9
10
11
12 13
14
Iberti TJ, Fischer EP, Leibowitz AB, Panacek EA, Silverstein JH, Albertson TE. A multicenter study of physicians’ knowledge of the pulmonary artery catheter. Pulmonary Artery Catheter Study Group. JAMA 1990;264:2928-32. Shoemaker WC, Appel PL, Kram HB, Waxman K, Lee TS. Prospective trial of supranormal values of survivors as therapeutic goals in high-risk surgical patients. Chest 1988;94:1176-86. Boyd O, Grounds RM, Bennett ED. A randomized clinical trial of the effect of deliberate perioperative increase of oxygen delivery on mortality in high-risk surgical patients. JAMA 1993;270:2699-707. Palazzo M. Circulating volume and clinical assessment of the circulation. Br J Anaesth 2001;86:743-6. Gattinoni L, Brazzi L, Pelosi P, Latini R, Tognoni G, Pesenti A, et al. A trial of goal-oriented hemodynamic therapy in critically ill patients. SvO2 Collaborative Group. N Engl J Med 1995;333:1025-32. Alia I, Esteban A, Gordo F, Lorente JA, Diaz C, Rodriguez JA, et al. A randomized and controlled trial of the effect of treatment aimed at maximizing oxygen delivery in patients with severe sepsis or septic shock. Chest 1999;115:453-61.
15 16
17
18
Kern JW, Shoemaker WC. Meta-analysis of hemodynamic optimization in high-risk patients. Crit Care Med 2002;30:1686-92. Mangano DT, Layug EL, Wallace A, Tateo I. Effect of atenolol on mortality and cardiovascular morbidity after noncardiac surgery. Multicenter Study of Perioperative Ischemia Research Group. N Engl J Med 1996;335:1713-20. Poldermans D, Boersma E, Bax JJ, Thomson IR, Ven LL van de, Blankensteijn JD, et al. The effect of bisoprolol on perioperative mortality and myocardial infarction in high-risk patients undergoing vascular surgery. Dutch Echocardiographic Cardiac Risk Evaluation Applying Stress Echocardiography Study Group. N Engl J Med 1999;34:1789-94. Rivers E, Nguyen B, Havstad S, Ressler J, Muzzin A, Knoblich B, et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N Engl J Med 2001;345:1368-77.
Aanvaard op 5 maart 2003
Capita selecta
Toekomstige verfijning van diagnostiek en therapie met DNA-microarrays. I. Technologie en data-analyse s.c.linn, m.van de rijn en g.giaccone Detectie van DNA- of RNA-moleculen in oplossing berust op de eigenschap van complementaire basenparen om aan elkaar te ‘plakken’ (hybridisatie volgens Watson en Crick). De basen cytosine (C) en guanine (G) hybridiseren met elkaar, en evenzo vormen thymine (T) (uracil (U) in geval van RNA) en adenine (A) een basenpaar. Het is eenvoudig zich voor te stellen dat een gelabelde DNA-sequentie van bijvoorbeeld ACCG goed hybridiseert met de complementaire sequentie TGGC en slecht met een willekeurige sequentie AAGT. Het idee om DNA of RNA te immobiliseren op een oppervlak en bloot te stellen aan te onderzoeken gelabelde RNA- of ‘copy’-DNA(cDNA)-moleculen in oplossing is niet nieuw.1 Bekende voorbeelden hiervan zijn de conventionele Southern en northern blots. Het concept voor de huidige DNA-microarrays (ook ‘gene-chiparrays’, ‘oligonucleotide-arrays’ of ‘chips’ genoemd) werd 10 jaar geleden voor het eerst gepubliceerd door Fodor et al.,2 en meer recent ontwikkeld door Brown en Botstein.3 Kon men met conventionele technieken, zoals Southern of northern blot, slechts informatie verkrijgen over enkele genen tegelijk, met microarrays kan men in één experiment genoomwijd patronen bepalen op DNA- of RNA-niveau (tabel). DNA-microarrays zijn er in vele soorten, maar het basisprincipe is dat duiStanford University Medical Center, afd. Pathologie, Stanford, Calif., VS. Mw.dr.S.C.Linn, internist (thans: Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis, Amsterdam); dr.M.van de Rijn, patholoog. VU Medisch Centrum, afd. Geneeskundige Oncologie, Postbus 7075, 1007 MB Amsterdam. Prof.dr.G.Giaccone, internist-oncoloog. Correspondentieadres: prof.dr.G.Giaccone (
[email protected]).
Zie ook het artikel op bl. 800. samenvatting – Met DNA-microarrays zal men diagnostiek en therapie kunnen verfijnen door kennis van de specifieke eigenschappen van een weefsel van een bepaalde patiënt. – Vooralsnog gaat het om het ontrafelen van genfuncties, pathogenetische mechanismen, metabole routes en effecten van geneesmiddelen daarop, het verfijnen van diagnostische classificaties en prognostische indexen en het vinden van nieuwe aangrijpingspunten voor therapie. Met genotypering kan een risicoprofiel worden opgesteld voor ziekten en bijwerkingen van geneesmiddelen en kan onderzoek worden versneld naar mutaties in genen waarvan de normale DNA-sequentie al bekend is. – Het basisprincipe van een DNA-microarray is dat duizenden verschillende DNA-sequenties, elk specifiek voor een bepaald gen, in een bekende volgorde geïmmobiliseerd zijn op een vast oppervlak (bijvoorbeeld een microscoopglaasje) en in contact worden gebracht met te onderzoeken gelabeld DNA of RNA in oplossing. – De te onderzoeken DNA- of RNA-moleculen binden aan complementaire basenparen op het glaasje, waarna de hoeveelheid die aan een specifiek gen bindt, wordt gemeten. – Voor de analyse van verkregen informatie over de duizenden sequenties wordt gebruikgemaakt van computerprogramma’s die associaties aantonen; het doel is genen met een vergelijkbaar expressiepatroon en daarmee ook de onderzochte weefselmonsters te groeperen. – Vervolgens gebruikt men conventionele biologische of biochemische technieken om de gevonden expressieprofielen te verifiëren en te bevestigen, en om na te gaan of de gevonden genassociaties biologisch relevant zijn.
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 26 april;147(17)
795
Voorbeelden van moleculaire technieken voor de detectie van moleculen DNA, RNA of eiwitten techniek
molecuul gevoeligheid
aantal genen per experiment*
kwantitatief
commentaar
Southern blot
DNA
gering
1
+
gering gering circa 10 m hoger dan northern blot hoog redelijk tot hoog
1 of 2 1 of 2 1 of 2
+ + +
gouden standaard bij mutatie- en amplificatieanalyse, bewerkelijke techniek bewerkelijke techniek bewerkelijke techniek zeer bewerkelijke techniek
1-4 tot 50.000
– ±
northern blot RNA western blot eiwit RNase-protectieassay RNA RT-PCR cDNA-microarray
RNA RNA
snel, veel controles nodig op fout-positieve resutaten snel, veel controles nodig op fout-positieve resultaten, kostbare techniek
+ = ja; – = nee; ± = redelijk; RT-PCR = ‘reverse transcriptase’-polymerasekettingreactie; cDNA = ‘copy’-DNA. *Eén experiment komt overeen met één hybridisatie.
zenden verschillende DNA-sequenties, ieder specifiek voor een bepaald gen, in een bekende volgorde geïmmobiliseerd zijn op een vast oppervlak (bijvoorbeeld een microscoopglaasje) en blootgesteld worden aan te onderzoeken gelabeld DNA of RNA in oplossing. Op basis van Watson-Crick-hybridisatie zullen de DNA- of RNA-moleculen in oplossing op zoek gaan naar hun complementaire basenpaarsequenties verbonden aan het vaste oppervlak. De hoeveelheid gelabeld DNA of RNA dat aan een specifiek gen bindt, kan vervolgens gemeten worden. De onderliggende gedachte bij de ontwikkeling van deze genoomwijde techniek is dat de eigenschappen van een cel worden bepaald door de functionele activiteit van alle eiwitten in die cel. Er bestaan nog geen technieken om het totale functionele eiwitprofiel van cellen te meten. Hieraan wordt wel gewerkt.4 Een benadering kan men verkrijgen door het totale ‘messenger’RNA(mRNA)-expressieprofiel van cellen te meten (ook ‘transcriptoom’, ‘genexpressieprofiel’ of ‘moleculaire signatuur’ genoemd). In preklinisch onderzoek worden deze genexpressieprofielen ingezet voor het ontrafelen van genfuncties, pathogenetische mechanismen, metabole routes en effecten van geneesmiddelen daarop. In klinisch onderzoek worden moleculaire signaturen gebruikt voor verfijning van bestaande diagnostische classificaties en prognostische indexen. Daarnaast helpen ze bij het vinden van nieuwe aangrijpingspunten voor therapie. DNA-microarrays worden ook gebruikt voor genotypering, waarbij met behulp van duizenden genetische markers voor ieder individu op basis van zijn of haar DNA een risicoprofiel voor verschillende ziekten bepaald kan worden. Analoog hieraan kan men een risicoprofiel op bijwerkingen van geneesmiddelen verkrijgen. Tot slot versnellen DNA-microarrays het onderzoek naar mutaties in genen waarvan de normale DNA-sequentie al bekend is. cdna-microarrays versus oligonucleotide-arrays Samenstelling van de array. De constructie van een microarray begint met de keuze van de DNA-sequenties die men wil analyseren in de te onderzoeken monsters 796
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 26 april;147(17)
(Greenhut S, Kerrigan D, Kelly J. Understanding the Cancer genome anatomy project; 2001; http://press2. nci.nih.gov/sciencebehind/cgap/cgap01.htm).5-7 Onderzoekt men bijvoorbeeld lymfocyten, dan zal men graag in ieder geval die genen op de array hebben die in lymfocyten en al hun voorstadia tot expressie gebracht worden. Vervolgens heeft men de keuze tussen korte nucleïnezuursequenties (oligonucleotiden; gemiddeld 2080 basenparen lang) of lange (cDNA-moleculen; gemiddeld 600-2400 basenparen lang). In beide gevallen zoekt men naar unieke gensequenties om fout-positieve hybridisatie te voorkomen. De cDNA-microarrays zijn vooral bedoeld om een genoomwijd overzicht van mRNA-expressieprofielen te verkrijgen, terwijl oligonucleotidearrays zowel voor RNA-expressiestudies als voor genotyperings- en DNAsequentieanalysen gebruikt kunnen worden.
a
b
c
figuur 1. Voorbeeld van het productieproces van ‘copy’DNA(cDNA)-microarrays: het printen van cDNA-moleculen op microscoopglaasjes (a en b) met behulp van robottechnologie; opname van een van de printpennen (c).
Op dit moment kunnen maximaal zo’n 50.000 cDNAsequenties op een enkel microscoopglaasje geprint worden (figuur 1). Voor oligonucleotiden bedraagt dat getal ongeveer 400.000 per glaasje, maar aangezien veel ruimte ingenomen wordt door controle-oligonucleotiden, ligt het aantal meetbare genen rond de 25.000. Labelen en hybridiseren van te onderzoeken nucleïnezuren. mRNA wordt met gelabelde nucleotiden en ‘reverse transcriptase’ omgezet in gelabeld cDNA. Om de meeste complicerende factoren van de hybridisatiekinetiek te vermijden, vergelijkt men op cDNA-microarrays het te onderzoeken mRNA met een mRNAreferentiemix. Hiertoe labelt men het te onderzoeken mRNA met een fluorescerende kleur en het referentiemRNA met een andere fluorescerende kleur. Vervolgens mengt men de twee verschillend gekleurde fracties en hybridiseert men ze op de microarray. De verschillende fluorescentiesignalen worden per cDNAspot met behulp van een confocale laserscanner gemeten en omgezet in twee digitale bestanden. Zo verkrijgt men bijvoorbeeld een plaatje met rood fluorescerende cDNA-spots voor het te onderzoeken mRNA en een plaatje met groen fluorescerende cDNA-spots voor het referentie-mRNA. Deze twee plaatjes projecteert men uiteindelijk over elkaar heen. Hiermee krijgt men informatie over de relatieve mRNA-expressieniveaus in het te onderzoeken monster ten opzichte van het referentiemonster (figuur 2). De keuze van het referentiemRNA hangt af van de onderzoeksvraagstelling. In de laboratoria van Brown et al. gebruikt men voor de meeste experimenten met humaan materiaal als referentiemRNA momenteel een mix van 11 verschillende humane cellijnen afkomstig van diverse maligniteiten. Door alle te onderzoeken monsters met hetzelfde referentiemRNA te vergelijken kan men de monsters uiteindelijk onderling vergelijken. Oligonucleotide-arrays bevatten veel controle-oligonucleotiden ten aanzien van verschillen in hybridisatiekinetiek. Op deze arrays wordt het gelabelde, te onderzoeken mRNA veelal zonder referentie-mRNA gehybridiseerd. Aan het te onderzoeken monster wordt een bekende hoeveelheid RNA van een ander organisme toegevoegd en voor dit RNA zijn ook oligonucleotiden op de array aanwezig. Uit de fluorescentie-intensiteit van deze bekende hoeveelheid RNA wordt de absolute hoeveelheid van de te onderzoeken mRNAsequenties in de oplossing afgeleid. data-analyse Indien men in een enkel experiment informatie verkrijgt over expressieniveaus van 40.000 cDNA-sequenties, dan leveren 25 experimenten een dataset van 1 miljoen elementen op. Om een dergelijke hoeveelheid aan microarraygegevens te analyseren zijn verscheidene computerprogramma’s ontwikkeld.8-11 Welke statistische methode (clustering-algoritme) men ook gebruikt, het doel is de genen met een vergelijkbaar expressiepatroon in de verschillende experimenten te groeperen (clusteren) en op basis van deze genclusters ook de experimenten te groeperen (zoals bijvoorbeeld maligniteiten; figuur 3).
normale cellen
tumorcellen
mRNA ‘reverse’ transcriptie en labeling cDNA labels
labels
microarray-oppervlakte
relatieve onderexpressie van het onderzochte mRNA
gelijke mate van expressie van het onderzochte mRNA
relatieve overexpressie van het onderzochte mRNA
figuur 2. Het principe van ‘copy’-DNA(cDNA)-microarraytechnologie: ‘messenger’-RNA (mRNA) geïsoleerd uit normaal weefsel (referentiemonster) en tumorweefsel (te onderzoeken monster) wordt met verschillende fluorescentiemarkers gelabeld tijdens omzetting naar cDNA. De beide gelabelde monsters worden gemengd en vervolgens gehybridiseerd met een cDNA-microarray. Doorgaans wordt het referentiemRNA met Cy3 (groen; in de figuur blauw) gelabeld en het te onderzoeken mRNA met Cy5 (rood). De fluorescentieratio’s op de array weerspiegelen voor elke cDNA de relatieve mate van expressie van het corresponderende mRNA in de 2 weefsels. Indien een cDNA rood wordt weergegeven, betekent dit relatieve overexpressie van het onderzochte mRNA; groen (in de figuur blauw) betekent relatieve onderexpressie van het onderzochte mRNA en geel betekent gelijke mate van expressie in beide monsters. Door in alle experimenten hetzelfde referentie-RNA te gebruiken, kunnen onderzoeksmonsters met elkaar vergeleken worden. Ned Tijdschr Geneeskd 2003 26 april;147(17)
797
Hiermee beoogt men groeperingen te vinden die biologisch relevant zijn. Het principe dat men hierbij hanteert, is ‘schuldig door associatie’. In studies waarin men bijvoorbeeld de celcyclus heeft bestudeerd, ziet men genen
4
3
2
tumor
patiënt
A
1
A
2
A
3
A
4
B
5
B
6
B
7
B
8
C
9
C
10
C
11
C
12
D
13
D
14
D
15
D
16
1
figuur 3. Voorbeeld van dataweergave na hiërarchische clustering. In dit voorbeeld worden genexpressieprofielen van 4 tumortypen A, B, C en D, afkomstig van 16 patiënten, met elkaar vergeleken, waarbij de genexpressieniveaus van de genen 1, 2, 3 en 4 voldoende onderscheidend vermogen hebben om deze tumortypen correct te groeperen. Voor visualisatie van de resultaten is het expressieniveau van elk gen (relatief ten opzichte van zijn gemiddelde expressie in alle voor deze analyse gebruikte experimenten) geel bij groter dan gemiddelde expressie en blauw bij minder dan gemiddelde expressie. De intensiteit van de kleur geeft de grootte van de afwijking van het gemiddelde aan. Gemiddelde expressie is weergegeven in zwart. Grijs betekent dat voor dat gen op de betreffende array geen interpreteerbaar signaal verkregen werd. Na clustering worden groepen genen met een gecoördineerd expressiepatroon in biologisch verwante tumoren zichtbaar. Zo heeft tumor type A een relatieve overexpressie van gen 4 en relatief verlaagde expressie van de genen 1 en 2. Het dendrogram geeft de onderlinge relatie tussen de tumoren weer. 798
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 26 april;147(17)
gecoördineerde relatieve over- of onderexpressie van groepen genen in de G1-, S-, G2- en M-fase.12 Wanneer genen vergelijkbare expressiepatronen hebben, veronderstelt men dat hun functies aan elkaar gerelateerd zijn. Deze aanname blijkt niet altijd juist en dient dan ook met conventionelere biologische of biochemische technieken bevestigd te worden. Figuur 3 is een voorbeeld van dataweergave na hiërarchische clustering. Het moge duidelijk zijn dat het ‘karakteristieke’ van iedere genexpressiesignatuur in de context van de onderzochte monsters gezien moet worden. In dit voorbeeld selecteert men op genen die differentieel tot expressie komen in de onderzochte tumortypen. Dit zou van nut kunnen zijn voor het zoeken naar diagnostische markers die een onderscheid maken tussen deze verschillende maligniteiten.13 Indien men bijvoorbeeld een maligniteit als hepatocellulair carcinoom zou vergelijken met normaal leverweefsel, ontstaan hele andere genexpressieprofielen.14 weefselmicroarrays Een nadeel van DNA-microarrays is dat cel- en weefselspecifieke informatie verloren gaat. Deze informatie blijft wel behouden met histologische technieken, zoals immunohistochemie, en in-situ-RNA- en -DNA-hybridisatie. Om kandidaatgenen, geïdentificeerd met DNAmicroarrays, op klinische bruikbaarheid te screenen dient materiaal van honderden patiënten, gerangschikt naar bijvoorbeeld ziektestadium en behandelingsprotocol, geanalyseerd te worden. Met de komst van weefselmicroarrays is dit screenen een stuk eenvoudiger geworden.15 In een paraffineblokje met een oppervlak van 4,5 × 2,0 cm en 5-10 mm dik worden weefselcilinders naast elkaar gerangschikt, die met een holle naald geboord zijn uit paraffineweefselblokjes van verschillende patiënten. De doorsnede van de weefselcilinders is 0,61,0 mm en de lengte 2-3 mm. Met deze techniek kunnen 300 tot maximaal 1000 weefselcilinders in een blok gerangschikt worden. Een blok levert ongeveer 200 coupes. De voordelen van deze techniek zijn evident: in plaats van het experimenteel bewerken van honderden glaasjes heeft men nu met een enkel glaasje informatie over honderden patiënten. Er is geen probleem van interexperimentele variabiliteit. Bovendien reduceert deze techniek de hoeveelheid benodigd archiefmateriaal, zodat er meer overblijft voor andere studies. Het nadeel is dat een coupe van een weefselcilinder ongeveer 0,3% van het huidige als representatief beschouwde materiaal vertegenwoordigt.16 Met twee of drie verschillende weefselcilinders per patiënt is de concordantie met data verkregen via conventionele technieken respectievelijk 95 en 98%.16 Omdat weefselmicroarrays bij uitstek geschikt zijn voor retrospectieve cohortonderzoeken, is ook gekeken naar het behoud van antigeniciteit in archiefmateriaal vanaf 1932 tot 1999. Het oude archiefmateriaal was veelal gefixeerd en ingebed volgens onbekende protocollen; desondanks bleek de antigeniciteit van de geteste epitopen over het algemeen goed bewaard gebleven.16 Met weefselmicroarrays heb-
ben wij bijvoorbeeld een aantal prognostische markers kunnen identificeren voor rabdomyosarcoom. conclusies De introductie van microarraytechnologie in de dagelijkse klinische praktijk zal nog even op zich laten wachten. De techniek is nog lang niet uitontwikkeld en de eerste methoden voor data-analyse en -verwerking zijn pas onlangs geïntroduceerd. Wel wordt veel onderzoek verricht met microarrays en het aantal publicaties groeit exponentieel. Men verwacht dat deze technologie haar intrede in de geneeskunde zal doen op een vergelijkbare manier als destijds de computers hun intrede deden in de maatschappij.7 Microarrays zullen straks hun eigen plek hebben in de diagnostiek, klinische genetica en in het ontwikkelen en voorschrijven van geneesmiddelen. Om dit te realiseren, zal intensieve samenwerking nodig zijn tussen wetenschappers uit de biologie, genetica, wiskunde, informatica, natuurkunde, scheikunde en geneeskunde. Inmiddels worden in Nederland door verschillende centra microarrayfaciliteiten opgezet, waarbij wetenschappers uit al deze disciplines zijn betrokken. Om de vele technische en klinische vraagstukken rondom deze nieuwe technologie te kunnen oplossen zal nauwe samenwerking tussen deze verschillende centra nodig zijn. Tot slot zal deze nieuwe technologie vragen om een andere manier van denken, met een verschuiving van moleculaire naar modulaire celbiologie.17 Ofwel, vrij naar de Nobelprijswinnaar Hartwell: ‘De arts van morgen zal in staat moeten zijn te denken op verschillende niveaus; op het niveau van het enkele molecuul, op het niveau van de functionele eenheid binnen de cel, en op het niveau van het gehele organisme’.17 Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: mw.dr.S.C.Linn ontving ondersteuning van de Nederlandse Kankerbestrijding/Koningin Wilhelminafonds in de vorm van een ‘research fellowship’.
abstract Novel approaches; improved diagnostics and therapeutics with DNA microarrays. I. Technology and data analysis – With DNA microarrays it will be possible to refine diagnostics and treatment with the use of genome wide information on a patient’s sample. – Microarrays are currently applied to unravel gene functions, pathogenetic mechanisms, metabolic routes and the effects of drugs on these, to refine diagnostic classifications and prognostic indexes, and to find new targets for therapy. With genotyping it will be possible to generate risk profiles for certain diseases and to assess the likelihood of a given drug-related side effect. Furthermore, it may accelerate research of mutations in genes for which the normal DNA sequences are already known. – The basic principle of DNA microarrays is that thousands of different DNA sequences, each specific for a given gene, are
immobilised on a solid surface (for example a microscope slide), arranged in a known order, and are hybridised with a solution of labelled DNA or RNA molecules. – The DNA or RNA molecules under investigation bind to complementary base pairs on the slide, and permit us to measure the amount of labelled DNA or RNA hybridised to each gene sequence. – Sophisticated software is used to analyse the large amount of data generated. The ultimate aim is to group genes with similar expression patterns across all samples, and then group samples accordingly. – Conventional biological or biochemical techniques are required to validate the data obtained with microarrays, and to verify whether the observed associations among genes are biologically relevant.
1
2
3 4 5 6 7 8 9
10
11
12
13
14
15
16 17
literatuur Gillespie D, Spiegelman S. A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. J Mol Biol 1965;12: 829-42. Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D. Lightdirected, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991;251:767-73. Brown PO, Botstein D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nat Genet 1999;21(1 Suppl):33-7. Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomes. Nature 2000;405:837-46. Lipshutz RJ, Fodor SP, Gingeras TR, Lockhart DJ. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet 1999;21(1 Suppl): 20-4. The chipping forecast. Nat Genet 1999;21 Suppl:1-60. Lockhart DJ, Winzeler EA. Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature 2000;405:827-36. Quackenbush J. Computational analysis of microarray data. Nat Rev Genet 2001;2:418-27. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:14863-8. Alter O, Brown PO, Botstein D. Singular value decomposition for genome-wide expression data processing and modeling. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:10101-6. Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:5116-21. Cho RJ, Huang M, Campbell MJ, Dong H, Steinmetz L, Sapinoso L, et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet 2001;27:48-54. Su AI, Welsh JB, Sapinoso LM, Kern SG, Dimitrov P, Lapp H, et al. Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Res 2001;61:7388-93. Okabe H, Satoh S, Kato T, Kitahara O, Yanagawa R, Yamaoka Y, et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression. Cancer Res 2001;61:2129-37. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S, et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998;4:844-7. Camp RL, Charette LA, Rimm DL. Validation of tissue microarray technology in breast carcinoma. Lab Invest 2000;80:1943-9. Hartwell LH, Hopfield JJ, Leibler S, Murray AW. From molecular to modular cell biology. Nature 1999;402(6761 Suppl):C47-52.
Aanvaard op 12 november 2002
Ned Tijdschr Geneeskd 2003 26 april;147(17)
799
