Lagares, A., Caetano-Anolles, G., Niehaus, K., Lorenzen, J., Ljunggren, H.D., Puhler, A., and Favelukes, G. (1992) A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation in alfalfa. J Bacteriol 174: 5941-5952. Legocki, R.P., and Verma, D.P.S. (1980 ) Identification of nodule-specific host proteins (nodulins) involved in the development of Rhizobium -legume symbiosis. Cell 20: 153-163 Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mellor, R., and Werner, D. (1987 ) Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules. Symbiosis 3: 75-100 Mills, K.K., and Bauer, W.D. (1985) Rhizobium attachment to clover roots. J Cell Sci Suppl. 2: 333-345. Müller, P., Hynes, M., Kapp, D., Niehaus, K., and Puhler, A. (1988) Two classes of Rhizobium meliloti inf ection mutants differ in exopolysaccharide production and in coinoculation properties with nodulation mutants. MGG 211: 17-26. Newcomb, W. (1981 ) Nodule morphogenesis and differentiation. In Biology of the Rhizobiaceae. Vol. 13. Giles, K.L. and Atherly, A.G. (eds). New York: Academic Press, pp. 247-298. Orosz, L., Svab, Z., Kondorosi, A., and Sik, T. (1973) Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. MGG 125: 341- 350. Petrovics, G., Putnoky, P., Reuhs, B., Kim, J., Thorp, T.A., Noel, K.D., Carlson, R.W., and Kondorosi, A. (1993) The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol. Microbiol. 8: 1083-1094. Putnoky, P., Grosskopf, E., Ha, D.T.C., Kiss, G.B., and Kondorosi, A. (1988) Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development. J. Cell Biol. 106: 597-607. Putnoky, P., Petrovics, G., Kereszt, A., Grosskopf, E., Ha, D.T.C., Banfalvi, Z., and Kondorosi, A. (1990) Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide
NR_DIP04.doc
36
37 can have the same function in the plant-bacterium interaction. J. Bacteriol. 172: 54505458. Putnoky, P., Kereszt, A., Nakamura, T., Endre, G., Grosskopf, E., Kiss, P., and Kondorosi, A. (1998) The pha gene cluster of Rhizobium meliloti involved in pH adaptation and symbiosis encodes a novel type of K+-efflux system. Mol. Microbiol. 28: 1091-1101. Redmond, J.W., Batley, M., Djordjevic, M.A., Innes, R.W., Kuempell, P.L., and Rolfe, B.G. (1986) Flavons induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature 323: 632-635. Reuber, T.L., and Walker, G.C. (1993 ) Biosynthesis of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. Cell 74: 269-280 Reuhs, B.L., Carlson, R.W., and Kim, J.S. (1993) Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175: 3570-3580. Reuhs, B.L., Geller, D.P., Kim, J.S., Fox, J.E., and Pueppke, S.G. (1998) Sinorhizobium fredii, and Sinorhizobium meliloti produce structurally conserved lipopolysaccharides and strain-specific K antigens. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4930-4938. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schauser, L., Roussis, A., Stiller, J., and Stougaard, J. (1999) A plant regulator controlling development of symbiotic nodules. Nature 402: 191-195. Schultze, M., Kondorosi, E., Ratet, P., Buire, M., and Kondorosi, A. (1994) Cell and molecular biology of Rhizobium-plant interactions. Int. Rev. of Cytol. 156: 1-75. Seto, Y., Hashimoto, M., Usami, R., Hamamoto, T., Kudo, T., and Horikoshi, K. (1995) Characterization of a mutation responsible for an alkali-sensitive mutant, 18224, of alkaliphilic Bacillus sp strain C-125. Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1364-1366. Spaink, H.P. (2000) Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 54: 257-288.
NR_DIP04.doc
37
38
7. Köszönetnyilvánítás Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Hálával tartozom a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelő hátteret biztosítottak terveim megvalósításához. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkámhoz nyújtott önzetlen segítségéért, tanácsaiért, irányításáért. Köszönöm Miklósvári Zoltánnénak, Maricának, a kísérletek előkészítésében nyújtot segítségét. Köszönöm Helesfay György segítségét, akivel a közös témánk kezdeti kísérleteit együtt végeztem.
NR_DIP04.doc
38
