DNA microarrays Josef Srovnal, Michaela Špenerová, Lenka Radová, Marián Hajdúch, Vladimír Mihál
Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice LF UP a FN Olomouc
Cíle
Seznámit posluchače s:
1. Technologií DNA microarrays a jejími možnostmi 2. Klinickými aplikacemi 3. Projekty řešenými v LEM Dětské kliniky FN Olomouc
RNA - transkriptom
DNA RNA
Protein
RNA – genová exprese
Analýza genové exprese 1. Northern Blotting
2. RT-PCR
3. Multi-well array
4. Microarrays
Technologie microarrays – platforma Affymetix • high-density oligonucleotide arrays • photolitography • 28 869 genes • 26 probes per gene (25mer) • 764 855 probes • Many controls
Možnosti microrrays – platforma Affymetrix Analýzy: Gene arrays miRNA arrays SNP Cytogenetic arrays Exon arrays Tilling arrays
Affymetrix GeneChip GeneChip Human Gene/Exon 1.0 ST Array – Whole Transcript
Workflow
1. Výběr vzorku 2. Izolace RNA, Quality control 3. Příprava microarrays 4. Scanning 5. Statistická analýza
Výběr vzorku 1. Čerstvá tkáň, buňky, FFPE 2. Buněčné linie – testování léčiv 3. Pacientské vzorky – response, prognóza, léčba
Izolace RNA
1. Fenol-chloroformová metoda (TRI reagent)
2. Izolační kolony (Qiagen)
Kvantifikace RNA Nanodrop ND 1000 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Malý objem vzorku: 1μl Velký rozsah měření: 2-3700ng/μl (dsDNA) Není nutno vzorky ředit Opětné použití vzorku Celé spektrum: 220 – 750nm Rychlost, jednoduchost
www.nanodrop.com
Kvalita RNA Agilent 2100 Bioanalyzer
www.home.agilent.com
Agilent 2100 Bioanalyzer Lab-on-a-chip Technology Výhody Agilent 2100 Bioanalyzeru: Jediná platforma pro elektroforetické (DNA, RNA, proteiny) i cytometrické (buňky) aplikace Maximální omezení manuální práce Minimální nároky na objem vzorků (1-4ul) Rychlé výsledky (všech 10-12 vzorků proměřeno do 30 minut) Přesné, opakovatelné a reprodukovatelné výsledky Automatický průběh analýz a sběru dat Snadné vyhodnocení, porovnávání a archivace digitálně uložených dat Unikátní nástroj: RIN (RNA Integrity Number) - přesné určení kvality RNA
www.home.agilent.com
RNA Integrity Number - RIN RIN 1
RIN 2
RIN 4
RIN 6
RIN 7
RIN 8
RIN 9
RIN 10
Příprava microarrays 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
cDNA syntéza In vitro transkripce (IVT) Purifikace cRNA cDNA syntéza Purifikace cDNA Fragmentace Značení
8. Hybridizace 9. Promývání a barvení 10. Skenování
Hybridization Oven 645
64 cartridges
Fluidic Station Washing and staining
GeneChip Scanner 7G with Autoloader • high stability • high throughput • high speed • low variability • temperature-controlled • 48 samples
Scanning
Scanning
Statistické analýzy 1. Unsupervised clustering: Hierarchical clustering. Tato analýza umožní počáteční identifikaci a strukturalizaci vzájemně podobných (blízkých) objektů, a to na podkladě matematicky definovaném měření jejich vzájemné vzdálenosti (podobnosti). 2. Supervised discriminatory gene classifiers: T-test, Mann-Whitney U-test, ANOVA, Pearson correlation. Tyto analýzy umožní vzájemně korelovat výsledky a stanovit jejich statistickou významnost. 3. Supervised machine learning classifiers: Support vector machines. Tato metoda umožní kategorizovat vzorky do již známých fenotypů (uplatnění při validaci předchozích metodik a v predikci)
Statistické analýzy
Heatmap Clustering dle (např. 100) genů, které se statisticky nejvýznamněji liší mezi vybranými skupinami
Klinické aplikace
1.
Screening potencionálních molekul Nové terapeutické cíle Nové prediktivní a prognostické markery
2.
Analýza buněčných pochodů Změny genové exprese v závislosti na exp. podmínkách či terapii Identifikace molekulárních drah
3.
Klasifikace Nové molekulární subtypy Prospektivní identifikace pacientů např. good respondérů
Klinické aplikace Pilotní studie Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications Therese Sørlie, Charles M. Perou et al:PNAS, 2001
Breast cancer: Luminal A,B,C Basal -like Normal breast-like ERB2+
Klinické aplikace Pilotní studie Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling Ash A. Alizadeh, Michael B. Eisen, et al.: Nature, 2000
DLBCL – nejčastější NHL, 40% pacientů má dobrou prognózu • Germinal centre B-like DLBCL – 5let 76% OS • Activated B-like DLBCL – 5 let 16% OS
Řešené projekty v LEM DK EHP/Norsko - Posílení výzkumné infrastruktury pro individualizaci léčby chronicky nemocných dětí IGA MZ ČR Molekulární podstata odpovědi na glukokortikoidy u dětí s ALL Cílem je identifikace profilů genové exprese, vztahující se k chemorezistenci k jednotlivým cytostatikům s cílem eliminovat interindividuální variabilitu v metabolismu, farmakokinetice, farmakogenetice a vylučování cytostatik. Pozitivní/negativní prediktory chemorezistence - nové léčebné protokoly.
Řešené projekty v LEM DK IGA MZ ČR NR/9076-4 Genomické profilování v predikci odpovědi na chemoradioterapii u pacientů s lokálně pokročilým karcinomem konečníku
Řešené projekty v LEM DK
223 genes vs. 20 arrays Red – non-responder Blue - responder
Řešené projekty v LEM DK 153 genes vs. 20 arrays Blue - day 1 Red - day 14
Geny MDM4 a OCT4 Chemoradioterapie
Řešené projekty v LEM DK
Analýza exprese genů zapojených do mechanismu účinku protinádorových léčiv - inhibitory aurorakináz, buněčná linie HCT 116
Závěry
1. DNA microarrays - široké experimentální a klinické aplikace 2. Dostupná metodika 3. Spolupráce
Děkuji za pozornost Projekt byl podpořen grantem z Islandu, Lichtenštejnska a Norska v rámci Finančního mechanismu EHP (CZ0099) Posílení výzkumné infrastruktury pro individualizaci léčby chronicky nemocných dětí.
