Agrobacterium rezisztens növények létrehozása géncsendesítéssel
DIPLOMAMUNKA
Készítette: CSEH ATTILA Biológus MSc szakos hallgató
Témavezetők: GALAMBOS ANIKÓ, DR. PUTNOKY PÉTER
PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
Pécs, 2012.
TARTALOMJEGYZÉK 1. Irodalmi áttekintés ............................................................................................. 5 1.1. Az agrobaktérium, mint növényi kórokozó ........................................................ 5 1.2. A tumorképződés folyamata ............................................................................... 5 1.2.1. Agrobacterium-közvetített transzformáció .................................................. 7 1.3. Agrobaktérium fertőzés elleni védekezés ........................................................... 9 1.4. A géncsendesítés ............................................................................................... 10 1.5. A munka előzményei......................................................................................... 15 1.5.1. A növényi transzformációra alkalmas pJP17 vektor.................................. 15 1.5.2. iaaM csendesítésre módosított miRNS gének létrehozása......................... 15 1.5.2.1. A módosított miRNS gének klónozása ................................................ 17
2. Célkitűzések........................................................................................................ 18 3. Alkalmazott anyagok és módszerek ........................................................... 19 3.1. Baktériumok, plazmidok ................................................................................... 19 3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése .............................................................. 20 3.3. Plazmid DNS izolálás ....................................................................................... 20 3.4. Emésztés restrikciós endonukleázokkal és agaróz gélelektroforézis ................ 21 3.5. T4 polimeráz kezelés, DNS ligálás, transzformálás.......................................... 21 3.6. Polimeráz láncreakció ....................................................................................... 22 3.7. Fragment izolálás .............................................................................................. 23 3.8. DNS-szekvencia meghatározás ......................................................................... 23 3.9. A baktériumok keresztezése .............................................................................. 23 3.10. Dohány transzformáció ................................................................................... 24 3.11. Növényi fertőzési teszt .................................................................................... 25
4. Eredmények és megvitatásuk ....................................................................... 26 4.1. Transzgenikus dohánynövények létrehozása .................................................... 26 4.1.1. Kettő transzgenikus dohányvonal fertőzési eredménye .............................. 27 4.2. A pCambia2300 vektor átalakítása ................................................................... 29 4.2.1. Az átalakított miR159 mikro RNS gének beépítése a pCambia2300 vektorba ....................................................................................................... 32 4.2.2. Növényi kísérletek ...................................................................................... 34
2
5. Összefoglalás ...................................................................................................... 35 6. Irodalomjegyzék ............................................................................................... 36 7. Köszönetnyilvánítás ......................................................................................... 42
3
Rövidítések jegyzéke:
Amp
Ampicillin
Rif
Rifampicin
Km
Kanamycin
Cm
Chloramphenicol
Spc
Spectinomycin
Tc
Tetracyclin
bp
bázispár
kb
kilobázis
DNS
dezoxi-ribonukleinsav
RNS
ribonukleinsav
miRNS
mikro RNS
siRNS
small interfering RNS
DMSO
dimetil-szulfoxid
EDTA
etilén-diamin-tetraacetát
SDS
nátrium-dodecil-szulfát
Tris
tris-(hidroxi-metil)-amino-metán
IPTG
izopropil-β-D-galaktopiranozid
X-gal
5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-tiogalaktopiranozid
PCR
polimeráz láncreakció
TDZ
thidiazuron
NAA
naftil-ecetsav
H+
hormontartalmú
MS
Murashige és Skoog
Cla (cf)
claforán
4
1. Irodalmi áttekintés 1.1. Az agrobaktérium, mint növényi kórokozó
Számos gazdasági növényt tudnánk felsorakoztatni, melyek sok, különféle növényi betegségre fogékonyak, többek között Agrobacterium infekcióra is. A magasabb rendű növényeken kifejlődő Agrobacterium által okozott daganatos elváltozás (golyvásodás) a XIX. század óta ismert növényi betegség, mely komoly károkat okoz a dísznövény-, szőlő- és növénytermesztésben. Gazdanövényköre tehát rendkívül széles, a nyitvatermők és a kétszikűek mintegy 60%-án képes tumort indukálni (DE
CLEENE AND DE LEY,
1976), az egyszikűeknek
viszont csak mintegy 3%-a fogékony (DE CLEENE, 1985). Ezek az adatok azonban nem tekinthetők teljes körűnek, mivel e korábban közölt gazdanövénykör vizsgálatok óta további fajokat is sikerült fertőzni (SMITH AND HOOD, 1995). A tumorképződés élettani és genetikai alapjainak vizsgálatát már a 1930-as - 40-es években elkezdték, mivel hasonlóságot véltek felfedezni az emberi rák és a baktérium által indukált növényi sejtburjánzás között. Tisztázódott, hogy a növényi tumorképzés során a növény genetikailag transzformálódik. Az 1970-es évek közepétől újra nagy lendületet vettek az agrobaktériummal kapcsolatos kutatások, és a 80-as évektől elkezdődött az Agrobacterium felhasználása a növényi génmanipuláció területén. Az Agrobacterium törzsekkel szemben rezisztens növényfajták előállítása nagy gazdasági jelentőséggel bírna, hiszen a betegséggel szembeni védekezés terén a fertőzés szisztematikus jellege miatt a hagyományos kémiai védekezési eljárásokkal sajnos a mai napig nem értünk el látványos eredményeket. A gyakorlatban az Agrobacterium rezisztencia kialakításának egyik módja lehet olyan transzgenikus növények létrehozása, melyekben a patogén baktérium által bejuttatott gének megnyilvánulása gátolt.
1.2. A tumorképződés folyamata
Az agrobaktériumok Gram-negatív talajbaktériumok, melyek a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik, és tumorokat okoznak rajtuk. A kórfolyamat során a baktérium egy rendkívül kifinomult makromolekuláris transzport rendszer segítségével
5
genetikailag transzformálja a gazdanövényt. Ennek következtében a növényi sejtek hormonális egyensúlya felborul, ami a tumoros növekedés közvetlen kiváltó oka. A baktériumok patogenitása összefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével, amely egy körülbelül 200 kilobázis (kb) nagyságú plazmid (ZAENEN J ET AL., 1974) A Ti plazmid egy része a transzfer DNS (T-DNS) a folyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába integrálódik (1. ábra) (BINNS AN. 2002, GELVIN S. 2000, TINLAND B ET AL. 1995, TZFIRA T ET AL. 2004).
1. ábra: Az agrobaktérium által okozott tumorképződés folyamata (I.) A talajban élő agrobaktériumok a növényeket a sebzési helyeken fertőzik; (II.) A baktériumban található Ti plazmid T-DNS része tartalmazza a tumoros növekedésért és az opin szintézisért felelős géneket; (III.) A T-DNS beépül a növényi sejtmag DNSállományába; (IV.) A baktérium által kialakított tumor, vagy „gyökérgolyva”. A T-DNS egy jobb és egy baloldali határoló szekvenciával rendelkezik (RB, right border; LB, left border), amelyek 25 bázispár nagyságúak (2. ábra). A határoló szekvenciák közötti régióban helyezkednek el a tumoros növekedésért és az opin (tápanyagforrás a baktérium számára) szintézisért felelős gének. A tumorszövet kialakításában szerepet játszó gének növényi növekedési hormonok bioszintéziséért felelős fehérjéket kódolnak. Ezen hormonok túltermelése felborítja a normális növényi sejtosztódási folyamatokat, és tumoros növekedést indít el. Az egyik ilyen hormon az auxin, melynek bioszintéziséért két gén, az iaaM és az iaaH által kódolt enzim, a triptofán-monooxigenáz és az indol-3-acetamid hidroláz a felelős (GAUDIN V
ET AL.
1994). A másik fontos hormon pedig a citokinin, amelynek képződésében az ipt gén által kódolt AMP-izopentenil transzferáz enzim vesz részt. Az iaaM és ipt gének inaktivációjával elvben megszüntethető a tumorképződés. 6
2. ábra: A Ti plazmid felépítése, fontosabb régiói A Ti plazmidon található virulencia gének irányítják a T-DNS átvitelt, a T-DNS régió a növényi tumorképződés szempontjából fontos géneket kódol (auxin, citokinin bioszintézis) 1.2.1 Agrobacterium-közvetített transzformáció A Ti plazmidon (2. ábra) végzett analízisek bizonyították, hogy a két határoló szekvencia között található gének önmagukban nem befolyásolják a fertőzőképességet, az átvitelt és az integrációt. A T-DNS növényi sejtmagba való transzportálásában a baktérium sejtben lokalizálódó kromoszomális (chv), valamint a Ti plazmidon található virulencia gének (vir gének) vesznek részt. Ha a vir gének nem működnek, akkor nem játszódik le a tumorképzés folyamata. A vir (virA-virH) gének különböző Vir fehérjéket kódolnak, amelyek egymás után aktiválódva elősegítik a T-DNS növényi sejtmagba való átjutását (3. ábra). Ez a folyamat szabályozott és függ attól, hogy a baktérium milyen érzékenyen reagál a növény megsebzésre adott válaszára. A növényt ért sebesülés hatására növényi védekező reakció indul be, enzimek képződnek antimikrobiális vegyületek előállítására, az elhalt sejtrétegek szintén védelmi vonalat
képeznek,
más
sejtek
differenciálódnak
és
elkezdenek
osztódni, a
sejtfalképződés beindul, helyi savasodás lép fel. A sejtosztódás és a sejtfalat alkotó poliszacharidok és a lignin szintézise közben jellegzetes vegyületek szabadulnak fel (fenolos komponensek, cukor és származékai, szerves savak [szukcinát, phidroxybenzoát], bizonyos aminosavak [valine, arginin]), melyek az Agrobacterium számára szignált jelentenek. Ezen Agrobacterium számára vonzó, kemoattraktáns 7
vegyületek (pl. acetosziringon) indukálják a chv gének transzkripcióját (BOLTON GW ET AL.
1986, MELCHERS LS ET AL. 1989). A kromoszomális virulencia gének (chvA, chvB,
chvE) a baktériumok növényi sejtfalhoz való kötődésében fontosak, illetve a megfelelő ozmotikus viszonyok kialakításában játszanak szerepet. A chvE gén például cukor-kötő fehérjét kódol, mely a sejtmembránon található kemotaxis receptorokkal kölcsön hat, a sérült sejt felismerésben játszik szerepet. A ChvE-cukor komplex képződése és kölcsönhatása megváltoztatja a VirA konformációját, melynek hatására az érzékenyebb lesz a fenolos molekulákra. Egyszikűekben is termelődnek ilyen vegyületek, de nincs sejtosztódás a sebnél, ezért okozhat nehézséget transzformálásuk.
3. ábra: Agrobacterium-mediált transzformáció folyamata (1) sebzés; (2) vir gének indukciója; (3) egyszálú T-DNS képződése; (4) T-DNS transzfer; (5) T-DNS sejtmagba importálódása és integrálódása a gazda kromoszómáiba; (6) növényi növekedési hormonok (auxin, citokinin) és opin bioszintézise; (7) tumor képződése Végső soron az Agrobacterium genetikailag „gyarmatosítja” a növényi sejteket, amikor genomjukba saját információját bejuttatva, a növényi sejteket a baktérium számára hasznos molekulák termelésére kényszeríti. Termelődésük hatására a sejtek korlátlanul kezdenek osztódni és megindul a rákos burjánzás, míg végül a növény felületén megjelenik a golyvaszerű képlet, a korona gubacs.
8
Mivel a Ti plazmid T-DNS régiójának, a két határoló régió közötti szekvenciája nem meghatározó a T-DNS növényi genomba történő beépülésének szempontjából, ezért gyakorlatilag alkalmas arra, hogy klónozó vektorként használva idegen géneket építsünk bele, és juttassunk be általa magasabb rendű növényekbe (GHEYSEN G. 1987, REAM W. 1989). Miután a T-DNS a növényi genomba integrálódott, tulajdonképpen a továbbiakban növényi szekvenciaként működik. Ezek a felfedezések tették lehetővé, elérhetővé, különféle transzformációs vektorrendszerek kidolgozását.
1.3. Agrobaktérium fertőzés elleni védekezés
A védekezést illetően jelenleg egyértelműen a megelőzésre, a prevencióra kell alapoznunk. A patogén baktérium a növényt az esetek egy jelentős részében látensen fertőzi, ezért az egészségesnek látszó szaporítóanyag sokszor fertőzött és a betegség kiinduló forrása lehet. A fertőzött szaporítóanyag tehát kulcsszerepet játszik a betegség terjedésében, ezért alapvető fontosságú az Agrobacterium-mentes, egészséges szaporítóanyag használata. Ennek hátránya egyrészt, hogy munkaigényessége miatt csak korlátozott számú tétel tesztelése lehetséges, illetve hazánkban a megfelelő laboratóriumok nem állnak rendelkezésünkre. A betegség ellen elsősorban a beteg részek levágásával és megsemmisítésével lehet védekezni, mivel a kórokozó a beteg vesszőkben telel át. Tavasszal,
a
nedvkeringés
(„könnyezés”)
megindulásakor
a
tápanyagdús
szövetnedvben a baktériumok felszaporodnak, és a xylem-transzporton keresztül elárasztják a növény föld feletti részeit, ahol belső sérülések esetén megjelennek a tumorok (LEHOCZKY, 1978). Tehát a gyors felmelegedés segíti a tumorok kifejlődését, így a korai metszés is egy védekezési módszer lehet. Fontos szempont lehet még a talaj fertőtlenítése (üvegházakban a talaj gőzölése), vagy vetésforgó használata. A betegség megelőzésére eredményesen alkalmazhatók a baktericidhatású réztartalmú, rézoxid hatóanyagú készítmények (frissen metszett gyökeret telepítés előtt 1 %-os réz, vagy kasugamicines agyagba mártják) (HOLB I, 2005). Azonban hatékony kémiai védekezési mechanizmus egyelőre nem áll rendelkezésünkre az agrobaktérium fertőzéssel szemben. Számos
helyen
végeztek
különféle
kutatásokat
a
szőlő
golyvásodásának
megelőzésére alkalmas antagonista baktériumok izolálására (STAPHORST JL ET AL. 1985, WEBSTER J
ET AL.
1986, PU XA
ET AL.
1933, BURR TJ
ET AL.
1994, BELL CR
ET AL.
9
1995, KHMEL IA
EZ AL.
1998). Találtak olyan agrobaktérium törzset, mely széleskörű
antagonista hatást mutatott a különböző patogén Agrobacterium vitis törzsekkel szemben in vitro, és szőlőn is gátolta a tumorképződést. Tumorfejlődést gátló, azonban antagonista hatást nem mutató A. vitis törzseket is izoláltak. Ezek a biológiai védekezés szempontjából mindenféleképpen ígéretesnek tűnnek (BURR TJ ET AL. 1999). A hagyományos, keresztezéses növénynemesítés mellett ─ ami nagyon idő- és költségigényes feladat ─ a molekuláris genetikai módszerek alkalmazása további lehetőséget jelenthet a golyvásodás elleni védekezésben. A patogén nagyfokú genetikai sokfélesége miatt azonban ezek a vizsgálatok nagy körültekintést igényelnek. Figyelembe véve a bakteriális kórokozók által okozott jelentős veszteségeket, világszerte intenzíven kutatják azokat a géntechnológiai lehetőségeket, amelyek ellenállóságot biztosítanak a gazdasági növényeink számára. Tumor képződéssel szembeni rezisztencia kialakítása lehetséges, egyrészt a vir gének manipulációján keresztül a T-DNS átvitelének és integrációjának megakadályozásával, vagy a fertőzési folyamatban részt vevő növényi gének inaktiválásával, másrészt a TDNS
által
kódolt
növényi
hormon-prekurzor
molekulák
(indol-acetamid)
inaktiválásával, harmadrészt pedig a T-DNS onkogénjeinek a gátlásával. Ezen utóbbi lehetőségnél az Agrobacterium rezisztencia kialakításában a géncsendesítés módszere speciálisan alkalmazható.
1.4. A géncsendesítés
A DNS jelentőségének megismerését követően évtizedekig a fehérjét kódoló szakaszok mind részletesebb feltárása állt a kutatások középpontjában, miközben a genom jelentős részét, több mint 98%-át kitevő, nem kódoló DNS szekvenciák vizsgálatára kisebb hangsúly helyeződött. A géncsendesítés jelenségére akkor derült fény, amikor a kutatók egyes transzgenikus növények esetében azt észlelték, hogy a növénybe átvitt transzgén feltűnően gyengén fejeződik ki (KIRÁLY L. 1999). A géncsendesítés (gene silencing-GS, RNS interferencia) egy nemrégiben megismert mechanizmus, amely eukarióta szervezetekben gének expresszióját képes módosítani (gátolni). A jelenséget ugyan a növényekben fedezték fel (NAPOLI ÉS MTSAI. 1990, VAN
DER
KROL
ÉS MTSAI.
1988), de állatokban és gombákban is megfigyelhető
(FIRE, 1998, HAMMOND ÉS MTSAI. 2001).
10
A megfigyelések alapján a géncsendesítés két alaptípusa különböztethető meg. Létezik a transzkripciós géncsendesítés (transcriptional gene silencing, TGS), amelynél a géninaktiválás a transzkripció szintjén történik, azaz a célgénből nem keletkezik mRNS. Másik alaptípusa a poszttranszkripciós géncsendesítés (posttranscriptional gene silencing, PTGS), gén inaktiválás a transzkripció (mRNS képződés) után, azaz a célgéneredetű mRNS-ek a citoplazmában fokozott mértékben lebomlanak. Jelen pillanatban úgy vélik, a mechanizmus alapvetően több célt is szolgálhat. Egyfelől véd a kétszálú RNS-t tartalmazó vírusoktól, másfelől az RNS interferenciának köze van a saját gének ki- és bekapcsolásához, valamint szerepe lehet az ugráló genetikai elemek kontrollálásában is (KIRÁLY L. 1999). Ha víruskórokozó genetikai anyagának egy részét (például a köpenyfehérje gént vagy a vírus replikáz gént) transzformációval bejuttatták a növénybe, a transzgenikus növény rezisztens lett a vírusfertőzéssel szemben (RNS-közvetített vírus rezisztencia). Ez a rezisztencia csak olyan rokon vírustörzsek ellen hatásos, amelyek szekvencia homológiát mutatnak azzal a vírussal, amelyből az átvitt transzgén származott. A géncsendesítés és a vírus RNS-től függő rezisztencia tehát egy jelenség két változata: mindkét esetben az mRNS bontásról van szó (KIRÁLY Z. 2002). Ha a növény felismeri, hogy az idegen transzgén mRNS vagy az idegen vírus RNS mennyisége egy küszöbértéken felül már túlságosan nagy, beindul az RNS degradálás. Meglepő, hogy a csendesítés mechanizmusa nemcsak a mesterségesen átvitt transzgénre hat, hanem a növény eredeti, endogén homológ génjére is. Ez a tény a molekuláris növénynemesítés szempontjából olykor jelentős hátránnyal járhat. Az RNS silencing indukciója során a duplaszálú RNS-eket (dsRNS) a DICER enzimkomplex RNáz aktivitása révén úgynevezett siRNS-ekre (small interfering RNS) hasítja. A siRNS-ek olyan 21-24 nukleotid hosszúságú jellegzetes szerkezettel bíró duplaszálú RNS molekulák, amelyek 3’ végén 2 bázis túlnyúlik és az 5’ végükön foszfát csoportot tartalmaznak. A siRNS-ek az RNS silencing végrehajtó komplexébe, a RISC (RNA-induced silencing complex) endonukleáz komplexbe épülnek be, ahol egyszálúvá alakulnak. A RISC felismeri és elhasítja a beépült siRNS-sel komplementer szekvenciát tartalmazó mRNS-eket (4. ábra).
11
4. ábra: siRNS alapú géncsendesítési folyamat (PETER M. WATERHOUSE ET AL., 2003)
A siRNS-eken kívül azonban találhatók olyan genomban kódolt szabályozó egyszálú RNS molekulák, melyek komplementer részei képeznek kettős szálú részleteket, ezeket mikro RNS (miRNS) névvel különböztetjük meg. Ezek az eukariótákból leírt nem kódoló kis RNS-ek, melyek a genomban kódolt MIR génekről keletkeznek. A miRNS-eknek
rendkívül
fontos
szerepük
van
a különböző
fejlődésszabályozási folyamatokban, a fehérje-kódoló gének kb. 30%-át szabályozzák. Az első miRNS-eket Nematoda-ban írták le, melyeket a lin-4 (LEE let-7 gének kódolják (REINHART
ET AL.,
ET AL.,
1993) és a
2000). Ezek a különböző lárvastádiumok
közötti átmenetet szabályozzák. Napjainkban a növényekben, állatokban, ill. vírusokban leírt miRNS-ek száma 4000-re tehető, melyek miRNS adatbázisban hozzáférhetőek (GRIFFITHS-JONES
ET
AL.,
2006). Az azonosított miRNS-ek döntő többsége
transzkripciós faktorokat szabályoz. Az eddigi adatok azt mutatják, hogy a növényi miRNS-ek többsége konzervatív, vagyis ugyanaz a miRNS megtalálható különböző növénycsaládokban és a rokon miRNS-ek közt csak kismértékű eltérés mutatható ki. Előfordulnak köztük azonban fajspecifikusak is (SUNKAR ET AL., 2005). A miRNS gének általában saját promoterrel rendelkeznek és transzkripciójukat a fehérje kódoló génekhez hasonlóan az RNS polimeráz II végzi (LEE
ET AL.,
2004).
12
A MIR gének transzkriptumai (pri-miRNS) körülbelül 1 kb hosszúságúak, poliadeniláltak, 5’ végi sapkát tartalmaznak és hajtűszerű másodlagos szerkezetet vesznek fel. A növényi pre-miRNS-ek az állati prekurzorokkal szemben egyesével keletkeznek és általában jóval hosszabbak (60-300 nt), mint az állati pre-miRNS-ek (BARTEL
AND
BARTEL, 2003; BARTEL, 2004). Arabidopsis thalianaban négy DCL (DICER-LIKE) enzimet kódoló gén található, melyek közül a miRNS képződésben alapvetően a DCL1 vesz részt (XIE
ET AL.,
2004). A DCL1 egyedül is képes a pri-miRNS-ek és a pre-
miRNS-ek hasítására, de pontos működéséhez mindkét esetben szükség van HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) és SERRATE (SE) fehérjékre is (DONG
ET AL.,
2008; LAUBINGER ET AL., 2008; YANG ET AL., 2006B). A kihasadt miRNS-t a HUA ENHANCER1 (HEN1) metilálja. A metiláció védi a miRNS-eket a kis RNS-eket lebontó nukleázoktól (SDN1). A növények miRNS-einek citoplazmába történő transzportjában feltételezhetően a HASTY (HST) játszik szerepet, bár HST hiányában sem figyelhető meg miRNS felhalmozódás a sejtmagban (PARK ET AL., 2005). A citoplazmába jutott miRNS/miRNS duplex egyik szála növények és állatok esetében is beépül az RNS csendesítés végrehajtó komplexébe (RNA-induced silencing complex, RISC), míg a másik szál lebomlik. A RISC fő komponense az ARGONAUTE (AGO), mely a cél mRNS-ek hasításáért felelős (BAUMBERGER
AND
BAULCOMBE,
2005). Végeredményében a miRNS-ek két fő módon szabályozhatják célgénjük kifejeződését: az mRNS-ek hasításával vagy transzlációs gátlásával (5. ábra). A végrehajó enzimkomplex szekvencia specificitását mindkét esetben a RISC-be beépült miRNS-ek határozzák meg. Növényekben a miRNS-ek általában teljes vagy majdnem teljes komplementaritást mutatnak a cél mRNS-sel, mely a cél szekvencia hasítását indukálja (TANG ET AL., 2003) Ismeretes, hogy a növényi silencing útvonalak aktivitása hőmérsékletfüggő, alacsony hőmérsékleten alig működnek, míg magas hőmérsékleten igen hatékonyak. Az siRNS irányított csendesítés hatékonysága alacsonyabb hőmérsékleten csökken, ez azonban a miRNS regulálta géncsendesítésre nem vonatkozik. Ha miRNS a silencing templátja, akkor a reakció kimenetele független a hőmérséklettől. Ennek komoly mezőgazdasági vonatkozása lehet, hiszen a miRNS regulálta géncsendesítés még akkor
13
is biztosítja a kórokozóval szembeni növényi rezisztenciát, amikor már az siRNS alapú csendesítési mechanizmus működése hiányt szenved az alacsony hőmérséklet miatt.
5. ábra: A miRNS képződésének, működésének, géncsendesítéshez való kapcsolódásának folyamata növényekben pri-miRNS transzkriptum képződése; DCL1 hasítás, pre-miRNS-ek keletkezése, miRNS/miRNS duplex kialakulása; metiláció; sejtmagi export; RISC kialakulása; transzlációs gátlás vagy cél mRNS hasítás és lebontás (BARTEL AND BARTEL, 2003)
14
1.5. A munka előzményei
1.5.1. A növényi transzformációra alkalmas pJP17 vektor
Munkánkhoz kiindulásként Lee és társai által végzett kísérletek eredményeit használtuk fel (LEE H ET AL. 2003). Agrobacterium tumefaciens A348 törzsből származó iaaM és ipt szekvenciák segítségével készítettek egy olyan konstrukciót, melyben a két gént egymás után építették, majd ezt két, egymással szemben elhelyezkedő, szensz és antiszensz RNS átírását biztosító promoter közé helyezték és növényi transzformációs vektorba juttatták. A konstrukció, különösen az iaaM gén esetében, hatásosan működött és akadályozta a tumorképződést. Ez a pJP17 vektorkonstrukció (6. ábra), amelynek hatásosságát koinokulációs kísérletek segítségével bizonyították.
6. ábra: A pJP17 vektorkonstrukció T-DNS része RB, LB: jobb és baloldali határoló régiók, nptII: neomicin foszfotranszferáz (KmR) gén, nos3’ és nos5’ nopalin szintáz 3’ és 5’ szekvencia, pCMV és pFMV növényi promoterek
1.5.2. iaaM csendesítésre módosított miRNS gének létrehozása Munkánk másik alapjaként egy olyan kísérlet szolgált, melyben sikeresen alakítottak ki mikro RNS alapú géncsendesítés segítségével vírus rezisztenciát (NIU QW ET AL. 2006).
Niu és munkatársai módosítottak egy, a géncsendesítés folyamatában részt vevő, Arabidopsis mikro RNS gént (miRNA159). Két mesterséges mikro RNS gént hoztak létre, melyek virális mRNS szekvenciák felismerését kódolták. Azok a transzgenikus növények, amelyek az amiR-P69 módosított mikro RNS-t termelték, ellenállóak lettek a TYMV vírussal szemben, az amiR-HC-PRO módosított mikro RNS-t termelő növények pedig a TuMV vírussal szemben mutattak rezisztenciát. A mindkét átalakított mikro
15
RNS-t termelő növények rezisztensek lettek a TYMV és a TuMV vírusfertőzésre egyaránt. Munkánk során az iaaM gén csendesítését terveztük, hasonló módon. A különböző agrobaktérium iaaM szekvenciák nagyon eltérőek, még közel rokon törzsek esetén is nehezen található bennük hosszabb, konzerválódott régió. Mivel a géncsendesítés szekvencia specifikus mRNS felismerésen alapul, így feltételezhetően egyetlen Agrobacterium iaaM szekvenciára tervezett konstrukció a különböző törzsek esetében nem működne, hacsak nem található meg mindegyik agrobaktérium törzs iaaM génjében ugyanaz a cél szekvencia részlet. Ehhez először különböző A. tumefaciens és A. vitis törzsek iaaM szekvenciáit illesztettük és legalább 21 bp hosszan konzerválódott szekvenciákat kerestünk, annak érdekében, hogy erre a szekvenciára specifikus mikro RNS átalakítással több különböző agrobaktérium törzzsel szemben is hatékonyan működő géncsendesítési folyamatot alakíthassunk ki (7. ábra). Ilyen 21 bp hosszú konzerválódott régiót, amely mindegyik általunk illesztett szekvenciában megegyezett volna, nem találtunk, ezért három eltérő helyen lévő 21 bp hosszú szekvencia részletet választottunk ki. Ezek közül két szekvencia az A. tumefaciens és rokon törzsekben konzerválódott, míg a harmadik elsősorban az A. vitis S4 törzsre specifikus szekvencia részlet. A negyedik szekvenciaként az egyik kiválasztott szekvencia részlet reverz komplementerét alkalmaztuk kontrollként. Ezek után többlépcsős PCR reakció segítségével szekvencia specifikusan módosítottuk a miRNA159 génnek a géncsendesítés folyamatában részt vevő szekvenciáját.
iaaM specifikus szekvencia 7. ábra: A géncsendesítés folyamatában részt vevő szekvencia specifikus mRNS felismerést biztosító 21 bp hosszú szekvencia, egy ilyen szekvenciát módosítottunk az adott iaaM célszekvenciára
16
1.5.2.1. A módosított miRNS gének klónozása
A négyféle, átalakított mikro RNS géneket hordozó PCR fragmenteket először pBluescript (pBS) plazmidba klónoztuk, majd EcoRI-HindIII fragmentként izoláltuk. Ezek a „rövid” fragmentek, melyek a gén előtt feltételezett promoter szekvenciát nem tartalmaznak.
Ezek
mellett
izoláltunk
EcoRI-HindIII
fragmentként
„hosszú”
fragmenteket is, melyek egy feltételezett promoter szekvenciát tartalmaztak a gén előtt. Ezt a nyolcféle, 4 „rövid” és 4 „hosszú” miRNS szekvenciát a növényi transzformációra alkalmas pPZP111 vektorba építettük EcoRI-HindIII fragmentként. A módosított miRNS gének létrehozását és a klónozó vektor átalakítását Galambos Anikó végezte el, én ezek után kapcsolódtam be a munkába.
17
2. Célkitűzések
Az előző eredmények alapján és ismeretében célul tűztük ki:
-
a pJP17 vektorkonstrukcióval transzgenikus dohánynövények létrehozását és ezen növények különböző Agrobacterium törzsekkel szembeni rezisztenciájának meghatározását,
-
átalakított mikro RNS gének segítségével feltételezetten szélesebb agrobaktérium rezisztenciát biztosító vektorok kialakítását, transzgenikus dohánynövények készítését és Agrobacterium törzsekkel szembeni ellenálló képességük jellemzését.
18
3. Alkalmazott anyagok és módszerek 3.1. Baktériumok, plazmidok
A munkánk során használt baktériumok és plazmidok jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: A munka során alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok TÖRZS
JELLEMZŐK
REFERENCIA
E. coli törzsek:
recA1,endA1,gyrA96,thi1,hsdR17,supE44,relA1,lacZ ∆M15,TcR
BULLOCK WO ET AL. 1987
JF1754
hsdR. del-lac-gal metB leuB hisB
McNEIL,J . B. and J. D. FRIESEN 1981
PP211
JF1754 (pRK2013) KmR
Putnoky Péter
RifR, SpcR
Szegedi Ernő
RifR
Szegedi Ernő
XL1-Blue
Agrobacterium törzsek: MOG301 A. tumefaciens C58 A. tumefaciens A348
Szegedi Ernő
A. vitis AT1
RifR
Szegedi Ernő
A. vitis Tm4
RifR
Szegedi Ernő
Plazmidok: pBS
pBluescript II SK (+) klónozó vektor AmpR STRATAGENE
pPZP111
CmR
pRK2013
helper plazmid keresztezéshez, KmR
Jakab Gábor
pCambia2300
KmR
DITTA ET AL. 1980 HAJDUKIEWICZ P. ET AL. 1994
pROK2
KmR
Joseph Ecker
pJP17
pJP21::iaaMc58-STOP, ipt-c58, (6. ábra)
LEE H ET AL. 2003
19
3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése Az Agrobacterium törzseket 28oC-on TA (OROSZ L
ET AL.
1973) táptalajon, az E.
coli törzseket pedig 37oC-on LB (SAMBROOK J ET AL. 1989) tápközegben növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 2. táblázatban leírtak szerint tartalmazták. Táptalaj készítésekor a tápoldatokat 1,5% agarózzal egészítettük ki. A baktérium törzseket 15 %-os glicerines TA-ban -20oC-on lefagyasztva tároljuk.
2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és végkoncentrációjuk (µg/ml) Rövidítés
E. coli (µg/ml)
Agrobacterium sp. (µg/ml)
Ampicillin
Amp
100
-
Chloramphenicol
Cm
5, 15
15
Rifampicin
Rif
-
30
Kanamycin
Km
30
30
Tetracyclin
Tc
15
-
Spectinomycin
Spc
100
100
Antibiotikumok
3.3. Plazmid DNS izolálás
A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke (ISH-HOROVICZ D ET AL. 1981) módszerének módosított változata szerint preparáltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf csőbe tettünk és a sejteket centrifugálással leülepítettük. A tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12000 fordulatszámmal, szobahőmérsékleten. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH=8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd 160 µl jéghideg Na-acetát oldatot (3M, pH=4,8) adtunk hozzájuk és az oldatot erősen összeráztuk. 5 perc 0°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 100 µl Tris-acetát pufferben (50 mM Tris, 100 mM Na-acetát, pH=8,0) feloldottuk. Ezután 200 µl abs. etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk,
20
szárítottuk az előzőekhez hasonló módon, majd 30-50 µl RNáz tartalmú desztillált vízben (100 µg/ml forralt RNázA) oldottuk fel, az adott plazmid kópiaszámának függvényében. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl (250-1000 ng/µl) preparátumot használtunk fel. A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az előzőek szerint készített 50 µl plazmid preparátumhoz 0,1 térfogat 10% SDS oldatot és 1 térfogat 0oC-os 7,5 M NH4-acetát oldatot adtunk és 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20°C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás után a tisztított DNS-molekulát 40 µl desztillált vízben vettük fel. A preparátumok minőségét agaróz gélelektroforézis segítségével ellenőriztük általában 1 µl minta felhasználásával.
3.4. Emésztés restrikciós endonukleázokkal és agaróz gélelektroforézis
A DNS-minták emésztését a
FERMENTAS
cég termékeit használva a megadott
protokollok szerint végeztük. Az emésztési reakciók után agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük a mintákat. A fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt és TBE puffert használtunk az általánosan alkalmazott módszerek, protokoll szerint. Kontrollként PstI enzimmel emésztett λ-DNS vagy GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus molekulát (FERMENTAS) alkalmaztunk.
3.5. T4 polimeráz kezelés, DNS ligálás, transzformálás
Az izolált fragmentet T4 polimeráz kezeléssel tettük alkalmassá a vektorba való beépüléshez. A reakciót fragment DNS oldat, dNTP, 10×puffer és desztillált víz segítségével végeztük 20 µl térfogatban. A T4 polimeráz enzim hozzáadása után 3 perc 23°C-os, majd 10 perc 75°C-os inkubálás következett. A kezeléssel létrehozott tompa végek lehetővé tették a fragment „blunt end” vágott vektorba való beépítését. Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80°C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig jégen inkubáltuk, majd hősokkot alkalmaztunk (3 perc, 37°C). Ez után 400 µl LB tápfolyadékot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív
21
táptalajra kentük. pBluescript használata esetén 25 ml táptalajba 100 µl ampicillin (25 mg/ml), 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl X-gal oldatot (2%, dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsok közül a fehér telepeket választottuk ki további ellenőrzésre. A
kompetens
sejteket
általában
az
XL1-blue
törzsből
készítettük,
szobahőmérsékleten OD600=0,5 denzitásig felnövesztett sejtekből, melyeket többszöri mosás, centrifugálás után tízszeresre koncentráltunk és 400 µl-es adagokban, 7% dimetil-szulfoxid (DMSO) jelenlétében -80°C-ra lefagyasztottunk.
3.6. Polimeráz láncreakció A pBS plazmid AmpR génjét az amp-fw2 és amp-rev1 primerek segítségével, a pCambia2300 plazmid inszertet tartalmazó részét a pROK-Fw és F755p primerek segítségével sokszoroztuk fel polimeráz láncreakcióval. Az Agrobacterium törzsek ellenőrzésére az iaaM génre specifikus Iam F és Iam R, illetve a poligalakturonáz génre specifikus PGF és PGR primereket használtuk. Az alkalmazott oligonukleotid primereket és a használt PCR programokat a 3. és 4. táblázatok tartalmazzák.
3. táblázat: A munka során használt oligonukleotidok Oligonukleotidok neve
Nukleotidszekvenciák
Tm (oC)
amp-fw2
agaattcGCGGAACCCCTATTTGTT
49
amp-rev1
gaagcttGGTCTGACGCTCAGTGGA
48,4
pROK-Fw
catttggagagaacacg
48
F755p
cttccggctcgtatgttg
50
Iam F
ccaaattgcgcgattattg
51
Iam R
acttttggcttaggaacatc
51
PGF
ggggcaggatgcgtttttgag
54
PGR
gacggcactggggctaagga
54
22
4. táblázat: Az alkalmazott PCR programok AmpR o
CAM_K o
iaMPG
1. 94 C 02:00
1. 94 C 02:00
1. 94oC 02:00
2. 94oC 00:30
2. 94oC 00:30
2. 94oC 00:30
3. 50oC 00:30
3. 58oC 00:30
3. 56oC 00:30
4. 72oC 01:40 5. go to 2. 33x 6. END
4. 72oC 00:40 5. go to 2. 33x 6. END
4. 72oC 01:30 5. go to 2. 33x 6. END
3.7. Fragment izolálás Polimeráz láncreakció után a keletkezett DNS fragmentet agaróz gélelektroforézis segítségével izoláltuk. Az izolálni kívánt fragment előtt bemetszést végeztünk és a gélbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk, majd további 20 perces 60 V feszültség melletti elektroforézis után a fragment a papírra került. Ezt követően a papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t 2x50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS kicsapásához 10 µl 3M Na-acetát oldatot (pH=7,0) és 120 µl izopropanolt használtunk. A csapadékot 20 perc, - 20oC inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel.
3.8. DNS-szekvencia meghatározás
A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok a szegedi Bay Zoltán Intézet (ABI3500 Genome Analyzer) laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/ChromasPro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program alkalmazásaival illesztettük össze és elemeztük tovább.
3.9. A baktériumok keresztezése A pPZP111, pCambia2300 és a pJP17 plazmid származékokat a PP211 helper plazmidot tartalmazó baktériumtörzs segítségével, konjugációval juttattuk be E. coli sejtekből a megfelelő Agrobacterium törzsbe (MOG301).
23
Ez a módszer a „háromszülős keresztezés”, mely magában foglalja a donor és a recipiens törzset, valamint a mobilizáló plazmidot tartalmazó, „helper” törzset. A keresztezni kívánt donor és recipiens baktériumokat és a „helper” törzset felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0,9%-os NaCl-oldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. Éjszakán át, 28°C-on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat 0,9%-os NaCloldatban ismét felszuszpendáltuk, majd különböző hígításokban szelektív lemezekre szélesztettünk belőlük 50 µl szuszpenziót. A 48 óra elteltével felnőtt telepek közül a kiválasztottakat legalább két lépésben tisztítottuk tovább szelektív lemezen, mielőtt tovább dolgoztunk velük.
3.10. Dohány transzformáció
A folyamat 1. lépése a kokultiváció, a fiatal baktériumtenyészetet és a fiatal dohánynövény leveleket együtt tenyésztjük. Ehhez szacharóz, agar, valamint hormon- és vitamintartalmú tápoldat, illetve táptalaj szükséges. Anyagok és eszközök: MS H+ tápoldat, 1% szacharózzal + 0,055 mg/l TDZ (=0,25 µM) és 0,050 mg/l NAA, MS H+ táptalaj 1% szacharózzal + 0,055 mg/l TDZ és 0,050 mg/l NAA (kokultivációnál a 3% szacharóz az agrobaktérium vektor növekedésére gátló lehet). 20 ml MS H+ oldatot mértünk széles szájú Erlenmeyer lombikba, valamint kb. 40 ml MS tápoldatot külön kiöntöttünk a levelek darabolásához. A dohányleveleket Petri csészében, steril tápoldat alatt kb. 6-8 mm-es korongokra vágtuk, a főér kihagyásával. Kb. 20-24 korongot összegyűjtöttünk 20 ml tápoldatban (széles szájú, 100 ml-es Erlenmeyer lombik). Fél kémcsövekbe 1 ml MS H+ oldatot mértünk, ebben készítettük el a baktérium szuszpenziót (kb. 5x108sejt/ml), amiből 0,5 ml-t adtunk a levélkorongokhoz, majd enyhén összeráztuk. Kb. 20-25 perc után a levélkorongokat fonákkal felfelé kiraktuk MS H+ táptalajra, két napig 25-27oC-on sötétben tartottuk a lemezeket. A folyamat 2. lépése a szelektív táptalajra való átrakás. A szelekciós médium tartalmazza a baktériumok megöléséhez szükséges antibiotikumot (claforán). 100-as Erlenmeyer lombikokba 50-60 ml MS tápoldatot mértünk 100 mg/l claforánnal 24
kiegészítve, ezekben történt a baktérium lemosása a levéldarabkák felületéről. Az alaposan lemosott levéldarabkákat ezután Petri csészékre tettük át, amikbe már a recept szerint elkészített táptalajt kiöntöttük. Anyagok: MS H+ (0,055 mg/l TDZ és 0,050 mg/l NAA), 3% szacharózzal, 0,6 % agarral, 200-200 mg/l claforán/carbenicillin + 100 mg/l kanamycin, vagy egyéb szelekciós ágens. Fényszobában 23-27 oC-on inkubáltuk. Ezután következett a hajtásregeneráció. A korongokról izoláltuk a képződő kalluszokat és átraktuk a fenti táptalajra, de már NAA nélkül. A hajtásregenerációt a növényregeneráció követte, amikor is a képződött hajtásokat gyökereztetés céljából hormonmentes táptalajra helyeztük, de az antibiotikumokat nem hagytuk el. További in vitro szaporításra elég 1% szacharóz. A munkafolyamat utolsó lépése az üvegházra edzés, amikor a regenerálódott növényeket steril kerti talajra ültettük ki (közel semleges pH-jú), és kizárólag steril csapvízzel öntöztük. A páratartalmat egy hét után fokozatosan csökkentettük, kb. további 10 napon keresztül. Amint a növények megedződtek, lehetett tápoldatozni.
3.11. Növényi fertőzési teszt Az agrobaktériumokat TA táptalajon két napig 28oC növesztettük a megfelelő antibiotikumok jelenlétében, majd 0,9%-os NaCl-oldatban szuszpendáltuk fel a kultúrákat, és OD590=1,5 denzitásra állítottuk be a sejtszámot. Koinokulációs kísérletek esetén a „védő” és a kórokozó baktériumokat 9:1 arányban kevertük össze. A dohány, illetve kalanchoe növények szárát két-három helyen átszúrtuk, előzetesen a baktérium szuszpenzióba,
illetve
kontroll
NaCl-oldatba
mártott
lándzsatű
segítségével.
Kezelésenként 5-6 növényt fertőztünk, majd a növényeket növénynevelő szobában 24oC-on, 14 óra megvilágítás mellett neveltük. A tumorképződést 5 hét elteltével értékeltük ki.
25
4. Eredmények és megvitatásuk Célunk volt a pJP17 vektor hatásosságának tesztelése, valamint olyan új, miRNS konstrukciót tartalmazó vektorok létrehozása, melyek több, különböző Agrobacterium törzs tumorképzését is megakadályozzák. A munka során már korábban átalakított pPZP111 plazmidról az előzetes gyors koinokulációs kalanchoe kísérletekből és dohánynövényen való tesztelés után kiderült, hogy a plazmid nem alkalmas növényi transzformációra, még az átalakított, mesterséges miRNS fragmenteket nem tartalmazó, „üres” vektor sem volt hatásos. Ennek megállapításában nagy segítségünkre voltak a kontrollként használt pJP17 vektorral transzformált növények. Így új vektort kellett keresnünk, a választás a növényi transzformációra alkalmas pCambia2300 vektorra esett, mely plazmid átalakításának folyamata a 4.2. fejezetben kerül ismertetésre.
4.1. Transzgenikus dohánynövények létrehozása
Az Anyagok és módszerek 3.10. fejezetében leírt protokoll alapján sikerült transzgenikus dohánynövényeket készíteni, összesen 16 vonalat hoztunk létre a pJP17 konstrukció segítségével. A növényi teszteléshez az Agrobacterium tumefaciens A348 és C58, illetve Agrobacterium vitis Tm4, AT1 és S4 törzseket választottuk. A növényi fertőzés megkezdése előtt PCR reakcióval meggyőzödtünk róla, hogy a fertőzésben használt agrobaktériumok valóban a megfelelő törzsek. Az A. tumefaciens A348 és C58 törzseket iaaM szekvenciájukra specifikus primer pár segítségével, az A. vitis Tm4 és AT1 törzseket pedig a poligalakturonáz génre specifikus primer páros segítségével ellenőriztük (8. ábra). Az A. vitis S4 törzset még nem használtuk a növényfertőzési kísérletekben, így ezt a törzset még nem is vizsgáltuk.
26
8. ábra: A fertőzésben használt agrobaktériumok PCR reakcióval való ellenőrzése C58, A348: A. tumefaciens C58 és A348 törzsek iaaM génre specifikus primerpárossal keletkezett PCR fragmentje; AT1, Tm4: A. vitis AT1 és Tm4 törzsek poligalakturonáz génre specifikus primerpárossal keletkezett PCR termék; L: 100bp DNA Ladder Plus
4.1.1. Kettő transzgenikus dohányvonal fertőzési eredménye
Eddig kettő transzgenikus vonalat tudtunk úgy elszaporítani, hogy tesztelni tudjuk különböző agrobaktériummal szembeni fogékonyságukat (N3 és N4 vonalak). Emellett kontroll (K) növényi tesztekben ellenőriztük, hogy a rendelkezésünkre álló, a kísérletekben használni kívánt Agrobacterium törzsek valóban képesek-e a dohánynövényeken tumort okozni.
Egy-egy agrobaktérium törzzsel 2-2 növényt
fertőztünk, 2-2 sebzési helyen. A kísérletek eredményét az 5. táblázat tartalmazza, ill. a 9. ábra szemlélteti.
5. táblázat: Az agrobaktérium fertőzés eredménye A348
C58
Tm4
AT1
K
+
+
+
+
N3
+
+
+
+
N4
-
-
+
+
(1) +: van tumor, -: nincs tumor
27
-K
K_A348
K_C58
K_Tm4
K_AT1
N3_A348
N3_C58
N3_Tm4
N3_AT1
N4_A348
N4_C58
N4_Tm4
N4_AT1
9. ábra: Agrobacterium törzsek tumorképzése dohánynövényeken -K: fertőzetlen kontroll; K_ A348, K_C58, K_Tm4, K_AT1: A. tumefaciens A348, C58, A. vitis Tm4, AT1 által okozott tumor kontroll dohányokon; N3_A348, N3_C58, N3_Tm4, N3_AT1: A348, C58, Tm4, AT1 által okozott tumor az N3 fogékony transzgenikus dohány vonalon; N4_A348, N4_C58: sebzési hely az A348, C58 fertőzésre rezisztens N4 transzgenikus dohányvonalon; N4_Tm4, N4_AT1: Tm4, AT1 által okozott tumor az N4 transzgenikus dohányvonalon
A többi transzgenikus vonalunk tesztelése is folyamatban van, de a kísérletek kiértékelése még nem történt meg. Ezen transzgenikus vonalak elkészítése mellett párhuzamosan miRNS-t expresszáló transzgenikus növényeket is szerettünk volna létrehozni a pCambia2300 vektor segítségével. Ehhez azonban szükség volt a klónozó vektor átalakítására.
28
4.2. A pCambia2300 vektor átalakítása
Előzetes vizsgálataink során kiderült, hogy a pCambia vektor használható a klónozáshoz, valamint sikerült önmagában az „üres” vektorral transzgenikus kalluszt létrehozni dohányleveleken, így remélhetőleg a miRNS konstrukciókat tartalmazó vektorok is sikeresen alkalmazhatók lesznek dohánynövény regeneráltatására. A klónozás érdekében előbb ezen a vektoron néhány átalakítást kellett elvégeznünk. A mesterséges miRNS géneket az egyszerűbb, és „orientált” klónozás érdekében EcoRI-HindIII fragmentként kívántuk beépíteni a bináris plazmidba. A miRNS inszertek beépítése előtt szükség volt egy 35S promoter és egy terminátor szekvencia beépítésére is. A pROK2 vektorban egy 1077 bp nagyságú EcoRI-HindIII fragmentként megtalálható a 35S promoter (cauliflower mosaic virus, CaMV) és a nopalin szintáz (nos) gén terminátor szekvenciája, így egy EcoRI-HindIII kettős emésztéssel az kivágható, illetve beépíthető a pCambia2300 plazmidba. Azonban az EcoRI- miRNS -HindIII fragmentek beépítése során kivágódna ez a fontos 35S promoter régió, így az inszertek beépítése előtt a promoter szekvencia két végéről el kell tüntetni e két enzim hasítóhelyet (10. ábra).
pROK2 MCS pS35 Xba Bam SmaI KpnI SacI NOS_TER oldal gggggacTCTAGAggatccccgggtaccGAGCTCgaatttccc
10. ábra: A klónozó vektor átalakítása, a pROK2 poliklónozó helye (MCS) 1.: a pROK2 35S promoter-NOSt beépítése a pCambia2300 vektorba; 2.-3.: EcoRIHindIII hasítóhelyek elrontása
29
A pCambia vektort először EcoRI enzimmel emésztettük meg, és T4 polimeráz enzimkezeléssel feltöltöttük a restrikciós hasítóhelyet, majd HindIII enzim esetében ismételtük meg a lépéseket. Ellenőrzésképpen EcoRI, HindIII és EcoRI-HindIII kettős emésztést végeztünk. Kontrollként a KpnI enzimet használtuk, ami emészti az eredeti és az elrontott EcoRI, illetve HindIII hasítóhelyet tartalmazó plazmidot is. Az ellenőrző emésztések igazolták, hogy kizárólag a kívánt hasítóhelyeket sikerült elrontani, ami a további tervezett munka előfeltétele (11. ábra). Az átalakított plazmidot szekvencia szinten is ellenőriztük.
11. ábra: A klónok ellenőrzése EcoRI, HindIII és KpnI restrikciós enzimekkel 3.: emésztetlen pROK2 35S promotert (EcoRI-HindIII fragmentként) tartalmazó pCambia2300 plazmid; 1.: emésztetlen pROK2 35S promotert (EcoRI-HindIII hely elrontott) tartalmazó pCambia2300 plazmid; 3EH, 1EH: EcoRI-HindIII kettős emésztett minták; 3E, 1E: EcoRI emésztett minták; 3H, 1H: HindIII emésztett minták; 3K, 1K: KpnI emésztett minták; λ: lambda DNS kontroll PstI restrikciós enzimmel hasítva
A következő lépésben célunk volt az EcoRI-HindIII klónozó helyek bevitele a 35S promoter és nos terminátor szekvenciák közé. Ehhez az Amp antibiotikum rezisztenciagént választottuk, melynek felsokszorozására két primert terveztünk, úgy hogy az 5’ primer szekvencia az EcoRI, a 3’ primer szekvencia pedig a HindIII hasítóhelyet tartalmazza, hogy klónozása után újra megjelenjen a vektoron. Így egyrészt szelektálni tudunk a két, restrikciós enzim hasítóhely beépülésére, másrészt a következő klónozási lépésnél ellenőrizni tudjuk, hogy az EcoRI és a HindIII enzim is hasította-e a
30
vektort. A sikeres kettős emésztést az antibiotikum rezisztenciát tartalmazó DNSfragment megjelenése jelzi. Kolónia PCR segítségével felsokszoroztuk a kiválasztott antibiotikum rezisztencia gént. A kapott megfelelő méretű (1110 bp) DNS fragmentet izoláltuk, SmaI enzimmel linearizált pCambia vektorba ligáltuk, majd XL1-Blue sejtekbe transzformáltuk. A transzformáns kolóniákból plazmidot izoláltunk és EcoRI-HindIII kettős emésztéssel ellenőriztük, hogy valóban a kívánt konstrukciót hordozzák-e. A beépült fragment orientációjának meghatározására is szükség volt, hiszen számunka a promoter után EcoRI-HindIII orientációban beépült inszertet tartalmazó plazmidok a fontosak. Az orientáció meghatározásához XbaI-HindIII enzimeket választottunk. A kettős emésztés során a megfelelő orientációban beépült inszertek esetén a gélen jól látható fragment jelenik meg (12. ábra).
12. ábra: Az orientáció meghatározás XbaI és HindIII restrikciós enzimekkel 2, 3, 4: emésztetlen minták; 2EH, 3EH, 4EH: EcoRI-HindIII enzimekkel emésztett minták; 2XH, 3XH, 4XH: XbaI-HindIII enzimekkel emésztett minták; λ: lambda DNS kontroll PstI restrikciós enzimmel hasítva 2XH és 4XH mintáknál látható a megfelelő méretű fragment, ami akkor keletkezik, ha jó orientációban van az inszert, így a XbaI-HindIII enzimek az inszertet is kivágják.
31
4.2.1. Az átalakított miR159 mikro RNS gének beépítése a pCambia2300 vektorba A tanszéken nyolcféle, módosított miRNS159 szekvenciát hoztak létre (Galambos Anikó munkája). Ezeknek a miRNS szekvenciáknak az átalakítása többlépcsős PCR és klónozási folyamat során történt. Ezeket az átalakított szekvenciákat tartalmazó EcoRImiRNS-HindIII fragmenteket izoláltuk, majd a pCambia2300 plazmid EcoRI-HindIII helyére ligáltuk (14. ábra), majd XL1-Blue kompetens sejtekbe transzformáltuk és megfelelő antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalajon növesztettük. A felnőtt telepek közül kolónia PCR segítségével kiválogattuk a pozitív klónokat, melyekből aztán plazmid DNS-t is tisztítottunk. Az inszert jelenlétét EcoRI-HindIII kettős emésztéssel (13. ábra) és szekvenálási reakcióval ellenőriztük.
13. ábra: EcoRI-HindIII kettős emésztés eredménye 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: emésztetlen minták; 1EH, 7EH, 11EH, 15EH: EcoRIHindIII kettős emésztett „rövid” fragmentet hordozó minták; 3EH, 5EH , 9EH, 13EH: EcoRI-HindIII kettős emésztett „hosszú” fragmentet hordozó minták; L: 100bp DNA Ladder Plus
32
14. ábra: A létrehozott miRNS gének beépítésének folyamata a már átalakított pCambia2300-as vektorba A. Az átalakított pCambia2300-as vektoron SmaI emésztés után beépítettük az EcoRIHindIII végekkel rendelkező Amp rezisztencia gént B. A rezisztencia gén kivágása után (1.) a módosított miRNS géneket a pCambia2300as vektorba ligáltuk (2.)
33
A szekvenáltatás eredménye igazolta, hogy mindegyik fragment bázispárra pontosan az általunk átalakított szekvenciákat tartalmazza, így az elkészített konstrukciók hatásosságának ellenőrzése megkezdődhet a növényi tesztekben.
4.2.2. Növényi kísérletek
A tervezett fertőzési kísérletekhez a létrehozott új és a kontroll „üres” plazmid konstrukciókat konjugációval juttattuk be a MOG301 „disarmed” („lefegyverzett”, a tumort eredményező, vad típusú T-DNS szakaszt eltávolították belőle) Agrobacterium törzsbe. Az Anyagok és módszerek 3.10. fejezetében leírt protokoll alapján megkezdtük a transzgenikus dohánynövények készítését.
34
5. Összefoglalás Az agrobaktériumok Gram-negatív talajbaktériumok, melyek a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik. A folyamat során az Agrobacterium genetikailag transzformálja a növényt a T-DNS segítségével. Ezen, többek között, auxin és citokinin bioszintézis gének találhatók, melyek tumoros sejtburjánzást eredményeznek. Elvben létre lehet hozni olyan Agrobacterium rezisztens transzgenikus növényeket, melyekben a baktérium által bejuttatott gének megnyilvánulása gátolt. Mi az auxin túltermelésért felelős iaaM gén géncsendesítés segítségével történő inaktiválását választottuk. Mivel számos patogén agrobaktérium törzs van, amelyek iaaM szekvenciái részben eltérőek egymástól, kérdés, hogy egy adott csendesítésre használt szekvencia mennyire biztosít védettséget a többi törzs tumorképzésekor. Először egy olyan szekvencia hatását vizsgáltuk, amely az A. tumefaciens A348 törzs iaaM génjének nagy részét tartalmazta (pJP17), ami a legtöbb rokon törzs iaaM szekvenciájával több vagy kevesebb részletében teljesen azonos. E konstrukció agrobaktériumokkal szembeni hatásosságát transzgenikus dohánynövények fertőzésével vizsgáltuk. Eddig 16 transzformáns vonalat hoztunk létre, melyeket vegetatív módon szaporítunk fel. A különböző agrobaktérium törzsekkel történő fertőzési tesztekben eddig két vonalat sikerült jellemeznünk. Ezek közül egy mutatott rezisztenciát az A. tumefaciens A348 és C58 törzsekkel szemben, de fogékony volt A. vitis AT1 és Tm4 fertőzésre. E kísérletek mellett egy Arabidopsis miRNS génből (miR159a) korábban laboratóriumunkban létrehozott, iaaM mRNS szekvenciákra specifikus konstrukciók transzformációs vektorokba klónozását végeztem el. Először a pPZP111 bináris plazmidot használtuk fel erre a célra, de kiderült, hogy ez a tervezett vizsgálatokra nem alkalmas. Ezek után a pCambia2300 bináris plazmid átalakítását végeztük el a mesterséges miRNS gének klónozásához, majd a klónozott, nyolc féle módosított miRNS gén szekvenciájának ellenőrzését segítettem. A létrehozott vektorokat agrobaktériumba juttattuk és megkezdtük a transzgenikus dohánynövények létrehozását.
35
6. Irodalomjegyzék BARTEL, B.
AND
BARTEL, D.P. 2003. MicroRNAs: at the root of plant development?
Plant Physiol 132(2): 709-17.
BARTEL, D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2): 281-97.
BAUMBERGER, N.
AND
BAULCOMBE, D.C. 2005. Arabidopsis ARGONAUTE1 is an
RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 102(33): 11928-33.
BELL
CR,
DICKIE
GA,
CHAN
JW.
1995. Variable response of bacteria isolated from
grapevine xylem to control grape crown gall disease in planta. Am J Enol Vitic 46: 499508
BINNS AN. 2002. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens: 25 years and counting. Trends in Plant Science 7: 231-233
BOLTON
GW,
NESTER
EW,
GORDON
MP.
1986. Plant phenolic compounds induce
expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science 232: 983-985
BULLOCK WO, FERNANDEZ JM, SHORT JM. 1987. XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA
Escherichia
coli
strain
with beta-galactosidase selection.
Biotechniques 5: 376-9
BURR
TJ,
REID CL. 1994. Biological control of grape crown gall with non-tumorigenic
Agrobacterium vitis strain F2/5. Am J Enol Vitic 45: 213-9
BURR TJ, OTTEN L. 1999. Crown gall of grape: biology and disease management. Annu Rev Phytopathol 37
36
DE CLEENE, M. 1985. Susceptibility of monocotyledons to Agrobacterium tumefaciens. Phytopath. Z., 113.: 81–89.
DE CLEENE,
M. AND
DE LEY,
M.
1976. The host range of crown gall. Bot. Rev., 442.:
389–466.
DITTA, G., STANFIELD, S., CORBIN, D. & HELINSKI, D.R. 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 7347-7351.
DONG, Z., HAN, M.H. AND FEDOROFF, N. 2008. The RNA-binding proteins HYL1 and SE promote accurate in vitro processing of pri-miRNA by DCL1. Proc Natl Acad Sci U S A 105(29): 9970-5.
FIRE A, XU S, MONTGOMERY MK, KOSTAS SA, DRIVER SE, MELLO CC 1988. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
GAUDIN V, VRAIN T, JOUANIN L. 1994. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiol. Biochem 32: 11-29
GELVIN S. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Ann Rev Plant Physiol 51: 223-56
GHEYSEN
G,
VAN
MONTAGU M,
ZAMBRYSKY P. 1987. Integration of Agrobacterium
tumefaciens DNA (T-DNA) involves rearrangements of target plant DNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 84: 6169-73
GRIFFITHS-JONES, S., GROCOCK, R.J.,
VAN
DONGEN, S., BATEMAN, A.
AND
ENRIGHT,
A.J. 2006. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res 34 (Database issue), D140-4.
HAJDUKIEWICZ P, SVAB Z, MALIGA P. 1994. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol. 25(6): 989-994
37
HAMMOND, S.M., BOETTCHER, S., CAUDY, A.A., KOBAYASHI, R., HANNON, G.J. 2001. Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293 (5532): 1146-1150.
HOLB I. 2005. Polifág kórokozók elleni ökológiai védekezés.
ISH-HOROVICZ D, BURKE JF. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 2989-98
KHMEL
IA,
SOROKINA
TA,
LEMANOVA
LB,
LIPASOVA
VA,
METLITSKY
OZ, ET AL.
1998.
Biological control of crown gall in grapevine and raspberry by two Pseudomonas spp. with a wide spectrum of antagonistic activity. Biocontr Sci Technol 8: 45-57
KIRÁLY L. 1999. The Silencing of (Trans)Genes - A Mechanism of Virus Resistance in Plants. Acta Phytopatologica Et Entomologica Hungarica 34: 263-75
KIRÁLY Z. - BARNA B. - KECSKÉS A. - FODOR J. 2002. Down-Regulation of Antioxidative Capacity in a Transgenic Tobacco Which Fails to Develop Acquired Resistance to Necrotization Caused by TMV. Free Radical Research. 36: 981-991
LAUBINGER, S., SACHSENBERG, T., ZELLER, G., BUSCH, W., LOHMANN, J.U., RATSCH, G. AND WEIGEL, D.
2008. Dual roles of the nuclear cap-binding complex and SERRATE in
premRNA splicing and microRNA processing in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 105(25): 8795-800.
LEE H, HUMANN J, PITRAK J, CUPERUS J, PARKS T,
ET AL.
2003. Translation start
sequences affect the efficiency of silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA oncogenes. Plant Physiol 133: 966-77
LEE, R.C., FEINBAUM, R.L. AND AMBROS, V. 1993. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75(5): 843-54.
LEE, Y., KIM, M., HAN, J., YEOM, K.H., LEE, S., BAEK, S.H.
AND
KIM, V.N. 2004.
MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. Embo J 23(20): 4051-60. 38
LEHOCZKY J. 1978. Root-system of the grapevine as a reservoir of Agrobacterium tumefaciens cells. Proc. 4th Internat. Conf. Plant Path. Bact.: 239–243, Angers, France.
MCNEIL, J . B. AND J. J. FRIESEN 1981. Mol. Gen. Genet. 184: 386-393.
MELCHERS LS, REGENSBURG-TUINK AJG, SCHILPEROORT RA, HOOYKAAS PJJ. 1989. Specificity of signal molecules in activation of Agrobacterium virulence gene expression. Mol Microbiol 3: 969-77
NAPOLI C, LEMIEUX C, JORGENSEN R 1990. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. The Plant Cell 2: 279-289
NIU QW, LIN SS, REYES JL, C CK, WU HW,
ET AL.
2006. Expression of artificial
microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol 11: 1420-8
OROSZ L, SVAB Z, KONDOROSI A, SIK T. 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 163. Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125: 341- 50
PARK, M.Y., WU, G., GONZALEZ-SULSER, A., VAUCHERET, H. AND POETHIG, R.S. 2005. Nuclear processing and export of microRNAs in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 102(10): 3691-6.
PETER M. WATERHOUSE & CHRISTOPHER A. HELLIWELL 2003. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Reviews Genetics 4: 29-38
PU XA, GOODMAN RN. 1993a. Effects of fumigation and biological control on infection of indexed crown gall free grape plants. Am J Enol Vitic 44: 241-8
REAM W. 1989. Agrobacterium tumefaciens and interkingdom genetic exchange. Annu Rev Phytopathol. 27: 583-618
39
REINHART, B.J., SLACK, F.J., BASSON, M., PASQUINELLI, A.E., BETTINGER, J.C., ROUGVIE, A.E., HORVITZ, H.R.
AND
RUVKUN, G. 2000. The 21-nucleotide let-7 RNA
regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403(6772): 901-6.
SAMBROOK J, FRITSCH EF, MANIATIS T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press
SMITH, R. H.
AND
HOOD, E. E. 1995. Agrobacterium tumefaciens transformation of
monocotyledons. Crop Sci., 35.: 301–309.
SUNKAR, R., GIRKE, T., JAIN, P.K. AND ZHU, J.K. 2005. Cloning and characterization of microRNAs from rice. Plant Cell 17(5): 1397-411.
TANG, G., REINHART, B.J., BARTEL, D.P.
AND
ZAMORE, P.D. 2003. A biochemical
framework for RNA silencing in plants. Genes Dev 17(1): 49-63.
TIINLAND B, SCHOUMACHER F, GLOECKLER V, BRAVO-ANGEL
AM,
HOHN B. 1995. The
Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome. EMBO J 14: 3585-95
TZFIRA T, LI J, LACROIX B, CITOVSKY
V.
2004. Agrobacterium T-DNA integration:
molecules and models. Trends in Genetics 20: 375-83
VAN DER KROL AR, LENTING PE, VEENSTRA J, VAN DER MEER IM, KOES RE, GERATS AGM, MOL JNM, STUITJE AR 1988. An anti-sense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Nature 333: 866-869
WEBSTER J, DOS
SANTOS M,
THOMSON
JA.
1986. Agrocin-producing Agrobacterium
tumefaciens strains active against grapevine isolates. Appl Environm Microbiol 52: 217219
XIE, Z., JOHANSEN, L.K., GUSTAFSON, A.M., KASSCHAU, K.D., LELLIS, A.D., ZILBERMAN, D.,JACOBSEN, S.E.
AND
CARRINGTON, J.C. 2004. Genetic and functional
diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2(5): E104. 40
YANG, L., LIU, Z., LU, F., DONG, A.
AND
HUANG, H. 2006b. SERRATE is a novel
nuclear regulator in primary microRNA processing in Arabidopsis. Plant J 47(6): 841850.
ZAENEN J, VAN LAREBEKE
N,
TENCHY H, SCHELL J. 1974. Supercoiled circular DNA in
crown gall inducing Agrobacterium strains. J Mol Biol 86: 109-27
41
7. Köszönetnyilvánítás Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Hálával tartozom a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelő hátteret biztosítottak terveim megvalósításához.
Köszönettel tartozunk Dr. Szegedi Ernőnek (FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Kecskemét) hasznos elméleti és gyakorlati tanácsaiért.
Külön köszönettel tartozom témavezetőimnek, Galambos Anikónak és Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért, sok segítségéért, hasznos tanácsaiért.
42
