DOKTORI (Ph. D.) ÉRTEKEZÉS
CSEH ESZTER
PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR
KESZTHELY
2012
Doktori (Ph. D.) értekezés
Szılıvírusok elıfordulása Magyarországon, valamint a hazai Grapevine leafroll- associated virus 1 és 3 izolátumok molekuláris vizsgálata
Cseh Eszter Okleveles növényorvos
Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskola Pannon Egyetem Georgikon Kar
Témavezetık
Dr. Gáborjányi Richard professor emeritus
Dr. Takács András Péter egyetemi docens
Keszthely
2012
SZİLİVÍRUSOK ELİFORDULÁSA MAGYARORSZÁGON, VALAMINT A HAZAI GRAPEVINE LEAFROLL- ASSOCIATED VIRUS 1 ÉS 3 IZOLÁTUMOK MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATA
Értekezés doktori (Ph. D.) fokozat elnyerése érdekében
Írta: Cseh Eszter
Készült a Pannon Egyetem Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskolája keretében
Témavezetık: Dr. Gáborjányi Richard Elfogadásra javaslom (igen / nem)
Dr Takács András Péter Elfogadásra javaslom (igen / nem)
A jelölt a doktori szigorlaton ........%-ot ért el, Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom:
Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………. Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………. A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........%-ot ért el.
Keszthely,
…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke
A doktori (PhD) oklevél minısítése…................................. ………………………… Az EDHT elnöke
Tartalomjegyzék Rövidítések................................................................................................................................. 6 Kivonat ....................................................................................................................................... 8 Abstract .................................................................................................................................... 10 Zusammenfassung .................................................................................................................... 12 1. Bevezetés és célkitőzés ........................................................................................................ 14 2. Irodalmi áttekintés................................................................................................................ 16 2.1. A magyarországi szılıvirológiai kutatások történeti áttekintése...................................... 16 2.2. A Magyarországon elıforduló szılı vírusbetegségek és kórokozóinak áttekintése......... 17 2.2.1. Szılı korai vírusos leromlás .......................................................................................... 18 2.2.1.1. Grapevine fanleaf virus - Szılı fertızı leromlás vírus (GFLV) ................................ 19 2.2.1.2. Arabis mosaic virus - Arabis mozaik vírus (ArMV)................................................... 20 2.2.1.3. Grapevine chrome mosaic virus - Szılı krómmozaik vírus (GCMV) ....................... 21 2.2.1.4. Tomato black ring virus - Paradicsom fekete győrős vírus (TBRV) .......................... 21 2.2.1.5. Grapevine Bulgarian latent virus - Szılı bolgár látens vírus (GBLV) ...................... 21 2.2.2. Levélsodródás tünetcsoport............................................................................................ 22 2.2.2.1. Grapevine leafroll-associated virus 1 - Szılı levélsodródás vírus-1 (GLRaV-1)...... 24 2.2.2.2. Grapevine leafroll-associated virus 2 - Szılı levélsodródás vírus-2 (GLRaV-2)...... 25 2.2.2.3. Grapevine leafroll-associated virus 3 - Szılı levélsodródás vírus-3 (GLRaV-3)...... 26 2.2.2.4. Grapevine leafroll-associated virus 4, 5, 6, 7 - Szılı levélsodródás vírus -4, -5, -6,-7 (GLRaV-4, -5, -6; -7) ............................................................................................................... 27 2.2.2.5. A 70 kDa nagyságú hısokk fehérje homológ (HSP70h) jellemzése .......................... 27 2.2.3. Látens foltosság.............................................................................................................. 28 2.2.3.1. Grapevine fleck virus - Szılı foltosodás vírus (GFkV) .............................................. 28 2.2.4. Szılı faszöveti barázdáltság .......................................................................................... 29 2.2.4.1. Rupestris stem pitting-associated virus - Rupestris faszöveti barázdáltság vírus (RSPaV) ................................................................................................................................... 30 2.2.4.2. Grapevine virus A - Szılı A vírus (GVA) .................................................................. 30 2.2.4.3. Grapevine virus B - Szılı B vírus (GVB) .................................................................. 31 2.2.5. Szılı vonalas és győrős mintázottság ............................................................................ 32 2.2.5.1. Alfalfa mosaic virus - Lucerna mozaik virus (AMV) ................................................. 32 2.2.6. Szılı vonalas mintázottság ............................................................................................ 33 2.2.6.1. Grapevine line pattern virus - Szılı vonalas mintázottság vírus (GLPV) ................. 33 2.2.7. Vírusszerő betegségek, még pontosan nem azonosított kórokozók ............................... 34 2.2.7.1. Szılı enáció ................................................................................................................ 34 2.2.7.2. Szılı érnekrózis .......................................................................................................... 34 2.2.7.3. Szılı érmenti mozaik.................................................................................................. 34 2.3. A vírusrezisztencia kialakításának lehetıségei a Vitis fajokban ....................................... 35 3. Anyagok és módszerek......................................................................................................... 38 4
3.1. A mintavételezés és a lágyszárú bioteszt módszertana ..................................................... 38 3.1.1. Növényi minta győjtése.................................................................................................. 38 3.1.2. Lágyszárú bioteszt.......................................................................................................... 39 3.2. Szerológiai módszer .......................................................................................................... 39 3.3. Molekuláris módszerek ..................................................................................................... 40 3.3.1. Össznukleinsav kivonás ................................................................................................. 41 3.3.2. Polimeráz láncreakció .................................................................................................... 41 3.3.3. Gélelektroforézis ............................................................................................................ 43 3.3.4. A PCR termék izolálása gélbıl ...................................................................................... 43 3.3.5. Ligálás és transzformálás ............................................................................................... 43 3.3.6. A plazmid tisztítása és az inzert ellenırzése .................................................................. 44 3.3.7. A vírusgenomról készült cDNS nukleotid szekvenciájának meghatározása ................. 45 3.3.8. A nukleotid és aminosav szekvenciák vizsgálata........................................................... 45 3.3.9. Statisztikai analízis ......................................................................................................... 45 3.4. Közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levélminta vizsgálata...................... 45 4. Eredmények.......................................................................................................................... 47 4.1. Mintavételezés és lágyszárú bioteszt eredményei ............................................................. 47 4.1.1. Tünettani vizsgálat eredményei...................................................................................... 47 4.1.2. Lágyszárú bioteszt eredménye ....................................................................................... 53 4.2. Szerológiai vizsgálatok eredményei.................................................................................. 54 4.3. Molekuláris vizsgálat eredményei..................................................................................... 60 4.4. A közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levélminta vizsgálatának eredménye ................................................................................................................................ 70 5. Következtetések, javaslatok ................................................................................................. 73 6. Összefoglalás........................................................................................................................ 78 7. Új tudományos eredmények................................................................................................. 81 8. New results ........................................................................................................................... 82 9. Irodalomjegyzék................................................................................................................... 83 10. Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................... 95 11. Publikációk, elıadások....................................................................................................... 96 12. Melléklet............................................................................................................................. 99
5
Rövidítések AMV: Alfalfa mosaic virus – Lucerna mozaik vírus ArMV: Arabis mosaic virus - Arabis mozaik vírus Bp: basepair- bázispár CLRV: Cherry leafroll virus - Cseresznye levélsodródás vírus CP: coat protein - köpenyfehérje CPm1: minor coat protein 1. copy - a köpenyfehérje kisebb molekulatömegő 1. másolata CPm2: minor coat protein 2. copy - a köpenyfehérje kisebb molekulatömegő 2. másolata DAS-ELISA: Double Antibody Sandwitch Enzime Linked Immunosorbent Assay - Kettıs ellenanyag szendvics – enzimhez kötött immunválasz eljárás EDTA: Ethylenediaminetetraacetic-acid – Etilén-diamin-tetraecetsav GBLV: Grapevine bulgarian latent virus - Szılı bulgáriai látens vírus GCMV: Grapevine chrome mosaic virus - Szılı króm mozaik vírus GFkV: Grapevine fleck virus - Szılı foltosodás vírus GFLV: Grapevine fanleaf virus - Szılı fertızı leromlás vírus GLPV: Grapevine line pattern virus - Szılı vonalas mintázottság vírus GLRaV 1, 2, 3, 4, 5, 7: Grapevine leafroll-associated virus 1, 2, 3, 4, 5, 7 - Szılı levélsodródás vírusok 1,-2,-3,-4,-5,-7 csoportjai GRSPaV: Grapevine rupestris stem pitting associated virus – Szılı rupestris faszöveti barázdáltság vírus GYSVd-1: Grapevine yellow speckle viroid-1 - Szılı sárga foltosság viroid-1 GVB: Grapevine virus B - Szılı B vírus GVA: Grapevine virus A - Szılı A vírus GVC: Grapevine virus C – Szılı C vírus HEL: helicase - helikáz enzim HP: Homing protein - önvezérlı fehérje HSP70h: 70 kDa heat shock homologue protein - 70 kDa hısokk fehérje homológ HSP90h: 90 kDa heat shock homologue protein - 90 kDa hısokk fehérje homológ IPTG: isopropyl- beta- D- thio- galactoside – izopropil- beta- D- tio- galaktozid Kb: kilobase - kilobázis LB: Luria- Bertani medium – Luria- Bertani táptalaj MET: methyltransferase - metiltranszferáz enzim
6
M-MuLV: Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase - Moloney Murine Leukemia Virus reverz transzkriptáz enzim NaOH: Sodium- hydroxide – Nátrium hidroxid ORF: Open reading frame – Nyílt leolvasási szakasz P30: P30 like protein - p30 szerő fehérje PEG: polyethylene glycol - polietilén-glikol P-PRO: papain like protease - papain szerő proteolitikus fehérje RBDV: Raspberry bushy dwarf virus - Málna bokros törpülés vírus RdRp: RNA dependent RNA polymerase - RNS függı RNS polimeráz enzim RpRSV: Raspberry ringspot virus - Málna győrősfoltosság vírus RSPaV-1: Rupestris stem pitting-associated virus 1 - Szılı faszöveti barázdáltság vírus RT-PCR: reverse transcription - polymerase chain reaction – reverz transzkripciós polimerizáción alapuló láncreakció SDS: sodium- dodecil- sulphate – nátrium- dodecil- szulfát sgRNS: szubgenomi RNS SLRSV: Strawberry latent ringspot virus - Szamóca látens győrősfoltosság vírus TBE: Tris- borate- EDTA buffer – Tris-borát- EDTA puffer TBRV: Tomato blackring virus - Paradicsom fekete győrős vírus TEM: transmission electron microscopy - transzmissziós elektron-mikroszkópia TGB: triple gene block - hármas génblokk TRIS: Tris-hydroxymethyl-aminomethane – Tris- hidroximetil- aminometán TRIS-HCl:
Tris-hydroxymethyl-aminomethane
hidrochlorid
–
Trisz- amino
metán-
hidroklorid TRSV: Tobacco ringspot virus - Dohány győrősfoltosság vírus TSWV: Tomato spotted wilt virus - Paradicsom bronzfoltosság vírus ToRSV: Tomato ringspot virus - Paradicsom győrősfoltosság vírus X-Gal: 5-bromo- 4 chloro- 3- indolyly- beta- D- galactoside – 5-bromo- 4 kloro- 3 indolilbeta- D- galaktozid VPg: virus genome linked protein - vírus genomhoz kötött fehérje
7
Kivonat Szılıvírusok elıfordulása Magyarországon, valamint a hazai Grapevine leafroll- associated virus 1 és 3 izolátumok molekuláris vizsgálata A disszertáció a Magyarországon eddig leírt szılıvírusok molekuláris vizsgálati eredmények alapján történı új rendszerezésének bemutatásával, a hazánkban elıforduló vírusok termıültetvényekben való elterjedésének vizsgálatával, valamint egy szılı levélsodródás 1 vírus (Grapevine leafroll-associated virus 1, GLRaV-1) és négy szılı levélsodródás 3 vírus (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3) hazai izolátum 70 kDa nagyságú hısokk fehérje homológ (HSP70) gén szakaszának molekuláris jellemzésével, aminosav
sorrendjének
meghatározásával
és
külföldi
izolátumok
genetikai
összehasonlításával foglalkozik. A 2007. és 2010. között 17 borvidék 31 termıültetvényét érintı virológiai vizsgálata során a szimptomatológailag fertızöttnek ítélt tıkékrıl 277 levélminta begyőjtésére, majd DAS-ELISA módszerrel vírusok kimutatására került sor. Megállapítást nyert, hogy a szerológia vizsgálat sokkal kevesebb, 76 mintában adott a vizsgált vírusok közül kilencre pozitív eredményt, mint az a tapasztalt tünetek alapján feltételezhetı volt. A korábban jelentısnek tartott nepovírusok, elsısorban szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV), arabis mozaik vírus (Arabis mosaic virus, ArMV), paradicsom fekete győrős vírus (Tomato black ring virus, TBRV), szılı króm mozaik vírus (Grapevine chrome mosaic virus, GCMV) egyenként kisebb arányban voltak jelen, de együtt hasonló arányt képviseltek, mint a szılı levélsodródás 1, 2 és 3 (Grapevine leafroll associated virus 1, 2, 3, GLRaV 1, 2, 3) szerológiai csoportok. Továbbá nagyarányú fertızöttség volt tapasztalható szılı foltosodás vírus (Grapevine fleck virus, GFkV) esetében. Jelenléte az eredmények alapján az ország észak-keleti részén és Közép- illetve Nyugat Dunántúlon volt kimutatható elsısorban. Tizennégy minta esetében két-két vírus együttes jelenléte igazolódott. A vizsgálat eredményeibıl feltételezhetı, hogy más kórokozók pl. fitoplazma, vagy anyagcserezavarok, esetleg tápanyaghiány is szerepet játszhat a vírusfertızésre hasonlító tünetek kialakulásában. A munka további részében molekuláris (RT-PCR) vizsgálat tárgyát képezte egy GLRaV-1, és négy GLRaV-3 hazai izolátum. A vizsgálathoz használt, a HSP70-es génszakasz 500 bp hosszúságú szekvenciájának kimutatására alkalmas primerek tervezésének
8
alapjai GLRaV-1 esetében az AF195822 génbanki számú szekvencia, a GLRaV-3 esetében pedig az AF037268 nyilvántartási számú NY1 izolátum szekvencia voltak. Az így nyert szekvenciák génbanki adatok alapján összevetésre kerültek külföldi izolátumokkal. Az elkészített dendrogrammokból látható, hogy a korábban GLRaV3 esetében öt csoportra osztott izolátumok közé beilleszthetık a magyarországi izolátumok. A 3.5, a 2.2 és a 4.2-es izolátumok a 2. számú csoportba, a 1.4-es izolátum a 4. számú csoportba tartoznak. A 6.4.1-es GLRaV-1 izolátum a dendrogram szerint az „E” jelzéső csoportba tartozik. Az izolátumok szekvencia adatai HE794021-HE794025 nyilvántartási számokkal elsıként kerültek be a Génbankba a magyarországi szılı levélsodródás vírus izolátumok közül.
9
Abstract Occurrence of grapevine viruses in Hungary and molecular studies of some Hungarian Grapevine leafroll- associated virus 1 and 3 isolates The task of this work was to survey the occurrence of grapevine viruses in Hungarian vineyards, its classification on recent molecular base. Further aim was the characterization and sequencing the HSP70h gene of one Grapevine leafroll- associated virus 1 (GLRaV-1) and three Grapevine leafroll- associated virus 3 (GLRaV-3) isolates and their comparison with other isolates, found in gene bank of National Centre for Biotechnology Information (NCBI). The first aim of the present study was the examination of frequency of virus infection in thirty one Hungarian vineyards. Symptoms bearing leaf samples were collected from seventeen wine growing regions from 2007. to 2010. Among 277 samples, seventy- six gave positive results in the serological tests. These numbers were much lower, than it might be supposed on the basis of symptoms. Among the Nepovirus group four viruses could be detected, but the occurrence of Grapevine fanleaf virus, Arabis mosaic virus, Tomato black ring virus and Grapevine chrome mosaic virus were not so frequent, than it was thought earlier. The ratio of the Grapevine leafroll- associated virus 1, -2 and -3 was similar, as in case of Nepoviruses. High infection of Grapevine fleck virus was detected. This virus was mostly present in the North-East part of Hungary and in the Middle-West part of Transdanubian region. Complex infections were found in fifteen samples. These results indicate that other pathogens can also induce similar symptoms, like phytoplasmas, other viruses or deficient of nutrition and disorders of plant metabolism. The second aim was to characterize one GLRaV-1 and three GLRaV-3 isolates from the earlier collected and serological positive samples by molecular ways. Five hundred bp fragments were encompassed and purified in case of both viruses 70 kDa heat shock homologue protein (HSP70h) genes. The primer pairs were designed on the bases of nucleic sequence of isolate GLRaV-3 NY1 (Gene Bank accession number AF037268) and GLRaV-1 according the Gene Bank accession number AF 195822. The molecular data were run in a phylogenetic analysis in which the HSP70h genes of a large number of isolates from elsewhere in the world. The phylogenetic trees showed that the four Hungarian isolates 2.2, 3.5 and 4.2 isolates could be inserted into the earlier classified five
10
groups of foreign GLRaV-3 isolates, into the group Nr. 2., but the isolate 1.4 belonged to the group Nr. 4. The GLRaV-1 6.4.1 isolate could be classified into the earlier created group “E”. These sequence data of Hungarian Grapevine leafroll-associated virus isolates have been registered in the Gene Bank, under accession numbers of HE794021, HE794022, HE794023, HE794024 and HE794025.
11
Zusammenfassung Das Vorkommnis der Rebenviren in Ungarn und molekulare Untersuchungen einiger ungarischer Grapevine leafroll- associated virus 1 und 3 Isolaten
Die Dissertation beschäftigt sich mit der Vorstellung des neuen Systems der Viren und Viruskrankheiten der Rebe in Ungarn. Weitere Zielsetzung war die molekulare Charakteristik eines Abschnittes des Genes HSP70h einer Grapevine leafroll- associated virus 1 (GLRaV-1) und vier Grapevine leafroll- associated virus 3 (GLRaV-3) aus Ungarn, sowie die Bestimmung der Aminosäurenreihenfolge und der Vergleich mit ausländischen Isolationen. Zweihundertsiebenundsiebzig Blattmuster wurden zwischen 2007 und 2010 gesammelt, die nach Fachliteratur symptomatisch vorkommen haben. Diese Muster stammen von dreißig Weintraubenplantagen des siebzehn Weingebietes. Die Viren wurden serologisch, mit der ELISA Methode untersucht. Nach den Ergebnissen ist festzustellen, dass nur in sechsundsiebzig Mustern Viren gefunden wurden und damit weniger Virusinfektion als vermutet, verglichen mit den Symptomen. Die früher bedeutenden Nepoviren, sowie Grapevine fanleaf virus, Arabis mosaic virus, Tomato blackring virus und Grapevine chrome mosaic virus, sind einzeln im Verhältnis weniger als früher, aber zusammen sind diese vier Viren soviel wie die GLRaV1-3 serologische Gruppe. Großzügige Grapevine fleck virus Infektionen konnten auch in Erfahrung gebracht werden. Dieser Virus ist konzentriert auf dem nordöstlichen Teil des Landes und im mittelwestlichen Transdanubien gefunden worden. Im Fall von fünfzehn Mustern sind gleich zwei Viren gleichzeitig anwesend. Nach den Ergebnissen zu urteilen, können die Virusinfektion ähnliche Symptome anderer Krankheitserreger, wie z.B. Phytoplasmen, anderer Viren, eventuell Stoffwechselstörungen oder Nährstoffmangel verursachen. Der andere Teil der Arbeit hat molekulare mit Polymerasenkettenreaktion Methode einer gesammelten GLRaV-1 und vier GLRaV-3 Isolationen gebildet. Ein 500 bp langer Genabschnitt der beiden Viren konnte hervorgehoben und vermehrt werden. Primere haben zu der Untersuchung nach bei GLRaV-1 unter der Datenbank Registernummer AF195822 Sequenz, bei GLRaV-3 unter Nummer AF037268 geplant werden. Die Sequenzen sind danach
12
mit der Datenbank NCBI verglichen und ausländische Isolationen sowie phylogenetische Bäume konstruiert worden. Im Fall der GLRaV-3 Isolate konnten die ungarischen Daten in die früher in fünf aufgeteilten Gruppen angepasst werden. Die Isolaten 3.5, 2.2 und 4.2 gehen in die zweite Gruppe, aber die Isolate CSE.1.4 wurde der vierten Gruppe zugeordnet. Nach dem Ergebnis und der phylogenetischen Analyse nach zu urteilen, gehört die GLRaV-1 und die 6.4.1 Isolation in die sogenannten Gruppe „E“. Diese Sequenzdaten von Ungarn werden vorerst in der internationalen Datenbank unter Registernummern HE794021, HE794022, HE794023, HE794024 und HE794025 eingegeben.
13
1. Bevezetés és célkitőzés A vírusmentes szılı szaporítóanyag használata alapvetıen fontos tényezı a megfelelı termésmennyiség és minıség elérése érdekében. A vírusbetegségek gazdasági következményei: a fokozott tıkeleromlás és elhalás, a hozamok csökkenése és a minıség romlása, a tıkék produktív idıszakának megrövidülése, az oltványkészítés eredményességének csökkenése, a szaporítóanyag gyökeresedı képességének romlása, a beteg tıkék környezeti tényezıkkel szembeni ellenálló képességének csökkenése (Lehoczky, 1965). Az elmúlt két évtizedben több vírusbetegség leírására és a kórokozók hagyományos virológiai módszerekkel történt azonosítására is sor került. A kórokozók rendszertani megítélésében történt változások ugyanakkor számos félreértésre is alapot adtak. Célszerő volt ezért a hazai eredményeket egységes rendszerbe foglalni és megemlíteni azokat a kórokozókat is, amelyek rövid idın belül megjelenhetnek Magyarországon. Az utóbbi 50 évben jelentıs eredmények születtek a szılıvírusok szabadföldi körülmények között történı kutatásában. Ennek alapján azonosították a kórokozókat és alakították ki a szaporítóanyagok vírusfertızöttségét ellenırzı programot. Hazánkban ez idáig a szılırıl 15 vírusbetegséget írtak le és rendeltek hozzá kórokozót (Lázár, 1996). A vizsgálatokat hagyományosnak tekinthetı lágyszárú és fás szárú teszteléssel végezték, valamint Lehoczky János által elıállított antiszérumok segítségével szerológiai módszert is alkalmaztak. Napjainkban az országok közötti kereskedelem és szaporítóanyag csere miatt fennáll a veszélye Magyarországon eddig még le nem írt, új kórokozók behurcolásának. Indokolttá vált az elızetes felmérések adatai alapján vírusizolátumok győjtése, génbankban való elhelyezése a további molekuláris vizsgálatok elvégzéséhez. A kimutatási módszerek fejlıdésével elıtérbe kerültek a molekuláris módszerek. Elınyük, hogy kisebb víruskoncentrációnál is megbízhatóan alkalmazhatók, olyan vírusok kimutatására is használhatók, amelyek esetében nem áll rendelkezésre antiszérum. Segítségükkel,
sokkal
pontosabb
képet
kaphatunk
a
vírusgenom
szerkezetérıl,
tulajdonságairól, a kódolt fehérjék szerepérıl, továbbá információkat nyerhetünk arról is, hogy egyes vírusok mely más hazai, esetleg más országban megtalált és molekulárisan jellemzett izolátumokhoz hasonlítanak, illetve állnak rokonságban vagy honnan származnak. E módszerek hátránya, hogy a szerológiai és más hagyományos módszereknél drágábbak, így tömeges ellenırzésre nem alkalmasak (Weber és mtsai, 2002).
14
A külföldön már használatos molekuláris módszerek adatai alapján, a korábban ismert nevezéktani rendszer is javításra szorul. Ezek alapján a szimptomatológiai alapú, külön elnevezéső vírusbetegség- korokozó rendszerezést meg kellett újítani. A dolgozat elkészítésének célkitőzései: •
A hazánkban leírt szılıpatogén vírusok eddig használt rendszerezésének aktualizálása
•
A vírusbetegségek és kórokozóik azonosítása
•
Magyarország szılıterületein virológiai felmérés végzése
•
A begyőjtött vírusizolátumok molekuláris jellemzésének megindítása és génbankba történı elhelyezése.
15
2. Irodalmi áttekintés 2.1. A magyarországi szılıvirológiai kutatások történeti áttekintése A szılıt károsító vírusok elıfordulásának vizsgálatát Dr. Lehoczky János és munkatársai kezdték meg az 1960-as években Magyarországon a kecskeméti a Szılészeti és Borászati Kutatóintézetben. Külföldi kutatóintézetekbıl megkezdıdött a virológiai szőrésben nemzetközileg használt indikátorfajták behozatala és felszaporítása a Kecskeméti Szılészeti és Borászati Kutatóintézet miklóstelepi, majd katonatelepi állomásán (Lehoczky és mtsai, 1992). A vírusfertızött egyedek fenntartására ugyancsak Kecskeméten létrehozták a Patológiai Kertet, olyan vírus génbankot, amely a vírustesztelési munka alapját képezte a külföldi kutatóintézetekbıl behozott és felszaporított fás szárú indikátorokkal. A szılıfajták rendszeres virológiai szőrése 1972- ben kezdıdött. A ma is használatos rendszer három szőrési módszeren alapul: tüneti vizsgálat, biológiai tesztelés és szerológiai ellenırzés (Lázár, 1998; Lázár és mtsai, 2002). Az elsı évben a vírustüneteket nem mutató tıkéket kell kiválasztani és megjelölni. Ezeket a tıkéket egy vegetációs periódus alatt kétszer (virágzás körül és szeptember második felében) kell vizsgálni. Az elsı szelekció idejében mintát kell győjteni ELISA tesztelés elvégzéséhez. 1985 óta többször módosult az ELISA teszteléssel vizsgálandó vírusok köre, a jelenleg érvényben lévı szılı szaporítóanyagok forgalomba hozataláról szóló 87/2006. (XII. 28.) FVM rendelet szerint a következı jelentıs szılıpatogén vírusokra kötelezı a rendszeres tesztelés: szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV), arabis mozaik vírus (Arabis mosaic virus, ArMV), a szılı foltosodás vírus (Grapevine fleck virus, GFkV), szılı levélsodródás vírus 1 és 3 (Grapevine leafroll-associated virus 1, 3, GLRaV 1, 3), szılı A, B és D vírusok (Grapevine virus A, B, D, GVA, GVB, GVD). Novemberben azokat a vesszıket kell begyőjteni további vizsgálatok elvégzéséhez, amelyek a felméréskor tünetmentesnek bizonyultak és a szerológiai tesztelés sem mutatta ki kórokozó jelenlétét. A mintákat célszerő mőanyag zacskókba győjteni és 2-3 o
C-on tárolni. A második év tavaszán, az elıbbi módon teleltetett vesszıket 8 indikátorfajta
segítségével, szövet-oltással (chip-transmission) kell vizsgálni szabadföldön: ezek az ’FS-4’ (’Siegfriedrebe’), Vitis rupestris cv. St. George, Vitis vinifera cv. Pinot noir és Chardonnay, V. berlandieri x V. riparia Teleki Kober 5 BB, ’Couderc 1613’ x V. berlandieri LN 33, V. riparia cv. Gloire de Montpellier, V. rupestris x V. berlandieri 110 Richter.
16
A szabadföldi tesztelı-iskolába kitelepített dugványokon jelentkezı tüneteket júniusban és szeptemberben kell vizsgálni. A második év tavaszán az átteleltetett vesszıket esetenként biológiai teszteléssel, mechanikai átvitellel, lágyszárú növényeken is tesztelni kell. Erre a célra használhatók a Chenopodium quinoa, C. amaraticolor, Cucumis sativus “Delicates”, Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii, N. tabacum cv. “Samsun”, N. glutinosa, Phaseolus vulgaris cv. “Beautiful” fajok illetve fajták. A harmadik évben is két alkalommal kell elvégezni az értékelést. A vizsgálat végére a kijelölt, és minden indikátoron, minden esetben negatív eredményt adó növények vírusmentesnek tekinthetık (Baracsi, 1999, Lázár és mtsai, 2002). A szerológiai vizsgálat megbízható eredményt ad, hátránya, hogy nem minden vírus kimutatására alkalmas. A rupestris faszöveti barázdáltság vírus (Rupestris stem pitting-associated virus, RSPaV) fertızöttség kimutatása ELISA módszerrel jelenleg még nem, PCR vizsgálattal azonban kimutatható. Ezért nagyon fontos a három módszer (fásszárú, lágyszárú teszt és szerológia) együttes alkalmazása. Az újabb eredmények szerint a legérzékenyebb módszer mégis a molekuláris genetikai vizsgálatok használata, de az elızı módszerekhez képest drágább, így ennek használata csak kivételes esetekben javasolt (Weber és mtsai, 2002). Azokhoz a vírusokhoz, amelyek elıször kerülnek meghatározásra, a leírásához szükség van elektronmikroszkópos felvételek készítésére is. A vírusok növénybe jutása passzív folyamat, így szükséges annak ismerete, hogy milyen úton kerülhet a kórokozó a növénnyel kapcsolatba. Ez lehet állatvektorokkal vagy állatvektor
nélküli
egyéb
módokon,
például
oltással,
mechanikailag,
vegetatív
szaporítószervekkel, esetleg maggal, pollennel (Pribék, 1999).
2.2. A Magyarországon elıforduló szılı vírusbetegségek és kórokozóinak áttekintése Hazánkban ez idáig a szılırıl 15 vírusbetegséget írtak le (Lázár, 1996). Ezek a tünetek alapján alkotott hét csoportba sorolhatók: 1) szılı korai vírusos leromlás (grapevine degeneration), 2) levélsodródás (grapevine leafroll), 3) látens foltosság (grapevine fleck), 4) vonalas és győrős mintázottság (grapevine yellow mottle) 5) vonalas mintázottság (grapevine line pattern) és 6) faszöveti barázdáltság (grapevine rugose wood). A hetedik csoportba azokat a vírusszerő betegségeket soroljuk, amelyek kórokozói feltehetıen vírusos eredetőek, de pontosan még nem kerültek meghatározásra. A víruscsoportok és tagjainak általános
17
genomjellemzéséhez használt ábrák a Swiss Institute of Bioinformatics Expert Protein Analysis System adatbázisában (http://expasy.org/viralzone/) található ábrák és szakirodalmi adatok alapján készültek.
2.2.1. Szılı korai vírusos leromlás A szılı korai vírusos leromlását, mint általános elnevezést több víruskórokozóra vezetik vissza. A Nepovirus nemzetségbe tartozó vírusok, nevezetesen a szılı fertızı leromlás vírusa (Grapevine fanleaf virus), a szılı tıkesatnyulás A és T vírusbetegséget okozó Arabis mosaic virus (ArMV) és Tomato black ring virus (TBRV), a szılı bolgár látens vírus (Grapevine bulgarian latent virus), és a szılı króm mozaik vírus (Grapevine chrome mosaic virus) okozzák. A nemzetség a nevét a Nematode transmitted- polihedral (NEPO) rövidítésbıl kapta, azaz fonalféreggel terjedı izometrikus vírusok csoportja (Horváth, 1972). Világszerte elterjedt kórokozók is vannak közöttük. Egyes vírusok erıs tüneteket idéznek elı, mások enyhébbeket. Akár 80%-os termésveszteséget is okozhatnak (Martelli, 1993; Pompe-Novak és mtsai, 2007). Jóllehet némelyik külön-külön is nagyobb kárt képes okozni helyenként, viszont nem túl nagy területen terjedt el, így kevésbé van gazdasági jelentısége. Leggyakrabban a szılı ültetvény korai pusztulását okozzák (Bovey és mtsai, 1980). A szılı vírusos leromlását elıször 1865-ben figyelte meg és írta le Cazalis és Allut Franciaországban (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). A kórokozó és két törzse által okozott tünetek hazai megjelenésérıl, pedig Sárospataki (1964) és Lehoczky (1965) számoltak be. A leromlást okozó vírusok elkülönítése késıbb következett be, ezért, ezek a vírusok külön is részletezésre kerülnek. A nepovírusok izometrikus virionjai 25-30 nm átmérıjőek osztott, kétkomponensőek - B és M -, pozitív egyszálú RNS genommal rendelkezık. Az elıbbi mérete 7,5 kb, az utóbbié 3,9 kb. Az 5’ végeiken VPg vírusgenomhoz kötött fehérjét tartalmaznak, 3’ végük poliadenilált (AndretLink és mtsai, 2004a). Az RNS1-en (B komponens) az elsı nyílt leolvasási szakasz a proteáz kofaktor (P1A), a következı a helikáz (HEL) enzimet, a vírusgenomhoz kötött fehérjét (VPg), a proteáz (Pro) és az RNS függı RNS polimerázt (POL) kódolja (1. ábra). A 2. RNS szál (M komponens) az ún. homing protein- „önvezérlésért” felelıs fehérjét (P2A), melynek pontos funkciója nem ismert, a mozgási fehérjét (MP) és a köpenyfehérjét (CP) kódolja (Vigne és mtsai, 2008).
18
Rövidítések:5’ VPg - vírusgenomhoz kötött fehérje, a genom 5’ végén, P1A - proteináz kofaktor, HEL - helikáz enzim, Pro - proteáz enzim, POL - RNS függı RNS polimeráz enzim, P2A - ún. homing protein - önvezérlésért felelıs fehérje, MP - mozgási fehérje, CP - köpenyfehérje: 3’polyA - a genom poliadeninlált 3’ vége, RNS-1 - a vírusgenom 1. komponense, RNS-2 - a vírusgenom 2. komponense
1. ábra. A Nepovirus nemzetség genomszervezıdése
A nepovírusok jelenleg rendszertanilag a Picornavirales rend, Secoviridae család Comovirinae alcsalád, Nepovirus nemzetségének tagjai (Carstens, 2010). A legtöbbjük fonálféreg vektora ismert, A szılı gyökerének szívogatása által veszik fel a virionokat és adják tovább. A fonálférgek a kórokozót még néhány hónapig hordozhatják, bár ezen az úton nagy távolságokra nem terjed.
2.2.1.1. Grapevine fanleaf virus - Szılı fertızı leromlás vírus (GFLV) A szılı fertızı leromlás kórokozója a szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV). Két törzsét különböztetik meg tünettanilag: a sárga mozaik törzs (Grapevine fanleaf virus - yellow mosaic strain, GFLV-YM) és az érmenti szalagosodás törzs (Grapevine fanleaf virus - vein banding strain, GFLV-VB) (Lázár, 1996). A GFLV-ról és a törzseirıl szóló elsı áttekintéseket, Vuittenez, Dias és Taylor írták le (Frazier, 1970). A sárga mozaik törzzsel fertızött tıkék krómsárga elszínezıdést mutatnak, ami már kora tavasszal megjelenik. Az érmenti és érközi területeken kiterjedt foltok jelennek meg, vagy teljesen elsárgul a levélzet (Martelli, 1993). Az érmenti szalagosodás törzsre a sárga foltok, illetve az ér mentén megjelenı, és az ér mellett végigfutó, hosszanti, sárga, szalagszerő lefutású, klorotikus mintázat jellemzı (Goheen és Hewitt, 1962). Szychowski és munkatársainak (1995) eredményei szerint az érmenti szalagosodás tünet a szılı páfránylevelőség vírus (GFLV) és egy viroid, a Szılı sárga foltosság viroid-1 (Grapevine yellow speckle viroid-1, GYSVd-1) komplex fertızésének következménye. Különösen nyáron és ısszel látszanak jól a tünetek. Ez a kórokozó a világ minden szılıtermesztı területén megjelent. A szılı egyik legelterjedtebb vírusa, ami az összes fajtát képes fertızni. A vírusfertızés hatással van a szılı
19
produktivitására és a tıke élettartamára (Andret-Link és mtsai, 2004b). A tünetek rendkívül változatosak és egyszerre több törzse is jelen lehet egy növényben. A fertızés következtében a tıke vagy nagyon gyorsan elpusztul, vagy néhány éven belül leromlik. A vesszıkön megjelenı tünetek a következık: rövid ízközök, villás elágazás, szalagos, ellaposodott hajtás és fürt. A levélerek futása páfránylevélre emlékeztetı, a levéllemez aszimmetrikus, erısen fogazott a levélszél és gyakori a klorotikus foltok megjelenése. A sárga mozaik és az érmenti szalagosodás törzs csak enyhe levél deformációt okoz, amelyeken világossárga elszínezıdés látható. Ha a sárgulás csak az erek mentén jelentkezik, akkor érmenti szalagosodásról beszélünk. A vírusfertızött leveleken klorotikus győrők, pontok, foltok jelennek meg. A fertızött tıkéken a rügyek kisebbek és számuk is kevesebb, mint az egészséges növényeken. A bogyók gyakran kiszáradnak, összeaszalódnak, kicsik maradnak, vagy magtalanok (Sárospataki, 1964). A GFLV elsısorban Xiphinema index és X. italie fonalférgekkel terjed nem cirkulatív, szemiperzisztens módon (Demangeat és mtsai, 2005). Ezen kívül ismert szaporítóanyaggal, szövetoltással (Hewitt és mtsai, 1962) és maggal (Lázár és mtsai, 1990) történı átvitele is. Fás szárú indikátorai: Vitis rupestris cv. St. George, Vitis vinifera cv. Chardonnay, ’FS 4’ (’Siegfriedrebe’) (Kölber és mtsai, 1981). Lágyszárú tesztnövénye elsısorban
Chenopodium
quinoa,
amelyen
szisztemikus
klorotikus
pontokat,
levéldeformációt, ritkán lokális léziókat idéz elı (Bashir, 2007).
2.2.1.2. Arabis mosaic virus - Arabis mozaik vírus (ArMV) Az Arabis mozaik vírus (Arabis mosaic virus, ArMV) az A típusú tıkesatnyulás betegség kórokozója szerológiailag a GFLV-sal rokon. A volt Jugoszlávia területén találták meg elıször (Panjan és Saric 1963). Hazánkban Martelli és Lehoczky (1968) írták le szılırıl. A kórokozó által elıidézett tünetek nagyon hasonlóak a fertızı leromláshoz, általában együtt fertıznek meg egy-egy tıkét (Wetzel és mtsai, 2004). Az ArMV-nak nagyon széles a gazdanövényköre, ide tartoznak különbözı gyomnövények is (Jenser és mtsai, 1979). Szintén fonálférgek terjesztik, elsısorban a Xiphinema diversicaudatum, X. coxi, Longidorus caespiticola, és ezen kívül ismert az oltással, fertızött szaporítóanyaggal és a maggal történı terjedése is. Legfontosabb tesztnövénye a Nicotiana glutinosa, amelyen feltőnı klorotikus győrőzöttséget és pettyeket okoz. Fás szárú indikátorai: Vitis rupestris cv. St. George, Vitis vinifera cv. Pinot noir, ’FS 4’ (’Siegfriedrebe’) (Baracsi, 1999).
20
2.2.1.3. Grapevine chrome mosaic virus - Szılı krómmozaik vírus (GCMV) A szılı krómmozaik betegséget okozó vírust, a szılı krómmozaik vírust (Grapevine chrome mosaic virus, GCMV) hazánkban a Balaton-felvidék egyik ültetvényében találták meg elıször a világon (Martelli és mtsai 1966; Lehoczky és mtsai, 1984b). A betegség tünetei: a levelek krómsárgára színezıdése, illetve a vegetáció során történı kifehéredése, rövid ízközök, kettıs nóduszok kialakulása. Néhány izolátuma a levélen deformációkat és klorotikus foltokat is okozott. Ismertek olyan törzsek is, amelyek látható tüneteket nem idéznek elı. A vírus fonálféreg vektora egyelıre nem ismert, de talajban terjedését feltételezik. Ezen kívül fertızött szaporítóanyaggal és oltással is átvihetı. Lágyszárú tesztnövényei: Chenopodium quinoa, Nicotiana occidentalis, N. clevelandii és a Cucumis sativus. Fás indikátorai: Vitis vinifera cv. Chardonnay, V. vinifera cv. Pinot noir, V. vinifera cv. Jubileum 75 és az ’FS 4’ (Le Gall és mtsai, 1997).
2.2.1.4. Tomato black ring virus - Paradicsom fekete győrős vírus (TBRV) A paradicsom fekete győrős vírust (Tomato black ring virus, TBRV) elıször Stellmach és Bercks (1963) írták le szılırıl. Hazánkban a kórokozót 1981-ben izolálták elıször (Lehoczky és Burgyán, 1986). Az általa elıidézett betegség a tıkesatnyulás T típusa. A fertızés a tıkék növekedését gátolja, az idısebb leveleken apró foltokat és a levélszélek sárgulását okozza. A frissen fertızött növények levelén klorotikus foltok és győrők is kialakulhatnak. A vírus Longidorus attenuatus fonálféreg vektoron kívül oltással és maggal is terjed (Joñczyk és mtsai, 2004). Lágyszárú tesztnövénye a Nicotiana tabacum cv. ’Samsun’ és a Chenopodium quinoa. Vitis vinifera cv. Chardonnay, Vitis vinifera cv. Pinot noir, Vitis rupestris cv. St. George és ’FS 4’ fás szárú indikátorfajták segítségével vizsgálható (Baracsi, 1999).
2.2.1.5. Grapevine Bulgarian latent virus - Szılı bolgár látens vírus (GBLV) A szılı bolgár látens foltosságot okozó szılı bolgár látens vírust (Grapevine Bulgarian latent virus, GBLV) Martelli és munkatársai (1977) írták le Bulgáriában, és
21
jellemezték elıször, hazánkban Pocsai (1981) találta meg. A vírus a szılı fajtákat általában látensen fertızi. A fertızésére utaló tünetek lehetnek a kései rügypattanás, a vesszık megnyúlása, egyenetlen fürtképzés, növekedésgátlás, illetve GFLV fertızéséhez hasonló tünetek kialakulása. Vektora még nem ismert, de fertızött szaporítóanyaggal és maggal képes terjedni
(Martelli,
1993).
Lágyszárú
tesztnövénye
Chenopodium
quinoa,
fásszárú
tesztnövénye az ‘FS-4’, Vitis vinifera cv. Pinot noir és a Vitis riparia cv. Gloire de Montpellier (Baracsi, 1999). Már korábban is a Nepovirus nemzetség feltételezett tagjaként tartották számon, Elbeaino és munkatársainak (2011) munkája alapján ma már ismerjük a vírus teljes szekvenciáját.
2.2.2. Levélsodródás tünetcsoport A szılı levélsodródás tüneteit részben a szılı levélsodródás vírus csoport tagjai, részben a viroid és fitoplazma fertızések okozzák. Az utóbbi két kórokozó csoport az értekezés tárgyát nem képezi.
A szılı levélsodródását több, egymáshoz hasonló tulajdonságú vírus külön-külön, vagy együttesen is elıidézheti. Ez idáig külföldi szakirodalmak 9, szerológiailag különbözı csoportot írtak le, amelyek összefüggésben állnak a betegséggel (Meng és mtsai, 2005). Ezek a Grapevine leafroll-associated virus 1-9 típusai. A jelenleg érvényben lévı International Commitee of Virus Taxonomy (továbbiakban ICTV) által közzétett hivatalos rendszertani besorolás és lista szerint 4 különálló víruscsoport maradt meg. A kórokozók a Closteroviridae család tagjai, ezen belül új vírusnemzetség jelent meg a Closterovirus nemzetség mellett, melybe jelenleg a Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) tartozik-, ez az Ampelovirus nemzetség. Tagjai a Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV 3) és a Grapevine leafroll-associated virus 5 (GLRaV-5) (Komínek és mtsai, 2005). Egyes felmérések szerint a vírusbetegség 20-40%-os (Routh és mtsai, 1998), mások szerint, akár 62%-os termésveszteséget is okozhat (Walter és Martelli, 1997). A mennyiségbeli romláson túl Brar és mtsai (2008), Lee és mtsai (2009), valamint Lee és Martin (2009, 2010) vizsgálták Vitis vinifera ’Crimson Seedless’ és ’Pinot noir’ fajtáknál a bogyók beltartalmi értékének minıségbeli változásait is, elsısorban a GLRaV-3 fertızés hatására. Méréseik alapján, a vírusfertızött tıkékrıl származó bogyóknál az antocianin, a szerves savak
22
közül az almasav és egyes aminosavak (valin, metionin) és a fenoltartalom mennyiségének csökkenését figyelték meg az egészséges kontrollhoz képest. Az alany és nemes kombinációk esetében ezek az eltérések nagy változatosságot mutatnak. Egyértelmően nem lehet számszerősíteni ezen összetevık csökkenését, mert egyéb befolyásoló tényezık pl. tıkék kora, a vírusfertızöttség idıtartama hatására is számítani kell. A Closteroviridae család tagjaira jellemzı a pozitív egyszálú RNS genom, és a 12 nm átmérıjő, 1800-2200 nm hosszú, flexibilis, fonál alakú virion (Regenmortel és mtsai, 2004). A betegség Olaszországban tapasztalt tünetére elıször 1906-ban Sannino tesz említést (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). Magyarországon Lehoczky és munkatársai (1969) figyeltek fel rá. A GLRaV -1, -2, -3 és -4 víruscsoportjainak elıfordulását nálunk Lehoczky kezdte el vizsgálni, jelenlétüket Lázár és munkatársai (1994) igazolták. Magyarországról származó mintákból is kimutattak szerológiai vizsgálattal egy azidáig ismeretlen vírust, amely hasonlóságot mutatott az okozott tünetek tekintetében és szerológiai tulajdonságaiban a levélsodródást okozó vírusokkal. Western blot vizsgálat eredményeként Choueiri és mtsai (1996) szerint ez a vírus feltételezhetıen GLRaV-7. További adatok errıl a vírusról és hazai elterjedésérıl nem állnak rendelkezésre. A ma érvényes ICTV által közzétett adatbázisban már a GLRaV-4, -6 és -7 nem szerepelnek (Carstens, 2010). A betegségre jellemzı a bogyók alacsony cukortartalma, késıi bogyóérés, rendellenesen megvastagodó és lefelé sodródó, és a vörösbort adó szılıfajtáknál vörösre színezıdı levéllemez (Little és Rezaian, 2006). A tünetek a vegetációs idıszak vége felé láthatók a legjobban (Meng és mtsai, 2005).
23
Rövidítések: 5’- a genom 5’ vége, ORF1a - elsı nyílt leolvasási szakasz a része, ORF1b - az elsı nyílt leolvasási szakasz b része, ORF2 - második nyílt leolvasási szakasz, HSP70h - 70 kDa nagyságú hısokk fehérje homológ, HSP90h - 55 kDa nagyságú HSP90 hısokk fehérje, CP - köpenyfehérje, CPm1 - köpenyfehérje egy részének 1.másolata, CPm2 - köpenyfehérje egy részének 2.másolata, ORF8 és ORF9 - nyolcadik és kilencedik, ismeretlen funkciójú fehérjéket kódoló nyílt leolvasási szakaszok, 3’ - vírusgenom 3’vége
2a ábra
Rövidítések: 5’- a genom 5’ vége, ORF1a - elsı nyílt leolvasási szakasz a része, ORF1b - az elsı nyílt leolvasási szakasz b része, HSP70h - 70 kDa nagyságú hısokk fehérje homológ, p55 - 55 kDa nagyságú HSP90h hısokk fehérje, CP - köpenyfehérje, CPm - köpenyfehérje egy részének másolata, p6, p5, p21, p19, p20, p4 és p7 ismeretlen funkciójú fehérjék, 3’ - vírusgenom 3’vége
2b ábra
2. ábra. Az Ampelovirus nemzetség tagjainak, a (2a) Szılı levélsodródás vírus 1 (Grapevine leafroll- associated virus 1, GLRaV-1) és a (2b) Szılı levélsodródás vírus 3 (Grapevine leafrollassociated virus 3, GLRaV-3) vírusok genom szerkezete
2.2.2.1. Grapevine leafroll-associated virus 1 - Szılı levélsodródás vírus-1 (GLRaV-1) A szılı levélsodródás 1-es típusú vírusnak (Grapevine leafroll-associated virus 1, GLRaV-1) renszertani helye a Closteroviridae család Ampelovirus nemzetsége (2a ábra). 17,6 kb nagyságú genommal rendelkezik a 3’ vég polyA struktúrát, míg az 5’ vég feltehetıleg metilált ún. cap struktúrát tartalmaz. Little és munkatársainak (2001) közleménye alapján 10 nyílt leolvasási szakaszát (Open reading frame, ORF) ismerjük, amelyek több fehérjét kódolnak. Az ORF1 replikációhoz szükséges enzimeket kódoló szakasz két részre osztható. Az ORF1a kódolja a Papain-szerő proteázt, metiltranszferázt és a helikázt. Az ORF1b az RNS függı RNS polimeráz domént tartalmazza, az ORF2-es egy 7 kDa nagyságú ismeretlen funkciójú hidrofób fehérjét kódol, Fazeli és Rezaian (2000) szerint a vírusgenom 3’ vég polyA struktúrájának kialakításában játszik szerepet. Az ORF3 a HSP70h fehérje, míg az ORF4 a HSP90–es 55 kDa nagyságú fehérje doménje. Az ORF5 kódolja a CP-t, míg a
24
következı két szakasz két eltérı köpenyfehérje (CP) másolatot kódol. A többi nyílt leolvasási szakasz (ORF8, ORF9) által kódolt fehérjék funkciója ismeretlen. A kórokozó oltással, fertızött szaporítóanyaggal és közönséges teknıs pajzstetvekkel (Parthenolecanium corni), valamint egyéb, viaszos pajzstető fajok, Heliococcus bohemicus, Phenococcus aceris közvetítésével is terjedhet (Komínek és mtsai, 2005). Magyarországon az utóbbi két faj fordul elı leginkább a szılıben (Jakab és Szendrey, 1989). A vírust terjesztheti még a Planococcus citri is, nem propagatív módon (Cid és mtsai, 2007). Egyéb rovarátvitelt is megfigyeltek már, például a Planococcus ficus, Pseudococcus longispinosus, és más Pseudococcus fajok esetében is (Cabaleiro és Segura, 2006). 2.2.2.2. Grapevine leafroll-associated virus 2 - Szılı levélsodródás vírus-2 (GLRaV-2) A szılı levélsodródás 2-es típusú vírusa (Grapevine leafroll associated-virus 2, GLRaV-2) a Closteroviridae család Closterovirus nemzetség tagja (3. ábra). Genomja nyolc nyílt leolvasási szakaszt kódol. Az ORF1 ab, az Ampelovirus nemzetségéhez hasonlóan a replikációhoz szükséges polipeptidet kódol. Az ORF1a metiltranszferázt, proteázt, helikáz enzimet, az ORF1b egy RNS függı RNS polimeráz enzimet kódol. Az ORF3 HSP70 homológ fehérjét kódol. Az 5-ös és 6-os nyílt leolvasási szakasz egy kisebb és egy nagyobb molekulatömegő köpenyfehérje (CP, CPm) leolvasási helyei. AZ ORF2, 4, 7 és 8 ismeretlen funkciójú, (p6) 25 kDa, (p64) 63 kDa, (p20) 19 és (p21) 24 kDa nagyságú ismeretlen funkciójú fehérjék doménjei (Meng et al, 2005). Természetes vektora nem ismert, a terjedését vegetatív szaporításkor és oltáskor figyelték meg. Lágyszárú tesztnövénye a Nicotiana benthamiana és a N. clevelandii. Fásszárú tesztelésnél Vitis vinifera fajták alkalmazhatók, különösen a ’Pinot noir’, ’Cabernet franc’ és a ’Merlot’ (Beuve és mtsai, 2007; Martelli, 1993). Vizsgálatok folynak a vírus pontos meghatározására. Masri és munkatársai (2006) publikációjában egy jelenleg a Vitivirus nemzetséghez tartozó Szılı C vírusaként ismert (Grapevine virus C, GVC) kórokozóval való azonosságát feltételezi. A fıleg Vitis vinifera ’Red Globe’ és ’Pinot noir’ fajtánál megfigyelt oltáskor fellépı inkompatibilítás és hirtelen fellépı tıkepusztulás tünetekért ugyancsak a GLRaV-2 vírust, és annak két törzsét (GLRaV-2 RG, GLRaV-2 PN) nevezi meg (Meng és mtsai, 2005).
25
Rövidítések: 5’ - 5’ vég, ORF1a - elsı nyílt leolvasási szakasz a része, ORF1b - az elsı nyílt leolvasási szakasz b része, HSP70h - 70 kDa nagyságú hısokk fehérje homológ, CP - köpenyfehérje, CPm - köpenyfehérje egy részének másolata, p6, p64, p21, és p20 - ismeretlen funkciójú fehérjék, 3’ - vírusgenom 3’vége
3. ábra. Closterovirus nemzetség genom felépítése
2.2.2.3. Grapevine leafroll-associated virus 3 - Szılı levélsodródás vírus-3 (GLRaV-3) A kórokozó az Ampelovirus nemzetség tagja, virionja 19,5 kb hosszúságú flexibilis (Kominek és mtsai, 2005). Genomja 12 nyílt leolvasási szakaszt tartalmaz (2b ábra). Az ORF1a kódolja a Papain-szerő proteázt, metiltranszferázt és a helikázt. Az ORF1b az RNS függı RNS polimeráz domént tartalmazza, az ORF2-es és 3-as egy 6 és egy 5 kDa nagyságú ismeretlen funkciójú fehérjét kódol, az ORF4 a HSP70h fehérje, míg az ORF5 a HSP90h-t, amely egy 55 kDa nagyságú fehérje doménje. Az ORF6 és 7 két különbözı tömegő CP-t kódol az utóbbi a kisebb molekulatömegő, ez az eredeti CP egy részének másolata. A nagyobb molekulatömegő köpenyfehérje a viriont burkolja, a kisebb valószínősíthetıen a virion 5’ végét. A többi nyílt leolvasási szakasz által irányított p21, p20, p20 p4 és p7 fehérjék funkciója mindezidáig ismeretlen (Maree és mtsai, 2010). GLRaV-3 vektora Dél-Afrikában és Olaszországban a Planococcus ficus (Engelbrecht és Kasdorf, 1990), Izraelben a Pseudococcus longispinosus faj, és Kaliforniában a Ps. affinis (Petersen és Charles, 1997). A szılı levélsodródás 1-es és 3-as vírusok átvitelével kapcsolatba hoztak teknıs pajzstető (Pulvinaria vitis, Neopulvinaria innumerabilis) fajokat (Sforza és mtsai, 2003). Kozár (2005) beszámolt arról, hogy hazánkban, a szakirodalmakban a szılı levélsodródás vírusok vektoraiként ismert fajok közül Magyarországon, szabadföldön a Parthenolecanium corni, Heliococcus bohemicus, Phenacoccus aceris, Planococcus citri és Pulvinaria vitis vannak jelen, továbbá üvegházakban igazolták Pseudococcus longispinosus megjelenését is.
26
2.2.2.4. Grapevine leafroll-associated virus 4, 5, 6, 7 - Szılı levélsodródás vírus -4, -5, -6,-7 (GLRaV-4, -5, -6; -7) A szılı levélsodródás 4-es és 6-os típusú vírusának (Grapevine leafroll-associated virus 4, 6) jelenlétérıl hazánkban szerológiai vizsgálattal Lázár és munkatársai (1994 és 1995a) valamint Lázár és Bisztray (2011) számoltak be. A szılı levélsodródás 5-ös (Grapevine leafroll-associated virus 5, GLRaV-5) szintén Ps. longispinosus vektorral terjed (Golino és mtsai, 2002, Martelli és Boudon-Padieu, 2006). A vírus magyarországi jelenlétérıl nincs információ. A szılı levélsodródás 7-es típusú vírus (Grapevine leafroll-associated virus 7, GLRaV-7) jelenleg a család feltételes tagja. Magyarországról származó levélmintában (Choueiri és mtsai, 1996) kimutatták a kórokozót.
2.2.2.5. A 70 kDa nagyságú hısokk fehérje homológ (HSP70h) jellemzése A HSP70-nel homológ fehérje 70 kDa-os hısokk fehérje. A Closteroviridae az egyetlen olyan víruscsalád, amely ilyen típusú fehérjét kódol. Funkciója a sejtrıl sejtre terjedésben van elsısorban (Premyslov és mtsai, 1999). A HSP70 gént használják leginkább a Closteroviridae család tagjainál a molekuláris jellemzés kezdı lépéseként és a genetikai diverzitás meghatározásához (Kominek és mtsai, 2005). A HSP70h gén 70 kDa nagyságú hısokk fehérje, mely egy chaperon, ún. dajkafehérje. Ideiglenes, nem kovalens kötı helyet tartalmaz, ezáltal összegombolyít vagy/és szétbont más polipeptideket vagy RNS molekulákat. Transzport és oligomerizációs folyamatokban is szerepet játszik. Újraburkolja azokat a fehérjéket vagy RNS molekulákat, amelyek stresszhatásra denaturálódtak. Noha részt vesznek ezekben a folyamatokban, a chaperonok nem szerves részei ezeknek a funkcionális molekuláknak (Agranovski és mtsai, 1991; Aranda és mtsai, 1996). A HSP70h gént kódoló szekvencia adatok és ezek alapján felállított filogenetikai elemzés eredményeként GLRaV-3 esetében öt genetikai variáns csoport alakítható ki a génbankban megtalálható izolátumokból (Fuchs és mtsai, 2009, Jooste és mtsai, 2010). Négy csoport kismértékő genetikai varabilitást mutat. Ebbe a négy csoportba tartozó izolátumok a NY-1 (AF037268 génbanki azonosítószámú) Amerikai Egyesült Államok területérıl izolált vírushoz viszonyítva, több mint 90 %-os hasonlóságot mutatnak. Az ötödik csoport egyetlen izolátumot tartalmaz, mégpedig a GLRaV-3 NZ-1 (új- zélandi EF508151 azonosítójú)
27
izolátumát, amely a legnagyobb mértékő különbséget mutatja az öt csoport közül. A NY-1 izolátumhoz viszonyítva csupán 74,1%-os a hasonlóság (Maree, 2010). GLRaV-1 esetében Kominek és mtsainak (2005) munkája alapján két variánscsoport különböztethetı meg, melyekbe a csehországi, szlovák, Amerikai Egyesült Államokból való és Ausztráliából származó vírusizolátumok HSP70h gén szekvencia adatai filogenetikai elemzésének eredményeként.
2.2.3. Látens foltosság Ebbe a tünetcsoportba azok a vírusbetegségek tartoznak, amelyek a Vitis vinifera fajtákon látensek, de más módszerekkel (indikátor fajták) kimutathatók. E csoportba a hazánkban ismert vírusok közül a szılı látens foltosságát okozó szılı foltosodás vírus (Grapevine fleck virus, GFkV) tartozik.
2.2.3.1. Grapevine fleck virus - Szılı foltosodás vírus (GFkV) A kórokozó rendszertani helye a Tymovirales rend, Tymoviridae család, Maculavirus nemzetség (Abou-Ghanem-Sabanadzovic és mtsai, 2003). Az általa okozott megbetegedést elıször Kaliforniában Hewitt és munkatársai (1962) írták le. Hazánkban Lehoczky és Farkas (1981) találta meg. A Grapevine fleck virus (GFkV) virionjai izometrikusak, 30 nm átmérıjőek. A vírus genom pozitív egyszálú RNS. Az 5’ végen cap struktúrával rendelkezik, a 3’ vég poliadenilált. Az elsı nyílt leolvasási szakasz a vírusreplikációjához szükséges poliproteint kódolja, amelynek egyik része az RdRp enzim. Sabanadzovic és munkatársai (2001) szerint az ORF1 poliprotein további három fehérje doménje: a metiltranszferáz, papain szerő proteáz és a helikáz. A második nyílt leolvasási szakasz a köpenyfehérjét, a 3. és 4. pedig 1-1 prolinban gazdag, de ismeretlen funkciójú fehérjét kódolja (4. ábra).
28
Rövidítések: 5’ cap - a vírusgenom 5’ vége „cap” struktúrával, ORF1 poliprotein - vírusreplikációjához szükséges poliprotein, CP - köpenyfehérje ORF3 - hármas számú nyílt leolvasási szakasz, ORF 4 - négyes számú nyílt leolvasási szakasz, 3’ polyA- a genom 3’poliadenilált vége
4. ábra. A Maculavirus nemzetség genom szervezıdése
Kimutatása Vitis rupestris ’St. George’ fajtán lehetséges, amelyre oltással vihetı át. A Vitis vinifera fajtákon a fertızés látens, innen származik a kórokozó neve is (Schieber és mtsai, 1997). A betegség tünetei érkivilágosodás, a harmad- és negyedrendő erek közelében áttetszı foltok megjelenése, amelyek akkor láthatók a legjobban, ha a fény felé tartjuk ıket. Az ilyen intenzíven foltosodó levelek ráncosodnak, torzulnak, és felfelé pöndörödnek. A vírus a floémben lokalizálódik, mechanikailag nem terjed. A betegséget kísérletes úton aranka fajok átviszik, és fertızött szaporítóanyaggal is terjed (Martelli, 1993; Martelli és mtsai, 2002).
2.2.4. Szılı faszöveti barázdáltság A szılı fás részeinek, oltással átvihetı vírusbetegség komplexét nevezzük faszöveti barázdáltságnak, amely az egész világon elterjedt. A tıke farészénél gödröket és barázdákat lehet megfigyelni. Négy elváltozás hozható kapcsolatba a faszöveti barázdáltsággal: a Rupestris stem pitting (Rupestris faszöveti barázdáltság), a Kober stem grooving (Kober faszöveti barázdáltság), az LN 33 stem grooving (LN 33 faszöveti barázdáltság) és a corky bark (parakérgőség). A tüneteket elıször Hewitt (1954) írta le, Olaszországban „érdes kéreg” tünetként. Magyarországon Martelli és munkatársai (1967) figyelték meg, majd Lázár munkatársai (1995b) fásszárú tesztelés segítségével különítette el az egyes változatokat. Ez a betegség felelıs az oltásoknál kialakuló összeférhetetlenségért, a kései rügyfakadásért, a tıkék leromlásos tüneteiért és késıbbi pusztulásáért. A betegség etiológiája még nem teljesen tisztázott, valószínősíthetı, hogy a Grapevine virus A (GVA), a Grapevine virus B (GVB) és a Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) kapcsolatba hozható a faszöveti barázdáltság betegséggel.
29
2.2.4.1. Rupestris stem pitting-associated virus - Rupestris faszöveti barázdáltság vírus (RSPaV) A Rupestris stem pitting betegséget a rupestris faszöveti barázdáltság vírus, Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), ma hivatalosan használandó néven Grapevine rupestris-associated virus (GRSPaV) ismert (Carstens, 2010). A kórokozó korábban a Flexiviridae család Foveavirus nemzetségéhez tartozott (Nolasco és mtsai, 2006), ma hivatalosan Tymovirales rend, Betaflexiviridae család, Foveavirus nemzetségéhez tartozik. Virionjai burokkal nem rendelkezı, flexibilis, 800 nm hosszú, 12-13 nm átmérıjő fonál alakúak. Az 5’ végen „cap”, a 3’ végen polyA struktúrával rendelkezik. (5. ábra). Genomja pozitív, egy szálú RNS, mely 5 fehérjét kódol. Az elsı rész a replikációhoz szükséges polipeptidet kódolja, melynek részei a metiltranszferáz, helikáz, és RNS függı RNS polimeráz enzimek. A következı 3 szakasz a mozgási fehérje (TGB) 3 komponensét, az azt követı pedig a köpenyfehérjét (CP) kódolja (Rebelo és mtsai, 2008). A vírus mechanikailag nem vihetı át, és eddig természetes vektorát sem találták meg (Nakaune és mtsai, 2008). Jelenlétét Vitis rupestris cv. St. George indikátor fajtán lehet kimutatni. Ezen a fajtán az oltás helye alatt, a farészen, sávosan gödröcskék láthatók, de esetenként bárhol máshol a farészen láthatók gödrök és barázdák (Zhang és mtsai, 1998, Meng és mtsai, 1999). Krónikus fertızés tünete a törpülés (Lima és mtsai, 2006).
Rövidítések: 5’cap - vírusgenom 5’ vége cap struktúrával, polipeptid – replikációhoz szükséges fehérjék, TGB1, TGB2, TGB3 - mozgási fehérje 3 komponense, CP - köpenyfehérje, 3’ polyA- a genom 3’ poliadenilált vége
5. ábra. A Foveavirus nemzetség genomszervezıdése 2.2.4.2. Grapevine virus A - Szılı A vírus (GVA) A szılı A vírus (Grapevine virus A, GVA) a szılı háncsrészében található kórokozó, melynek 800 nm hosszú fonál alakú virionja van. Genomja pozitív, egyszálú RNS. 5’ végen „cap”, 3’ végen polyA struktúrával rendelkezik (6. ábra). A genom 5 fehérjét kódol: a replikációhoz szükséges poliproteint, egy ismeretlen funkciójú fehérjét (p20), egy TGB típusú mozgási fehérjét (MP), egy köpenyfehérjét (CP) és egy géncsendesítést feloldó fehérjét (NB) (Minafra és mtsai, 1997). A GVB-vel együtt a Flexiviridae új nevén Betaflexiviridae család 30
Vitivirus nemzetségéhez tartozik (Murolo és mtsai, 2008). A GVA-t a Kober faszöveti barázdáltsággal hozzák összefüggésbe. Biológiai indexelése a Vitis berlandieri x Vitis riparia cv. Kober 5BB indikátoron történik (Lázár, 1996). Különbözı pajzstetvekkel (Pseudococcus longispinosus, Ps. affinis, Planococcus ficus, Pl. Citri) terjed, további vektorai Heliococcus bohemicus és Neopulvinaria innumerabilis lehetnek (Minarfa és mtsai, 1997). A közönséges teknıspajzstetőrıl vagy akácpajzstetőrıl (Parthenolecanium corni) is kimutatták vektor szerepét. A vírus kimutatására Nicotiana benthamiana, N. clevelandii és a Gomphrena globosa lágyszárú tesztnövények alkalmasak (Haviv és mtsai, 2006).
Rövidítések: 5’ cap- a vírusgenom 5’ vége „cap” struktúrával, polipeptid – replikációhoz szükséges fehérjék, p20 - ismeretlen funkciójú fehérje, MP - mozgási fehérje, CP - köpenyfehérje, NB - Nukleinsavhoz kötött fehérje, 3’ polyA – genom 3’ vége polyA struktúrával
6. ábra. A Vitivirus nemzetség génszerkezete 2.2.4.3. Grapevine virus B - Szılı B vírus (GVB) A szılı B vírus (Grapevine virus B, GVB) a parakérgőség (corky bark) kórokozójaként ismerik. Ugyancsak a Vitivirus nemzetséghez tartozik. A virion alakja és felépítése ugyanolyan, mint a GVA esetében. A betegség tünetei a Vitis rupestris cv. St. George és’Couderc 1613’ x Vitis berlandieri cv. LN 33 fajtákon vizsgálhatók (Kuniyuki és mtsai, 2006). A vírust a Pseudococcus longispinus terjeszti. Lágyszárú tesztnövénye a Nicotiana benthamiana és N. occidentalis (Saldarelli és mtsai, 2005). A környezı országok közül, Szlovéniában Tomazič és munkatársai (2005) folytattak vizsgálatokat a szılı vírusfertızöttségével kapcsolatban, de elıfordulását nem tudták igazolni. Horvátországban viszont Voncina és munkatársai (2011a) viszonylag nagyszámú szılı mintában igazolták a GVB elıfordulását molekuláris és szerológiai vizsgálatokkal is. Hazánkban fásszárú teszteléssel feltételezik a vírus jelenlétét (Lázár és mtsai, 1995b), de a vírus leírásáról nem jelent meg közlemény.
A negyedik típusú elváltozásról, az LN 33 stem groovingról nagyon keveset tudunk. Fásszárú tesztnövénye a ’Couderc 1613’ x Vitis berlandieri cv. LN 33 (Lázár, 1996). 31
2.2.5. Szılı vonalas és győrős mintázottság
2.2.5.1. Alfalfa mosaic virus - Lucerna mozaik virus (AMV) A lucerna mozaik vírus (Alfalfa mosaic virus, AMV) a szılı vonalas és győrős mintázottság betegség - Grapevine yellow mottle- kórokozójaként ismert. Virionjai bacillus alakúak, 18 nm átmérıjőek, a pozitív, egyszálú 3 komponenső RNS genom, külön víruspartikulumban található meg (7. ábra). Az egyes RNS-ek 3’ végükön tRNS, az 5’ végükön „cap” struktúra található. Az RNS1 a vírusgenom elsı komponense. 3,6 kb nagyságú és az RNS replikációhoz szükséges poliproteint kódolja. Az RNS2 a vírusgenom második komponense 2,6 kb nagyságú. Az RNS3- a vírusgenom harmadik komponense 2 kb nagyságú. Az itt található nyílt leolvasási szakasz a mozgási fehérjét kódolja, míg a 3b nyílt leovasási szakasz (ORF3b) egy szubgenomi RNS-en (sgRNS4) át kódolja a köpenyfehérjét (Vlot és mtsai, 2001). Gazdanövényköre rendkívül széles. A fertızött tıkék lombozata különbözı mintázatú sárga elszínezıdéseket mutat. A sárgulás nem terjed át az erekre, azok zöldek maradnak. A mozaikos foltok nyáron kifehéredhetnek, de nem maszkírozódnak. A kórokozó a Bromoviridae család, Alfamovirus nemzetségének típustagja. A vírus, oltással, mechanikailag, fertızött szaporítóanyaggal és levéltetvekkel terjed (Martelli, 1993). A vírusbetegséget szılırıl elıször Németországban írták le Bercks és munkatársai (1973) majd hazánkban is megtalálták, és kezdték el vizsgálni (Lehoczky és Beczner, 1980, Beczner és Lehoczky, 1980). Fásszárú tesztnövényeinek köre széles, a szılıfajták közül a Vitis vinifera cv. Chardonnay, V. vinifera cv. Pinot noir és a Vitis rupestris cv. St. George használhatók
kimutatására.
Lágyszárú
tesztnövényei:
Chenopodium
quinoa,
Ch.
amaranticolor, Phaseolus vulgaris, Nicotiana tabacum és N. glutinosa (Beczner és Lehoczky, 1981).
32
Rövidítések: RNS1 - a vírusgenom elsı komponense, RNS2 - a vírusgenom második komponense, RNS3 - a vírusgenom harmadik komponense, 5’ cap- a vírusgenom 5’ vége „cap” struktúrával, ORF1a - elsı nyílt leolvasási szakasz, ORF2a - második nyílt leolvasási szakasz, ORF3b - harmadik nyílt leovasási szakasz „b” része, ORF3a - a harmadik nyílt leolvasási szakasz „a” része, sgRNS4 CP - 4-es számú szubgenomi RNS-en át keletkezı köpenyfehérje, 3’ tRNS – a vírusgenom 3’ vége, amely egy „tRNS” struktúrával záródik
7. ábra. A lucerna mozaik virus (Alfalfa mosaic virus, AMV) genom szervezıdése
2.2.6. Szılı vonalas mintázottság
2.2.6.1. Grapevine line pattern virus - Szılı vonalas mintázottság vírus (GLPV) A betegség kórokozójaként a Grapevine line pattern virus (GLPV) néven ismert, szerológiai tulajdonságai miatt a Bromoviridae család Ilarvirus nemzetségének feltételezett tagja. Elsıként Lehoczky és munkatársai (1987) számoltak be róla Magyarországon. Multikomponenső, 24 nm átmérıjő, izometrikus vírus (Brunt és mtsai, 1996). A vírusbetegség csak Magyarországon fordul elı. A beteg levelek világos, juharfalevélre emlékeztetı mintázatot, szétszóródva pontokat vagy foltokat mutatnak. Üvegházi, lágyszárú tesztelésre a Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, Phaseolus vulgaris, Nicotiana glutinosa és Cucumis sativus lágyszárú tesztnövények alkalmazhatók. Fásszárú indikátora a Vitis vinifera cv. Jubileum 75 (Lehoczky és mtsai, 1987). A 2010-ben kiadott ICTV hivatalos vírus nevezék- és rendszertannal foglalkozó testület
listáján
valószínősíthetıen
a
kórokozó
újabb
elfordulása
tulajdonságokról szóló adatok hiányában nem szerepel (Carstens, 2010).
33
és
molekuláris
2.2.7. Vírusszerő betegségek, még pontosan nem azonosított kórokozók
2.2.7.1. Szılı enáció A betegség németországi elıfordulásáról elıször Buchenau 1891-ben számolt be (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). Magyarországon Lehoczky (1965) írta le. A tünetek kései rügyfakadás, lassú növekedés, bokrosodás, és hosszanti vagy győrő alakú kinövések a vesszık alapjához közeli nyolc-tíz levél fonákán. Vektora nem ismert, fertızött szaporítóanyaggal terjed. Kimutatására egyetlen módszer az ’LN 33’ indikátorra történı oltás, bár eredményessége gyakran bizonytalan (Martelli, 1993).
2.2.7.2. Szılı érnekrózis 1973-ban Legin és Vuittenez találta meg és írta le elıször ezt a vírus jellegő megbetegedést Franciaországban (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). Magyarországon Lehoczky és munkatársai (1986) jelezték elıfordulását. A kórokozó nem ismert, a betegség fertızött szaporítóanyaggal és oltással terjed. Fásszárú indikátora Vitis rupestris x Vitis berlandieri cv. 110 R. A tesztnövényen betegség tünetei, a levél fonákán jól látható levélerek nekrózisa. Elıször az idısebb leveleken jelenik meg, aztán a hajtás növekedésével a fiatalabbakra is átterjed. Ezzel egy idıben, nekrotikus pontok is megjelennek a levél színén. Néhány esetben megfigyelhetı a kacs és a zöld hajtás elhalása is (Martelli, 1993). A növekedés teljes leállása is megfigyelhetı, és az indikátor ki is pusztulhat. Mechanikai átvitelre még nem ismert megfelelı lágyszárú tesztnövény (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). Bouyahia és munkatársainak (2005) közleményében a tünetek kialakulásában szerepet játszó kórokozóként a korábban már említett Grapevine rupestris stem pitting associated virus-t említi.
2.2.7.3. Szılı érmenti mozaik 1966-ban Vuittenez és munkatársai olyan mozaikos foltosságot találtak szılın, amely teljesen független volt a szılı vírusos leromlásától (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). Ez volt az érmenti mozaikról szóló elsı leírás a világon. Magyarországon Lehoczky és mtsai (1984) írták le. A fertızött növények levelén halványzöld mozaikosság mutatkozik az elsı- és 34
másodrendő erek mentén. A legérzékenyebb fajtáknál a levelek érközi területei elhalhatnak, de a nekrózis a levélereket nem érinti (Martelli és Boudon-Padieu, 2006). A betegség kórokozója nem ismert. Oltással, fertızött szaporítóanyaggal terjed (Lehoczky és mtsai, 1984a). Fásszárú tesztnövénye a Vitis riparia cv. Gloire de Montpellier (Lázár, 1996). Lunden és munkatársainak (2010) munkájában ezt a tünetet érkivilágosodás (vein clearing complex) tünetegyüttesként definiálja, molekuláris vizsgálatok alapján a paradicsom győrősfoltosság vírus (Tomato ringspot virus, ToRSV), a szılı fertızı leromlás vírus (Grapevine fanleaf virus, GFLV) és a szılı rupestris faszöveti barázdáltság vírus (Grapevine rupestris stem pitting associated virus, GRSPaV) komplex fertızésével hozza összefüggésbe.
2.3. A vírusrezisztencia kialakításának lehetıségei a Vitis fajokban A vírusok elleni védekezés jelenleg megoldatlan kérdés termı szılı ültetvényekben. A vírusok fertızött szaporítóanyaggal, oltással, mechanikailag és vektorok segítségével (fonálféreg
és
pajzstető
fajok) terjednek,
ezért
a megelızés
alapja a fertızés
megakadályozása. Új szılıültetvények létesítésekor az egészséges, ellenırzött vírusmentes szaporítóanyag használata és fonalféregmentes terület kialakítása lehet a megelızés alapja. A szılı metszésével és egyéb sebet okozó zöldmunkával is terjednek egyes vírusok, így a terjedés megakadályozása a vágóeszközök fertıtlenítésével oldható meg. Vírusvektorok ellen termıültetvényben ugyan lehetne kémiai úton vegyszeresen védekezni (pajzstetvek ellen), talajlakó fonalférgek ellen azonban kevés a forgalomban növényvédı szer. A manapság terjedı molekuláris technika nyújtotta lehetıségeket kihasználva, az új információk segítségével, elı lehet állítani rezisztens növényeket. A molekuláris vizsgálatok térhódításával megkezdıdött a különbözı vírusokkal szembeni esetleges rezisztencia források kutatása. Ez idáig természetes rezisztenciagént ezekkel a kórokozókkal szemben nem azonosítottak (Laimer és mtsai, 2009). A GFLV vírussal szembeni indirekt védekezés egyik lehetısége a vektoraként ismert Xiphinema index-re rezisztensnek mutatkozó Muscadinia (Vitis) rotundifolia használata. Sajnos alanynak ez a szılıfaj nem alkalmas, mert inkompatibilis a V. vinifera fajokkal. E fajnak gyenge a gyökeresedı képessége és a talaj mésztartalmára is érzékeny. Fonalféreg toleráns hibrideket már kialakítottak, de a vírus terjedését nem tudták teljesen meggátolni (Walker és mtsai, 1985).
35
Természetes rezisztencia vagy toleranciaforrást szılı levélsodródás vírusokkal szemben sem V. vinifera fajtákban sem az alanyokban nem találtak. Lahouge és Boulard 1996-ban közzétett publikációjában zöldoltásos technikával próbáltak GLRaV-1 és -3 vírusokkal szembeni rezisztens növényeket elıállítani, amelyhez amerikai, ázsiai, eurázsiai szılı fajokat és interspecifikus hibrideket használtak, azonban ezzel a módszerrel nem sikerült rezisztens egyedet kialakítani. Feltételezhetıen vannak olyan alanyfajták is, amelyek kevésbé fogékonyak a GLRaV3-al és/vagy a vektorokkal szemben, mint a V. vinifera fajták. Ezt támasztják alá azok a megfigyelések, hogy az egyébként fertızött alanyok levelein nem jelentkeznek tünetek, illetve sokkal kisebb a víruskoncentráció, amely ELISA tesztelésre alkalmatlanná teszik ıket (Boscia és mtsai, 1991; Credi és Santucci, 1991). A Vitivirus és Foveavirus nemzetségbe tartozó faszöveti barázdáltság kórokozói ellen sem találtak még természetes rezisztenciagént. A jelenlegi gyakorlat úgy tartja, hogy az in vivo merisztéma kultúrával, megfelelı eredménnyel képesek eltávolítani a GRSPaV-t. Jelenleg ez a módszer elterjedtebb az ígéretesebbnek tőnı szomatikus embriogenezissel szemben. Más kultúrákhoz hasonlóan a szılı esetében is elkezdıdött a kutatás a patogéntıl származtatott rezisztencia kialakítására. Bardonnet és munkatársai (1984) dohány növényeket transzformáltak és alakítottak ki védettséget a GFLV-vel szemben, a vírus köpenyfehérjéjét kódoló gén szakaszának felhasználásával. Le Gall és munkatársai (1994), Torregrosa és Bouquet (1997) pedig az Agrobacterium rhizogenes és az A. tumefaciens vektorok segítségével alakítottak ki rezisztenciát GCMV vírussal szemben a köpenyfehérje gén beépítésével és így hozták létre a 110 Richter (V. berlandieri x V. rupestris) transzgenikus alanyfajtát. Mauro és munkatársai (1995) GFLV köpenyfehérje gén felhasználásával állítottak elı Vitis vinifera x V. berlandieri cv. 41B, V. berlandieri x V. riparia cv. SO4 és V. vinifera cv. Chardonnay esetében transzgenikus vonalakat. Ezeknek körülbelül 30%-a adott szerológiailag negatív eredményt GFLV-re a fertızés után. Spielmann és munkatársai (2000) ArMV köpenyfehérje gén beépítésével hoztak létre transzformált Vitis rupestris és Nicotiana benthamiana növényeket. A biotechnológiai módszerek közül nemcsak kórokozótól származtatatott rezisztencia kialakítására van lehetıség. GFLV esetében felhasználható szekvencia még a repetitív interferáló szekvenciák beépítése is (Jardak-Jamoussi és mtsai, 2009). A rezisztencia kialakításának másik módszere az ún. rekombináns antitest módszer (Nölke és mtsai, 2004). Orecchia és munkatársai (2008) GLRaV-3 vírus köpenyfehérje 36
szekvenciájának felhasználásával állítottak elı vírus specifikus antitestet, amely Nicotiana benthamiana növénybe transzformálva megakadályozta a vírusfertızést. Ezért feltételezhetı, hogy ily módon a Vitis vinifera fajnál is kialakítható rezisztencia. Minafra és munkatársai (1998) Nicotiana benthamiana és N. occidentalis fajokat transzformáltak és alakítottak ki rezisztenciát GVA és GVB vírusokkal szemben azok köpenyfehérje (CP) gén szekvenciáit beépítve. Muruganatham és munkatársai (2009) közleménye szerint Nicotiana benthamiana növényfajon GVA esetében is folynak kutatások a vírus minireplikonja indukálta géncsendesítésen alapuló rezisztencia kialakítására. GLRaV-2 vírus esetében Ling és munkatársai (2008) transzgenikus Nicotiana benthamiana növényeket hoztak létre, amelyekben a vírus köpenyfehérjéit használták fel. Magyarországon Vitis fajok esetében a vírusrezisztencia kialakítására nem folynak kutatások. A vírusok elleni védekezés ésszerő és leghatékonyabb módja mindenképp a vírusokkal szemben rezisztens növények, növényfajok vagy fajták termesztése. A genetikailag módosított növények termesztésével kapcsolatos környezeti hatásokat, esetleges kockázatokat nem ismerjük pontosan. A szılı esetében a vírusrezisztencia biotechnológiai módszerekkel történı kialakítása még kísérleti állapotban van.
37
3. Anyagok és módszerek 3.1. A mintavételezés és a lágyszárú bioteszt módszertana
3.1.1. Növényi minta győjtése A három éves virológiai vizsgálat során 17 borvidék, mintegy 31 mintavételi helyérıl (8. ábra) - különbözı korú, fajta-összetételő és mérető termıültetvényekbıl - Balatonboglár, Lengyeltóti (Balatonboglári borvidék), Kıszeg (Soproni borvidék), Badacsonytomaj, Káptalantóti, Szent György- hegy (Badacsonyi borvidék), Cserszegtomaj, Kékkút (Balatonfelvidéki borvidék), Csopak (Balatonfüred-Csopaki borvidék), Etyek (Etyek-Budai borvidék), Kecskemét (Kunsági borvidék,) Tokaj, Tarcal (Tokaji borvidék), Szomolya, Noszvaj, Eger (Egri borvidék), Bogács (Bükki borvidék), Gyöngyöstarján (Mátrai borvidék), Görögszó, Bátaszék (Szekszárdi borvidék), Kismórágy, Izmény (Tolnai borvidék), Somló (Somlói borvidék), Pécs (Pécsi borvidék), Villány (Villányi borvidék) és Nagyrada, Csörnyeföld, Dobri, Zalaszentbalázs, Zalaszentgrót, Murakeresztúr, (Zalai borvidék) győjtöttük be a vírusbetegségekre jellemzı tüneteket mutató szılıtıkék levélmintáit.
8. ábra. Mintagyőjtések helye Magyarországon 38
A Nepovirus, Maculavirus, Alfamovirus nemzetségekhez tartozó vírusok kimutatására alkalmas a szılı virágzásától a nyári meleg beköszöntéig tartó idıszak. A legjobb erre, a virágzástól bogyókötıdésig győjteni a fiatalabb leveleket, a vitorla közelébıl. A másik mintagyőjtési idıszak a bogyó zsendülésétıl nyár végéig, ısz elejéig terjedı idıszak, amely a Closterovirus, Ampelovirus, Vitivirus nemzetségbe tartozó vírusok kimutatására alkalmas. Ilyenkor célszerő az idısebb levelekbıl az alsóbb levél emeletekrıl mintát győjteni, mert a víruskoncentráció, ezekben az idıszakokban a legmagasabb és így a szerológiai vizsgálat eredménye is megbízhatóbb (Vanek, 1996). A vizsgálatokhoz győjtött szılı levélminták a vizsgálni kívánt vírusok által okozott tünetek alapján történt, amelyek levéldeformáció, mozaik, vörösödés, sárgulás, klórozis, nekrotikus foltosság, krómsárga mozaik, sárga mozaik, érmenti mozaik, érnekrózis, faszöveti elváltozások voltak. A mintagyőjtések idejét, helyét és a feljegyzett tüneteket az 1. számú melléklet tartalmazza. Az azonosíthatóság miatt a vizsgált szılıtıkéket mőanyag szalaggal megjelöltük, a tüneteket feljegyeztük. A mintákat a vizsgálat helyszínére hőtıtáskában szállítottuk és a vizsgálat elvégzéséig 4 oC-on tároltuk.
3.1.2. Lágyszárú bioteszt A szerológiai vizsgálattal egy idıben lágyszárú biotesztet is végeztünk. A mechanikai átvitelhez Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, Nicotiana benthamiana, N. glutinosa, Cucumis sativus és Gomphrena globosa lágyszárú tesztnövényeket alkalmaztunk. A szılılevél felületi fertıtlenítésére 2%-os NAOH oldatot használtunk, majd vízzel leöblítettük. A minta homogenálását 0,067 M-os foszfát- pufferrel (pH 7,2) és 3%-os polietilén- glikol (PEG 6000) hozzáadásával történt, mintánként 3 ml/g-os mennyiségben (Baracsi, 1999). A tesztnövények leveleit karborundum porral beszórtuk és üvegspatulával vittük az inokulumot levelek felületére. A növényeket félárnyékos, párás helyen tartottuk.
3.2. Szerológiai módszer A növényvírusok kimutatására leggyakrabban alkalmazott szerológiai módszer a Double Antibody Sandwich (DAS) Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) azaz a kettıs antitest szendvics enzimhez kötött immunválasz eljárás volt. A vizsgálat elsı lépéseként szilárd felülethez - polisztirol mikrotitráló lemezhez - kötjük a vizsgálni kívánt vírusra szelektív antitesteket. Majd az inkubációs idı letelte után második 39
lépésben történik meg a minták felvitele. A pozitív minták esetében a vírus adszorbeál az antitestekhez. Ezután következik az enzimhez kötött antitestek felvitele a vizsgálat harmadik lépésében. Azokban a mintákban, ahol a vírus jelen van, az enzimhez kötött antitestek komplexet alkotnak a vírus fehérjéivel. A lépések közötti mosásokkal a nem kötödıtt anyagok eltávolítása történik. Utolsó, negyedik lépésként megfelelı szubsztrát (para-nitrofenil-foszfát, amely színtelen, fényérzékeny vegyület) hozzáadása történik. Az enzim lehasítja a szubsztrát molekulákról a foszfát csoportokat, amely során para-nitrofenol keletkezik és a vírus antigén mennyiségétıl
függı
intenzítású
sárga
színreakciót
ad.
A
színreakció
erıssége
spektrofotometriával mérhetı 405 nm hullámhosszon (Clark és Adams, 1977). A vizsgálat során Labsystems Multiskan EC ELISA fotométert használtunk. Negatívnak azokat a mintákat tekintettük, amelyek extinkciós értékei nem haladták meg a negatív kontrollnál mért extinkciós érték háromszorosát. A szılı levélminták esetében a mintafeltáró puffer, más növényi részek esetében használatostól eltérı TRIS (Trishidroximetil- aminometán) és PEG (polietilén-glikol) tartalmú. A puffer pH értéke 8,2 volt. A vizsgálatokhoz LOEWE, Bioreba és Agritest cég reagenseit használtuk, az általuk kiadott ajánlások alapján. A szılı vírusos leromlását okozó nepovírusok közül a GFLV, az ArMV, TBRV és a GCMV jelenlétét teszteltük. A vizsgálatok során még a szılı látens foltosságát okozó GFkV, a szılı vonalas és győrős mintázottságát okozó AMV, valamint a levélsodródás tünetet okozó GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3,GLRaV-6 és GLRaV-7 valamint a Kober faszöveti barázdáltság vírusbetegséget okozó GVA jelenlétét ellenıriztük. A szerológiai vizsgálatban pozitív eredményt adó minták esetében visszakerestük a tıkéket késı ısszel a vesszık beérése után, amelyekrıl a minta származott. Tıkénként 3 vesszıt győjtöttünk be és következı év tavaszán meggyökereztettük ıket. Jelenleg szabadföldi és üvegházi körülmények között perlit- föld keverékben tartjuk ıket a Pannon Egyetem Georgikon Kar Növényvédelmi Intézetének Virológiai Üvegházában.
3.3. Molekuláris módszerek A molekuláris virológiai vizsgálatok során olyan hazai izolátumokat választottunk, amelyek korábban a tesztnövény kísérletek és a DAS-ELISA vizsgálat során Grapevine leafroll- associated virus -1 és -3 vírusnak bizonyultak. Célunk volt, hogy a Magyarországon eltérı helyrıl begyőjtött vírus izolátumokat molekuláris módszerrel is azonosítsuk, illetve az
40
izolátumok HSP70 fehérjéjének adott primerekkel történı reverz transzkripciós polimeráz láncreakción alapuló vizsgálata során felszaporított PCR termék nukleotid sorrendjét meghatározzuk, és más országokban már leírt izolátumok szekvenciáival összehasonlítsuk. A molekuláris virológiai vizsgálatokat a Budapesti Corvinus Egyetem Kertészettudományi Kar Növénykórtani Tanszékén végeztük Dr. Palkovics László egyetemi tanár laboratóriumában.
3.3.1. Össznukleinsav kivonás Össznukleinsav kivonást és tisztítást a SPEKTRUM Plant total RNA Kit-tel (SigmaAldrich Chemie GmbH, Germany) végeztük. Vörösödést és sodródás tüneteket mutató szılılevél lemezébıl származó 3 levélkorongot dörzsmozsárban, jégen, hőtött körülmények között homogenáltunk, majd a Kit elıírásainak megfelelıen elvégeztük az össznukleinsav kivonását és 50 µl oldószerbe oldottuk vissza. Az RNS-rıl a DNS másolatot reverz transzkripcióval készítettünk. A 3 µl tisztított és visszaoldott vírus RNS-hez 1 µl 3’ indítószekvenciát (primert) adtunk (100 pmol/ µl), majd 65°C-on denaturáltuk. Ezután az oldathoz adtuk a reverz transzkriptáz M-MuLV enzimet (0,5 µl), annak pufferjét 2 µl mennyiségben, 0,25 µl RiboLock RNAse inhibítort és 1 µl mennyiségben 5 mmol/µl koncentrációjú nukleotidokat (Fermentas), 10 µl végtérfogatra higítottuk steril desztillált vízzel, majd a reakcióelegyet 1 órára 42°C-ra tettük. Ily módon a vírus RNS-sel komplementer DNS másolatot (cDNS) hoztunk létre (Sambrook és mtsai, 1989).
3.3.2. Polimeráz láncreakció A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz olyan univerzális primerpárt terveztünk, amely felismeri a GLRaV-1 és -3 HSP70 fehérjéjét. A GLRaV-1 540 bp nagyságú, a HSP70 gén középsı részének 416-955 nukleotid közti fragmentumát kívántuk felszaporítani, ehhez az AF 195822 számú génbanki, a mintegy 1632 nukleotidból álló, teljes HSP70 szekvenciát alapul véve, Kominek és munkatársai (2005) által alkalmazott primereket használtuk. A GLRaV-3 esetében az 546 bp nagyságú fragmentumát kódoló LC1 és LC2 jelzéső primereit használtuk Turturo és munkatársainak 2005-ös és Mekuria és munkatársainak 2009es publikációi alapján génbanki adatokra - GLRaV-3 NY1 izolátum szekvencia adataira -
41
támaszkodva (AF037268). A PCR-hez használt primerek a Bio-Science Kft.-tıl (Budapest) származnak.
Specifikus primerek:
GLRaV-1 esetében:
1FHSP705’- CAG GGC TCG TTT GTA CTG G- 3’ 1RHSP705’- TCG GAC AGC GTT TAA GTT CC- 3’
GLRaV-3 esetében:
LC1F5’- CGC TAG GGC TGT GGA AGT ATT- 3’ LC2R5’- GTT GTC CCG GGT ACC AGA TAT- 3’
A PCR reakcióelegy (50 µl) tartalmazta a cDNS-t (3µl), a felszaporítani kívánt szakasz kiemeléséhez szükséges 1-1 µl 5’ és 3’ foszforilált indító szekvenciákat (20 pmol/µl), 2 µl nukleotid keveréket (5 mmol/µl), a megfelelı körülményeket biztosító puffert (10x-es PCR puffer 5µl mennyiségben), 3 µl MgCl2 (25 mmol/µl) és 0,5 µl Taq polimeráz enzimet. A reakciót a PCR Applied Biosystems GenAmp PCR System 9700 készülékkel végeztük. A PCR ciklus elsı lépéseként a DNS-t elıdenaturáltuk 94°C-on 1 percig, ezt követte a 40 cikluson át tartó denaturáció 94°C-on 1 perc 15 másodpercig, majd a primerek kapcsolódása a templáthoz (anellálás) 52°C-on (mindkét vírus primerének esetében) 30 másodpercig, majd a lánchosszabbítás 72°C-on 1 percig. A végsı láncépítés 72°C- on 10 percig tartott.
42
3.3.3. Gélelektroforézis Az elektromos térbe helyezett gélben a negatív töltéső nukleinsavak a pozitív pólus felé mozogtak. A vándorlás gyorsaságát a molekula mérete határozta meg. Az egyes fragmentumok fluoreszcens festék jelenlétében ultraibolya fényben láthatóvá váltak. A kapott PCR
termékeket
agaróz
gélben
(1,5%),
gélelektroforézissel
ellenıriztük
90
mA
áremerısségnél. Az elektroforézishez használt gél fluoreszcens festéket, GelRed-et (Izinta) tartalmazott. Az elsı mintahelyre tömegmarkert tettünk (Invitrogen 1Kb DNA Ladder), hogy jól látható legyen a GLRaV-1 esetében 540, a GLRaV-3 esetében pedig 546 bázispár nagyságú PCR termék.
3.3.4. A PCR termék izolálása gélbıl A PCR terméket a gélbıl steril szikékkel kivágtuk és Roche High Pure Purification Kit segítségével, a gyártó utasításainak megfelelıen kitisztítottuk, majd 30 µl oldószerbe oldottuk vissza.
3.3.5. Ligálás és transzformálás A PCR termék felszaporítását Sambrook és mtsai (1989) szerint végeztük. A tisztítás után közvetlenül ampicillin rezisztencia gént tartalmazó pGEM-T Easy Vektorba kapcsoltuk. A ligálás (az inzert és a plazmid összekapcsolása) 4 órán át szobahımérsékleten (20–24 C°) 10 µl végtérfogatban történt. A reakcióelegy 3 µl cDNS-t (inzert; tisztított, illetve tisztított és emésztett PCR-termék), 1 µl plazmidot, 1 µl 10x ligáz puffert és 1 µl T4 DNS ligáz enzimet tartalmazott, desztillált vízzel kiegészítve. A ligálás után a genetikailag megváltoztatott (rekombináns) plazmidot E. coli DH5α plazmidmentes kompetens sejtekbe juttattuk (transzformálás). A hısokkos transzformálást Koósné (2006) munkája szerint végeztük. A 10 µl ligátumot, jégen 50 µl lassan kiolvasztott kompetens baktérium-szuszpenzióval finoman elegyítettük, majd 15 percen át jégen tartottuk. Ezután 1 percre 42 °C-os vízfürdıbe helyeztük, majd azonnal jégre tettük, ahol 2 percig állt. Végül 500 µl antibiotikum-mentes, folyékony LB táptalaj /2TY/ (10 g/l tripton; 5 g/l élesztıkivonat; 10 g/l NaCl; pH: 7,2) hozzáadása után 37 °C-on 1,5 órán keresztül rázattuk, 190 rpm fordulatszámmal. Ezt követıen 100 µl-nyi szuszpenziót ampicillin tartalmú szilárd
43
LB/IPTG+X-Gal táptalajon (10 g/l tripton, 5 g/l élesztıkivonat, 10 g/l NaCl, 10 g/l agar; 50 µg/ml ampicillin) szélesztettünk. Szélesztés elıtt a lemez felszínén 10 µl IPTG-t és 40 µl XGalt oszlattunk szét egyenletes eloszlásban. A kész lemezeket, táptalajt tartalmazó oldalukkal felfelé, egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Az antibiotikummal kezelt táptalajon csak azok a baktérium sejtek voltak képesek felszaporodni, amelyek ampicillin rezisztencia gént hordoztak. A ligálás sikerességét az ún. „kék-fehér” szelekció segítségével értékeltük. Azok a baktérium kolóniák, amelyekben az inzert beépülése következtében a plazmidban lévı enzim mőködésképtelenné vált fehér színőek lettek, míg azok, amelyekben az inzert nem épült be a plazmidba kék színőek voltak. Ennek ismeretében minden lemezrıl 4–6 különálló, fehér színő telepet oltottunk le steril fogpiszkáló felhasználásával. A fogpiszkálóval leemeltünk egy kolóniát, és elıször egy mesterlemezhez (masterplate) érintettük, majd 2 ml 50 µg/ml ampicillin tartalmú, folyékony LB táptalajt tartalmazó üvegcsıbe tettük. A csöveket lezártuk, és egy éjszakán át 37 °C-on rázattuk, 190 rpm fordulatszámmal. Az eredeti telepek felszaporítására szolgáló mesterlemezt, egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk.
3.3.6. A plazmid tisztítása és az inzert ellenırzése A baktérium sejtbıl a rekombináns plazmid DNS tisztítását alkalikus lízisen alapuló minipreparálással végeztük. A ligálás sikerességének ellenırzéséhez a plazmidot Sambrook és mtsai (1989) alapján szintén Koósné (2009) szerint a következıképpen izoláltuk. A táptalaj eltávolításához a folyékony baktérium sejtkultúrát 3 percig 13400 rpm fordulatszámon, szobahımérsékleten centrifugáltuk, majd az összegyőjtött baktérium sejteket 200 µl ”A” (sejt szuszpendáló) oldatban (15 mM Tris-HCl pH: 8,0; 10 mM EDTA; 50 mM glükóz) szuszpendáltuk, és 5 percig szobahımérsékleten állni hagytuk. Ezután 400 µl „B” (sejt lízis) oldattal [0,2 M NaOH, 1% SDS], majd 300 µl „C” (semlegesítı) oldattal (3 M nátrium-acetát; 11,5% ecetsav) történt elegyítést követıen 5 percig jégre tettük az elegyet. A kicsapott nemkívánatos sejtalkotók maradványait 5 perces, szobahımérsékleten végzett centrifugálással távolítottuk el. A felülúszóból az oldott állapotban lévı nukleinsavakat kétszer csaptuk ki: elıször 600 µl izopropanollal, majd a centrifugálással összegyőjtött nukleinsavak 200 µl ”D” oldatban (0,1 M nátrium-acetát pH: 7,0; 50 mM Tris-HCl pH: 8,0) történt visszaoldását követıen 400 µl abszolút alkohollal. A csapadékot vákuum koncentrátorban 7-10 percig
44
szárítottuk. Végül a nukleinsavakat 50 µl 1x-es RN-áz TE oldószerben [10 mM Tris pH: 7,6; 1 mM EDTA; 10 µl (10 mg/ml) RN-áz] oldottuk fel. Az inzertek ellenırzését a Fast Digest EcoRI restrikciós enzim alkalmazásával végeztük. A reakcióelegyet, amelyben lévı puffer már gyárilag tartalmazta a fluoreszcens festéket is, 10 percig 37 °C-on tartottuk. A hasítás után keletkezett DNS-fragmentumokat fluoreszcens, 1 %-os TBE agaróz gélen tettük láthatóvá. Szekvencia meghatározáshoz a plazmidot BIO-RAD Quantum Prep Plasmid Miniprep Kittel a gyártó utasításainak megfelelıen izoláltuk.
3.3.7. A vírusgenomról készült cDNS nukleotid szekvenciájának meghatározása A nukleotid sorrend meghatározását a BAY-GEN Növénygenomikai, Humán Biotechnológiai és Bionergiai Intézet munkatársai végezték Szegeden.
3.3.8. A nukleotid és aminosav szekvenciák vizsgálata A nukleotid és aminosav szekvenciák hasonlóság-vizsgálatához, a szekvenciák illesztéséhez a filogenetikai vizsgálatokhoz és az UPGMA eljárással készített filogenetikai törzsfa elkészítéséhez a CLC Sequence viewer 6.5.1. (CLC bio, Dánia) szoftvercsomagot használtuk.
3.3.9. Statisztikai analízis A filogenetikai törzsfák megbízhatóságának becslésére a nukleotid szekvenciapozíciók véletlenszerő ismétléses mintavételét és az ezt követı törzsfaszerkesztést 1000-es ismétlésben alkalmazó bootstrap-analízist végeztünk.
3.4. Közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levélminta vizsgálata 2009. év ıszén a pécsi mintagyőjtés alkalmával a szılıültetvény gyomflórájában mozaikos és nekrotikus győrősfoltosságot mutató közönséges farkasalma (Aristolochia
45
clematitis) növényeket észleltünk. A szılımintákkal együtt begyőjtésre kerültek a további elektronmikroszkópos és molekuláris vizsgálatok elvégzése céljából. Az elektronmikrószkópos vizsgálathoz alkalmazott módszer a transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) volt, melyet az Eötvös Lóránd Tudományegyetem Természettudományi Karának Növényszervezettani Tanszékén dr. Bóka Károly egyetemi tanár végzett el. A vizsgálat módszertani alapja Almási (1999) munkája volt. A tüneteket mutató levél 1-2 mm nagyságú szövetdarabjait felhasználva, fixáláskor 2,5 %-os glutáraldehidet tartalmazó oldatban (0,1 M foszfát puffer, pH 7,2) állt 3 órás idıtartamig. Az ezt követı mosás mosópuffer felhasználásával, az utófixálás, 1%-os OsO4 (ozmium- tetroxid) segítségével, a dehidratálás etanol (25, 50, 70, 90, 96, abszolút alkohol) sorozat segítségével, majd azt követı propilén oxidos kezeléssel zajlott. A beágyazás DURCUPAN ACM mőgyantába (polimerizáció 60 oC termosztátban 72 óra) történt. Az ultravékony (70 nm) metszetek Reichert Jung Ultracut-E ultramikrotómmal készültek, gyémánt késsel. A metszetek rézpalládium gridre kerültek. A kontrasztozás 1% metanolos uranil acetát oldattal 4 percig, ólom citrát oldattal 6 percig történt. A metszetek vizsgálatára Hitachi 7100 TEM készülékkel 90 kV gyorsítófeszültség került sor. A molekuláris vizsgálathoz Qiu és munkatársainak (1998) közleményében szereplı TSWV-S1983 5′-CCCTCGAGGCTTTCAAGCAAGTTCTGCG-3’ és TSWV-S2767 5′GCTCTAGAGCCATCATGTCTAAGGTTAAGCTCAC-3′ primereket alkalmaztuk.
46
4. Eredmények 4.1. Mintavételezés és lágyszárú bioteszt eredményei
4.1.1. Tünettani vizsgálat eredményei A leggyakrabban tapasztalt tünetek a különbözı fokú levél deformáció (9., 10. ábra), mozaikfoltosság (11., 12. ábra), levélklorózis (13. ábra), sárga mozaik (14. ábra), krómsárga mozaik (15. ábra), levélelszínezıdés (vörösödés, sárgulás) és levélsodródás (16., 17. ábra). Egyes tıkék esetében tapasztaltunk érmenti mozaikosságot, érkivilágosodást (18. ábra), érnekrózist (19. ábra) és nekrotikus foltokat, egy esetben figyeltünk meg tıke barázdáltság komplexre utaló tüneteket (20. ábra).
9. ábra. Levéldeformáció
47
10. ábra. Levéldeformáció és nekrotikus foltok
11. ábra. Mozaikos foltok levélen
48
12. ábra. Mozaikos levél
13. ábra. Klorózis
49
14. ábra. Sárga mozaikos foltosság
15. ábra. Krómmozaik
50
16. ábra. Vörösödés és levélsodródás
17. ábra. Sárgulás és levélsodródás
51
18. ábra. Érkivilágosodás
19. ábra. Érnekrózis
52
20. ábra. Tıke barázdáltság tünete
4.1.2. Lágyszárú bioteszt eredménye A Chenopodium quinoa és Ch. amaranticolor esetében a vírusfertızött minták átvitelekor a fertızést követı 10. napon lokálisan klorotikus és nekrotikus léziókat tapasztaltunk, a nem inokulált leveleken pedig klorotikus foltokat és levéldeformációt (21. ábra). Nicotiana benthamiana tesztnövényeken lokálisan sárguló léziók, és klorotikus foltok voltak láthatók, szisztemikus tünetként levéldeformációt figyeltünk meg.
53
21. ábra. Chenopodium quinoa és Ch. amaranticolor tesztnövényen látható lokális klorotikus léziók és levéldeformáció
4.2. Szerológiai vizsgálatok eredményei A győjtött 277 mintából a hazai elıfordulású vírusok közül 9 vírus esetében 76 minta volt fertızött. Hatvanegy minta esetében egy vírus jelenlétét mutattuk ki, tizennégy esetben két-két vírus együttes jelenlétét tapasztaltuk (1. melléklet). A vírusok megoszlását az 1. táblázat mutatja. Négy mintában a GLRaV-1 és -3 fertızését, míg 2-2 esetben GCMV-t találtunk együttesen GLRaV-1-gyel és GLRaV-3-mal. Ezen kívül 1-1 mintában GCMVArMV, GFkV-ArMV, TBRV-GFkV, ArMV-AMV, ArMV-TBRV és TBRV-AMV komplex fertızést lehetett azonosítani. A vírusos leromlást okozó nepovírusok közül a szılı fertızı leromlás vírus (GFLV) elıfordulását 5, az arabis mozaik vírus (ArMV) megjelenését 7, a paradicsom fekete győrős vírus (TBRV) fertızést 5, a szılı króm mozaik vírus (GCMV) jelenlétét 8 esetben sikerült szerológiailag kimutatni. A szılı levélsodródás 1 és 3 vírusok jelenlétét azonos arányban, viszonylag magas számban 16- 16 minta esetében találtuk meg önállóan vagy komplex fertızést elıidézve. A szılı levélsodródás 2 vírus megjelenését 1 esetben igazoltuk. Így a vírusos leromlást elıidézı nepovírusok együttesen csak 25 mintában, azaz kisebb számban fordultak elı, mint a levélsodródást okozó vírusok, melyek jelenlétét 33 esetben igazoltuk . 54
Mintegy 26 esetben GFkV fertızést mutattunk ki. A GVA jelenlétét egyetlen esetben sem sikerült igazolni.
1. táblázat. A szerológiai vizsgálatok eredménye
Vírus
Minták száma
GFLV
5
ArMV
7
TBRV
5
GCMV
8
GFkV
26
AMV
6
GLRaV-1
16
GLRaV-2
1
GLRaV-3
16
GVA
0
Ebbıl komplex fertızésben ArMV+GCMV
1
ArMV+GFkV
1
ArMV- TBRV
1
ArMV+AMV
1
TBRV+GFkV
1
TBRV+AMV
1
GCMV+GLRaV-1
2
GCMV+GLRaV-3
2
GLRaV-1+GLRaV-3
4
A szimptomatológiai és a szerológiai vizsgálatok eredményei alapján megállapítható, hogy a szerológiai vizsgálattal igazoltan GFLV-vel fertızıdött növények levéldeformáció, mozaik, klorózis, és sárga mozaik tüneteket mutattak. Hasonló tüneteket mutatott a többi begyőjtött minta is, de a GFLV-t nem minden esetben tudtuk azonosítani mindegyik tüneteket mutató levélmintában.
55
Az ArMV pozitív mintáknál megfigyelhetı volt ugyancsak levéldeformáció, mozaik, sárga mozaik és egy esetben a lombozat vörösre színezıdése. A TBRV-re pozitív leveleken, mozaikon, levéldeformáción kívül, levélelszínezıdést (vörösödés) és levélsodródást is tapasztaltunk. A GCMV esetében a pozitív eredményt adó minták olyan tıkékrıl származtak, amelyek különféle levéldeformációkat, krómsárga mozaikot és a GLRaV-3-al komplex fertızésben vörösödét és levélsodródást mutattak. A vírus jelenlétét olyan mintában is kimutattuk, amely nem mutatott vírufertızésre utaló tüneteket. Az egyik legnagyobb mennyiségben pozitív eredményt adó kórokozó a GFkV volt, amelyet nagy gyakoriságban elsısorban Magyarország északkeleti régióiban azonosítottunk. A tünetek rendkívül változatosak voltak és nem utaltak egyértelmően a vírus jelenlétére. Ezek a levél nekrotikus foltossága, klorózis, mozaik, levéldeformáció, esetenként krómmozaikszerő és sárgamozaikos tünetek, valamint érkivilágosodáshoz hasonló tünetek voltak. Az
AMV -
ArMV
komplex
fertızés
esetében
klorózis,
levéldeformáció,
levélelszínezıdés fordult elı. A kórokozó jelenlétét tünetmentes levélminta esetében is kimutattuk. A Grapevine leafroll-associated virus 1, 2, 3 az általuk okozott tünetek alapján nem különíthetı el. A megfigyelések szerint csak levélelszínezıdést (vörösödést, sárgulást) vagy az elszínezıdés melett levélsodródást is okoztak. A fertızött növényeken néhány nem tipikus, de vírusfertızöttségre utaló tünetet is lejegyeztünk, mint a sárga vagy krómsárga mozaik, nekrotikus foltok, érmenti mozaik, levéldeformáció. Egy esetben a GLRaV-1 et mutattunk ki levéldeformációt mutató mintából, amelynek tıkéje tipikus faszöveti barázdáltság kórokozóját jelezte. A leggyakoribb komplex fertızést elıidézı vírusok a GLRaV-1 és GLRaV-3 voltak. Gyakran tapasztaltuk jelenlétüket GCMV-vel együtt. A GLRaV-3-mal alkotott komplexben a levélsodródás és vörösödés tünete dominált, a GLRaV-1-gyel közösen, pedig a GCMV-re jellemzıbb levéldeformáció volt domináns. Mindezek a levélminták az ország 17 borvidékérıl származtak, így a vírusok jelenléte borvidékenként a 2. táblázat szerint alakult.
56
2. táblázat. A szerológiai vizsgálatok eredményei borvidékenként Borvidékek Badacsonyi
Győjtött minták száma 43
Fertızött minták száma 10
Vírusok 4 GLRaV1 2 GLRaV3
Balatonboglári
10
1 TBRV 1 GLRaV1
5
1 GLRaV3
Balaton-felvidéki
56
1 GFLV 3 AMV
19
3 GLRaV3
Víruskomplexek 2 GLRaV1GLRaV3 1 GCMVGLRaV1 1 ArMVGCMV 1 GCMVGLRaV1 2 GCMVGLRaV3 1 GLRaV1GLRaV3
3 GFkV 2 GLRaV1 2 GFLV 1 TBRV 1 GLRaV2 1 GCMV 1 GFLV
BalatonfüredCsopaki Bükki Egri
4
1
3 14
8
Etyek- Budai Kunsági
7 12
0 3
Mátrai Nagy-Somlói Pécsi Soproni
15 3 8 8
9 0 1 3
Szekszárdi
21
4
Tokaji
15
6
Tolnai Villányi Zalai
13 11 34
2 1 4
2 GCMV 1 GFLV 4 GFkV 1AMV 1 GFkV 1 GLRaV1 2 ArMV
Összesen
277
76
61
7 GFkV 1 ArMV 2 GLRaV1 1 GLRaV3 9 GFkV 1 GLRaV3 2 GLRaV3
57
1 GLRaV1GLRaV-3 1 ArMV-GFkV 1 ArMV-TBRV 1 TBRV-GFkV 1 ArMV-AMV 1 AMV-TBRV 14
A Badacsonyi borvidék mintagyőjtı helyeirıl származó mintákban leggyakrabban levéldeformációt, sárgulást, klorózist, nekrotikus foltosságot és levélsodródást tapasztaltunk. A győjtött 43 mintából 10 mintában mutattuk ki vírus jelenlétét. 4 mintában találtunk GLRaV-1-t, kettıben GLRaV-3-at, egy mintában pedig TBRV-t. Három esetében komplex fertızést mutattunk ki. A sárgulást és érmenti mozaikot mutató tıkékrıl győjtött levelekben a GLRaV-1 és a GLRaV-3 együttes jelenlétét tapasztaltuk. Levéldeformációt mutattak a GCMV és GLRaV-1 vírusokkal fertızött tıkék. A Balatonboglári borvidék mintagyőjtı helyein 10 olyan levélminta győjtése történt, ahol krómsárga mozaik, levéldeformáció, vörösödés és levélsodródás tünetek voltak megfigyelhetık. 5 mintában találtunk vírust. Egy-egy esetben GLRaV-1, GLRaV-3, GFLV, valamint, egy-egy minta esetében igazoltuk a GCMV jelenlétét ArMV-sal és GLRaV-1-gyel. Az elıbbi krómmozaikos elszínezıdést mutatott, az utóbbi levéldeformációt. A Balatonfelvidéki borvidékrıl származó 56 minta közül 19-ben mutattunk ki vírusok jelenlétet. A leggyakoribb tünetek sárgulás, vörösödés, levélsodródás, levéldeformáció, mozaik és klorózis voltak. Három - három mintában bizonyítottuk szerológiai úton AMV, GLRaV-3 és GFkV vírusok jelenlétét. Két mintában GLRaV-1-et és GFLV-t, egy-egy mintában pedig a GCMV, ArMV és TBRV vírusokat azonosítottuk. Három mintában komplex fertızést mutattunk ki. Vörösödést és levélsodródást mutatott az a három tıke, amelyek közül kettıben GCMV és GLRaV-1-et, egyben pedig GLRaV-1-et és GLRaV-3-at is kimutattunk. A Balatonfüred-Csopaki borvidékrıl származó négy, sárga mozaikot mutató minta közül egyben sikerült GFLV-t találni. Az Egri borvidékrıl származó 14 levélminta győjtésekor levéldeformációt, mozaikot, klorózist és sárgamozaikot figyeltünk meg. Közülük nyolcban találtunk vírusfertızést. Hétben GFkV egyben pedig ArMV. Az Etyek-Budai és
a Nagy-Somlói és a Bükki borvidékekrıl származó
levélmintákban, amelyeknél sárgulás, sárgamozaik és mozaik valamint levéldeformáció tüneteket figyeltünk meg, nem találtunk a vizsgált 10 vírusból. A tünetek feltehetıleg tápanyaghiányt vagy vízhiányt jelezhettek, vagy olyan vírus jelenlétét, amelyre a vizsgálat nem terjedt ki. A Kunsági borvidék 12 levélmintájából 3 mintában találtunk levéldeformáció, sárga mozaik, érnekrózis, vörösödés tüneteket, és egy esetben GLRaV-1-et és két esetben GLRaV3-at mutattunk ki.
58
A Mátrai borvidéken mozaikot, sárgamozaikot, levéldeformációt, klorózist és krómsárga mozaikot tapasztaltunk. A begyőjtött 15 mintából 9 mintában találtunk GFkV-t. A Pécsi borvidékrıl győjtött 8 mintából egy mintában tudtuk csak a GLRaV-3 jelenlétét bizonyítani. Vörösödés és levélsodródást több esetben is tapasztaltunk, emellett pedig levéldeformációt és mozaikfoltosságot is megfigyeltünk. A tünetek kiváltó okai valószínőleg fitoplazmás fertızés vagy tápanyaghiány következményei. A Soproni borvidékrıl származó nyolc mintából 3 minta volt fertızött. Két mintában GLRaV-3-at, egy mintában pedig GLRaV-1 és -3 együttes jelenlétét mutattuk ki. A fertızött tıkék lombozata vörös elszínezıdést és levélsodródást mutatott. A krómsárga mozaikos levélmintából nem tudtunk kimutatni vírusfertızést. A Szekszárdi borvidékrıl győjtött 21, leggyakrabban vörösödés, sárgulás, sárga mozaik és érkivilágosodás tüneteit mutató tıkékrıl származó levélmintákból négy esetében mutattunk ki vírus jelenlétét. Két mintában GCMV, egy mintában GFLV és egy mintában ArMV és GFkV együttes jelenlétét bizonyítottuk az ELISA teszttel. A Tokaji borvidéken leggyakrabban megfigyelt tünetek levéldeformáció, mozaik, klorózis, sárga mozaik és nekrotikus foltosság voltak. A tüneteket mutató tıkékrıl 15 minta került begyőjtésre. Közülük hat minta esetében igazolódott vírus jelenléte. Négyben GFkV-t, egyben AMV-t, szintén egy minta esetében ArMV-TBRV komplexét mutattuk ki. A Tolnai borvidékrıl győjtött 12 mintából kettı esetében azonosítottunk vírus kórokozót. Az egyikben GFkV egyedül, a másikban pedig TBRV-vel együttesen volt jelen. Az elsı esetben a tıke lombozatán nekrotikus foltosságot, a második esetben mozaikfoltosságot tapasztaltunk. A Villányi borvidékrıl 11 minta került begyőjtésre. A leveleken vörösödés, levélsodródás, mozaik és levéldeformáció is megfigyelhetı volt. Közülük egy minta esetében tudtuk GLRaV-1 jelenlétét bizonyítani. A
Zalai
borvidékrıl
származó,
leggyakrabban
mozaikfoltosságot,
sárga
mozaikfoltosságot, vörösödést és levélsodródást mutató tıkék esetében 34 begyőjtött mintájából 4-ben mutattunk ki vírust. Kettıben ArMV, egy-egy esetben pedig AMV mellett ArMV és TBRV jelenléte is bizonyítható volt. A 2010. évi mintagyőjtés alkalmával olyan vírusok jelenlétét is vizsgáltuk, amelyek hazánkban még egyáltalán nem, vagy csak szılırıl nem kerültek leírásra, viszont elıfordulásuk feltételezhetı vagy várható. Ilyenek voltak Cherry leafroll virus (CLRV), Raspberry ringspot virus (RpRSV), Raspberry bushy dwarf virus (RBDV), Strawberry latent
59
ringspot virus (SLRSV), Tomato ringspot virus (ToRSV) és a Tobacco ringspot virus (TRSV). A szerológiai vizsgálattal pozitív eredményt kaptunk RBDV esetében két mintában, melyek esetében a levélzet elszínezıdése volt megfigyelhetı, egyik minta esetében sárgulás, a másik esetben pedig vörösödés. RpRSV egy esetben lett pozitív, nekrotikus foltokat tapasztaltunk a tıkérıl begyőjtött levélmintán. A Cherry leafroll virust 3 esetben mutattunk ki szerológiai
vizsgálattal
mozaik
tünetet
mutató
tıkérıl.
GCMV-val
komplexben
érkivilágosodást, ToRSV-t klorózist mutató tıke levélmintájából. ToRSV-t ezen kívül még 1 esetben mutattunk ki, ahol a tıke levélzetén klorózist figyeltünk meg. Valamint egy esetben TRSV vírus estében is pozitív eredményt kaptunk, levéldeformációt mutató tıkérıl származó levélmintában. A pozitív eredményeket adó levélmintákat -80 oC- os mélyfagyasztóba helyeztük el a további vizsgálatok elvégzéséig. Az eddigi eredmények meggyızıen bizonyították, hogy a betegségtünetek egyedül alkalmatlanok a kórokozó vírus pontos azonosítására, ezért mindenképp szükség van azoknak más módszerek eredményeivel való összevetésére.
4.3. Molekuláris vizsgálat eredményei Szerológiai vizsgálat során a korábban begyőjtött GLRaV-1 és GLRaV-3 vírusokra pozitív eredményt adó szılı levélminták molekuláris vizsgálatára került sor reverz transzkripciós polimerizációs láncreakció (RT-PCR) módszerrel (3. táblázat).
60
3. táblázat. A molekuláris vizsgálathoz felhasznált szılılevélminták
PCR vizsgálat sorszám
ELISA vizsgálat mintaszám
Minta erdete
1.
2.
Kıszeg
2.
3.
Kıszeg
3.
24.
Badacsonytomaj
4.
33.
Cserszegtomaj
5.
1.
Kıszeg
6.
9.
Badacsonytomaj
7.
15.
Balatonboglár
8.
20.
Badacsonytomaj
9.
137.
Pécs
10.
37.
Cserszegtomaj
11.
51.
Kecskemét
A GLRaV-1 és a GLRaV-3 vírusok HSP70h fehérjének kimutatására alkalmas primerek segítségével öt mintában (1. 2. 3. 4. és 6. számú) kaptunk olyan 546 illetve 540 bázispár nagyságú PCR termékeket, amelyek a GLRaV-3 illetve GLRaV-1 vírus jelenlétét bizonyítják. Az RT-PCR során pozitív eredményt adó minták közül az egyes és kettes számú minták Kıszegrıl származnak, a hármas számú minta Badacsonytomajról származik, a négyes izolátum Cserszegtomajról származó szılılevélminta. A hatos számú minta ugyancsak Badacsonytomajról származik. A termékeket gélbıl izoláltuk (22. ábra).
61
22. ábra. Gélbıl izolált PCR termékek gél elektroforézis képe
Jelmagyarázat: M - marker, 1 - 1. mintaszámú GLRaV-3 izolátum, 2 - 2. mintaszámú GLRaV-3 izolátum, 3 - 3. mintaszámú GLRaV-3 izolátum, 4 – 4. mintaszámú GLRaV-3 izolátum, 6 - 6. mintaszámú GLRaV-1 izolátum
A ligálást és transzformálást követıen a rekombináns plazmidokat felszaporításakor, az elsı négy minta esetében a mintánkénti hat minipreparátumból (23. ábra) az 1/4; 2/2; 3/5; 4/2 jelzető minipreparátumokat választottuk ki, majd újra felszaporítottuk, tisztítottuk, és meghatároztuk a szekvenciájukat. A hatos számú minta esetében a minipreparátumokban felszaporított termékeknél két mérettartományba estek a PCR termékek, így két transzformált baktériumkolónia vizsgálatára is sor került a különbségek meghatározása céljából (6/3 és 6/4es számú minipreparátumok).
62
23. ábra. A klónozás során szekvenálásra kiválasztott minipreparátumok gélfotója
Jelmagyarázat: 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6 - az 1. számú minta PCR termékének minipreparátumai, 2/1, 2/2, 2/3, 2/4, 2/5, 2/6 - a 2. számú minta PCR termékének minipreparátumai, a 3/1, 3/2, 3/3, 3/4, 3/5, 3/6 - a 3. számú minta PCR termékének minipreparátumai, 4/1, 4/2, 4/3, 4/4, 4/5, 4/6 - a 4. számú minta PCR termékének minipreparátumai, a 6/1, 6/2, 6/3, 6/4, 6/5, 6/6 – a 6. számú minta PCR termékének minipreparátumai
A kiválasztott minipreparátumokban lévı baktériumokat felszaporítottuk, majd szekvenálásra elıkészítettük, kitisztítottuk, és újra elvégeztük a gélelektroforézist. A 24. ábrán látható, hogy az egyes, kettes, hármas és négyes számú minta esetében a PCR termékek azonos magasságban vannak, a hatos számú minta esetében a 6/3 számú kolóniában felszaporított PCR termék mérete megegyezik az elsı négy mintáéval, míg a 6/4 jelzéső minipreparátumban felszaporított termék méretében magasabb tartományba esik.
63
24. ábra. A tisztított és emésztett PCR termék minipreparátumok gélfotója
Jelmagyarázat: M - marker, ¼ - az 1. számú minta 4. minipreparátuma által felszaporított PCR terméke, 2/2 - a 2. számú minta 2. minipreparátuma által felszaporított PCR terméke, 3/5 - a 3. számú minta 5. minipreparátuma által felszaporított PCR terméke, 4/2 - a 4. számú minta 2. minipreparátuma által felszaporított PCR terméke, 6/3 - a 6. számú minta 3. minipreparátuma által felszaporított PCR termék, 6/4 - a 6. számú minta 4. minipreparátuma által felszaporított PCR terméke
A felszaporított PCR termékek aminosav sorrendjének meghatározására 2011. február végén került sor. A 4. táblázatban a 6/4-es és 6/3-as E. coli baktérium kolóniák által felszaporított PCR termékek aminosavsorrendje látható. Az 5. táblázat a 1/4, 2/2, 3/5 és 4/2 jelzéső baktérium kolóniák által felszaporított PCR termékek szekvenciája látható. A 6/3 és 6/4-es számú minipreparátumok, - amelyek ugyanannak a 6. számú Badacsonytomaji GLRaV-1 vírusizolátumnak az E. coli DH5α törzsének eltérı kolóniái -, által felszaporított PCR termékek a gélelektroforézis során méretükben eltérést mutattak. A szekvencia meghatározás során megállapítottuk, hogy aminósav sorrendjük majdnem teljesen megegyezik. Az 1/4, 2/2, 3/5 és 4/2- es számú kolóniák PCR termékeinek összehasonlításból látható, hogy az 1/4-es számú kolónia esetében több helyen is látható aminosav csere, a többi kolónia által felszaporított termékhez képest.
64
4. táblázat. A 6/3-as és 6/4-es kolónia által felszaporított PCR termékek nukleotid szekvenciája (a pontok a nukleotid hiányt jelölik)
6_3
1 TGCCGGCGGAGTATAACTCGTTCAAGCGAAGTTTTGTGGGCGTCGCTTTGGAAGGGTTAG
6_4
1 TGCCGGCGGAGTATAACTCGTTCAAGCGAAGTTTTGTGGGCGTCGCTTTGGAAGGGTTAG
6_3
61 GTAAGCCGTTGAGAGCTCTCATAAACGAACCAACGTCAGCAGCTTTGTACGGCGCTGTTA
6_4
61 GTAAGCCGTTGAGAGCTCTCATAAACGAACCAACGTCAGCAGCTTTGTACGGCGCTGTTA
6_3
121 GGGGAGGTGCGCTGAAAGAGACGTACGCCGTCTTCGATTTCGGAGGAGGGACTTTAG..A
6_4
121 GGGGAGGTGCGCTGAAAGAGACGTACGCCGTCTTCGATTTCGGAGGAGGGACTTTAGATA
6_3
179 TATCGTTCATTTCAAGGTTCAATAACGTCGTGAGCGTCTTATTTTCGAAAGGAGACAACT
6_4
181 TATCGTTCATTTCAAGGTTCAATAACGTCGTGAGCGTCTTATTTTCGAAAGGAGACAACT
6_3
239 TTTTGGGAGGTCGCGACATAGACAGAGCGATAATACAATTCCTGCGTAAAGAGAAACGAA
6_4
241 TTTTGGGAGGTCGCGACATAGACAGAGCGATAATACAATTCCTGCGTAAAGAGAAACGAA
6_3
299 TAACCGGTGAGATAGATGCGGGTATATTGGCGGTTATGATAGCTGACCTAAAAGAGAAAA
6_4
301 TAACCGGTGAGATAGATGCGGGTATATTGGCGGTTATGATAGCTGACCTAAAAGAGAAAA
6_3
359 TTTGTGTTAATGGTGGTACACAATACACGCAAATGAAGACGTCGAACGGCTTAGAAACCT
6_4
361 TTTGTGTTAATGGTGGTACACAATACACGCAAATGAAGACGTCGAACGGCTTAGAAACCT
6_3
419 TATCATTGTCGGTAGACGAATTGAACACCGTCTCTGAACCATATATAGACAGAGCGATCA
6_4
421 TATCATTGTCGGTAGACGAATTGAACACCGTCTCTGAACCATATATAGACAGAGCGATCA
6_3
479 AAATCTTCGTAGAAGGTGCTGA
6_4
481 AAATCTTCGTAGAAGGTGCTGA
65
5. táblázat. Az 1/4, 2/2, 3/5 és 4/2 jelzéső kolóniák által felszaporított PCR termékek nukleotid szekvenciája (a pontok az azonosságokat jelölik)
2.2 3.5 4.2 1.4
1 1 1 1
CAAAACTGGTCTTGACAACTTTTACCCAGACCCGGTTATTGCTGTTATGACTGGGGGGTC ............................................................ ............................................................ ......C.................T........T......T...................
2.2 3.5 4.2 1.4
61 61 61 61
AAGTGCTCTAGTTAAGGTCAGGAGTGATGTGGCTAATTTGCCGCAGATATCTAAGGTCGT ............................................................ ............................................................ .................................C.......................T..
2.2 3.5 4.2 1.4
121 121 121 121
GTTCGACAGTACCGATTTTAGATGTTCGGTGGCTTGTGGGGCTAAGGTTTACTGCGATAT ............................................................ ........................C................................... ........A...T........G........A..C....................T.....
2.2 3.5 4.2 1.4
181 181 181 181
TTTGGCAGGTAATAGCGGACTGAGACTGGTGGACACTTTAACGAATACGCTAACGGACGA ............................................................ ......G..................................................... .......................................G....................
2.2 3.5 4.2 1.4
241 241 241 241
GGTAGTGGATTTTCAGCCGGTGGTAATTTTCCCGAAAGGTAGTCCAATACCCTGTTCATA ............................................................ ..C......................................................... ...G.....C.....A............................................
2.2 3.5 4.2 1.4
301 301 301 301
TACTCATAGATACACAGTGGGTGGTGGAGATGTGGTATACGGTATATTTGAAGGGGAGAA ............................................................ ............................................................ C.....C.............................G.......................
2.2 3.5 4.2 1.4
361 361 361 361
TAACAGAGCTTTTCTAAATGAACCGACGTTCCGGGGCGTACCGAAACGTAGGGGAGACCC ........................................T................... ........................................T......T............ ......G....................A............T...................
2.2
421 AGTAGAGACCGACGTGGCGCAGTTTAATCTCTCCACGGACGGAACGGTGTCTGTTATCGT
3.5
421 ............................................................
4.2
421 ............................................................
1.4
421 .AA............A.....A......T.A...........T.....A........T..
2.2
481 TAATGGTGAGGAAGTAAAGAATGA
3.5
481 ........................
4.2
481 ........................
1.4
481 ...C....................
66
Az általunk győjtött izolátumok HSP70-es gén 500 bp hosszúságú szakaszának aminosav sorrend meghatározását követıen a Biotechnológiai Információk Nemzetközi Központi Adatbázisában (National Center for Biotechnology Information, NCBI) elhelyezett GLRaV-1 (25. ábra) és GLRaV-3 (26. ábra) HSP70-es fehérjetermék variánsainak adataival összevetve a következı törzsfákat kaptuk:
Jelmagyarázat: génbanki azonosítóval rendelkezı izolátumok: AY754914.1 - sv12-5 (Csehország), AY754912.1 - sv12-3 (Csehország), AY754929.1 - sv26-1 (Csehország), AY754931.1 - sv26-3 (Csehország), AY754920.1 sv17-1 (Csehország), AY754944.1 - Tl33-6 (Szlovákia), AY754939.1 - Tl33-1 (Szlovákia), FJ952150.1 - IR-S7 (Irán), AF233935.1 - (USA), AY754924.1 - sv20-1 (Csehország), AY644650.1 - Czech heat shock protein gene (Csehország), AY754933.1 - Tl29-1 (Csehország), AY754915.1 - sv15-1 (Csehország), AY754905.1 - sv11-1 (Csehország), AF195822.1 - (Ausztrália), a magyarországi izolátumok jelölése: 6.4.1. (Badacsonytomaj)
25. ábra. A GLRaV-1 HSP70-es génszakaszának rokonsági viszonyai
A GLRaV-1 HSP70-es gén 500 bp hosszúságú szakaszának génbankból és az általunk győjtött izolátum nukleinsav sorrendjének analízisébıl kapott dendrogram adatai szerintKominek is munkatársai (2005) közleményében megjelentekhez hasonlóan,- az eddig ismert szekvenciaadatok alapján GLRaV-1 HSP70 gén esetében a genetikai változékonyság alapján két csoportot lehet elkülöníteni. Az egyik az általuk A csoportnak, a másik az E csoportnak nevezett. Az „A” csoportot alkotja az AF233935-ös génbanki azonosítószámú Amerikai Egyesült Államokból és az AF195822-es Ausztráliából való izolátumok (Amerikai-Ausztrál „A” csoport). Az „E” csoportba az 540 bp hosszúságú HSP70 gén szakaszának analízisekor pedig olyan európai izolátumok kerültek, mint az AJ404738 számú Ausztriából és az Y15891 azonosítóval ellátott Olaszországból származó vírusizolátumok. Kominek és munkatársai a saját csehországi és szlovákiai izolátumokat és azok izolátumainkénti 4-6 klónjait helyezték ebbe a rendszerbe. A 25. ábrán látszik, hogy valóban van genetikai távolság a két csoportosulás között. 67
Az elsı csoportot az AY754914.1 sv12.5., az AY754912.1 sv12.3., az AY754929.1 sv26.1, az AY754931.1. sv26.3. és az AY754920.1 sv17.1. csehországi izolátumok, valamint az AY754944.1. Tl33.6. és az AY754939.1. Tl33.1. Szlovákiából származó izolátumok. alkotják. A második csoportba az általunk készített dendrogram adatai alapján az FJ952150.1. IR-S7 (Irán), az AF233935.1 (USA), az AY754924.1 sv20.1., az AY644650.1., az AY754933.1 Tl29.1-es, az AY754915.1. sv15.1., valamint az AY754905.1 sv11.1. (Csehország) izolátumok tartoznak. Habár a fent említett publikáció adatai szerint az AF195822.1 jelzéső, ausztráliai vírusizolátum is ugyanebbe a csoportba sorolható, a többi izolátumtól jól láthatóan eltér. A 6.4.1-es számmal ellátott Badacsonytomajról származó izolátum a filogenetikai elemzés alapján az elsı csoportba tartozik.
68
Jelmagyarázat: génbanki azonosítóval rendelkezı izolátumok: ef508151 - NZ-1 (Új- Zéland), aj748524 - IL1 (Izrael), aj748521-MT-48-4 (Olaszország), aj748512 - AUSG5-5 (Ausztria), aj748514 - C3 (Kína), dq780887 C3-1 (Kína), dq780891 - WA N1-1 (USA), gq352631 - 621 (Dél- Afrika), aj748511 - AUSG5-4 (Ausztria), aj748517 - Sy2-7 (Szíria), eu344893 - Cl-766 (Chile), af037268 - NY1 (USA), aj748522 - Tu32 (Tunézia), dq 780889 - C5-1 (Kína), aj748513 - AUSG5-8 (Ausztria), gq352632 - 623 (Dél- Afrika), eu259806 - GP-18 (DélAfrika), aj748516 - Sy2-4 (Szíria), aj748510 - AUSG5-2 (Ausztria), aj748519 - MT-48-2 (Olaszország), gq352633 - PL-20 (Dél-Afrika), a magyarországi izolátumok jelölése: 3.5. (Badacsonytomaj), 2.2. (Kıszeg), 4.2. (Cserszegtomaj), 1.4. (Kıszeg)
26. ábra. A GLRaV-3 HSP70-es génszakaszának összehasonlító elemzésébıl elkészített filogenetikai törzsfa
A GLRaV-3 HSP70-es gén 500 bp hosszúságú szakaszának szekvencia analízise és a génbankban található külföldi izolátumok adatai alapján készített dendrogram (26. ábra) adatai alapján 5 csoportot lehet elkülöníteni. Az elsı csoportba az ef508151 génbanki azonosítójú NZ-1 Új Zélandból származó izolátum tartozik. A második csoportba több izolátum is sorolható. Ezek az aj748524 IL1 (Izrael), aj748521 MT-48-4 (Olaszország), az aj748512 AUSG5-5 (Ausztria), aj748514 C3 (Kína), a
69
dq780887 C3-1 (Kína), dq780891 WA N1-1, (USA), a gq352631 621 (Dél-Afrika), aj748511 AUSG5-4 (Ausztria), az aj748517 Sy2-7 (Szíria), az eu344893 Cl-766 (Chile), az af037268 NY1 (USA) valamint az aj748522 Tu32 jelzéssel ellátott (Tunézia) GLRaV-3 HSP70-es gén szekvencia adatai. Ebbe a csoportba tartozik 3 magyarországi általunk győjtött és vizsgált izolátum is. A 3.5 jelzéső badacsonytomaji izolátum a legnagyobb hasonlóságot az IL1, az MT48-4 és az AUSG 5-5 izolátumokkal mutat azonosságot. Jól látható a dendrogramon, hogy nincs közöttük különbség. A 2.2 kıszegi minta a C3 és C3-1 kínai mintákhoz hasonlít leginkább, míg a 4.2 Cserszegtomajról származó izolátumunk a CL-766 izolátummal áll közelebbi rokonságba. A harmadik csoportba, az általunk készített törzsfa adatai alapján csak a dq780889-es génbanki azonosítóval rendelkezı C5-1-es kínai izolátum tartozik. A negyedik csoportot az aj748513 számú AUSG5-8 ausztriai minta, a gq352632-es azonosítójú 623-as Dél- Afrikából származó, az eu259806- GP-18-as szintén dél- afrikai, az aj748516 génbanki azonosítójú Sy2-4-es szíriai minta és az, aj748510-es AUSG5-2 jelzéső ugyancsak Ausztriából aszármazó GLRaV-3 izolátumok alkotják. A vizsgált magyarországi izolátumok közül a szintén Kıszegrıl származó 1.4 jelzéső izolátum ebbe a csoportba került a vizsgálataink alapján. Az ötödik utolsó csoportot a törzsfát alkotó izolátumok közül az aj748519-es számú MT-48-2 olaszországi izolátum és a gq352633 génbanki azonosítójú Pl-20-as dél-afrikai izolátum alkotja. A vírus izolátumok szekvencia adatai a Nemzetközi Génbanki Adatbázisba HE794021-HE794025 nyilvántartási számokkal kerültek be a magyarországi szılı levélsodródás vírus izolátumok közül.
4.4. A közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levélminta vizsgálatának eredménye A szılı levélmintákkal egyidıben elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztünk a vírusfertızésre utaló tüneteket mutató levélmintákon (27. ábra). Megállapítottuk, hogy a levélmintákban kb. 80-120 nm átmérıjő, közel izometrikus glükoproteid burokkal rendelkezı virionok láthatók (28. ábra). A morfológiai felépítés alapján Tospovirus nemzetséghez tartozó paradicsom
bronzfoltosság
vírus
(Tomato
spotted
wilt
virus,
TSWV)
jelenlétét
valószínősítettük, így további molekuláris vizsgálatokat végeztünk S1983 és S2767 primerek segítségével, összevetettük a kapott PCR termék nukleotid sorrendjét (6. táblázat) a génbank
70
adatbázisában szereplı TSWV vírusizolátumok szekvenciaadataival. Ennek eredményeként igazoltuk a levélmintában a vírus jelenlétét.
27. ábra. Klorotikus foltok közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis L.) levelein
28. ábra. A Tomato spotted wilt virus virionok közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis) levélben (Fotó: Bóka Károly)
71
6. táblázat. A TSWV köpenyfehérje régiójának nukleotid szekvenciája ACCCCAAACATTTCATAGAACTTGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCCATAGCAATACTTCCTTTAGCATTAGGATTGCT GGAGCTAAGTATAGCAGCATACTCTTTCCCCTTCTTCACCTGATCTTCATTCATTTCAAATGCTTTGCTTTTCAGCACAG TGCAAACTTTCCCTAAGGCTTCCCTGGTGTCATACTTCTTTGGGTCGATCCCAAGGTCCTTGTATTTTGCATCCTGATAT ATAGCCAGGACAACACTGATCATCTCAAAGCTATCGACTGAAGCAATAAGAGGTAAGCTACCTCCCAGCATTATGGCAAG CCTCACAGACTTTGCATCATCAAGAGGTAATCCATAGGCTTGAATCAAAGGGTGGGAAGCAATCTTAGATTTGATAGTAT TGAGATTCTCGGAATTCCCAGTTTCCTCAACAAGCCTGACCCTGATCAAGCTATCAAGCCTTCTGAAGGTCATGTCAGTG GCTCCAATCCTGTCTGAAGTTTTCTTTATGGTGATTTTACCAAAAGTAAAATCACTTTGCTTAATAACCTTCATTATGCT CTGACGATTCTTCAGGAATGTCAGACATGAAATAACACTCATCTTTTTGATCTGGTCAAGGTTTTCCAGACAAAAAGTCT TGAAGTTGAATGCTCCC
72
5. Következtetések, javaslatok A tüneteket mutató mintákban azonosított alacsony vírusfertızöttség oka részben abban keresendı, hogy más tényezık is szerepet kaphattak a tünetek kialakulásában, pl. a viroid és más általunk nem vizsgált vírusferızések is levélsodródást okoznak, a fitoplazmás tünetek pedig gyakran összetéveszthetık a vírusbeteg növények tüneteivel. Számos szılıvírus kimutatásához nem áll rendelkezésre antiszérum. A kimutathatóságot lényegesen befolyásolja a mintavétel ideje és a feltárás módja, a víruskoncentráció, valamint a növényi szövetek inhibitor tartalma, ami szintén eredménytelenségre vezethet. Ez lehet az oka annak, hogy a szipmtomatológiailag fertızöttnek tekinthetı tıkék esetében a begyőjtött minták kevesebb, mint felébıl sikerült kimutatni valamely vírust. Számos esetben GFkV fertızöttséget tudtunk kimutatni, olyan tıkékrıl, melyek a szakirodalomban leírt tüneteket nem mutatták. A vírussal fertızött tıkék levelei sárgultak, levél deformációkat mutattak és néhány esetben mozaik foltosságot figyelhettünk meg. Ezeket a mintákat Tokaj, Gyöngyöstarján és Szomolya területérıl győjtöttük be, itt a GFkV volt a leggyakrabban elıforduló kórokozó. A vírusos leromlást okozó nepovírusok külön-külön nem voltak nagy számban jelen. A felmérés eredményei azt mutatják, hogy a GFLV a korábbi eredményekkel ellentétben, már kevésbé gyakori, vagy a fertızı leromlás tünet együttesét más kórokozók is elıidézhetik. A szılı fertızı leromlás tünetcsoportba sorolt vírusok együtt is kisebb gyakoriságban fordultak elı, mint a levélsodródás tünetet okozó GLRaV 1-3, amelyeket 33 esetben sikerült azonosítani. A tipikus levélsodródás és levélelszínezıdést mutató szılıtıkékrıl származó mintáknál csak kisszámú GLRaV 1-3 jelenlétet tudtunk bizonyítani szerológiailag. A tünettani és szerológiai vizsgálatok összevetése után arra következtetünk, hogy a növény
az
esetek
legnagyobb
részében
valamilyen
anyagcserezavarral
(levelek
deformációjával, mozaikfoltossággal, levélelszínezıdéssel) jelzik a kórokozók jelenlétét. A szakirodalmi leírásoknak megfelelı, adott vírusra jellemzı jól behatárolható tünetek ritkán fordultak elı. A szılı foltosodás vírus (GFkV) esetében voltak különbözı vírusfertızöttségre utaló tünetek, azonban olyan tünetet, melyet a fásszárú teszteléskor indikátorfajtán megfigyelhetı, szakirodalmi forrásokban megtalálható tünet, nem tapasztaltunk. Bármely, vírussal fertızött tıke közül a szılı levélsodródás vírusok esetében lehetett a legnagyobb biztonsággal vírus jelenléthez kötni a kialakult tüneteket. A begyőjtött minták szerológiai vizsgálatakor kis számú mintában tudtunk vírust kimutatni. Ennek okai lehetnek, hogy
73
antiszérum hiányában a szılı levélsodródás 4, -5, -8, -9 vírusokat nem tudtuk vizsgálni, a tünetek kialakulásában más kórokozók- fitoplazmák- is szerepet játszhattak, vagy egyes szılıfajták levélelszínezıdésre való hajlama állhat a tapasztalt levélelszínezıdés hátterében. Esetleg a szerológiai vizsgálat során a vírusok kimutathatóságát gátolták a növény inhibítoranyagai (tannin, fenol) vagy a szılıpatogén vírusok köpenyfehérjéjében bekövetkezı mutáció módosította azt, vagy a víruskoncentráció nem volt kellıen magas ezekben a levélmintákban. A vizsgálatok során kapott adatokból kitőnik a GFkV-val fertızött minták nagyobb száma, különösen az ország észak-keleti részén: az Egri, a Mátrai, a Tokaji borvidéken, de jelen van a Tolnai és a Balatonfelvidéki borvidéken is. Jelenlétére utaló speciális tünet nincs, az indikátorfajon (Vitis rupestris cv. St. George) kívül más fajtákban nem írtak le tünetet, látens fertızést idéz elı. Az általunk tapasztaltak szerint levéldeformáció, mozaikfoltosság és klorózis is jelezheti a fertızést. Sok esetben a levélsodródás és vörös vagy sárga elszínezıdés sem a Magyarországon gyakorinak számító GLRaV-1 és GLRaV-3 jelenlétét mutatta. Ezeket a vírusokat a Balaton körüli borvidékekben (Badacsonyi, Balaton-felvidéki), az ország északnyugati részén fekvı Soproni és a Déli- Dél- Nyugati Pécsi és Villányi borvidékeken találtuk meg nagyobb számban. Ezen kívül a Kunsági borvidéken is észleltük jelenlétét. AMV-t is találtunk a Balatonfelvidéki, a Tokaji és a Zalai borvidékeken is. A Nepovirus nemzetség tagjai közül a GCMV és az ArMV voltak a gyakoribbak, különösen a Zalai borvidéken. A világszerte nagy problémát okozó korai vírusos leromlást elıidézı vírusokat, a jelenlétükre utaló
tünetek
gyakoriságához
képest
kevesebb
esetben
sikerült
kimutatni.
A
legelterjedtebbnek tartott GFLV-t is csak öt minta esetében lehetett igazolni a Balatonboglári, Balatonfelvidéki, Balatonfüredi és a Szekszárdi borvidéken. A kapott eredményekbıl jól látható, hogy a korábban nagy jelentıségő GFLV gyakoriságát tekintve a korábbi irodalmi források adataihoz képest kisebb mértékő, bár a többi nepovirussal (GCMV, TBRV, ArMV) együtt még mindig jelentıs arányt képvisel. Vizsgálataink alapján levélsodródás tüneteit okozó GLRaV-1 és GLRaV-3 jelentısége gyakorisága mitt is nagyobb. A Magyaroszággal szomszédos országok közül Ausztriában, Szlovéniában és Horvátországban
is
végeztek
hasonló
szerológiai
vizsgálatokat.
A
víruscsoportok
gyakoriságában hasonló tendenciát figyeltek meg, a kórokozók arányát illetıen azonban eltérések vannak. Gangl és munkatársainak (2011 a,b) eredményei szerint Ausztriában is a leggyakoribbak a szılı levélsodródás vírusok. A legnagyobb arányban, 23%-ban GLRaV-1 jelenlétét igazolták, ezt követi a GFkV, melyet 13%-os gyakorisággal mutattak ki, és a 74
harmadik helyen a GLRaV-3 áll, mely a vizsgálataik eredménye szerint 5%-os gyakoriságú. Hasonlóan nagy arányban, a vizsgált minták 37%- ában igazolták Szlovéniában is GLRaV-1 jelenlétét (Tomazič és mtsai, 2005). Horvátországban a virológiai vizsgálatok eredményei szerint a GLRaV-3 vírus gyakorisága jelentıs, mintegy 80%-ban igazolták a jelenlétét, különösen Dalmáciában (Kontić és mtsai, 2009), de GLRaV-2 jelenlétét is igazolták 4,1%ban (Voncina és mtsai, 2011b). A három országban végzett virológiai vizsgálat eredménye szerint a nepovírusok gyakorisága itt is alacsony, közülük is elsısorban a GFLV fordul elı leggyakrabban, majd ezt követi az ArMV (Tomazič és mtsai, 2005, Kontić és mtsai, 2009, Gangl és mtsai, 2011 a, b). Molekuláris
úton
egy
Badacsonytomajról
származó
GLRaV-1
és
négy
Badacsonytomajról, Kıszegrıl és Cserszegtomajról származó GLRaV-3 izolátumot vizsgáltunk. A HSP70 homológ fehérjét kódoló gén 500 bázispár hosszúságú génszakaszának nukleinsav sorrendjének meghatározása után összevetettük a már génbanki adatbázisban szereplı külföldi izolátumok szekvencia adataival. A filogenetikai törzsfák adatai alapján a GLRaV-3 izolátumok közül a 3.5 Badacsonytomajról, a 4.2 számú Cserszegtomajról és a 2.2 számú Kıszegrıl származó izolátumok egy csoportba sorolhatók. A 3.5. minta közel azonos a génbankban már szereplı IL1 izraeli, MT48-4 olaszországi és az AUSG5-5 ausztriai vírusokkal. Ezektıl kis mértékben tér el a 2.2 minta, a tıle legkevésbé eltérı a C3-1 és C3-as Kínából származó izolátumok. A 4.2 cserszegtomaji minta a dendrogram adatai alapján a legközelebbi rokonságot a CL-766-os chilei, az SY2-7-es szír és az AUSG5-4-es ausztriai izolátumokkal mutatja. Ebbe a csoportba tartozik két Amerikai Egyesült Államokból, egy Dél- Afrikából és egy Tunéziából származó izolátum is. Jól látható, hogy ezek között az országok között a földrajzi távolság olyan nagy, hogy pontosan nem lehet megállapítani, hogy melyik országból indulhatott ki a vírusfertızés, viszont a terjedésben az adatok alapján a kereskedelemnek lehetett a legnagyobb szerepe. Az 1.4 –es minta ugyancsak Kıszegrıl származó minta, habár ugyarról a tábláról származik, mint a 3.5 számú, a dendrogram adatai alapján egy másik csoportba tartozik, legnagyobb hasonlóságot a GP-18-as és 623-as dél-afrikai és az AUSG5-8-as ausztriai izolátumokkal mutatja. Ugyanide tartozik még SY2-4 jelzéső szír, valamint egy másik ausztriai AUSG5-2-es izolátum is. Az I. csoportba tartozó, jól láthatóan a többi csoporttól leginkább elkülönülı NZ-1-es Új Zélandról származó vírus, valószínősíthetıen a sajátos genetikai állományát az elszigetelt fejlıdésének köszönheti. A Magyarországról származó izolátumok hasonlóságot mutatnak a szomszédos Ausztriából származó vírusokkal, így akár más terjedési mód is közrejátszhatott a mindkét 75
országban megjelenı vírusfertızésnek. Akár természetes módon bizonyos pajzstető fajok is szerepet játszhatnak, ennek megerısítése azonban további vizsgálatok elvégzését követeli meg. A GLRaV1 esetében a korlátozottan rendelkezésre álló adatok tükrében korábbi munkák alapján csehországi, szlovákiai, iráni, Amerikai Egyesült Államokbeli és ausztrál izolátumokkal lehetett összehasonlító elemzést végezni. Megerısítést nyert, hogy valóban két csoportba lehet sorolni. Az 6.4.1 jelzéső badacsonytomaji izolátum az sv12.5-ös Csehországból származó vírussal mutatja a legnagyobb hasonlóságot, de egy csoportba sorolható az sv15.1-es, az sv12.3-as, az sv17.1-es, az sv26.1-es és az sv26.3-as csehországi, valamint a Tl 33.1 és Tl33.6-os szlovákiai izolátumokkal, amelyet korábban „E” európaiként neveztek el. A másik „A” amerikai-ausztrál csoportot egy iráni, egy amerikai, hat csehországi és egy ausztrál izolátum alkotja. A kapott adatok alapján sem tudjuk biztosan igazolni, hogy a magyarországi vírusizolátum honnan származhat, feltehetıleg a terjedésében a fertızött szaporítóanyag játszhat fontos szerepet. A génbanki adatbázisban megtalálható információk segítségével a vírusok közötti genetikai hasonlóságok feltérképezhetık, így több információhoz lehet jutni a vírusok terjedését illetıen. Ehhez szükség van arra, hogy minél több vírusizolátum szekvenciaadata legyen elérhetı a Génbank adatbázisaiban. A dolgozatban szereplı vírus izolátumok szekvencia adatai HE794021-HE794025 nyilvántartási számokkal elhelyezésre kerültek a Génbankban. Szükséges a továbbiakban a hazai vírusizolátumok molekuláris feltérképezését folytatni és szekvencia adataikat elhelyezni a vírus génbank adatbázisába, hogy ezek is hozzáférhetık legyenek további genetikai vizsgálatokhoz. A jelenlegi adatok alapján valószínősíthetı a fertızött szaporítóanyaggal való terjedés, amely a szaporítóanyag kereskedelemmel függ össze. Eredményeink megerısítik azt a már korábbról ismert tényt, hogy csak a szimptómák alapján a vírusok pontos azonosítása nem lehetséges. A tünetek egy része élettani problémákkal függhet össze, tápanyaghiány (Bovey és mtsai, 1980), más részük valószínősíthetıen fitoplazma eredető, habár a tünetek nagyon hasonlóak (Martelli, 1993). Az elvégzett szerológiai vizsgálattal mód nyílt a szılı vírusfertızöttségében az utóbbi években bekövetkezett változások nyomon követésére, úgymint egyes kórokozók megjelenése illetve elıretörése.
76
A hagyományos lágyszárú és fásszárú tesztelés a GFLV különbözı törzseit, vagy az eltérı átviteli tulajdonsággal is rendelkezı GLRaV szerológiai csoportjait nem tudja elkülöníteni, vagy új korókozók esetén a pontos azonosítást biztosítani. További hátránya az idıigénye és az egyéb biotikus és abiotikus környezeti tényezık befolyásoló hatásának érvényesülése. A jövıben mindenképp szükséges és kívánatos volna a szerológiai vizsgálatok mellett a molekuláris vizsgálatok párhuzamos elvégzése is és annak bevezetése a gyakorlatba a kórokozók pontos azonosítása érdekében. A dolgozat elkészítéséhez szükséges vizsgálatok elvégzésekor a szılılevélminták mellett közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis) levélminták is begyőjtésre kerültek. Az
esetükben
elvégzett
eletronmikroszkópos
és
RT-PCR
molekuláris
vizsgálatok
eredményeképpen paradicsom bronzfoltosság vírust (Tomato spotted wilt virus, TSWV) azonosítottunk. Ezidáig a kórokozót hazánkban errıl a fajról még nem írták le. A vírusfertızött gyomnövényt szılı ültetvényben találtuk, így további vizsgálatokat folytatunk a vírus szılı levélminták esetében is.
77
6. Összefoglalás A
dolgozat
elkészítésének
elsı
lépésében
a
korábbi
évek
magyarországi
szılıvirológiai kutatási eredményeit is felhasználva a molekuláris vizsgálati eredményekre támaszkodva a szılıvírusok
és
általuk
okozott
vírusbetegségek
rendszerezésében
bekövetkezı változások alapján a hazai rendszer is átalakításra került. 2007. és 2010. között mintegy 277 levélminta került begyőjtésre magyarországi különbözı
korú
és
fajtaösszetételő
termı
szılıültetvényekbıl.
A
levélmintákat
szimptomatológiailag, a szakirodalomban leírt tünetek alapján választottuk ki. Szerológiai úton, DAS-ELISA módszerrel vizsgáltuk a hazai szılıvírusok jelenlétét. Mintegy 26 esetben GFkV fertızést mutattunk ki. GLRaV-1 és GLRaV-3, jelenlétét azonos arányban 16-16 minta esetében találtuk meg önállóan vagy más vírussal komplex fertızést elıidézve. A GLRaV-2 megjelenését egy esetben igazoltuk. Így a vírusos leromlást elıidézı nepovírusok (GFLV, ArMV, TBRV, GCMV) együttesen kisebb számban fordultak elı, mint a levélsodródást okozó vírusok. A GFLV elıfordulását 5, az ArMV megjelenését 7, a TBRV fertızést 5, a GCMV jelenlétét pedig 8 esetben sikerült szerológiailag kimutatni. AMV fertızést 6 esetben találtunk. A GVA jelenlétét egyetlen esetben sem sikerült igazolni. Megállapítottuk, hogy a vizsgált vírusok a 17 borvidéken hogyan oszlanak meg. A GFkV- val fertızött minták az Egri-, a Mátrai-, a Tokaji-, a Tolnai- és a Balaton-felvidékiborvidéken kerültek begyőjtésre. A GLRaV-1 és GLRaV-3 vírusokat a Badacsonyi-, a Balaton-felvidéki, a Soproni-, a Pécsi-, a Villányi- és a Kunsági borvidékekben találtuk meg nagyobb számban. AMV-t is találtunk a Balaton-felvidéki-, a Tokaji- és a Zalai borvidékeken is. Ez utóbbi helyen izolálható volt GCMV és az ArMV is. A legelterjedtebbnek tartott GFLV-t is csak öt minta esetében lehetett igazolni a Balatonboglári-, Balaton-felvidéki-, Balatonfüredi- és a Szekszárdi borvidéken. A világszerte nagy problémát okozó korai vírusos leromlást elıidézı vírusok valamelyikét, a tünettani vizsgálatok alapján várthoz képest kevesebb esetben sikerült kimutatni, de együtt még mindig jelentıs arányt képvisel. Vizsgálataink alapján a levélsodródás tünetet okozó szılı levélsodródás 1 és 3 vírusok gyakoriságuknál fogva nagyobb jelentıségőek. De figyelemre méltó a szılı látens foltosság vírus magas száma, melyet elsısorban Magyarország észak- keleti régiójának ültetvényeiben tudtunk kimutatni. A szerológiai vizsgálat eredményei alapján kiválasztott és begyőjtött egy GLRaV 1 és négy GLRaV 3 izolátum további vizsgálatára került sor molekuláris módszerekkel. Ezek az
78
azonosítószámmal ellátott izolátumok a Kıszegrıl származó, 1.4. és 2.2. jelzéső, a 3.5. jelzéső Badacsonytomajról származó, a 4.2. jelzéső Cserszegtomajról származó GLRaV 3-as izolátumok, illetve az 6.4.1. azonosítóval ellátott ugyancsak Badacsonytomajról származó GLRaV 1-es izolátumok voltak. A molekuláris munka során a vírusizolátumok HSP70 homológ fehérjét kódoló szakaszát emeltük ki és szaporítottuk fel. Az alkalmazott primer a NY1-es AF037268-as génbankban elhelyezett GLRaV 3 vírusizolátum HSP70 génszakaszának aminosav sorrendje alapján tervezett indító szekvencia volt. A GLRaV 1 vírusizolátum esetében ugyancsak a HSP70 gént-t használtuk, a primertervezés alapja az AF195822 azonosítószámú ausztrál vírusizolátum volt. A HSP70 homológ fehérjét kódoló gén 500 bázispár hosszúságú génszakaszának nukleinsav sorrendjének meghatározása után összevetettük a már génbanki adatbázisban szereplı külföldi izolátumok szekvencia adataival és olyan dendrogramot szerkesztettünk, amely
alkalmas
a
magyaroszági
vírusizolátumok
hasonlóságát
összevetni
külöldi
izolátumokkal. A törzsfa adatai szerint a GLRaV-3 izolátumok a genetikai távolság meghatározása alapján öt csoportot lehet elkülöníteni. A magyarországi izolátumok közül a 3.5. jelzéssel ellátott Badacsonytomajról, a 4.2 jelő Cserszegtomajról és a 2.2. jelzéső Kıszegrıl származó izolátumok a genetikai távolságuk figyelembe vételével egy csoportba, a II. számúba sorolhatók. A három szekvencia közül a legnagyobb eltérést a 2.2 minta mutatta másik kettıhöz képest. Ebbe a csoportba tartozik Amerikai Egyesült Államokból, DélAfrikából és Tunéziából származó izolátum is. A 1.4 jelzéső ugyancsak Kıszegrıl származó minta, habár ugyarról a tábláról származik, mint a 2.2 jelő, a dendrogram adatai alapján egy másik csoportba, a IV. számúba tartozik szír, ausztriai, és más Dél- Afrikai izolátumokkal együtt. A GLRaV1 esetében - a korábbi munkák alapján - csehországi, szlovákiai, iráni, Amerikai Egyesült Államokbeli és ausztrál izolátumokkal lehetett összehasonlító elemzést végezni. Megerısítést nyert, hogy a génbankban található GLRaV-1 izolátumokat valóban két csoportba lehet sorolni. Közülük az „E” csoportba tartozik az 6.4.1 jelzéső badacsonytomaji izolátum, mely egy Csehországból származó vírussal mutatja a legnagyobb hasonlóságot. A származási országok között a földrajzi távolság általában nagy, pontosan nem lehet megállapítani, hogy melyik országból indulhatott ki a vírusfertızés, viszont a terjedésben a kereskedelemnek lehetett a legnagyobb szerepe. A vizsgálatok eredményeképp egy GLRaV 1 és négy GLRaV 3 hazai vírusizolátum HSP70 homológ fehérjéjének szekvenciaadatai kerültek be elsıként a magyarországi szılı 79
levélsodródás vírusizolátumok közül az NCBI nemzetközi génbankjába. Ezek az adatok hozzájárulnak a külföldi génbanki adatbázis magyarországról származó vírusizolátumaval való bıvítéséhez melyek további vizsgálatok elvégzéséhez nyújthatnak alapot a vírusok terjedésének pontos megismeréséhez, és szerepe lehet a vírus elleni védekezés kialakításában is. Szılıültetvény
gyomflórájából
győjtött
közönséges
farkasalma
(Aristolochia
clematitis) levélmintákon elvégzett eletronmikroszkópos és RT-PCR molekuláris vizsgálatok eredményeképpen paradicsom bronzfoltosság vírust (Tomato spotted wilt virus, TSWV) azonosítottunk, ami felveti annak szükségességét, hogy ezt a kórozót a szılıben is keressük.
80
7. Új tudományos eredmények 1. A Magyarországon eddig leírt szılıpatogén vírusok új rendszertani csoportosításra kerültek. A molekuláris vizsgálatok eredményei és az okozott tünetek alapján hét csoportba sorolhatók: 1) szılı korai vírusos leromlás, 2) levélsodródás, 3) látens foltosság, 4) faszöveti barázdáltság 5) vonalas és győrős mintázottság 6) vonalas mintázottság. A hetedik csoportba azokat a vírusszerő betegségeket soroljuk, amelyek kórokozói feltehetıen vírus eredetőek, de pontosan még nem kerültek meghatározásra. Ezek a szılı enáció, az érmenti mozaik és az érnekrózis.
2. Szerológiai vizsgálat során 76 mintában kaptunk a hazai elıfordulású vírusok közül 9 vírus esetében pozitív eredményt. Tizennégy minta esetében pedig két-két vírus együttes jelenléte igazolódott. A korábban jelentısnek tartott nepovirusok, elsısorban GFLV, ArMV, TBRV, GCMV egyenként kisebb arányban voltak jelen, de együtt valamivel kisebb arányt képviselt, mint a GLRaV 1 és-3 szerológiai csoportok. Továbbá nagyarányú fertızöttség volt tapasztalható GFkV esetében, sokféle tüneti vagy tünetmentes megjelenésben.
3. A győjtött minták közül molekuláris (RT-PCR) vizsgálattal jellemeztünk egy GLRaV-1 és négy GLRaV-3 hazai izolátumot. Filogenetikai analízis alapján a GLRaV3 esetében öt csoportra osztott izolátumok közé a magyarországi izolátumok is beleilleszthetık, a 3.5, a 2.2 és a 4.2-es izolátumok a 2. számú csoportba, a 1.4-es izolátum a 4. számú csoportba tartozik. A 6.4.1.-es GLRaV-1 izolátum az „E” jelzéső csoportba sorolható. Az izolátumok szekvencia adatai HE794021-HE794025 nyilvántartási számokkal elsıként kerültek be Nemzetközi Génbank adatbázisába a magyarországi szılı levélsodródás vírusizolátumok közül.
4. A szılı ültetvény gyomflórájában elıforduló közönséges farkasalma (Aristolochia clematitis)
levélminták
is
begyőjtésre
kerültek,
melyek
esetében
az
elvégzett
eletronmikroszkópos és RT- PCR molekuláris vizsgálatok eredményeképpen a paradicsom bronzfoltosság vírust (Tomato spotted wilt virus, TSWV) azonosítottuk.
81
8. New results 1. New classification of grapevine viruses, occurring in Hungarian vineyards, has been made according to the symptoms and recent molecular data. Grapevine viruses and virus like agents has been classified on the basis of most characteristic symptoms as 1) virus degeneration, 2) leaf roll, 3) fleck, 4) rugose wood, 5) yellow mottle, 6) line pattern, 7) virus like diseases (enation, vein necrosis and vein mosaic).
2. Among 277 samples, seventy- six gave positive results. Among the Nepovirus group four viruses could be detected, but the occurrence of Grapevine fanleaf virus, Arabis mosaic virus, Tomato black ring virus and Grapevine chrome mosaic virus were not so frequent, than it was thought earlier. The ratio of Grapevine leafroll- associated virus 1, -2 and -3 were similar, as in case of Nepoviruses. High infection rates of Grapevine fleck virus were detected.
3. One GLRaV-1 and three GLRaV-3 isolates from the earlier collected and serological positive samples were characterised by molecular methods. The molecular data were run in a phylogenetic analyis in which the HSP70h genes of a large number of isolates from elsewhere in the world were included. The phylogenetic trees showed that the four Hungarian isolates 2.2, 3.5 and the 4.2. isolates could be inserted into the earlier classified five groups of foreign GLRaV-3 isolates into the group Nr. 2., but the isolate 1.4 belonged to the group Nr. 4. The GLRaV-1 CSE.6.4.1 isolate belonged to the earlier created group “E”. These sequence data of Hungarian grapevine virus isolates were into the Gene bank under accession numbers of HE794021, HE794022, HE794023, HE794024 and HE794025.
4. On bases of electron-microscopic and molecular studies leaf samples of Aristolochia clematitis L. found in vineyards proved to be infected with Tomato spotted wilt virus (TSWV).
82
9. Irodalomjegyzék Abou Ghanem-Sabanadzovic, N., Sabanadzovic, S. and Martelli, G. P. (2003): Sequence analysis of the 3’ end of three grapevine fleck virus-like viruses from grapevine. Virus Genes 2: (1) 11-16. Agranovsky, A. A., Boyko, V. P., Karasev, A. V., Lunina, N. A., Koonin, E. V and Dolja, V. V. (1991): Nucleotide sequence of the 3'-terminal half of beet yellows closterovirus RNA genome: unique arrangement of eight virus genes. J. Gen. Virol. 72: 15-23. Almási A. (1999): Elektronmikroszkópos módszerek. In: Horváth, J. és Gáborjányi, R. (szerk.) Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek. Mezıgazda Kiadó, Budapest. pp. 168-178. Andret-Link, P., Schmitt-Keichinger, C., Demangeat, G., Komar, V. and Fuchs, M. (2004a): The specific transmission of grapevine fanleaf virus by its nematode vector Xiphinema index is solely determined by viral coat protein. Virology 320: 12-22. Andret-Link, P., Laporte, C., Valat, L., Ritzenthaler, C., Demangeat, G., Vigne, E., Laval, V., Pfeiffer, P., Stussi-Garaud, C. and Fuchs, M. (2004b): Grapevine fanleaf virus: Still a major threat to the grapevine industry. J. Plant Pathol. 86: (3) 183-195. Aranda, M. A., Escaler, M., Wang, D. and Maule, A. J. (1996): Induction of HSP70 and polyubiquitin expression associated with plant virus replication Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 15289–15293. Baracsi É. (1999): A biotesztek virológiai alkalmazása In: Horváth, J. és Gáborjányi, R. (szerk.) Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek. Mezıgazda Kiadó, Budapest. pp. 156-159. Bardonnet, N., Hans, E., Serghini, M. A. and Pinck, L. (1994): Protection against virus infection in tobacco plants expressing the coat protein of grapevine fanleaf nepovirus. Plant Cell Rep. 13: 357-360. Bashir, S. N., Zarghani, N. S. and Hejazi, S. M. (2007): Diversity of Grapevine fanleaf virus isolates from Iran. Virus Research 128: 144-148. Beczner L. és Lehoczky J. (1980): Szılıbetegség a lucerna-mozaikvírus fertızéstıl II. Kertgazdaság 12: (3) 33-43.
83
Beczner, L. and Lehoczky, J. (1981): Grapevine disease in Hungary caused by Alfalfa mosaic virus infection. Acta Phytopath. Sci. Hung. 16: 119-128. Bercks, R., Lesemann, D und Querfurth, G. (1973): Über den nachweis des Alfalfa mosaic virus in einer Weinrebe. Phytopath. Z. 76: 166-171. Beuve, M., Sempé, L. and Lemaire, O. (2007): A sensitive one-stem real-time RT- PCR method for detecting Grapevine leafroll-associated virus 2 variants in grapevine. J. Vir. Meth. 141: 117-124. Boscia, D., Savino, V., Elicio, V., Jebahi, S. D. and Martelli, G. P. (1991): Detection of closteroviruses in grapevine tissues. Proceedings of the 10th Meeting of ICVG 5257. Bouyahia, H., Boscia, D., Savino, V., La Notte, P., Castellano, M. A., Minafra, A. and Martelli, G. P. (2005): Grapevine rupestris stem pitting-associated virus is linked with grapevine vein necrosis. Vitis 44: 133-137. Bovey, R., Gärtel, W., Hewitt, W. B, Martelli, G. P. and Vuittenez, A. (1980): Virus and Virus-like Diseases of Grapevines - Colour Atlas of Symptoms: Edition Payot Lausanne Brar, H. S., Singh, Z., Swinny, E. and Cameron, I. (2008): Girdling and grapevine leafroll associated viruses affect berry weight, colour development and accumulation of anthocyanins in ‘Crimson Seedless’ grapes during maturation and ripening. Plant Sci. 175: 885-897. Brunt, A. A., Crabtree, K., Dallwitz, M. J., Gibbs, A. J. and Watson, L. (1996): Viruses of Plants - Description and Lists from the VIDE Datebase. CAB International., University Press, Cambridge Cabaleiro, C. and Segura, A. (2006): Temporal analysis of grapevine leafroll associated virus 3 epidemics. Eur. J. Plant Pathol. 114: 441-446. Carstens, E. B. (2010): Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch. Virol. 155: 133-146. Cid, M., Pereira, S., Cabaleiro, C., Faoro, F. and Segura, A. (2007): Presence of Grapevine leafroll- associated virus 3 in primary salivary glands of the mealybug vector Planococcus citri suggests a circular transmission mechanism. Eur. J. Plant Pathol. 118: 23-30. Choueiri, E., Boscia, D., Digiaro, M., Castelano, M. A. and Martelli, G. P. (1996): Some properties of a hitherto undescribed filamentous virus of the grapevine. Vitis 35: 91-93. 84
Clark, M. F. and Adams, A. N. (1977): Characteristics of the microplate method of Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 475-483. Credi, R. and Santucci, A. (1991): Serological detection of leafroll associated closterovirus-like particles: apparent absence of viral antigens in the leaves of graft-inoculated American rootstocks. Proceedings of the 10th Meeting of ICVG 71-78. (Abstr.) Demangeat, G., Voisin, R., Minot, J.-C., Bosselut, N., Fuchs, M. and Esmenjaud, D. (2005): Survival of Xiphinema index in Vineyard soil and retention of Grapevine fanleaf virus over extended time in absence of host plants. Phytopathology 95: (10) 1151-1156. Elbeaino, T., Digiaro, M., Fallanaj, F., Kuzmanovic, S. and Martelli, G. P. (2011): Complete nucleotide sequence and genome organisation of grapevine Bulgarian latent virus. Arch. Virol. 156: 875–879. Engelbrecht, D. J. and Kasdorf, G. C. F. (1990): Transmission of grapevine leafroll disease and associated closteroviruses by the vine mealybug, Planococcus ficus. Phytophyllactica 22: 341-346. Fazeli, C. F. and Rezaian, M. A. (2000): Nucleotide sequence and organization of ten open reading frames in the genome of Grapevine leafroll-associated virus 1 and identification of three subgenomic RNAs. J. Gen. Virol. 81: 605-615. Frazier, N. W. (ed.) (1970): Virus diseases of small fruits and Grapevines- Handbook. Div. of Agr. Sci. Univ. California. Burkley, USA. Fuchs, M., Martinson, T. E., Loeb, G. M., and Hoch, H. C. (2009): Survey for the three major leafroll disease-associated viruses in Finger Lakes vineyards in New York. Plant Dis. 93: 395-401. Gangl, H., Leitner, G., Hack, C. und Tiefbrunner, A. (2011a): Verteilung und Häufigkeit wichtiger Rebvirosen in Weinbaugebieten Österreichs. Mitt. Klosterneuburg. 61 (4): 216-227. Gangl, H., Leitner, G., Hack, C. Tiefbrunner, A., Tiefbrunner, M. and Tiefbrunner, W. (2011b): Comparison of virus infection patterns in Austrian vineyards with simulated ones and some conclusion about transmission. Mitt. Klosterneuburg. 61 (1): 11-22. Goheen, A. C. and Hewitt, W. B. (1962): Vein banding, a new virus disease of grapevines. Am. J. Enol. Vitic. 13 (29): 73-77. 85
Golino, D. A., Sim, S. T., Gill, R. and Rowhani, A. (2002): California mealybugs can spread grapevine leafroll disease. California Agriculture 56 (6): 196-201. Haviv, S., Galiakparov, N., Goszczynski, D. E., Batuman, O., Czosnek, H. and Mawassi, M. (2006): Engineering the genome of Grapevine virus A into a vector for expression of proteins in herbaceous plants. J. Virol. Meth. 132: 227-231. Hewitt, W. M. B. (1954): Some virus and virus-like diseases of grapevine. Bulletin of the California Dep. Agricult. 43: 47-64. Hewitt, W. M. B., Goheen, A. C., Raski, D. J. and Gooding, G. V. Jr. (1962): Studies on virus diseases of the grapevine in Califiornia. Vitis 3: 57-83. Horváth J. (1972): Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Akadémiai Kiadó, Budapest. Jakab J. és Szendrey L. (1989): A viaszos akác-pajzstető (Heliococcus bohemicus Sulz) megjelenése Heves megye szılıültetvényeiben. Növényvédelem 15: 460-464. Jardak-Jamoussi, R., Winterhagen, P., Bouamama, B., Dubois, C., Mliki, A., Wetzel, T., Ghorbel A. and Reustle, G. M. (2009): Development and evaluation of a GFLV inverted repeat construct for genetic transformation of grapevine. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 97: 187–196. Jenser G., Schuster V., Seljahudin A. és Mahunka M. (1979): Az Arabis mozaik virus fennmaradását
meghatározó
vektor-
gyomnövény
kapcsolat
vizsgálata.
Kertgazdaság 11: (3) 15-19. Joñczyk, M., Le Gall, O., Pa³ucha, A., Borodynko, N. and Pospieszny, H. (2004): Cloning and sequencing of full-length cDNAs of RNA1and RNA2 of a Tomato black ring virus isolate from Poland. Arch. Virol. 149: 799–807. Jooste, A. E. C., Maree, H. J., Bellstedt, D. U., Goszczynski, D. E., Pietersen, G. and Burger, J. T. (2010): Three genetic grapevine leafroll-associated virus 3 variants identified from South African vineyards show high variability in their 5’UTR. Arch. Virol. 155: 1997-2006. Komínek, P., Glasa, M. and Bryxiová, M. (2005): Analysis of the molecular variability of Grapevine leafroll-associated virus 1 reveals the presence of two distinct virus groups and their mixed occurence in grapevines. Virus Genes 31: (3) 247-255. Kontić, J. K., Pejić, I., Maletić, E., Sladonja, B., Poljuha, D., Vokurka, A., Zdunić, G., Preiner, D., Šimon, S. and Rühl, E. (2009): Virus diseases screening in clonal selection of Croatian grapevine cultivars. Proc. IXth Int. Conf. on Grape Genetics and Breeding. 623-626. (Abstr.)
86
Koósné Szathmáry E. (2009): Különbözı természetes és mesterséges rekombináns szilva himlı vírus (Plum pox virus, PPV) izolátumok jellemzése. Doktori értekezés. Budapesti Corvinus Egyetem Kertészettudományi Kar. Budapest. Kozár, F. (2005): Pajzstető fajok lelıhelyei Magyarországon. MTA Növényvédelmi Kutatóintézete Kiadó. Budapest. Kölber, M., Lehoczky, J., Pácsa, S. és Kobza, S. (1981): A szılı fertızıleromlásvírusának kimutatása ELISA technikával a különbözı fenofázisokban győjtött levélmintákból és a mélyhőtve tárolt présnedvbıl. Kertgazdaság 13 (2): 11-22. Kuniyuki, H., Gioria, R. and Rezende, J. A. (2006): Transmission of the Grapevine virus B by the mealybug Pseudococcus longispinosus Targioni- Tozzetti (Hemiptera: Pseudococcidae) in Brazil. Summa Phytopathol. 32 (2): 151-155. Lahogue, F. et Boulard, G. (1996): Recherche de gènes de résistance naturelle à deux viroses de la vigne: le court-noué et l’enroulement. Vitis 35: 43-48. Laimer, M, Lemaire, O., Herrbach, E., Goldschmidt, V., Minafra, A., Bianco, P. and Wetzel, T. (2009): Resistance to viruses, phytoplasmas and their vectors in Europe: a review. J. Plant Pathol. 91 (1): 7-23. Lázár J., Kölber M. és Lehoczky J. (1990): Néhány Nepovirus kimutatása a szılımagvakban és magoncokban ELISA módszerrel. Kertgazdaság 22 (4): 58-72. Lázár J., Kölber M., Mikulás J., Farkas G.-né és Lehoczky J. (1994): Magyarország jelentıs szılıbetegségei. 40. Növényvédelmi Tudományos Napok. 87. (Abstr.) Lázár J., Kölber M., Farkas E. és Farkas G. (1995a): A szılı levélsodródását okozó Closterovírusok
(GLRaV-s)
tesztelése
Magyarországon,
fás
indikátorok
használatával. 41. Növényvédelmi Tudományos Napok. 96. (Abstr.) Lázár J., Farkas G., Farkas E. és Mikulás J. (1995b): A Rugose wood komplex egyes tagjainak azonosítása Magyarországon, fás indikátorok használatával. 41. Növényvédelmi Tudományos Napok. 95. (Abstr.) Lázár J. (1996): A szılı vírusokkal kapcsolatos újabb hazai kutatások eredményeiVírusbetegségek és mentes törzsültetvények létesítése. Doktori értekezés. Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem. Budapest. Lázár J. (1998): A hazai szılı-vírusmentesítési program történeti elızményei, jelene és megoldásra váró problémái. Növényvédelem 35: 415-418. Lázár, J., Mikulás, J., Farkas, G., and Kölber, M. (2002): Certification programme for production of virus-free propagating material of grapevine and its results in Hungary. Int. J. Hort. Sci. 8 (3-4): 39-43. 87
Lázár J. and Bisztray Gy. D. (2011): Virus and virus-like diseases of grapevine in Hungary. Int. J. Hort. Sci. 17 (3): 25- 36. Lee, J., Keller, K. E., Rennaker, C. and Martin, R. R: (2009): Influence of grapevine leafroll associated viruses (GLRaV-2 and-3) on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir: free amino acids, sugars and organic acids. Food Chem. 117: 99-105. Lee, J. and Martin, R. R. (2009): Influence of grapevine leafroll associated viruses (GLRaV-2 and-3) on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir: Phenolics. Food Chem. 112: 889-896. Lee, J. and Martin, R. R. (2010): Analysis of polyamines from Grapevine leafroll associated viruses (GLRaV-2 and -3) infected vines. Food Chem. 122: 1222-1225. Le Gall, O., Torregrosa, L., Danglot, Y., Candresse, T. and Bouquet, A. (1994): Agrobacterium-mediated genetic-transformation of grapevine somatic embryos and regeneration of transgenic plants expressing the coat protein of grapevine chrome mosaic nepovirus (GCMV). Plant Sci. 102: 161-170. Le Gall, O., Candresse, T., and Dunez, J. (1997): An RNA-dependent-RNA-polymerase activity associated with grapevine chrome mosaic nepovirus infection. Arch Virol. 142: 151-156. Lehoczky J. (1965): Research on virus diseases of grapevines in Hungary. Proc. Int. Conf. on Virus and Vector on Perennial Hosts, with special Reference to Vitis. Publ. Univ. Calif. Dept. Plant Path. 311-318. (Abstr.) Lehoczky, J., Martelli, G. P. and Sárospataki, Gy. (1969): Leafroll of grapevine in Hungary. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4: 117-124. Lehoczky J. és Beczner L. (1980): Szılıbetegség a lucerna mozaik vírus fertızésétıl I. Kertgazdaság, 2: 59-66. Lehoczky J. és Farkas G. (1981): A szılı látens foltosságának elıfordulása Magyarországon. Kertgazdaság 13 (1): 15-25. Lehoczky J., Farkas G. és Lázár J. (1984a): Új szılıfajták és klónok vírustesztelése és mentesítési módszerek kidolgozása. Az érmenti mozaik hazai elıfordulásának igazolása. KÉE SZBKI, Kecskemét, Évi kutatási jelentés. Lehoczky J., Kölber M., Beczner L. és Pácsa S. (1984b.): A szılı krómmozaik vírusbetegségének elterjedése hazánkban és vírusának kimutatása ELISAtechnikával a szabadföldi tıkék levelébıl. Kertgazdaság 16 (4): 41-51.
88
Lehoczky J. és Burgyán J. (1986): A paradicsom fekete győrős foltosság virus elıfordulása szılıben Magyarországon. Kertgazdaság 18 (4): 47-57. Lehoczky J., Farkas G. és Lázár J. (1986): A szılı érnekrózis vírus kimutatása a termesztett szılıfajták tıkéibıl. Kertgazdaság 18 (4): 59-65. Lehoczky J., Boscia D., Martelli G. P., Burgyán J., Castellano M. A., Beczner L. és Farkas
G.
(1987):
Vonalas
mintázottság-
a
szılı
eddig
ismeretlen
vírusbetegségének elıfordulása Magyarországon. Kertgazdaság 19 (6): 61-79. Lehoczky J., Luntz O., Lázár J., Kölber M., Mikulás J. and Farkas G. (1992): Production of virus free grapevine propagating material in Hungary. 44th Int. Symp. Crop Protection. Gent, Belgium 333-339. (Abstr.) Lima, M. F., Alkowni, R., Uyemoto, J. K., Golino, D., Osman, F. and Rowhani, A. (2006): Molecular analysis of a California strain of Rupestris stem pitting associated virus isolated from declining Syrah grapevines. Arch. Virol. 151: 18891894. Ling, K.-S., Zhu, H.-Y. and Gonsalves, D. (2008): Resistance to Grapevine leafroll associated virus-2 is conferred by post-transcriptional gene silencing in transgenic Nicotiana benthamiana. Transgenic Res. 17: 733–740. Little A., Fazeli, C. F. and Rezaian, M. A. (2001): Hypervariable genes in Grapevine leafroll associated virus 1. Virus Res. 80: 109–116. Little, A. and Rezaian, M. A. (2006): Improved detection of grapevine leafroll-associated virus 1 by magnetic capture hybridisation RT- PCR on a conserved region of viral RNA. Arch. Virol. 151: 753-761. Lunden, S., Meng, B., Avery, J. Jr. and Qiu, W. (2010): Association of Grapevine fanleaf virus, Tomato ringspot virus and Grapevine rupestris stem pitting-associated virus with a grapevine vein clearing complex on var. Chardonnay. Eur. J. Plant Pathol. 126: 135-144. Maree, H. J. (2010): Identification and characterisation of Grapevine leafroll-associated virus 3 genomic and subgenomic RNAs. Ph.D. Dissertation. Stellenbosch University, Stellenbosch, South Africa. Maree, J. H, Gardner, H. F. J., Freeborough, M.-J. and Burger, J. T. (2010): Mapping of the 5- terminal nucleotides of Grapevine leafroll-associated virus 3 sgRNAs. Virus Res. 151: 252–255. Martelli, G. P., Lehoczky, J. and Quaquarelli, A. (1966): Host range and properies of a virus associated with Hungarian grapevines showing macroscopic symptoms of 89
fanleaf and yellow mosaic. Proc. Int. Conf. on Virus and Vector on Perennial Hosts, with special Reference to Vitis. Publ. Univ. Calif. Dept. Plant. Path. 389401. (Abstr.) Martelli, G. P., Quaquarelli, A., Lehoczky, J. and Sárospataki, Gy. (1967): A disorder resembling “legno riccio” (rugose wood) of grapevine in Hungary. Phytopath. Mediterr. 6: 110-112. Martelli, G. P. and Lehoczky, J. (1968): Isolation of Arabis mosaic virus from Hungarian grapevines. Phytopathol. Mediterr. 7: 129-133. Martelli, G. P., Gallitelli, D., Abrachova, P., Savino, V. and Quaquarelli, A. (1977): Some properties of grapevine Bulgarian latent virus. Annuals Appl. Biol. 85: 5158. Martelli, G. P. (1993): Graft Transmissible Diseases of Grapevines, FAO Editions, Rome Martelli, G. P., Sabanadzovic, S., Abou Ghanem-Sabanadzovic, N. and Saldarelli, P. (2002): Maculavirus, a new genus of plant viruses. Arch. Virol. 147: 1847-1853. Martelli, G. P. and Boudon-Padieu, E. (eds.) (2006): Directory of Infectious Diseases of Grapevines and Viroses and Virus-like Diseases of the Grapevine, Bari 279 p. Masri, S., Rast, H., Johnson, R. and Monette, P. (2006): Grapevine virus C and grapevine leafroll associated virus 2 are serologically related and appear to be the same virus. Vitis 45: 93-96. Mauro, M. E., Toutain, S., Walter, B., Pinck, L., Ottene, L., Coutos-Thevenot, P., Deloire, A. and Barbier, P. (1995): High efficiency regeneration of grapevine plants transformed with the GFLV coat protein gene. Plant Science 112: 97-106. Mekuria, T. A., Karasev, A. V., Martin, R. R. and Naidu, R. A. (2009): First report of Grapevine leafroll- associated virus-3 in six wine grape cultivars in Idaho. Plant Dis. 93: 1218. Meng, B., Johnson, R., Peressini, S., Forsline, P. L. and Gonsalves, D. (1999): Rupestris stem pitting associated virus 1 is a consistently detected in grapevine that are infected with rupestris stem pitting. Eur. J. Plant Pathol. 105: 191-199. Meng, B., Li, C., Goszczynski, D. E. and Gonsalves, D. (2005): Genome sequences and structures of two biologically distinct strains of Grapevine leafroll-associated virus 2 and sequence analysis. Virus Genes 31: 31-41. Minafra, A., Saldarelli, P. and Martelli, G. P. (1997): Grapevine virus A: nucleotide sequence, genom organization, and relationship in the Trichovirus genus. Arch. Virol. 142: 417-423. 90
Minafra, A., Gölles, R., da Camara Machado, A., Saldarelli, P., Buzkan, N., Savino, V., Martelli, G. P., Katinger, H. and Laimer da Camara Machado, M. (1998): Expression of the coat protein genes of Grapevine virus A and B in Nicotiana species and evolution of the resistance conferred on transgenic plants. J. Plant Pathol. 80: (3) 197-202. Murolo, S., Romanazzi, G., Rowhani, A., Minarfa, A., La Notte, P., Branzanti, B. M. and Savino, V. (2008): Genetic variability and population structure of Grapevine virus A coat protein gene from naturally infected Italian vines. Eur. J. Plant Pathol. 120: 137-145. Muruganantham, M., Moskovitz, Y., Haviv, S., Horesh, T., Fenigstein, A., du Preez, J., Stephan, D., Burger, J. T. and Mawassi, M. (2009): Grapevine virus A-mediated gene silencing in Nicotiana benthamiana and Vitis vinifera. J. Virol. Meth. 155: 167–174. Nakaune, R., Inoue, K, Nasu, H., Kakogawa, K., Nitta, H., Imada, J. and Nakano, M. (2008): Detection of viruses associated with rugose wood in Japanese grapevines and analysis of genomic variability of Rupestris stem pitting-associated virus. J. Gen. Plant Pathol. 74: 156-163. Nolasco, G., Santos, C., Petrovic, N., Teixeira Santos, M., Cortez, I., Fonesca, F., Boben, J., Nazaré Pereira, A. M. and Sequeira, O. (2006): Rupestris stem pitting associated virus isolates are composed by mixtures of genomic variants which share a highly conserved coat protein. Arch. Virol. 151: 83-96. Nölke, G., Fischer, R. and Schillberg, S. (2004): Antibody-based pathogen resistance in plants. J. Plant Pathol. 86: (1) 5-17. Orecchia, M., Nölke, G., Saldarelli, P., Dell’Orco, M., Uhde-Holzem, K., Sack, M., Martelli, G. Fischer, R. and Schillberg, S. (2008): Generation and characterization of a recombinant antibody fragment that binds to the coat protein of grapevine leafroll-associated virus 3. Arch. Virol. 153: 1075–1084. Panjan, M. i Saric, A. (1963): Seroloska dijagnostika Arabis mozaik virusa iz vinove loze I tresnje gel-difuzinom metodom. Agronomski Glasnik 3: 204-206. Petersen, C. L. and Charles J. G. (1997): Tranmission of grapevine leafroll-associated closteroviruses by Pseudococcus longispinosus and P. calceolariae. Plant Pathol. 46: 509-515. Pocsai E. (1981): Occurence of Grapevine Bulgarian latent virus in Hungary. Acta Phytopatol. Acad. Sci. Hung. 16: 349-354. 91
Pompe-Novak, M., Gutiérrez- Aguirre, I., Vojvoda, J., Blas, M., Tomazic, I., Vigne, E., Fuchs, M., Ravnikar, M. and Petrovic, N. (2007): Genetic variability within RNA2 of Grapevine fanleaf virus. Eur. J. Plant Pathol. 117: 307-312. Premyslov, V. V., Hagiwara, Y and V. V. Dolja (1999): HSP70 homolog functions in cellto-cell movement of a plant virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S:A. 96: 14771-14776. Pribék D. (1999): A vírusátvitel módszerei In: Horváth J. és Gáborjányi R. (szerk.) Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek. Mezıgazda Kiadó, Budapest. pp. 91-100. Qiu, W. P., Geske, S. M., Hickey, C. M. and Moyer, J. W. (1998): Tomato spotted wilt tospovirus genome reassortment and genome segment specific adaptation. Virology 244: 186-194. Rebelo, A. R., Niewiadomski, S., Prosser, S. W., Krell, P. and Meng, B. (2008): Subcellular localization of the triple gene block proteins encoded by a foveavirus infecting grapevines Virus Res. 138: 57–69 Regenmortel, van M. H. V., Fauquet, C. M., Bishop, D. H. L. Carstens, E. B., Estes, M. K., Lemon, S. M., Maniloff, J., Mayo, M. A., McGeoch, D. J., Pringle, C. R. and Wickner, R. B. (eds) (2004): Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Academic Press, San Diego. Routh, G., Zhang, Y.-P., Saldarelli, P. and Rowhani, A. (1998): Use of degenerate primers for partial sequencing and RT-PCR- Based Assays of Grapevine leafrollassociated viruses 4 and 5. Phytopathology 88: 1238-1243. Sabanadzovic, S. Abou Ghanem-Sabanadzovic, N, Saldarelli, P. and Martelli G. P. (2001): Complete nucleotide sequence and genome organization of Grapevine fleck virus. J. Gen. Virol. 82: 2009–2015. Saldarelli, P., Keller, H., Dell’orco, M., Schots, A., Elicio, V. and Minarfa, A. (2005): Isolation of recombinant antibodies (scFvs) to Grapevine virus B. J. Virol. Meth. 124: 191-195. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989): Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. Sárospataki Gy. (1964): A szılı-vírusbetegségek hazai vizsgálata. Kísérleti Közlemények 57/C. 63-80. Schieber, O., Seddas, A., Belin, C. and Walter, B. (1997): Monoclonal antibodies for detection, serological characterization and immunopurification of Grapevine fleck virus. Eur. J. Plant Pathol. 103: 767-774. 92
Sforza, R., Boudon-Padieu, E. and Greif, C. (2003): New mealybug species vectoring Grapevine leafroll-associated viruses-1 and 3 (GLRaV-1 and -3). Eur. J. Plant Pathol. 209: 975-981. Spielmann, A., Krastanova, S., Douet-Orhant, V. and Gugerli P. (2000): Analysis of transgenic grapevine (Vitis rupestris) and Nicotiana benthamiana plants expressing an Arabis mosaic virus coat protein gene. Plant Science 156: 235–244. Stellmach, G. und Bercks, R. (1963): Untersuchungen an Rebenvirosen: Nachweis des Tomatenschwarzringflecken- Virus (Tomato blackring virus) in krankes Stocken der Sorte Aramon x Riparia 143 AMG (Amerikanerrebe). Phytopath. Z. 48: 200202. Szychowski, J. A., McKenry, M. V., Walker, M. A., Wolpert, J. A., Credi, R. and Semancik, J. S. (1995): The vein-banding disease syndrome: A synergistic reaction between grapevine viroids and fanleaf virus. Vitis 34: 229-232. Tomazic, I., Korosec-Koruza, Z. and Petrovic, N. (2005): Sanitary status of Slovenian indigenous grapevine cultivar Refosk. J. Int. Des Sciences De La Vigne et Du Vin. 39: 19-22. Torregrosa, L. and Bouquet, A. (1997): Agrobacterium rhizogenes and A. tumefaciens cotransformation to obtain grapevine hairy roots producing the coat protein of grapevine chrome mosaic nepovirus. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 49: 53–62. Turturo, C., Saldarelli, P., Yafeng, D., Digiaro, M., Minafra, A., Savino, V. and Martelli, G. P. (2005): Genetic variability and population structure of Grapevine leafroll-associated virus 3 isolates. J. Gen. Virol. 86: 217-224. Vigne, E., Marmonier, A., and Fuchs, M. (2008): Multiple interspecies events within RNA2 of Grapevine fanleaf virus and Arabis mosaic virus. Arch. Virol. 153: 1771-1776. Vanek, G. (1996): A szılı növényvédelme. Mezıgazda Kiadó, Budapest. Vlot, A. C., Neeleman, L., Linthorst, H. J. M. and Bol, J. F. (2001): Role of the 3’Untranslated regions of Alfalfa mosaic virus RNAs in the formation of a transiently expressed replicase in plants and in the assembly of virions. J. Virol. 75: 6440-6449. Voncina, D., Simon, S., Dermic, E., Cvjetkovic, B., Pejic, I., Maletic, E. and Karoglan Kontic, J. (2011a): Differential properties of Grapevine virus B isolates from Croatian autochthonous grapevine cultivars. J. Plant Pathol. 93: 283-289.
93
Voncina, D., Simon, S., Dermic, E., Cvjetkovic, B., Pejic, I., Maletic, E. and Karoglan Kontic, J. (2011b): Distribution and partial molecular characterisation of Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) found in Croatian autochthonous grapevine (Vitis vinifera L.) germplasm. J. Plant Dis. and Prot. 117: 194-200. Walker, M. A., Meredith, C. P. and Goheen, A. C. (1985): Sources of resistance to grapevine fanleaf virus (GFV) in Vitis species. Vitis 24: 218-228. Walter, B. and Martelli, G. P. (1997): Clonal and sanitari selection of the grapevine. In: Walter, B. (ed.) Sanitary Selection of the Grapevine: Protocols for Detection of Virus and Virus-like Diseases. INRA Editions, France pp. 43-95. Wetzel, T., Wegener, U. and Krczal, G. (2004): Complete nucleic sequence of the RNA1 of a grapevine isolate of Arabis mosaic virus. Arch. Virol. 149: 989-995. Weber, E., Golino, D. A. and Rowhani, A. (2002): Laboratory testing for grapevine diseases. Practical Winery Vinyard, 22: (2) 13-26. Zhang, Y.-P., Uyemoto, J. K., Golino, D. A. and Rowhani, A. (1998): Nucleotide sequence and RT-PCR detection of a virus associated with Grapevine rupestris stem pitting disease. Phytopathology 88: 1231-1237. 87/2006 (XII. 28.) FVM rendelet a szılı szaporítóanyagok elıállításáról, minısítésérıl és forgalomba hozataláról. http://expasy.org/viralzone/
94
10. Köszönetnyilvánítás Ezúton is szeretném megköszönni témavezetıimnek Dr. Gáborjányi Richardnak (professor emeritus) és Takács András Péternek (egyetemi docens), hogy egyetemi éveim óta tanítottak, támogattak és támogatnak. İk keltették fel érdeklıdésemet a virológia tudománya iránt, és tanítottak annak alapjaira. Szeretném megköszönni a rengeteg segítséget Dr. Palkovics Lászlónak tanszékvezetı, egyetemi tanárnak, aki önzetlenül és fáradságot nem kímélve vezetett be a molekuláris biológia módszertanának alapjaiba. Köszönöm Dr. Bóka Károly egyetemi tanárnak az elektronmikroszkópos vizsgálatotok elvégzését. Köszönöm a Pannon Egyetem Georgikon Kar Növényvédelmi Intézet Növénykórtani Tanszékén mindenkinek, különösen Czimondor Imrénének és az egyetem hallgatóinak, akik a szerológiai vizsgálatok elvégzésében és a vírusizolátumok fenntartásában segítséget nyújtottak. Köszönetemet fejezem ki azoknak a szılıtermesztıknek, akik az izolátumok begyőjtését lehetıvé tették, beengedtek az ültetvényükbe vagy segítettek kapcsolatokat kiépíteni. Nem utolsósorban szeretném megköszönni dr. Kocsis László tanszékvezetı, egyetemi tanárnak és a Kertészeti Tanszéken dolgozó minden munkatársamnak a dolgozatom elkészülésében nyújtott segítségüket. Végül pedig köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy támogattak.
95
11. Publikációk, elıadások Magyar nyelvő szakcikk:
Cseh E., Lázár J., Takács A., Kazinczi G. és Gáborjányi R. (2008): A szılı Magyarországon elıforduló
és
várhatóan
megjelenı
vírusos
betegségeinek
és
kórokozóinak
áttekintése.
Növényvédelem 44: 535-544. Cseh E., Daragó Á., Takács A. P. és Gáborjányi R. (2011): Szılıvírusok gyakoriságának felmérése magyarországi szılıültetvényekben. Kertgazdaság 43: (1) 63-67. Cseh E., Daragó Á., Takács A. P., Csöndes I., Gáborjányi R., Kocsis L., Kazinczi G. és Horváth J. (2011): Magyarországi borvidékek vírusfertızöttségének vizsgálata. Növényvédelem 47: 363-370. Cseh E., Palkovics L., Apró M., Gáborjányi R. és Takács A. P. (2012): Hazai szılı levélsodródás virus 3 izolátumok (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3) molekuláris jellemzése. Növényvédelem. 48: 297-302.
Magyar nyelvő elıadások:
Cseh E., Takács A., Lázár J., Kazinczi G. és Gáborjányi R. (2008): Áttekintés a szılıpatogén vírusok hazai elıfordulásáról. XVIII. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely. 140-142. (Abstr.) Cseh E., Takács A., Kazinczi G. és Gáborjányi R. (2009): Szılıvírusok elıfordulása néhány dunántúli ültetvényben. 55. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest. 73. (Abstr.) Cseh E., Daragó Á., Takács A. P. és Gáborjányi R. (2010): Szılıvírusok elıfordulásának felmérése a magyarországi szılıültetvényekben. 56. Növényvédelmi Tudományos Napok, Keszthely. 74. (Abstr.) Juhász K. Cseh E., Daragó Á., Kocsis L., Gáborjányi R. és Takács A. P. (2011): Virológiai vizsgálatok Zala megyei szılıültetvényekben. XXI. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely. 81. (Abstr.) Cseh E., Apró M., Bese G., Krizbai L., Bóka K., Gáborjányi R. és Takács A. P. (2012): A Paradicsom bronzfoltosság vírus (Tomato spotted wilt virus, TSWV) magyarországi kimutatása farkasalma (Aristolochia clematitis) növényben. XXII. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum Keszthely. 48-50. (Abstr.)
96
Cseh E., Palkovics L., Apró M., Takács A. P. és Gáborjányi R. (2012): Magyarországról származó szılı levélsodródás vírus 3 izolátumok (Grapevine leafroll- associated virus 3, GLRaV-3) molekuláris vizsgálata. 58. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest. 37. (Abstr.)
Idegen nyelvő szakcikk:
Cseh, E., Takács, A. P., Kocsis, L. and Gáborjányi, R. (2012): General properties of grapevine viruses occurring in Hungary. J. Central Eur. Agricult. 13: (1) 44-57. Cseh, E., Apró, M, Bese, G., Krizbai L., Bóka K., Gáborjányi, R. and Takács, A. P. (2012): Tomato spotted wilt virus (TSWV) in Birthwort (Aristolochia clematitis L.) in Hungary. Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 48: (in press)
Idegen nyelvő elıadás:
Cseh, E., Lázár, J., Takács, A., Kazinczi, G. and Gáborjányi, R. (2008): Survey of soil-borne virus diseases of grapevine in Hungary. Proceedings of the VII. Alps-Adria Scientific Workshop, Cer. Res. Com. Suppl. 36: 99-102. (Abstr.) Cseh, E., Daragó, Á., Szerecz, A., Takács A. and Gáborjányi, R. (2009): Apprise the significance of grapevine viruses in West Hungary. Proceedings of the VIII. Alps-Adria Scientific Workshop, Cer. Res. Com. Suppl. 153-155. (Abstr.) Cseh, E., Daragó, Á., Takács, A., Szerecz, A. Gáborjányi, R. and Horváth J. (2010): Emerging grapevine virus diseases in Hungary: accessing future threats. 28. International Horticultural Congress, Lisbon 269. (Abstr.) Cseh, E., Palkovics, L., Apró, M., Gáborjányi, R. and Takács, A. P. (2012): Occurrennce and evolutionary relationship of Grapevine leafroll associated virus 3 isolates in Hungary.Proceedings of Patholux 2012 Conference on Impact of Plant Pathogens on the Quality of Crops and Wine, Luxemburg,72-73. (Abstr.)
97
Más témában megjelent publikációk, elıadások:
Cseh E., Kadlicskó S. és Kovács O. (2007): Növényvédelmi tapasztalatok egy nagyradai szılıültetvényben 2006-ban. Növényvédelem 43: 415-420. Hatala Á., Cseh E., Daragó Á. és Takács A. (2009): A dohányt károsító vírusbetegségek. XIX. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely. 67-68. (Abstr.) Daragó Á., Nagy P., Cseh E., Gáborjányi R., Nádasy M. és Takács A. (2010): Vírusvektor fonálférgek kimutatásának módszertani különbségei. XX. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely. 58-59. (Abstr) Daragó, Á., Nagy, P., Cseh, E., Gáborjányi, R., Takács, A., Nádasy, M. and Répási, V. (2010): Studies on grapevine-virus-nematode associations in Hungary. 28. International Horticultural Congress, Lisbon. 734. (Abstr.) Apró M., Cseh E., Daragó Á., Papp M., Gáborjányi R., Horváth J. és Takács A. P. (2011): Búzaminták vírusfertızöttsége Dél- Magyarországon 2010-ben. XXI. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely. 13. (Abstr.) Harun, M. M., Cseh, E., Horváth, J., Gáborjányi, R., Fári M. and Takács A. (2011): Symptomatology and characterization of viruses in Heirloom tomato varieties as a potential source of resistance. XXI. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely 165. (Abstr.) Daragó Á., Nagy P., Cseh E., Gáborjányi R., Takács A. P. és Répási V. (2011): Vírusvektor fonálférgek elıfordulása Magyarország szılıültetvényeiben. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest. 9. (Abstr.) Harun, M. M., Cseh, E., Apró, M., Horváth, J., Gáborjányi, R., Fári, M. and Takács, A. (2011): Characterization of virus susceptibility of heirloom tomato varieties. IWGLVV Conference, Antequera. 107. (Abstr.) Daragó Á., Cseh E., Nagy P., Takács A. P., Répási V. és Gáborjányi R. (2011): A tőfonálférgek (Xiphinema spp.) elıfordulása egyes hazai szılıültetvényekben. Növényvédelem 47: 381-386. Kazinczi G., Horváth J., Takács A., Gáborjányi R. és Cseh E. (2011): Vírusok alternatív gazdája: Ürömlevelő parlagfő (Ambrosia artemisiifolia L.). Növényvédelem 47: 505-510. Cseh E. (2012): Magyarországon elıforduló macskagyökér fajok jellemzése, valamint termesztésük és felhasználásuk lehetıségei. Növénytermelés 61 (3): 117-138.
98
12. Melléklet
minta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
fajta Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Cabernet franc Kékfrankos Cabernet franc Cabernet franc Cabernet franc Pinot noir Pinot noir Oportó Sauvignon blanc Királyleányka Juhfark Juhfark Juhfark Kéknyelő Kéknyelő Budai Pinot blanc Pinot noir Rajnai rizling Rajnai rizling Rajnai rizling Pátria Pátria Pátria Olasz rizling Olasz rizling Olaszrizling Nem ismert Vénusz Tempranillo
győjtés helye Kıszeg Kıszeg Kıszeg Kıszeg Kıszeg Kıszeg Kıszeg Kıszeg Balatonboglár Balatonboglár Balatonboglár Balatonboglár Balatonboglár Balatonboglár Balatonboglár Balatonboglár Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj 99
ideje 2008.07.03 2008.07.03 2008.07.03 2008.07.03 2008.07.03 2008.07.03 2008.07.03 2008.07.03 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.12 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.06.11 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26
tünet R, LR R, LR R, LR CM CM CM CM R, LR CM CM CM M LD R, LR LD RW LR LR LR VM VM M, LD M, LD LD LD LD LD SL SL SL Y, LR Y, LR Y, LR R, LR R, LR R, LR
Virus GLRaV-1, -3 GLRaV-3 GLRaV-3
GLRaV-3 ArMV, GCMV
GCMV, GLRaV-1 GLRaV-1 GLRaV-1
GLRaV-1, -3
TBRV GCMV, GLRaV-1
GCMV GLRaV-3
GLRaV-3 GCMV, GLRaV-3 GLRaV-2
minta 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77
fajta Tempranillo Nem ismert Tempranillo Nem ismert Nem ismert Nem ismert Korona Korona Korona Réka Réka Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Furmint T85 Hárslevelő Hárslevelő Hárslevelő Hárslevelő Hárslevelő Hárslevelő Furmint Furmint Furmint Furmint Furmint Furmint Furmint Furmint Titán Titán Titán Rizlingszilváni Rizlingszilváni Rizlingszilváni Rizlingszilváni Rizlingszilváni Rizlingszilváni Rizlingszilváni
győjtés helye Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Kecskemét Kecskemét Kecskemét Kecskemét Kecskemét Kecskemét Kecskemét Tokaj Tokaj Tokaj Tokaj Tokaj Tokaj Tokaj Tokaj Tokaj Tarcal Tarcal Tarcal Tarcal Tarcal Tarcal Noszvaj Noszvaj Noszvaj Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján
100
ideje 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.08.26 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2008.09.02 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.13 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.15
tünet R, LR R, LR R, LR R, LR Y, LR Y, LR LD LD LD LD R LD LD LD R LD M NS, ST Ch St M, LD M, LD M, LD M LD Ch YM Ch Y LM Ch Ch LM, LD LM LM, LD YM Y YM, LD CM LD Ch, LD
Virus GCMV, GLRaV-3 TBRV
GFLV
GLRaV-3 GLRaV-1 GFkV GFkV GFkV
GFkV
AMV
ArMV, TBRV
GFkV
GFkV GFkV GFkV
minta 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118
fajta Rizlingszilváni Rizlingszilváni Tramini Olasz rizling Olasz rizling Turán Turán Turán Turán Turán Turán Turán Nem ismert Nem ismert Nosztori rizling Nosztori rizling Nosztori rizling Nosztori rizling Nosztori rizling BRK 125 AA BRK 125 AA BRK 125 AA BRK 125 AA BRK 125 AA Cabernet sauvignon Cabernet sauvignon Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Nem ismert Korona Korona Korona Korona Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert
győjtés helye Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Szomolya Szomolya Szomolya Szomolya Szomolya Szomolya Szomolya Lengyeltóti Lengyeltóti Görögszó Görögszó Görögszó Görögszó Görögszó Kismórágy Kismórágy Kismórágy Kismórágy Kismórágy Kismórágy Kismórágy Izmény Izmény Izmény Izmény Izmény Izmény Kékkút Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj
101
ideje 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.15 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.05.14 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.06.10 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07
tünet Ch, LD YM M, LD LD M M M LD LD M M YM LD LD Y, ST Y LM, LD M Ch F F NS, VN LD F M F M VM CM CM M M VC LD LD LD VC Ch M Ch Ch
Virus GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFkV GFLV
ArMV, GFkV GFLV
GFkV
TBRV, GFkV
GFkV
GFkV GFLV GFkV
minta 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159
fajta Nem ismert Vinitor Vinitor Pátria Pátria Vinitor Vinitor Vinitor Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Pinot noir Nem ismert Nem ismert Acolon Nem ismert Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Zweigelt Zweigelt Zweigelt Blauburger Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nosztori rizling Kékfrankos Kékfrankos
győjtés helye Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Pécs Pécs Pécs Pécs Pécs Pécs Pécs Pécs Villány Villány Villány Villány Villány Villány Villány Villány Villány Villány Villány Kecskemét Kecskemét Kecskemét Kecskemét Kecskemét Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Gyöngyöstarján Görögszó Nagyrada Nagyrada
102
ideje 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.07.07 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.10.15 2009.09.22 2009.09.22 2009.09.22 2009.09.22 2009.09.22 2009.08.27 2009.08.27 2009.08.27 2009.06.10 2009.10.07 2009.10.07
tünet Ch LD Ch, LD LD LD Ch CH Ch Ch SL SL M, LD M, LD SL R, LR R, LR R, LD R R, LR R R R R, LR Ch M, LD M R, LR R R, LR R, LR YM YM VN VN LD, NS M M, LD LD R R R, LR
Virus
AMV
AMV
GLRaV-3 GLRaV-1
GLRaV-1
GFkV
minta 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
fajta Merlot Chardonnay Chardonnay Kövidinka Kövidinka Olasz rizling Szürkebarát Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Ottonel muskotály Ottonel muskotály Ottonel muskotály Ottonel muskotály Ottonel muskotály Kadarka Kadarka Kadarka Kadarka Kadarka Csaba gyöngye Nem ismert Furmint
győjtés helye Nagyrada Nagyrada Nagyrada Nagyrada Nagyrada Nagyrada Nagyrada Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Bogács Bogács Bogács Eger Eger Eger Eger Káptalantóti Káptalantóti Káptalantóti Káptalantóti Káptalantóti Káptalantóti Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Bátaszék Murakeresztúr Cserszegtomaj Somló
103
ideje 2009.10.07 2009.10.07 2009.10.07 2009.10.07 2009.10.07 2009.10.07 2009.10.07 2009.10.02 2009.10.02 2009.10.14 2010.05.05 2010.05.05 2010.05.05 2010.05.05 2010.05.05 2010.05.05 2010.05.05 2010.05.07 2010.05.07 2010.05.07 2010.05.07 2010.05.07 2010.05.07 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.05.11 2010.07.04 2010.07.07 2010.06.23
tünet R, LR LR Y, LR Y, LR M Y, LR Y, LR M, LD M, LD SL LD LD LD YM R LD LD M Ch LD YM, LD NS M VC R YM YM M, LD R R R R YM Ch R R R R M, LD LD YM
Virus
ArMV RBDV
RpRSV GCMV, CLRV
RBDV
GCMV
TBRV, AMV AMV
minta 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241
fajta Furmint Furmint Nem ismert Nem ismert Juhfark Juhfark Pinot noir Pinot noir Pinot noir Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Olasz rizling Olasz rizling Szürkebarát Szürkebarát Szürkebarát Szürkebarát Szürkebarát Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Nem ismert Cserszegi főszeres Cserszegi főszeres Zenit Cserszegi főszeres Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Corvinus Corvinus Corvinus Corvinus
győjtés helye Somló Somló Etyek Etyek Etyek Etyek Etyek Etyek Etyek Csopak Csopak Csopak Csopak Csörnyeföld Csörnyeföld Csörnyeföld Csörnyeföld Csörnyeföld Csörnyeföld Csörnyeföld Dobri Dobri Dobri Dobri Zalaszentbalázs Zalaszentbalázs Zalaszentbalázs Zalaszentbalázs Zalaszentbalázs Zalaszentbalázs Zalaszentgrót Zalaszentgrót Zalaszentgrót Zalaszentgrót Zalaszentgrót Zalaszentgrót Zalaszentgrót Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj
104
ideje 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.23 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.24 2010.06.28 2010.06.28 2010.06.28 2010.06.28 2010.06.28 2010.06.28 2010.06.29 2010.06.29 2010.06.29 2010.06.29 2010.06.29 2010.06.29 2010.06.29 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16
tünet YM YM YM Y Y Y YM YM YM YM YM Ch, RW YM YM Ch YM Y R CM YM YM YM M M YM LD VM R MP YM M MP YM Ch Ch M Ch R, LR R, LR R, LR R, LR
Virus
GFLV
ArMV
SLRSV CLRV ArMV TRSV ArMV, AMV
ToRSV ToRSV, CLRV
GLRaV-1, -3
minta 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277
fajta Corvinus Rozália Corvinus Rozália Rozália Valentin Valentin Valentin Corvinus Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Nem ismert Vulkanus Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Olasz rizling Vulkanus Vulkanus Juhfark
győjtés helye Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Cserszegtomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Cserszegtomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj Badacsonytomaj
ideje 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.09.16 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.19 2010.10.15 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13 2010.10.13
tünet YM NS R, NS Y, NS NS NS Y, NS SL NS Y, LR VN MP, VN Y LD Y, LD YM Ch Ch Ch Ch, VN Ch Ch RW Y, LR Y R, LR NS Ch Y NS Y, LD Y, LD LR M Y, LD Y, LD
Virus GLRaV-3 GLRaV-1
GLRaV-1
GLRaV-1 GLRaV-1
GLRaV-1
GLRaV-1, -3 GLRaV-3 GLRaV-3
Rövidítések: Tünetek: Ch (chlorosis)- klorózis, CM (chrome mosaic)- Krómsárga mozaik, LD (leaf deformation)levéldeformáció, LR (leaf rolling)- Levélsodródás, MP (mosaic pattern)- Mozaikos mintázottság, NS (necrotic spots)- Nekrotikus foltosság, R (redding)- Vörösödés, RW (rugose wood)- Faszöveti barázdáltság, SL
105
(symptomless)- tünetmentes, St (stanting)- törpülés, bokrosodás, rövidszártagúság, Y (yellowing)- sárgulás, YM (yellow mosaic)- Sárgamozaik, VC (vein clearing)- érkivilágosodás, VM (vein mosaic)- érmenti mosaic, VN (vein necrosis)- Érnekrózis Vírusok: AMV (Alfalfa mosaic virus)- Lucerna mozaik vírus, ArMV (Arabis mosaic virus)- Arabis mozaik vírus, CLRV (Cherry leafroll virus)- Cseresznye levélsodródás vírus, GCMV (Grapevine chrome mosaic virus)Szılı króm mozaik vírus, GFkV (Grapevine fleck virus) Szılı foltosodás vírus, GFLV (Grapevine fanleaf virus) Szılı fertızı leromlás vírus, GLRaV- 1, -2, -3 (Grapevine leafroll-associated virus 1, -2, -3)- Szılı levélsodródás vírus 1., 2., 3., RBDV (Raspberry bushy dwarf virus) Málna bokros törpülés vírus, RpRSV (Raspberry ringspot virus)- Málna győrősfoltosság vírus, SLRSV (Strawberry latent ringspot virus)- Szamóca látens győrősfoltosság vírus, TBRV (Tomato black ring virus)- Paradicsom fekete győrős
vírus, TRSV
(Tobacco ringspot virus) Dohány győrősfoltosság vírus, ToRSV (Tomato ringspot virus)- Paradicsom győrősfoltosság vírus
106
