Disertační práce MUDr. Regina Demlová

Masarykova Univerzita v Brně Lékařská fakulta

Interindividuální variabilita metabolizujících enzymů z pohledu farmakogenetiky u vybraných cytostatik

Disertační práce MUDr. Regina Demlová

Brno 2008

poděkování: tato práce je integrální výsledkovou součástí programu VVZ MOÚ Brno č. MZ0MOÚ2005: „Farmakogenetika protinádorové chemoterapie“, jehož hlavním řešitelem v MOÚ je D. Valík. Z ostatních pracovištˇ MU Brno se na projektu významně podílejí prof. J. Štěrba, KDO FN a LF a doc. L. Dušek, jimž děkuji za náměty, připomínky a komentáře.

Paní profesorce McCaskey-Hadašové, své školitelce, děkuji za mnoho cenných rad, připomínek i čas, který mi během studia věnovala.

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

2

1. úvod vrozené poruchy metabolismu a farmakogenetika historické aspekty, základní pojmy, termíny a definice mendelovská dědičnost, monogenní choroby a ekogenetika farmakogenetika a její kontext v reakci zprostředkované prostředím biomarkery v hodnocení farmakogenetické reakce genetický základ farmakologie a lidská reakce na léčivo

2. farmakogenetika a chemoterapie nádorových eönemocnění cytochrom(y) P 450 thiopurin S-methyltrasferasa (EC 2.1.1.67) uridindiphosphat glucuronyltransferasa (EC 2.4.1.17) N-acetyl transferasa (EC 2.3.1.1) dihydropyrimidin dehydrogenasa (EC 1.3.1.2)

3. 5-fluorouracil (5-FU) faktory ovlivňující farmakokinetiku 5-fluorouracilu obecné faktory dihydropyrimidin dehydrogenasa DPD aktivita a plazmatické hladiny 5-FU DPD a toxicita 5-FU selekce cílových parametrů farmakogenetické aspekty podávání 5-FU

4. methotrexat (MTX) antifoláty role homocysteinu v průběhu terapie MTX

5. použitá literatura

6. cíle práce

projekt A – farmakogenetické souvislosti při podávání fluoropyrimidinové chemoterapie primární cíl projektu vstupní kriteria vylučující kriteria ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

3

přehled vyšetření, sběr dat a metodika výsledky diskuse k výsledkům projektu A

projekt B – biomarkery ve sledování farmakodynamiky methotrexatu primární cíl projektu vstupní kriteria přehled vyšetření, sběr dat a metodika výsledky a diskuze k výsledkům projektu B

7. publikace autorky

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

4

1. Úvod

Položíme-li otázku, jaká onemocnění se nám vybaví jako geneticky podmíněná či dědičná, řada z nás si bezprostředně vzpomene na pacienty s Downovým syndromem, cystickou fibrózou, muskulární dystrofií, nebo také například na dědičné formy nádorových nemocnění, především nádory prsu a vaječníků spojených s mutací BRCA genů. Už méně z nás si však zřejmě vybaví ten fakt, že může existovat genetická souvislost s interindividuálními rozdíly v reakci na podávané léčivo, popřípadě na jiné exogenní látky vyskytující se v okolním prostředí. Podání léčiva pacientovi je vždy tak trošku a do jisté míry určitým „experimentem“, ač si to možná mnoho z nás ne zcela uvědomuje. Na výsledném terapeutickém efektu se uplatní celá řada faktorů, počínaje věkem a pohlavím pacienta, stavem nutrice, stavem renálních a jaterních funkcí, přítomností souběžných onemocnění, současnou expozicí jiným léčivům a neméně podstatně také vlastním genotypem každého jedince. Ještě než se budeme zabývat pojmem farmakogenetika, zastavme se i u nikoliv geneticky podmíněné, nicméně ve výsledné reakci na léčivo také velmi podstatné skutečnosti, a to podávání konkomitantní medikace a s ní spojené možnosti vzniku lékových interakcí. Ty mohou vznikat jak na úrovni farmakokinetické, tak i farmakodynamické, popřípadě farmaceutické. O významu a závažnosti lékových interakcí vypovídají údaje získané analýzami národních registrů mapujících neočekávané a závažné nežádoucí účinky léčiv. Například v US bylo publikováno, že nežádoucí účinky léčiv jsou na 4. – 6. místě mezi nejčastějšími příčinami úmrtí (1), přičemž se předpokládá, že lékové interakce jsou příčinou až poloviny těchto úmrtí. (2). Z literatury je známo, že významný podíl na vzniku závažných lékových interakcí mají polymorfismy v metabolizaci podávaných léčiv, a tady již genetika svou roli jistě hraje. Budeme-li hovořit o metabolismu léčiv a farmakogenetice, zopakujme si některé základní pojmy, které s tím úzce souvisejí. Lidský genom představuje obrovské množství více než 3 gigabazí v DNA (sekvencí párů mukleotidů). Menší část genomu je tvořena kódujícími úseky (tzv. exony), které pak určují asi 32 tisíc genů. Předpokládá se však, že jen necelá polovina kóduje vlastní proteinový řetězec. Díky různým posttranskripčním úpravám však tento relativně malý počet genů výsledně determinuje více než 100 tisíc bílkovinných molekul. I když je DNA neobvykle stabilní strukturou, mohou při předávání informace pomocí sekvence párů bází DNA vznikat chyby. Naprostá většina je dána odchylkou jednoho páru, tedy bodovou mutací. Podstatné je, jak se tato odchylka v pořadí odrazí na funkci proteinu. Změny, které vedou k záměně aminokyseliny (tzv. missense mutation), mohou vést ke změně struktury, následované poklesem aktivity, např. enzymu, nebo se aktivita změnit nemusí, popřípadě se naopak může navýšit. Horší alternativou je, když bodová změna kodonu vede k ukončení syntézy řetězce proteinu (tzv. stop kodon). Výpadek, či naopak přidání baze, navodí systémovou ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

5

chybu čtení řetězce, která také zpravidla ukončí syntézu zbytku molekuly proteinu. Závažné poruchy syntézy důležitých proteinů jsou většinou vývojem eliminovány. Méně závažné odchylky funkce (s nízkou penetrací) však mohou být v populaci časté. V našich více než 30-ti tisících genech jsou známy nejméně dva miliony takovýchto odchylek, neboli polymorfismů. Polymorfismus je definován jako odchylka v sekvenci DNA, která je přítomna nejméně u 1% populace. V řadě případů polymorfismus vede ke snížené aktivitě například enzymů, receptorů, transportních proteinů, vzácně může být aktivita i vyšší. Významem těchto polymorfismů ve farmakologii se zabývá právě farmakogenetika.

1.1 Vrozené poruchy metabolismu a farmakogenetika:

1.1.1. Historické aspekty, základní pojmy, termíny a definice

Základy vědeckého oboru, který je dnes již pod pojmem „farmakogenetika“ obecně známý, lze vysledovat až na počátek 20. století. Teoretické základy farmakogenetiky jsou odvozeny z konceptu tzv. „chemického individualismu”, přičemž tento termín byl poprvé použit britským lékařem Sirem Archibaldem Garrodem již v roce 1902. Ten si při svých výzkumech všiml, že lidé s alkaptonurií, tedy nemocí se sníženou degradací kyseliny homogentisové (ta je metabolitem tyrozinu), mají několik společných symptomů - vylučují moč, která ztmavne při stání a/nebo alkalizaci, mají černou ochronotickou pigmentaci chrupavky a kolagenových tkání a artritidu, charakteristicky přítomnou zejména v oblasti páteře. Při pozorném sledování svých pacientů zjistil, že je tato vlastnost přenášená vertikálně celým rodokmenem jako jakýsi „genetický rys“. Přestože v té době o genech ještě nemohl nic vědět, byl první, kdo dal tomuto jevu „Mendelovský výklad”. Ve své publikaci z roku 1902 dospěl k závěru, že „...se zabýváme individualismy v metabolismu a ne výsledky chorobných procesů… (3). Později, v roce 1909, odvodil pojem „vrozené poruchy metabolismu”, který chápal správně jako podskupinu svého mnohem širšího konceptu – a to konceptu chemického individualismu - „chemical individuality“ (4).

Obdobně jako tomu bylo v případě prací Johanna Gregora Mendela, jehož významné objevy byly na nějakou dobu zapomenuty, aby pak byly znovuobjeveny na počátku 20. století, i Garrodovo pojetí vrozené poruchy metabolismu mělo podobný osud. Nejprve téměř zapomenuto bylo znovuobjeveno koncem padesátých let – konkrétně v roce 1949, a to na symposiu Biochemické společnosti v Londýně, které bylo výhradně věnováno oboru nazvanému “biochemická genetika”. Garrodův přínos pro genetiku byl obecně uznáván, neb ustanovil dva důležité principy..a to i) že “...kdykoli je to možné, genetická rozdílnost by měla být měřena chemickým testem” a ii) že “...kdybychom znali dostatečně každý gen, mohli bychom mu přiřadit také konkrétní chemický účinek v lidském organismu” (5). Měřeno současnou úrovní vědeckých poznatků lze konstatovat, že se tyto principy staly stěžejními stavebními kameny moderního pojetí základní a klinické genetiky – a ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

6

některé její podobory, ke kterým jistě patří i farmakogenetika, byly založeny právě a především na těchto principech.

1.1.2. Mendelovská dědičnost, monogenní choroby a ekogenetika

Opomenut tehdejšími významnými vědci vyšel v roce 1865 rukopis přednášky nazvané „Versuche über Pflanzen-Hybride” (Pokusy s rostlinnými hybridy), jehož autorem byl moravskoslezský augustiniánský mnich Johann Gregor Mendel. Mendel popsal svá pozorování týkající se dědičnosti různých charakteristických vlastností („faktorů") u křížených rostlin hrachu, které se fenotypově manifestovaly v následných generacích. Při opakovaném křížení rostlin hrachu zaznamenal určité vlohy k dědičnosti znaků z jedné sady rostlin hrachu na další. Pečlivou analýzou počtu rostlin hrachu a jejich tvaru objevil dva zcela zásadní principy dědičnosti, které byly později nazvány Mendlovými zákony: Zákon dominance a segregace a Zákon o nezávislé kombinovatelnosti. Mnohem později, v podstatě s objevy DNA a její struktury (Watson, Crick) a rozvojem biochemie a molekulární genetiky, byla objasněna i molekulární podstata Mendelových zákonů, a to formou exprese genů v buňkách a jejich přenosem v buněčných liniích. Důležité je, že Mendelova práce umožnila poprvé systematicky využít genetickou podstatu organismů. S jménem J.G.Mendela jsou tak spojeny nejen počátky genetiky jako vědního oboru , ale také počátek systematického používání matematiky, význam kvantifikace v měřeních a aplikované statistiky v biologii (6). Během Garrodova období zůstával gen jakousi statistickou jednotkou, a to až do doby publikování práce Beadla a Tatuma (7), kteří genu přiřadili biochemického „následníka” – enzym. Lze tedy říci, že to byla v podstatě myšlenka „biochemického fenotypu”, která vedla v souladu s klinickými pozorováními k myšlence „chemického individualismu” a pojmu „vrozené metabolické poruchy”, a to zavedením funkční definice genu, jeho produktu se specifickou biochemickou funkcí a s jeho klinicky vyjádřeným fenotypem daného znaku. Toto pojetí zůstává dodnes v platnosti pro stavy, které dnes označujeme pojmem „monogenní choroby”. Pochopení charakteristických reakcí na podání léčiva člověku lze datovat do doby přibližně před 150 lety. V té době byly poprvé pozorovány účinky cizorodých látek na lidský organismus, ovšem další pokrok v těchto experimentálních pracech byl možný až koncem 19. a začátkem 20. století, a to s dalšími, zejména metodologickými, objevy a pokroky (8). V té době byly rovněž prohloubeny poznatky v oblasti organické chemie. Jak bylo podrobně rozepsáno výše, znovuobjevení Mendelových zákonů vedlo významné myslitele začátku 20. století, Garroda, Cuenota a Batesona k závěru, že genetická výbava hraje významnou a zásadní roli v řídících chemických přeměnách v těle. Garrodova práce s hypnotikem sulfonalem jej vedla k poznání, že geneticky dané vrozené předpoklady se promítly nejen do patologické eliminace endogenní látky, jež se v organismu hromadila díky „vrozené poruše metabolismu“, ale že hrají svou roli i při eliminaci látek exogenních. ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

7

Jiným významným postřehem bylo, že exogenně podané látky byly často vyloučeny ve formě, která byla odlišná od té, v jaké byly do organismu přijaty. Garrod rozšířil svá pozorování a objevil, že jedinec může přeměnit řadu cizích látek na netoxické konjugáty, příkladem hippuráty a glukuronáty, a tímto mechanismem je tak neškodně vyloučit. (9) Hlavní kategorie enzymů, podílejících se na metabolizaci léčiv, byly objeveny přibližně o 50 let později, tj. v době, kdy byl již popsán značný počet „klasických” vrozených poruch metabolismu (10). Studie Williamse (11) přinesly poznatek, že lidé, ale i zvířata, jsou schopni biotransformace velkého počtu exogenních látek, a to překvapivě ne jedinou, nýbrž i větším počtem metabolických cest. V těchto studiích Williams také popsal novější pohled na metabolismus léčiv, a to jeho rozložení do dvou fází : fáze I sestávající z chemické modifikace výchozího léku, jako například oxidace, redukce nebo hydrolýza, s následnou fází II, kdy došlo k jeho následné konjugaci tak, aby bylo rozpustnější ve vodě a tím také snadněji vyloučitelné z organismu.

1.1.3. Farmakogenetika a její kontext v reakci zprostředkované prostředím

Koncem padesátých a v šedesátých let minulého století byly z genetického pohledu zkoumány reakce organismu na podání takových látek, jako byly suxametonium, primaquin a isoniazid (12). Dědičné odchylky v reakci na antimalarika posloužily jako učebnicové příklady konceptu „chemického individualismu”, kdy základní vrozená porucha metabolismu – zde nedostatek glyceraldehyd- 3-fosfátdehydrogenázy, vedla k nadprůměrné senzitivitě na primaquin a podobné léky. Rozdíly v citlivosti se jevily současně závislé na pohlaví (13). Prokázalo se, že jedno z prvních klinicky účinných antituberkulotik, isoniazid, způsobuje u určité podskupiny pacientů periferní neuropatii. Později bylo prokázáno, že isoniazid je metabolizován acetylací a že lidská populace se v podstatě dělí na tzv. „rychlé” a “pomalé” acetylátory, a to podle rychlosti přenosu acetylového zbytku (14). Za skutečný počátek konceptu farmakogenetiky lze označit publikací Motulského (15), který jako první propojil disciplíny biochemie, farmakologie a genetiky do jediného vědního oboru, zabývajícího se interindividuálními variacemi v odpovědi na podaná léčiva, způsobenými individuální genetickou výbavou daného jedince . S pojmem „farmakogenetika” přišel následně Vogel v roce 1959 (16). Jak vyplývá z výše uvedeného, farmakogenetika zahrnuje široký okruh farmakologických a toxikologických jevů, které jsou – přinejmenším v teorii – v podstatě neomezené. Skutečnost, že většina „farmakogenetických” principů je uvedena na příkladech podávání léčiv, vyplývá z historicky dané skutečnosti, neb léčiva jsou na rozdíl od imisí či jiných exogenních látek obvykle podávána za kontrolovaných podmínek. Pojmy jako například „environmentální genetika” a/nebo „ekogenetika” se v tomto případě mohou jevit přesnější a farmakogenetika je pochopitelně v podstatě zahrnuta v jejich rámci (17). ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

8

Základem farmakogenetického výzkumu jsou často izolovaná pozorování, jako například hlášení případů „vedlejších nežádoucích účinků” a/nebo nepředvídané “idiosynkratické” a/nebo epidemiologické studie, jak bylo zmíněno již v úvodu. Objasnit tyto jevy a roztřídit je na úrovni genotypu, farmakobiochemického fenotypu a klinického fenotypu je značně náročné a vyžaduje nemalé úsilí. K tomu, aby se toto zdárně podařilo, je dnes nezbytná spolupráce výzkumníků s různými odbornostmi. (18). Na rozdíl od mnoha jiných genetických oborů, kde zavedení pokusných zvířat vedlo k významným objevům a napomohlo objasnění specifických metabolických a regulačních cest, použití laboratorního zvířecího modelu ke studiu farmakogenetických zákonitostí je obtížné právě kvůli povaze farmakogenetických jevů – pro připomenutí, z Garrodovy teze o chemické individualitě lze snadno odvodit, že tyto funkční charakteristiky jsou u různých savčích druhů rozdílné. Savci mohou například trpět různými patologickými stavy, které svou povahou patří mezi „vrozené metabolické poruchy”, které však nemají patofyziologickou paralelu pozorovatelnou u lidí. K demonstraci tohoto lze uvést dva zajímavé příklady, související s vrozenými poruchami metabolismu purinu a pyrimidinu – myší model u Lesch-Nyhanova syndromu a orotic acidurie v Holsteinově plemenu skotu. Vytvořený experimentální laboratorní myší model s deficientním enzymem hypoxantinguaninfosforibózyltrasferázou (HGPRT) nevedl k předpokládanému klinickému fenotypu, velmi pravděpodobně tento enzym nehraje tak významnou roli v intermediárním metabolismu purinu, jak tomu je u lidských subjektů (19). Druhý příklad představuje endogenní biochemickou abnormalitu, která je u tohoto chovu dobytka dle Mendelových zákonů vertikálně přenosná (20). Za normálních podmínek heterozygotní zvířata vykazují biochemický fenotyp této genetické abnormality v činnosti uridinmonofosfátsyntázy (UMPS), ovšem bez zjevného patologického fenotypu, avšak homozygotní deficit UMPS je považován za letální. Opačně, heterozygotní stav u lidí nebyl popsán, neexistuje tedy ani jeho klinický fenotyp, ovšem homozygotní jedinci vykazují vážné hematologické onemocnění – orotovou acidurii typu I – sestávající z megaloblastické anémie a hyperexkrece kyseliny orotové močí. Skutečnost, že léčba vysokými dávkami uridinu přívodem ve stravě dokáže tuto poruchu korigovat, vedla k závěru, že orotová acidurie typu I je patrně jediný známý lidský nutriční auxotrofní stav (tzn. stav, kdy je buňka neschopna syntetizovat některou z nezbytných složek a proto tato složka musí být dodána exogenně (21).

1.1.4. Biomarkery v hodnocení farmakogenetické reakce

Studium farmakogenetiky a designování farmakogenetických studií přináší problémy také na úrovni stanovování vhodných cílových parametrů při zkoumání takových jevů, jako jsou například reakce u osob, které mohou reagovat na daný podnět dané povahy buď normální, nebo abnormální odpovědí. Navíc v některých případech může být abnormální reakce zcela akutní, zatímco v jiných případech ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

9

může trvat roky, než dojde k její manifestaci: typickými příklady těchto jevů může být na jedné straně akutní toxicita uracilových analogů, fluoropyrimidinů, u jedinců se sníženou činností dihydropyrimidindehydrogenázy, jejíž studium je i předmětem této práce, druhým příkladem pak může být chronická expozice látek, které jsou endogenně, např. hydroxylací, přeměněny na sloučeniny působící dlouhodobě karcinogenně. Důležitým přístupem, jak možná řešit obdobné problémy, je stanovování takových cílových parametrů, respektive biologických markerů, které mohou být měřeny v krátkých časových intervalech a které jsou biochemické a/nebo genetické povahy. Při návrhu vhodného biomarkeru by měly být splněny minimálně následující podmínky : biomarker by měl být i) snadno a spolehlivě zjistitelnou veličinou; ii) měl by být dostatečně selektivní vůči sledovanému jevu; iii) měl by být měřitelný v dobře dostupném biologickém materiálu s upřednostněním neinvazivního odběru vzorků; iv) měl by být vyjádřen rozdílně u normálně a abnormálně reagujících osob a v) měla by u něj existovat minimální pravděpodobnost spontánní změny. Samozřejmě je nutno konstatovat, že užití pouze biologických markerů při hodnocení komplexního farmakogenetického jevu nemusí být dostatečné a informace, získané jeho studiem by měly vést k dalšímu výzkumu studovaného jevu. V ideálním případě by pak následné využití správného cílového biomarkeru vedlo k jeho využití v klinické praxi. Používaný parametr, resp. biomarker by tak byl využit jako minimálně invazivní a nenákladný diagnostický test k určení fenotypu jedince a určení, zda je daný fenotypový znak determinován geneticky nebo vyvolán působením exogenních a/nebo získaných vlivů (diskutováno v publ. 18, 22).

1.1.5. Genetický základ farmakologie a lidská reakce na léčivo

Xenobiotika, podaná savčím jedincům, mají většinou zcela charakteristické a více či méně reprodukovatelné účinky. Odpovědi, vyvolané podáním léčiva, jsou pak většinou determinovány jednak danými fyziologickými a biochemickými vlastnostmi daného léčiva a dále pak vlastnostmi buněk a tkání, na které léčivo působí, které jsou tedy jeho cílovými strukturami. Jakýkoliv léčivo, podané jedinci, je pak následně zapojeno do dvou základních farmakobiochemických procesů, které určují výsledný efekt, a to procesu farmakokinetiky a farmakodynamiky. Od doby objevu receptorů je základním „postulátem” farmakologie fakt, že aktivní lék, má-li vyvolat reakci, musí být přítomný v místě receptorů. Navíc musí být léčivo podané v takové dávce, která zajistí v cílové tkáni s receptory jeho účinnou koncentraci. Vzhledem k tomu, že většina dnes podávaných léčiv působí na receptor reverzibilně, je výsledná odpověď závislá především na koncentraci transientních komplexů mezi vazebným místem receptoru a jeho ligandem (tedy např. léčivem). Kvantifikovat přesnou koncentraci komplexů receptor - ligand je obtížné, lze však vycházet z koncentrace podaného léčiva a tu lze monitorovat měřením plazmatické hladiny jeho volné frakce. Obecně, procesy, které popisují osud léčiva v organismu po jeho podání lze zařadit do kategorie „farmakokinetika” a procesy, odpovědné za samotné farmakologické působení , jsou označeny ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

10

pojmem„farmakodynamika. Jelikož jsou oba tyto procesy geneticky determinovány, můžeme předpokládat variabilitu v každém z nich, tedy jak v části farmakokinetické, tak i farmakodynamické. Z tohoto konceptu také vycházel návrh komplexního farmakogenetického sledování fluoropyrimidinové chemoterapie, a to jak na úrovni fenotypu, tak i i genotypu (podrobněji viz dále 2.1. projekt A - Farmakogenetické souvislosti při podávání fluoropyrimidinové chemoterapie).

2. Farmakogenetika a chemoterapie nádorových onemocnění

Přes význačné pokroky v cytostatické léčbě nádorových onemocnění nejsou dnešní výsledky protinádorové chemoterapie zcela uspokojivé. I přesto lze říci, že chemoterapie dále zůstává nepostradatelnou a významnou léčebnou metodou v komplexní protinádorové léčbě. Pokračující výzkumy v posledních letech navíc ukazují, že pravděpodobně dosud nebyly vyčerpány všechny možnosti dalšího posílení účinnosti a bezpečnosti protinádorové chemoterapie (23). Při rozhodování o léčbě konkrétního pacienta je klinický onkolog postaven před rozhodnutí zvolit nejen vhodné cytostatikum nebo kombinaci cytostatik, ale také podat optimalizovanou dávku a zvolit vhodný dávkový interval (dávkovou intenzitu). Stanovení výše dávky každého cytostatika vychází v běžné klinické praxi v naprosté většině případů z přepočtu na tělesný povrch pacienta (BSA – Body Surface Area). Takto vypočtená dávka sice vychází z přesné a reprodukovatelné kalkulace, ovšem pouze na základě matematické funkce výšky a váhy daného pacienta, a jako taková má své limity. Řada farmakokinetických studií v nedávné době potvrdila, že u některých cytostatik téměř neexistuje korelace mezi BSA a dalšími farmakokinetickými parametry jako jsou například clearance nebo plocha pod křivkou (AUC – Area Under Curve ) (24,25,26,27). Jak se takto fakta mohou promítnout do praxe klinické onkologie ? Jedním z často pozorovaných jevů může být skutečnost, že podání stejného cytostatika v dávce přepočtené na tělesný povrch různým pacientům může být u jednoho z nich doprovázeno výraznými nežádoucími účinky a u druhého nejsou doprovodné projevy toxicity vůbec vyjádřeny. Samozřejmě nelze tuhle skutečnost zjednodušit pouze na problematiku výpočtu dávky, i když v ní může hrát pravděpodobně zásadní roli. Ještě více problematické je pak vztáhnout stejný argument i na korelaci s léčebným efektem, neboť zde hraje roli mnohem více faktorů, než je pouze samotná problematika farmakologická. Pozorované interindividuální rozdíly mohou souviset i s dalšími faktory, ať již ve vztahu k hostiteli – léčenému jedinci (těmi obecně známými jsou již výše zmíněné věk a pohlaví pacienta, nutriční stav, stav renálních a jaterních funkcí, souběžná onemocnění, současná expozice jinými léčivy nebo cirkadiánní rytmicita ), tak i ve vztahu k jedinečnosti vlastního nádoru (28). Samostatnou kapitolou i v kontextu farmakologie chemoterapeutik, v současné době stále více studovanou, jsou faktory zde diskutované, tedy ty související s rozdílnou genetickou výbavou každého jedince. Vezmeme-li v úvahu skutečnost, že u jednotlivých pacientů mohou být významné, geneticky podmíněné interindividuální rozdíly v distribuci léčiva a v rychlosti jejich metabolismu a eliminace ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

11

(tedy ve farmakokinetice léčiva), mohou být dosažené koncentrace podaných léčiv u různých pacientů rovněž rozdílné. Nejedná se samozřejmě pouze o rozdíly v dosažené maximální koncentraci nebo poločasech eliminace, ale především, obecně pro cytostatika zásadnějších farmakokinetických parametrech jako je AUC (plocha pod křivkou, Area Under Curve), které odráží celkovou dobu expozice danému cytostatiku s větší biologickou správností (29). Vzhledem k tomu, že chemoterapeutika mají obecně velmi úzké terapeutické rozmezí, mohla by být tato skutečnost významná i klinicky, a mohla by být tak jedním z faktorů vysvětlujících variabilitu zejména v doprovodných projevech toxicity a částečně i predikovaných léčebných efektech spjatých s podáním stejné cytotoxické látky ve stejné dávce různým jedincům, jak již bylo zmíněno v úvodu. Farmakogenetika je definována jako věda, zabývající se především studiem geneticky podmíněných variant enzymů, podílejících se na biotransformaci podaných léčiv (30). Po podání léčiva do organismu, tedy i po podání chemoterapeutika pacientům s nádorovým onemocněním, dochází k jeho metabolické biotransformaci, a to na cestě mezi jeho absorpcí a eliminací. Obecně patří tyto metabolické přeměny k jedné ze dvou hlavních kategorií, nazvaných reakce fáze I a fáze II. Reakcemi fáze I se obvykle léčivo proměňuje v polárnější metabolity připojením nebo odhalením funkčních skupin –OH, –NH2 , nebo –SH. Tyto metabolity jsou často inaktivní, nicméně v některých případech je jejich aktivita různě změněna – příkladem může být v onkologii často používaný cyklofosfamid, jehož aktivní metabolit 4 –OH cyklofosfamid (4-OH-CPA) je následně tautomerizován na aldofosfamid a ten pak hydrolyzován na konečný aktivní produkt fosforamid N-yperit a akrolein (31). Jestliže jsou metabolity z fáze I dostatečně polární, mohou se snadno z organizmu eliminovat. Převážná většina však vstupuje do další reakce, ve které se endogenní substrát (většinou aniont kyseliny) jako je glukuronát, acetát, sulfát nebo určitá aminokyselina (taurin nebo glycin) spojuje s nově utvořenou funkční skupinou a vytváří vysoce polární konjugát. Tato konjugace nebo syntéza se označuje právě jako metabolická fáze II. Je dobře známo, že hlavním orgánem metabolizmu léčiv jsou játra, nicméně značnou aktivitu mohou vykazovat i další tkáně jako GIT, plíce, kůže nebo ledviny (32). Tyto reakce v naprosté většině neprobíhají spontánně, nýbrž jsou katalyzovány specifickými buněčnými enzymy, které jsou lokalizovány v endoplazmatickém retikulu, mitochondriích, cytozolu, lysozomech nebo i v plazmatické membráně (33). Farmakogenetika, jak bylo zmíněno, se tedy zabývá jednak studiem genetických polymorfismů enzymů podílejících se na metabolizaci podaných látek a/nebo buněčných - membránových transportérů, jednak může studovat i geneticky dané polymorfismy cílových struktur těchto látek - receptorů, jež pak mohou vést k jejich rozdílné expresi neboli také farmakodynamickému polymorfismu (34). Genetický polymorfismus je definován jako přítomnost varianty (neboli mutace) jedné kopie (alely) určitého zkoumaného genu u více než 1 % populace (jak bylo uvedeno výše) (34). Ve většině případů je genetický polymorfismus spjat se snížením aktivity kódujících proteinů, jsou však i příklady, kde alelické varianty kódujících proteinů jsou spojeny s vyšší aktivitou (35). Polymorfní místo se může nacházet buď v kódující oblasti genomu, čímž může v některých případech změnit sekvenci proteinů, nebo v nekódujících oblastech, ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

12

pak může mít za následek změnu regulace exprese genu. Jedním z prvních v literatuře popsaných polymorfismů byl polymorfismus genu CYP 2D6, jak o něm bude dále pojednáno v části věnující se cytochromu P450 (36). Proč je však farmakogenetika a studium biotransformačních enzymů tolik podstatným právě v případě chemoterapeutik ? Důvodů bychom mohli najít hned několik: A) chemoterapeutika mají obecně velmi úzké terapeutické rozmezí, rozdíl mezi dávkou terapeutickou a toxickou B) celá řada těchto látek jsou tzv. pro-drugs, jsou tedy biotransformována na aktivní metabolity právě enzymovými systémy, které mohou vykazovat genetický polymorfismus (např. zmíněný cyklofosfamid) C) aktivní formy jsou obykle spojeny s poměrně výraznou toxicitou D) tyto látky jsou také velmi často detoxikovány právě enzymovými systémy E) celá řada chemoterapeutik vykazuje významnou interindividuální variabilitu v měřených farmakokinetických parametrech, a také rozdílnou toxicitu zaznamenanou a pozorovanou pak v klinické praxi. Následným přehledem bych chtěla poukázat na roli genetického polymorfismu u některých velmi dobře známých metabolizujících enzymů, které hrají klíčovou roli v přeměně chemoterapeutických látek.

2.1. Cytochrom(y) P 450

Jak již bylo řečeno dříve, četné enzymy podílející se na metabolizaci léčiv se nacházejí v lipofilních membránách endoplazmatického retikula jater, popřípadě minoritně i v jiných tkáních (37). Po homogenizaci a frakcionaci buněk vytváří tyto membrány tzv. „mikrozomy“, které si uchovávají většinu funkčních i morfologických charakteristik intaktních membrán, přičemž hladké mikrozomy jsou odpovědny za oxidativní metabolismus léčiv. Jedním ze dvou klíčových enzymů v procesu oxidace je právě mikrozomální enzym zvaný cytochrom P450, který je nejdůležitějším členem metabolizujících enzymů zapojených do fáze I metabolických přeměn. Cytochrom P450 je hemoprotein, přičemž v mikrozomální membráně jsou ve skutečnosti přítomny rozličné formy tohoto enzymu. Název cytochrom P450 byl odvozen od jeho spektrálních vlastností. Ve své redukované (Fe++) formě váže oxid uhelnatý a tvoří komplex, maximálně absorbující světlo vlnové délky 450 nm. Poprvé byl tento název použit japonskými autory Omura a Sato v roce 1964 (38). V následujících letech a desetiletích pak byla popsána celá řada izoenzymů tohoto cytochromu, přičemž se dnes používá nomenklaturní systém založený na rozdílných sekvencích aminokyselin. Izoenzymy jsou označovány jako „CYP“ ( CY tochrome P450 ), následuje arabská číslice označující genovou rodinu enzymů (tzn. více než 40% identita v sekvenci aminokyselin), písmeno určující genovou podrodinu (tzn. více než 55 % shoda) a konečně opět arabská číslice přiřazující individuální gen této podrodiny. Jedním z prvních v literatuře popsaných polymorfismů byl polymorfismus genu CYP 2D6, který je také z hlediska polymorfismu jedním z nejlépe prostudovaných (39). Molekulárním základem tohoto ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

13

defektu je chybná exprese proteinu cytochromu P450, jejímž důsledkem je pak chybění nezbytného izoenzymu. Uplatňuje se zde autozomálně recesivní typ dědičnosti a u postižených jedinců (3-10 % bělochů) jsou porušeny cytochrom P450 – dependentní oxidace debrisoquinu, sparteinu, dextromethorphanu a dalších asi čtyřiceti léčiv zahrnujících zejména psychofarmaka nebo betasympatomimetika. Při snížené expresi CYP2D6 je u těchto jedinců porušena metabolizace těchto léčiv, která resultuje ve zvýšenou plazmatickou hladinu a v korelaci s ní i v možný vyšší výskyt nežádoucích účinků podaných léčiv. Ke konci roku 2007 bylo popsáno 67 alelických variant CYP2D6, z nichž některé způsobují ztrátu aktivity enzymů a tím fenotyp pomalého metabolizátora, naopak duplikace a multiplikace genu v lokusu CYP2D6 má za následek ultrarychlý metabolizační fenotyp (40). Vlastní genotypování daného enzymu je postup, při kterém je zjišťována přítomnost dědičného poškození genu v DNA izolované z bílých krvinek, nejčastěji metodou PCR. Kromě genotypizace se v klinických podmínkách provádí také fenotypizace a velmi důležitým se pak jeví studium genotypu v korelaci s fenotypem biotransformačních enzymů. Takzvaný „translational research“ který v sobě spojuje laboratorní a klinické přístupy výzkumu, je předmětem zcela aktuálního rozvoje ve světě. Dalším z velmi častých polymorfismů rodiny cytochromu P450 je poměrně nedávno objevený a v současné době intenzivně studovaný genetický polymorfismus CYP 3A4, který byl původně popsán na příkladu rozdílné oxidace nifedipinu (41). Rovněž verapamil je metabolizován CYP 3A4 (a CYP 1A1), což může být spjato s vývojem rezistence v případě současného užití verapamilu a protinádorových látek metabolizovaných stejným izoenzymem (42). Z těchto chemoterapeutik, který využívají stejný izoenzym CYP3A4, se jedná zejména o následující látky: teniposid, etoposid (43), ifosfamid (44), vinblastin (45), vindesin (46), vinkristin (47), cyclophosphamid (48), paclitaxel (49) nebo docetaxel (50). Jako příklad zde můžeme rozvést interindividuální variabilitu v metabolizaci paclitaxelu v závislosti na expresi izoenzymů P450. Při biotransformaci vznikají 2 základní metabolity, 6-alfa-hydroxypaclitaxel, využívající izoenzym CYP2C8 a 3´- OH paclitaxel spojený s izoenzymem CYP3A4. Jako významnější z obou se jeví majoritní metabolit 6alfa-hydroxypaclitaxel, který vzniká stereospecifickou hydroxylací taxanového kruhu v poloze 6 cestou katalyzace CYP 2C8. Interindividuální rozdíly v pozorované toxicitě a částečně možná i efektu při léčbě paclitaxelem mohou souviset s geneticky danou expresí jednotlivých izoenzymů cytochromu P450 u každého jedince, tyto předpoklady však musí být potvrzeny dalšími intenzivními výzkumy. Jsou známy polymorfismy i u řady dalších isoenzymů cytochromu P450, jako například u CYP1A2, 1B1, 2C9, 2C18/19, a je a bude velkou úlohou současné vědy zhodnotit jejich klinický význam.

2.2. Thiopurin S-methyltransferasa (TPMP) EC 2.1.1.67

Merkaptopurin (6-merkaptopurin a příbuzný 6-thioguanin) je cytostatikum začleněné zejména do léčebných protokolů akutní lymfoblastické leukémie dětského věku, popřípadě myelodysplastického syndromu nebo chronické fáze myeloidní leukemie (51). 6-MP je extensivně metabolizován na aktivní ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

14

antimetabolit cestou phosphoribosylace (6-merkaptopurin ribotid) a degradován jednak cestou Smethylace na 6-methylmerkaptopurin, jednak oxidace. Oxidace thipurinového kruhu je katalyzována enzymem xanthinoxidázou a je hlavní katabolickou cestou vedoucí k produkci kyseliny thiomočové (52). Aktivita enzymu se liší v jednotlivých tkáních, nejvyšší hladiny můžeme nalézt ve střevě nebo játrech (53). Populační studie ukazují na 4 – 10 ti násobné interindividuální rozdíly v aktivitě xanthinoxidázy, je však nutno říci, že jasný klinický korelát ve vztahu k efektu a toxicitě podaného 6MP nebyl v prospektivních studiích prokázán. Hypoxantin-guanin phosphoribosyltransferáza (HPRT) katalyzuje iniciální krok v bioaktivaci 6-MP, čímž dochází k syntéze intracelulárních thionukleotidů (TGNs), jež jsou zodpovědné za vlastní cytotoxické působení 6-MP. Vlastní mechanismus účinku je vysvětlován inkorporací 6-thioguanin nukleotidů do struktury DNA, současně však některé thionukleotidy mohou inhibovat syntézu purinů de novo. Poslední ze zmíněných metabolických přeměn, S-methylace, je katalyzována enzymem thiopurin S-methyltransferasou (TPMT) a vede k produkci inaktivních, methylovaných metabolitů. Tento enzym vykazuje širokou interindividuální variabilitu a je právě jedním z příkladů genetického polymorfismu. Populační studie v kavkazské (caucasian – bělošské) populaci ukazují na trimodální distribuci, kdy asi 89 % vykazuje vysokou, 11 % střední a přibližně 1 ze 300 extrémně nízkou nebo žádnou TPMT aktivitu (54). U pacientů vykazujících sníženou expresi enzymu TPMT dochází ke kumulaci aktivního metabolitu 6-TGN zejména v hematopoetických tkáních, která tak může být důvodem k vyšší hematologické toxicitě. TPMT deficientní pacienti mohou vyžadovat až 15-ti násobně sníženou dávku 6-MP, aby se předešlo velmi závažné až fatální hematologické toxicitě (55). Opačně, homozygoti se zvýšenou aktivitou TPMT mohou být rezistentní na podání 6-MP (56). TPMT aktivita je nejčastěji měřena stanovením v erytrocytech, která koreluje s aktivitou v leukocytech, játrech, ledvinách a leukemických lymfoblastech (57,58). V erytrocytech byla také pozorována inverzní korelace TPMT aktivity v porovnání s koncentrací 6-thioguanin nukleotidů (TGNs). Situaci může komplikovat aktivita ostatních enzymů zapojených do biotransformace 6-MP, které mohou interferovat se stanovenou fenotypizací TPMT. Problematické je také měření aktivity TPMP u pacientů, u kterých byla podána transfuze erytrocytů. Pomocí technik molekulární biologie byl nedávno klonován funkční TPMT gen a lokalizován na lidském chromozomu 6. Izolovány byly také 2 deficientní mutantní alely, TPMT*2, Ala to Pro kodon 80 a TPMT*3, Ala to Thr kodon 154 a Tyr to Cys kodon 240. Genotypizace byla v 98 % korelaci s TPMT fenotypem, který byl stanoven měřením erytrocytární TPMT aktivity (59).Další z dostupných metod je také přímá kvantifikace metabolitů 6-MP nebo měření hladiny thionukleotidů v plazmě, moči, erytrocytech, granulocytech nebo lymfoblastech pomocí HPLC. Stejně jako u dalších metabolických enzymů vykazujících genetický polymorfismus bude potřebné další prospektivní zhodnocení v korelaci s klinickým dopadem, ať již hodnocením vedlejších nežádoucích účinků nebo efektu daného cytostatika.

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

15

2.3. Uridindiphosphat glucuronyltransferasa (UDPGT, UGT) EC 2.4.1.17

Uridin diphosphat glucuronyltransferasa je podobně jako cytochrom P450 početnější rodinou enzymů katalyzujících glukuronidaci celé řady endogenních substrátů a xenobiotik (60,61). Hlavními dvěma identifikovanými a popsanými skupinami jsou subtypy UGT1 a UGT2. Enzymy UGT1 se podílejí na glukuronidaci bilirubinu a fenolů, zatímco UGT2 katalyzují glukuronidaci zidovudinu, morfinu a některých nesteroidních antiflogistik (62). Z pohledu protinádorové chemoterapie a vztahu UGTS k jejich metabolizaci je nutné zmínit se především o jednom z novějších cytostatik uvedených do klinické praxe, o irinotecanu, CPT 11. Irinotecan je ve vodě rozpustnějším analogem camptothecinu a ve srovnání s ním vykazuje vyšší antiproliferativní aktivitu (63). Mechanismus účinku je spojen s vazbou a následnou inhibicí topoizomerázy I, nukleárního enzymu, který hraje kritickou roli v DNA replikaci a transkripci (64). Irinotecan je po podání metabolizován za pomocí karboxylesterázy na aktivní metabolit SN-38, jež je asi 1000x-potentnějším inhibitorem topoizomerázy I (65) a následně je právě za pomoci uridindifosfátglukuronyltransferázy 1 (UGTS 1A1) konjugován za vzniku metabolitu SN-38 glukuronidu ( SN-38G) (66). Podání irinotekanu je v klinické praxi provázeno více či méně predikovatelnou toxicitou, především pozdními průjmy a myelosupresí. Tyto nežádoucí účinky vykazují poměrně širokou interindividuální variabilitu a nedávné výzkumy potvrdily, že jsou spojeny právě s s geneticky danou, rozdílnou mírou glukuronidace jeho aktivního metabolitu SN–38 enzymem UGT1A1 (67,68). Je také zajímavé zmínit, že stejný izoenzym UGT1A1 je zapojen do glukuronidace bilirubinu a již dříve bylo popsáno, že pacienti s Gilbertovým syndromem resultujícím v benigní hyperbilirubenemii mají nižší expresi tohoto izoenzymu (69). Tito pacienti ( představující asi 10-15 % populace ) také zřejmě představují rizikovější skupinu pro podání irinotekanu ve vztahu k doprovodným projevům toxicity (70). V současnosti probíhají další studie zabývající se korelací fenotypu a genotypu UGT1A1 a toxicitou irinotekanu. Je možné se domívat, že mohou přispět k potenciální individualizaci léčby tímto chemoterapeutikem (71).

2.4. N-acetyltransferasa (NAT) EC 2.3.1.1

„Acetylační polymorfismus“ byl dokumentován již v 50tých letech studiemi pomalých a rychlých acetylátorů izoniazidu (72).Pomocí různých markerových substrátů je možno rozlišit dva základní subtypy NAT, a to NAT 1 (substrátem je p-aminobenzoová kyselina a p-aminosalicylová kyselina ) a NAT 2 (substráty izoniazid, prokainamid, sulphonamid) (73). Polymorfismus v lokusu NAT2 a NAT1 byl popsán v roce 1990, resp. 1993. (74). Některé z alel jsou spojovány s vyšší enzymatickou aktivitou ( př. NAT1*10, NAT1*1, NAT2*4 ), jiné jsou inaktivující ( NAT1*14 a 15, NAT2*5, 6 , 7 ) a nesou tak informaci pro fenotyp pomalého acetylátora (75). Kromě genotypování je opět možné provést i fenotypizaci in vivo pomocí substrátu a rozdělit tak jedince na pomalé, střední a rychlé acetylátory. Zajímavou skutečností jsou výrazné rozdíly v zastoupení různých alel v závislosti na rase. Populační ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

16

studie přinesly informace, že mezi bělochy je asi 50 % (40 – 70) pomalých acetylátorů ve srovnání s 10 % Asiatů nebo 5% Eskymáků (76). Studie českých autorů přinesla také informace o situaci v české populaci, konkrétně srovnáním acetylační kapacity u zdravých dětí a dětských pacientů s fenylketonurií a diabetem I.typu. (77) Objevují se také informace, že určitý acetylační fenotyp může být spojen s častějším výskytem určitých patologických stavů, např některých typů nádorů (karcinom močového měchýře nebo střeva), tyto údaje však nejsou konsistentní a existuje řada prací, která tuto teorii nepotvrzuje (78,79,80,81). Z hlediska farmakogenetiky je zajímavá informace o NAT2 Nacetylaci inhibitoru topoizomerázy II, amonafidu, který v klinice vykazuje výrazné inter-individuální rozdíly stran pozorované toxicity. Studie MJ Rataina a jeho kolegů pak v závislosti na rozdělení pacientů podle acetylačního fenotypu NAT2 doporučila rozdílné dávkování pro každou skupinu, 250 mg/m2 u pomalých , respektive 375 mg/m2 u rychlých acetylátorů (82,83).

2.5. Dihydropyrimidin dehydrogenasa (DHPDH, DPD) EC 1.3.1.2

Dihydropyrimidin dehydrogenasa je iniciálním a „rate-limiting“ enzymem v třístupňové katabolické dráze uracilu a thyminu vedoucí ke tvorbě beta-alaninu a beta-aminoisomáselné kyseliny. DPD je také hlavním enzymem odpovědným za katabolismus protinádorového léku 5-fluorouracilu. Tento lék byl vyvinut a použit jako protinádorové léčivo již před čtyřmi dekádami a v současnosti je hlavní komponentou terapie u pacientů s kolorektálním karcinomem. Je také součástí kombinovaných režimů používaných v léčbě dalších solidních nádorů, jako např. nádorů prsu a hlavy a krku. Je v současnosti třetím nejčastěji předepisovaným protinádorovým lékem (84). 5-fluorouracil je prekursorem cytotoxických nukleotidových analogů, které jsou odpovědné za vlastní protinádorové působení. Významná jaterní a renální eliminace 5-fluorouracilu způsobuje, že pouze minimální množství podané látky je ve vlastním tumoru k dispozici pro biotransformaci na fluoropyrimidinnukleotidy, jelikož 1020 % látky se vyloučí v nezměněné podobě močí a cca 80 % podané látky je metabolizováno převážně v játrech na 5-fluorodihydrouracil (85). Klinické odezvy na lék bývají poměrně nízké (cca 20 – 40 %), zčásti z důvodů úzkého terapeutického rozpětí a nelineární kinetiky léčiva. To vede k tomu, že je obtížné dosáhnout klinické odezvy bez navození významné systémové toxicity (86). V populaci vykazuje aktivita DPD výraznou variabilitu (myšlena jaterní aktivita enzymu, tj ta, která je dominantně odpovědná za katabolismus). Přibližně 3 – 5 % jedinců má aktivitu tohoto enzymu redukovanou (87). Snížená aktivita DPD resultuje v závažnou gastrointestinální, hematologickou a neurologickou toxicitu u pacientů léčených 5-fluorouracilem (88). V literatuře je doposud popsáno asi 20 případů těžkých projevů toxicity 5-FU daných sníženou aktivitou DPD. Léčení těchto pacientů je nákladné a navíc, takové nežádoucí reakce snižují compliance pacienta s další chemoterapeutickou léčbou. Farmakokineticky se snížená aktivita DPD projevuje prosloužením eliminačního poločasu z 8 až na 160 min a systémová clearance léčiva klesne na hodnoty 70 ml/min/m2 (normální hodnota je 594 ± 198 ml/min/m2 (89). Aktivita DPD je měřitelná v řadě tkání, nicméně nejvyšší aktivita se ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

17

vyskytuje v játrech. Pro klinické monitorování aktivity DPD se používají monocyty periferní krve (PBMC); mezi aktivitou DPD v játrech a PBMC byla pozorována významná, ale slabá korelace (r2 = 0.32) (90). Vztah mezi systémovou clearance 5-FU a aktivitou v PBMC ukázal, že mezi nimi existuje slabá korelace, z prací nicméně vyplynulo, že stanovení aktivity DPD v PBMC není ke správné predikci clearance 5-FU dostatečné (91). Pomocí farmakokinetické analýzy NONMEM bylo ukázáno, že existují na pacientovi závislé proměnné, které ovlivňují interindividuální variability v clearance 5fluorouracilu (92). Clearance 5-FU se výrazně snižovala s věkem pacienta, vysokou aktivitou ALP, délkou infuse a sníženou aktivitou PBMC-DPD. Mezi pozorovanou a predikovanou clearance se navíc objevoval významný rozptyl, a tak nebylo možné pomocí tohoto přístupu předpovědět adjustaci podané dávky (90). Z výše uvedeného vyplynulo, že dávková adjustace na základě měření aktivity PBMC DPD není v současnosti proveditelná (93). Kompletní deficience DPD je vzácným onemocněním, projevujícím se v dětském věku variabilním spektrem klinických příznaků, zejména neurologických. Biochemický fenotyp poruchy tkví ve zvýšené exkreci thyminu, uracilu a 5hydroxymethyluracilu (94). Molekulární studie ukázaly, že incidence mutace G>A v exonu 14 vedoucí k přeskočení 165 bp exonu je 1 : 270, z čehož plyne, že k vysvětlení molekulární podstaty DPD deficience bude třeba indentifikovat další mutace (95). Jelikož řada z pozorovaných změn má charakter tzv. SNP (single nucleotide polymorphism), které se přímo neodrážejí ve snížené aktivitě DPD, nelze zatím nahradit fenotypické sledování aktivity DPD jednodušším postupem molekulární genetiky. Jak u zvířat, tak u lidí byla navíc prokázána existence cirkadiánní variability (96). Další studie prokázaly existenci velkého interindividuálního rozptylu mezi vysokou a nízkou aktivtou DPD, z čehož dovozovaly, že v průběhu 24 hod cirkadiánní cyklus neexistuje u všech subjektů (97). Kromě dominantní role, kterou hraje DPD v toxicitě podaného 5-FU, se objevují data indikující že aktivita DPD ve vlastním nádoru může být jednou z determinant terapeutické odpovědi na 5-FU. Vysoká aktivita DPD v nádoru totiž znamená, že již tak minimální množství léku, které se k nádoru dostává, je rychle přeměněno na cytotoxicky neúčinný 5-fluorodihydrouracil. In vitro aktivita DPD v nádorových buňkách byla v přímém vztahu k citlivosti na 5-fluorouracil – tzn. čím nižší enzymatická aktivita, tím nižší cytotoxicita (98). V současnosti se otevírá i prostor pro používání inhibitorů DPD (např. 5ethinyluracil), jejichž hlavní (alespoň teoretickou) výhodou má být zvýšení terapeutického indexu 5fluorouracilu nebo jeho prekursorů (např. kapecitabin).

Léčiva, jež jsou předmětem disertační práce

3. 5-fluorouracil (5-FU)

Fluorovaný pyrimidinový analog 5-fluorouracil je široce používán v chemoterapii solidních nádorů již od jeho syntézy Duschinským v roce 1957 (99). Jeho farmakologický účinek v nádorových tkáních je výsledkem jeho aktivace na 5-FdUMP, jež je potentním inhibitorem tymidylátsyntasy a současně také ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

18

zasahuje na úrovní RNA inkorporací fluorovaného nukleotidu do její struktury. Jak bylo uvedeno výše, přirozeně se vyskytující pyrimidinové báze jsou metabolizovány zapojením tří degradačních enzymů, a to dihydropyrimidin dehydrogenasy (E.C.1.3.1.2), dihydropyrimidinasy (E.C. 3.5.2.2) a ureidopropionasy (E.C.3.5.1.6), jejichž výsledkem je konečné vytvoření β-alaninu a β- kyseliny aminoisomáselné z uracilu a tyminu. Fluorované pyrimidiny jsou degradovány stejnou sadou enzymů. V roce 1985 (100) byl popsán první dědičný případ závažné toxicity po podání 5-fluorouracilu, přičemž jeho obsáhlejší farmakologický popis byl pak publikován Diasiem (101), který ve své práci uvedl, že k ovlivnění metabolizace léčiva a tím ke zpomalení jeho degradace může dojít na základě polymorfismu v genu DPYD, kódujícím enzym DPD. Je zajímavé, že autosomálně recesivní fenotyp příslušné metabolické choroby – úplný deficit DPD – byl později popsán Bergerem a spolupracovníky (102) a nazván „dědičná tymin-uracilurie”, přičemž s tímto stavem však může být spojena velká různost klinických fenotypů. Tento deficit DPD je dědičný jako autosomálně recesivní znak, přičemž dle literárních údajů může být takto postiženo 1-3 % pacientů s nádorovým onemocněním (103). V posledních letech bylo publikováno další významné sdělení, týkající se genetického základu fluoropyrimidinové toxicity, kdy 5-fluorouracilová toxicita byla spojena také s druhým enzymem v cestě degradace pyrimidinu, a to dihydropyrimidinasou (104). Souhrnně řečeno, jak dihydropyrimidindehydrogenasa (DPD), tak dihydropyrimidinasa (DHP), mohou odpovídat za závažnou, geneticky determinovanou fluoropyrimidinovou toxicitu. I přesto, že v posledních letech se do protinádorové léčby dostala řada nových léčiv, včetně cílené biologické léčby, zůstávají 5-fluorouracil, případně jeho perorální analog capecitabine, i nadále základními složkami chemoterapie solidních nádorů. Farmakogenetické hodnocení fluoropyrimidinové toxicity tak v klinické onkologické praxi získává praktický význam. S ohledem na současné poznatky, že příčinou fluoropyrimidinové toxicity může být změna ve funkci obou enzymů Fáze I, tedy DPD a DHP – tj. ne pouze DPD, jak bylo dříve uvažováno, byl navržen protokol pro pacienty, u nichž je plánována léčba 5-fluorouracilem. Cílem tohoto projektu je postihnout nejen stanovení genotypu pro DPD, ale provést také fenotypové hodnocení vycházející jak z farmakokinetické analýzy 5-FU a jeho metabolitu fluoro-5,6-dihydrofluorouracil (DHFU) (podrobněji viz dále 6.1. projekt A - Farmakogenetické implikace fluoropyrimidinové chemoterapie).

Úvodní zamyšlení nad faktory ovlivňujícími farmakokinetiku i farmakodynamiku 5-fluorouracilu – teoretický základ projektu

3.1. Faktory ovlivňující farmakokinetiku 5-fluorouracilu 3.1.1. Obecné faktory

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

19

Interindividuální variabilita farmakokinetických parametrů po podání fluorouracilu byla prokázána v celé řadě studií, přičemž koeficient variace se pohybuje v rozmezí 10 – 40 %. Farmakokinetické parametry jsou závislé, podobně jako i u jiných léčiv, na řadě obecně známých faktorů, jako jsou např. dávka, cesta podání a dávkový režim, váha, tělesný povrch (BSA), věk, pohlaví, stav jaterních a renálních funkcí apod. Další faktor, který může farmakokinetiku fluorouracilu intenzivně ovlivnit, spadá svou povahou již mezi faktory farmakogenetické a je jím případný genetický polymorfismus katabolického enzymu dihydropyrimidindehydrogenasy (DPD), jak o něm bude pojednáno dále obšírněji. V literatuře byla publikována celá řada studií, které zkoumaly vliv BSA, váhy, věku a pohlaví na clearance fluorouracilu. Metodou lineární regrese byla prokázána statisticky významná závislost clearance fluorouracilu na podané dávce a BSA. Příkladem, v jedné z těchto studií u pacientů, kterým byl podán fluorouracil ve srovnatelné dávkové denzitě (dávka /m2) , byla clearance u mužů vyšší ve srovnání s ženami (rozdíl činil 0,22 l/min). Tento fakt, který byl prokázán i v jiných studiích, může částečně vysvětlit důvod, proč je u žen po podání fluorouracilu obecně pozorován závažnější stupeň nežádoucích účinků, který se objevuje také častěji (105). Jiné klinické práce studovaly vliv změněných jaterních funkcí (ALT, AST, ALP. GMT, LDH a bilirubin) a stavu nutrice (albumin, prealbumi, transferrin) na clearance fluorouracilu, přičemž v publikovaných pracích nebyla prokázána žádná statisticky významná ovlivnění. Stejně tak nebyly pozorovány žádné významné rozdíly ve sledovaných farmakokinetických parametrech u pacientů s a nebo bez jaterního metastatického postižení (106,107) . Vzhledem k tomu, že pouze 10% nezměněného fluorouracilu je vylučováno ledvinami, také renální dysfunkce nijak zásadně neovlivňují farmakokinetické parametry. Zvýše uvedeného vyplývá, že u pacientů s jaterními metastázami a mírnou nebo střední jaterní nebo ledvinnou dysfunkcí není potřeba a priori uvažovat o redukci dávky.

3.1.2. Dihydropyrimidin dehydrogenasa (DHPD, DPD)

K osvětlení role DPD v metabolismu fluorouracilu a v případných farmakogenetických konsekvencích spojených s parciálním nebo totálním deficitem DPD je vhodné blíže přiblížit vlastní mechanismus účinku a metabolismus fluorouracilu. Cytotoxický efekt 5-fluorouracilu je zprostředkován inkorporací 5-FU ve formě nukleotidů, a to jak na úrovní RNA tak i DNA. Syntézu a stabilitu RNA intenzivně ovlivňuje inkorporace fluorouracilu ve formě 5-fluorouridin 5´trifosfátu (FUTP), k inhibici prodlužování DNA pak dochází inkorporací 5fluoro-2´-deoxyuridin 5´- trifosfátu do struktur DNA. Nejdůležitější antitumorozní efekt je ale zprostředkován inhibicí thymidilátsyntasy (TS) pomocí fluorodeoxyuridinmonofosfátu (FdUMP). TS je kruciální enzym pro de novo syntézu thymidylátu a tedy syntézu DNA. Relativní ovlivnění a rozložení RNA- a DNA- zprostředkovaného protinádorového efektu je závislé na koncentraci 5-FU a ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

20

délce jeho expozice. Bylo prokázáno, že krátkodobá infuze 5-FU ovlivňuje spíše RNAzprostředkovaný cytotoxický efekt, kdežto dlouhodobá kontinuální infuze ovlivňuje spíše DNA toxicitu. Na opačném pólu anabolické cesty fluorouracilu je jeho katabolismus, neboli cesta jeho degradace. Enzym dihydropyrimidindehydrogenasa katalyzuje konverzi 5-FU na jeho metabolit fluoro-5,6-dihydrofluorouracil (DHFU), a ten je následně přeměněn na fluoro-beta-ureidopropionát a fluoro-beta-alanin, a to za pomocí enzymů dihydropyrimidinasy a ureidopropionasy. Dihydropyrimidindehydrogenasa (DPD) je tak iniciálním a „rate-limiting“ enzymem odpovědným za katabolismus 5-fluorouracilu , zapojeným v třístupňové katabolické dráze uracilu a thyminu vedoucí ke tvorbě beta-alaninu a beta-aminoisomáselné kyseliny. Neméně podstatná je ta skutečnost, že jaterní eliminace hraje zcela zásadní roli, protože až 80 % podaného 5-fluorouracilu je metabolizováno na 5-fluorodihydrouracil. Navíc přibližně 10 % léčiva se vyloučí v nezměněné podobě močí, což způsobuje, že pouze minimální množství podané látky je ve vlastním tumoru k dispozici pro biotransformaci na fluoropyrimidinnukleotidy, a tedy vlastní cytotoxický efekt. Dihydropyrimidindehydrogenasa je enzym saturabilní, s Michaelis-Menten konstantou (Km) přibližně 3 µmol/l. Významná interindividuální variabilita v clearance fluorouracilu, odpovědi nádoru na léčbu a především v pozorované toxicitě může být dána právě genetickými rozdíly v aktivitě DPD. 3.1.3. DPD aktivita a plazmatické hladiny 5-FU Jak již bylo uvedeno, až 80 % podaného 5-fluorouracilu je metabolizováno dihydropyrimidin dehydrogenasou na 5-fluorodihydrouracil. Aktivita DPD je detekovatelná v celé řadě tkání, hlavním orgánem zodpovědným pro metabolizaci však zůstává tkáň jaterní. Vzhledem k tomu, že aktivita DPD v jaterní tkáni dobře koreluje s aktivitou DPD v periferních monocytech, byla právě takto měřená aktivita jakýmsi „surrogate markerem“ pro hodnocení celkové aktivity DPD (108). Pokud se týká aktivity DPD a korelace s plazmatickými hladinami 5-FU, prokázaly nedávné práce, že pacienti s parciálním nebo kompletním deficitem DPD mají redukovanou kapacitu degradace 5-FU a tím také zvýšené riziko závažnější toxicity po podání léčiva. U pacientů s parciálním deficitem DPD na podkladě heterozygotní mutace G>A v exonu 14 vedoucí k přeskočení 165 bp exonu (IVS 14+1 G>A mutace) byla clearance 2,5x snížená oproti kontrole, stejně tak naměřená AUC byla 2,5x vyšší než tomu bylo v kontrolním rameni (109). Následné farmakologické studie u pacientů s kompletním deficitem DPD pak prokázaly zcela minimální katabolismus 5-FU, který se projevil až v desetinásobném prodloužení plazmatického poločasu než u pacientů s normální aktivitou DPD (110).

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

21

3.1.4. DPD a toxicita 5-FU

Snížená aktivita DPD je v korelaci se zvýšením rizika závažné toxicity po podání 5-FU. Tento fakt byl prokázán v řadě studií a lze tedy říci, že vzhledem k velmi úzkému terapeutickému indexu 5-FU existuje úzká souvislost mezi expozicí 5-FU a pozorovanou hematologickou a gastrointestinální toxicitou. Aktivita DPD by tak mohla být určitým prediktivním faktorem vzhledem k očekávané toxicitě. Pokud se týká intratumorální aktivity DPD jakožto prognostického faktoru pro efektivitu 5FU, lze na základě dosavadních publikovaných prací konstatovat, že pro toto tvrzení zatím neexistují přesvědčivá data a tato otázka dále zůstává diskutabilní. V literatuře je do dnešních dnů popsána celá řada kasuistik pacientů s parciálním deficitem DPD, u kterých byla zaznamenána velmi závažná toxicita, u některých pacientů bohužel i letální (111-124). Na základě těchto zkušeností byla také definována jakási prahová hodnota pro aktivitu DPD ( a to minimálně 70% aktivity DPD v kontrolní populaci), při nižších hodnotách již existuje reálné riziko závažných nežádoucích účinků. DPD aktivita u kontrolní skupiny vykazuje znaky rozložení dle Gaussovy křivky, při použití limitní hladiny 70% pak asi 14% populace je v ohrožení závažnými NÚL.

3.1.5. Selekce cílových farmakokinetických parametrů

V literatuře byla publikována řada prací, které se zabývaly korelací farmakokinetických parametrů po expozici 5-FU u pacientů s nádorovým onemocněním (AUC, Css, max) s incidencí nežádoucích účinků, odpovědí nádoru na léčbu a celkovým přežitím (125-129). Rozdílné a stále diskutabilní závěry vyplývají ze studií, které se zabývají vztahem mezi dosaženou plazmatickou koncentrací 5-FU a odpovědí nádoru na tuto léčbu. V některých studiích nebyla žádná korelace nalezena, z jiných závěrů pak vyplývá, že vyšší procento dosažených odpovědí bylo zaznamenáno u pacientů s hodnotou AUC průměrně nad 30 mg.h/l během 5-ti denní kontinuální infuze 5-FU. Response rate a celkové přežití bylo v těchto studiích v signifikantním vztahu k celkové expozici 5-FU (p=0,05, resp. 0,001), nikoliv však k výši podané dávky. Dle těchto studií bylo také AUC 5-FU buď během celého 5-ti denního cyklu, ale i během poloviny cyklu nebo během prvních 8-mi hodin infuze užitečným prediktivním faktorem k předpokládané toxicitě léčby. Vzhledem k uvedeným závěrům, tedy že hodnoty AUC v rozmezí 25 – 30 mg.h/l jsou spojeny s vyšším stupněm závažných nežádoucích účinků jako leukopenie, průjem, stomatitida a hand-foot syndrom, přičemž nedochází k nijak podstatnému vylepšení odpovědi nádoru na léčbu, je možno konstatovat, že expozice 5-FU vedoucí k zlepšení response rate se pohybuje nad rozmezím bez nežádoucích účinků. Tento fakt potvrzuje i studie u pacientů s kolorektálním karcinomem léčeným 5-FU, kdy vyšší koncentrace ve steady-state byla spojena s vyšším počtem závažných NÚL a současně i s vyšším ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

22

počtem zaznamenaných kompletních nebo parciálních remisí (p< 0,01) (55,12) a to nezávisle na podané dávce. Pacienti s kompletní nebo parciální odpovědí dosáhli při aplikaci 8-mi hodinové infuze v týdenních intervalech průměrných hodnot Css 2 mg/l. Akutní zaznamenaná toxicita (průjem a hand foot syndrom) korelovala s hodnotami plazmatické koncentrace 5-FU nad 3 mg/l (AUC 0-8 h 24 mg.h/l). Obecně tedy lze říci, že přestože existuje pravděpodobně i řada jiných proměnných, lze považovat hodnotu AUC a/nebo plazmatickou koncentraci ve steady state Css za vhodný farmakokinetický parametr, který má prediktivní hodnotu ve vztahu k očekávané farmakodynamice léčiva. 3.2. Farmakogenetické aspekty podávání 5-FU Dihydropyrimidindehydrogenasa je tedy iniciálním a „rate-limiting“ enzymem odpovědným za katabolismus 5-fluorouracilu , zapojeným v třístupňové katabolické dráze uracilu a thyminu. Vzhledem k tomu, že jedinci s redukovanou nebo chybějící aktivitou DPD mají po podání 5-FU závažné, zejména hematologické, gastrointestinální a neurologické nežádoucí účinky, bylo by optimální provést genotypizaci DPD ještě před zahájením léčby. V celkové populaci se předpokládá, že asi 3-5 % jedinců má parciální deficit v aktivitě DPD, můžeme tedy hovořit o genetickém polymorfismu, a asi 0,1 % má deficit kompletní. Gen pro DPD (označovaný jako DPYD , OMIM 274270) se nachází v oblasti 1q22, kde zabírá úsek 950 kbp. Kódující sekvence (3078 bp) je rozprostřena po celé délce genu v 23 exonech. DPD je cytosolový, ubikvitně exprimovaný enzym. V přirozené podobě se DPD vyskytuje jako homodimer s podjednotkami o 11 kDa. Charakterizace 3D proteinové struktury DPD umožnila ozřejmění dopadů řady mutací a polymorfismů v DPYD (obvykle mají charakter missense mutací) na změny ve struktuře proteinu. Od konce 90. let je tento gen intenzivně studován, přičemž do dnešních dnů bylo popsáno více než 30 mutací u pacientů s nádorovým onemocněním. Z toho jako nejčastější, klinicky závažná, je popisována bodová mutace G>A v exonu 14 vedoucí k přeskočení 165 bp exonu (IVS 14+1 G>A, známa jako DPYD*2A), klinicky vyznamné se však jeví ještě některé další mutace, zejména M166V, M182K, V335L, I560S, A777S a D949V. V případě DPYD*2A heterozygotní mutace dochází k asi 50-ti % redukci clearance podaného 5-FU, provázené závažnou toxicitou, pacienti s homozygotní formou jsou pak ohroženi na životě. V některých publikacích je tedy doporučováno využít PCR-based genotypizace (minimálně právě pro tuto mutaci DPYD*2A) a případně primárně redukovat dávku v případě heterozygotní nalezené mutace, případně se vyvarovat podání 5-FU u homozygotů. Obecně je však možné konstatovat, že mutační analýza genu neumožňuje sama o sobě selekci populace pacientů ohrožených vznikem závažných komplikací léčby. Jedním z důvodů je i ten fakt, že řada z pozorovaných změn má

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

23

charakter tzv. SNP (single nucleotide polymorphism), které se přímo neodrážejí ve snížené aktivitě enzymu.

4. Methotrexat (MTX)

4.1. antifoláty

Antifoláty jsou látky, jejichž obecným mechanismem účinku je ovlivnění specifického enzymu zapojeného do folátového metabolismu. Klasickým příkladem a také mateřskou látkou celé skupiny je methotrexat (MTX), který je silným inhibitorem enzymu dihydrofolátreduktasy (DHFR). Jsou-li v buňce přítomny vysoké koncentrace MTX, dojde k depleci tetrahydrofolátu, která vede k následné depleci substrátů kriticky důležitých k syntéze DNA. MTX se v klinické praxi používá již přes 50 let a je součástí léčebných schémat zejména u hematologických malignit, nádorů prsu, nádorů ORL oblasti, nádorů plic a také řady autoimunitních onemocnění. V analogii na mechanismus působení MTX se v průběhu 80. a 90. let stala předmětem výzkumu nová generace antifolátů. Jejich společným mechanismem účinku je přímé ovlivnění dalších enzymů zapojených do metabolismu folátů, nejčastěji enzymu thymidilátsyntasy (TS ) a glycinamid ribonucleotid transformylasy (GARFT). Příkladem může být raltitrexed

( Tomudex, ZD 1694 ),

který je přímým inhibitorem enzymu TS a je již používán v klinické praxi. Raltitrexed je v buňce přeměněn na polyglutamát a je zde tak retinován minimálně 24 hodin, což se projeví zesíleným účinkem na inhibici TS. Přípravek je indikován zejména v léčbě kolorektálních nádorů, v klinickém zkoušení se testuje účinnost i u jiných solidních nádorů. Pametrexed je nově zaváděné antifolikum, které se označuje také jako MTA – multitarget antifolate, neboť je schopen kromě thymidilátsyntasy slabě inhibovat také enzym GARFT. Výsledkem je blokáda purinové a thymidilátové syntézy. K dalším inhibitorům TS, které jsou zatím ve fázi klinického zkoušení, jsou například látky ZD 9331 nebo AG337 (Thymitaq), k novějším zkoušeným inhibitorům enzymu dihydrofolátreduktázy patří například PT-523.

4.2. role homocysteinu v průběhu terapie MTX

Jak již bylo řečeno, methotrexat je klinicky využíván od jeho zavedení Farberem v roce 1948 (131) a zůstává klíčovou složkou léčby dětské leukémie ALL. Bylo zjištěno, že u dětí s ALL léčených metotrexatem dochází ke zvýšení homocysteinu v plazmě (132). Přestože bylo uskutečněno několik pokusů o objasnění role homocysteinu během methotrexatové chemoterapie, nebyla zatím provedena žádná systematická klinická studie, jejímž primárním cílem by byla právě tato problematika. Pracovní skupina, ve které mám možnost také působit, se podrobně ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

24

touto problematikou zabývá a ověřuje klinicky a laboratorně hypotézu, že“homocystein je farmakodynamický biomarker při podávání vysokodávkovaného methotrexatu“ . Potenciální klinická implikace těchto pozorování spočívá ve skutečnosti, že zjevně vysoké hladiny plazmového folátu mohou, přinejmenším do určité míry, neutralizovat antimetabolický účinek vysokých dávek metotrexátu (133) (podrobněji viz dále 6.2 Projekt B - Biomarkery ve sledování farmakodynamiky metotrexatu).

5. Použitá literatura

1. Lazaru J, Pomeranz BH, Corey PN. Incidence of adverse drug reactions in hospitalised patients – a meta-analysis of prospective studies. JAMA 1998, 279: 1200–1205 2. Philips KA, et al. Potential role of pharmacogenomics in reducing adverse drug reactions: a systematic review. JAMA 2001, 286: 2270-2279 3. Garrod AE. The incidence of alkaptonuria: A study in chemical individuality, Lancet 2, 1902,1616 4. Bearn AG. Archibald Garrod and the Individuality of Man. Oxford, Oxford Univ Press. 1993 5. Childs B, Valle D, Jimenez-Sanchez G. The Inborn Error and Biochemical Individuality, In: Scriver C, Editor. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8th Edition, McGraw-Hill, 2001, 155-165 6. http://mendel.imp.univie.ac.at/mendeljsp/biography/biography.jsp 7. Beadle G, Tatum EL. Genetic control of Biochemical reactions in Neurospora. Proc Natl Acad Sci USA 27: 1941, 499 ex 8. Weber W. Pharmacogenetics, 1997, Oxford Univ Press. 5-6 9. Garrod AE. Medicine from the chemical standpoint. Lancet ii, 1914: 281-89 Sci 1932, 32: 436-40 10. Stanbury JB Ed. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. 1st edition. McGrawHill, New York 1960 11. Williams RT. Detoxication mechanisms (in vivo) In: Unvas B. Ed. Metabolic factors controlling drug action. Proceedings First Pharmacological Meeting. New York 1963: MacMillan, p 1-12 12. Alving AS, Kellermeyer RW, Tarlov A, Schrier S, Carson PE. Ann Intern Med. 1958 Aug;49(2):240-8. Biochemical and genetic aspects of primaquine-sensitive hemolytic anemia 13. Tarlov AR, Brewer GJ, Carson PE, Alving AS. Primaquine sensitivity. Glucose-6phosphatedehydrogenase deficiency: an inborn error of metabolism of medical and biological significance.Arch Intern Med. 1962 Feb;109:209-34. 14. Johnson WJ. Nature. 1954 Oct 16;174(4433):744-5 15. Motulsky A. Drug reactions, enzymes and biochemical genetics. JAMA 165, 1957, 835-837 16. Vogel F. Moderne problems in Humangenetik. Ergib in Kinderheild, 1959, 12, 52-125 ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

25

17. Weber W. Pharmacogenetics, 1997, Oxford Univ Press. 8-9 18. Valik D, Radina M, Sterba J, Vojtesek B. Homocysteine: exploring its potential as a pharmacodynamic biomarker of antifolate chemotherapy. Pharmacogenomics. 2004 Dec;5(8):1151-62 19. Jinnah HA, Wojcik BE, Hunt M, Narang N, Lee KY et all. Dopamine deficiency in a genetic mouse model of Lesch-Nyhandisease. J. Neurosci. 14: 1164-1174, 1994 20. Robinson JL, Srabák MR, Dombrowski DB, Clark JH. Consequences of UMP synthase deficiency in cattle. Proc. Nat. Acad. Sci. 1983, 80:321-323 21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=258900 22. Valik D, Sterba J, Bajciova V, Demlova R. Severe encephalopathy induced by the first but not the second course of high-dose methotrexate mirrored by plasma homocysteine elevations andpreceded by extreme differences in pretreatment plasma folate. Oncology. 2005;69(3):269-72. 23. Klener P, Protinádorová chemoterapie, Galén 1996, 30. 24. Gurney H. Dose calculation of anticancer drugs : a review of the current practice and introduction of an alternative. J of Clin Oncol 14(9), 1996,2590-2611. 25. Grochow LB, Baraldi C, Noe D. Os dose normalization to weight or body surface area useful in adults ? J Natl Cancer Inst. 82,1990,323-325. 26. Ratain MJ, Mick R, Schilsky RL, et all. Pharmacologically based dosing of etoposide. A means of safety increasing dose intensity. J Clin Oncol 9, 1991, 1480-1486. 27. Port RE, Daniel B, Ding RW, et all. Relative importance of dose, body surface area, sex and age for 5-fluorouracil clearance. Oncology 48, 1991, 277-281 28. Chabot GG. Factors involved in clinical pharmacology variability in oncology. Review. Anticancer Research 14, 1994, 2269-2272. 29. Canal P,Chatelut E,Guichard S. Practical treatment guide for dose individualisation in cancer chemotherapy. Drugs 56(6), 1998, 1019-1038. 30. Boddy AV, Ratain MJ. Clinical Cancer Research .3, 1997, 1025-1030. 31. Gut I, Danielová J, Holubová J, Souček P, Klučková H. Cytotoxicity of cyclophosphamide, paclitaxel and docetaxel for tumor cell line in vitro : effects of concentration, time and cytochrome P450-catalyzed metabolism. Arch Toxicol 74, 2000, 437-446. 32. Katzung B.Základní a kllinická farmakologie, H&H 1994, 49. 33. Katzung B.Základní a kllinická farmakologie, H&H 1994, 49-50. 34. Boddy A,Idle J. The role of pharmacogenetics in chemotherapy : modulation of tumor response and host toxicity. Cancer Sur 17, 1993,79-104. 35. Šarmanová J.,Gut I.,Týnková L.,Souček P. Genotypování biotransformačních ehzymů, Remedia 11(1),2001, 35-45 . 36. Dengler HJ.,Eichelbaum M.Polymorphism and deficient drug metabolism as trigger of tixic reactions. Arzneimitt Forsch 27, 1997, 1836-1844. ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

26

37. Katzung B. Základní a klinická farmakologie, H&H 1994, 50. 38.Omura T, Sato R. The carbon monooxide-binding pigment of liver microsomes I. Evidence for its hemoprotein nature. J Biol Chem 239,1994,2370-2378. 39. Dengler HJ, Eichelbaum M.Polymorphism and deficient drug metabolism as trigger of tixic reactions. Arzneimitt Forsch 27, 1997, 1836-1844. 40. Šarmanová J, Gut I, Týnková L, Souček P. Genotypování biotransformačních ehzymů, Remedia 11(1),2001, 35-45. 41. Kleinbloesem CH, van Brummelen P, Faber H. Variability in nifedipine kinetics and dynamics: a new oxidation polymorphism in man. Biochem Pharmacology 33,1984,3721 – 3724. 42. Kroemer HK, Gautier JC, Beaune P. at all. Identification of P450 enzymes involved in metabolism of verapamil in humans. Naunyn-Schm Arch Pharmacol 348, 1993,332 – 337. 43. Relling MV, Evans R, Dass C, Desiderio DM, Nemec J. Human cytochrome P450 metabolism of teniposide and etoposide. J Pharmacol Exp Ther 261, 1992, 491-496 . 44. Chang TKH, Weber GF, Cresli CL, Waxman DJ. Differential activation of cyclophosphamide and ifosphamide by cytochrome P450 2B and 3A in human liver microsomes. Cancer Res 1993, 53, 5729 – 5737. 45. Zhou-Pan XR, Seree E, Zhou XJ. Involvment of cytochrome P450 3A in vinblastine metabolism: drug interactions, Cancer Res 53, 1993,5121 – 5126. 46. Zhou XJ, Zhou PXR, Gauthier T. Human liver microsomal cytochrome P4503A isoenzymes mediated vindesine biotransformation. Biochem Pharmacol 45, 1993, 853 – 861. 47. Wacher MJ, Chi-Yuan W, Benet LZ. Overlapping substrate specificies and tissue distribution of cytochrome P450A and P-glycoprotein: implication for drug delivery and activity in cancer chemotherapy. Mol Carcinogen 13, 1995,129 – 134. 48. Chang TKH, Weber GF, Crespi CL, Waxman DJ. Differential activation of cyclophosphamide and ifosphamide by cytochrome P450 2B and 3A in human liver microsomes. Cancer Res 53, 1993, 5729 – 5737. 49. Harris JW, Rahman A, Kim BR, Guengerich P, Collins JM. Metabolism of taxol by human hepatic microsomes and liver slices: participation of cytochrome P4503A4 and an unknown P450 enzyme. Cancer Res 54, 1994, 4026 – 4035. 50. Royer I, Monsarrat B, Sonnier M. Metabolism of docetaxel by human cytochrome P450: interaction with paclitaxel and other antineoplastic drugs. Cancer Res 56,1996,58 – 65. 51. Klener P, Protinádorová chemoterapie, Galén 1996. 52. Lennard L. The clinical pharmacology of 6-mercaptopurine. Eur J Clin Pharmacology 43, 1992, 329-339. 53. Iyer L, Ratain MJ. Pharmacogenetics and cancer chemotherapy, Eur Journal of Cancer, 34, 1998, 1493-1499. ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

27

54. Weinshilbourm RM, Sladek Sl.Mercaptopurine pharmacogenetics: monogenic inheritance of erythrocyte thipurine methyltrasferase activity. Am J Hum Gen 32, 1980, 651 – 652. 55. Evans WE, Hormer M, Chu YQ, Kalwinsky D, Roberts WM. Altered mercaptopurine metabolism, toxic effects and dosage requirements in a thiopurine methyltransferaze-deficit child with acute lymphocytic leucemia. J Ped 119, 1991, 985 – 989 . 56. Lennard L, Lilleyman JS, van Loon J, Weinshilbourm RM. Genetic variation in response to 6mercaptopurine for childhood acute leucemia. Lancet 336, 1990, 225 – 229. 57. Szumlanski C, Honchel R, Scott MC, Weinshilbourm RM. Human liver thiopurine methyltransferase pharmacogenetics: biochemical properties.liver-erythrocyte correlation and presence of isozymes . Pharmacogenetics 2 , 1992, 148 – 159 . 58. McLeod HL, Relling MV, Liu Q, Pui CH, Evans WE. Polymorphic thiopurine methyltransferase in erythrocytes is indicative of activity in leucemic blast from children with acute lymphoblastic leukemia. Blood 85, 1995, 1897 – 1902. 59. Yates CR, Krynetski EY, Loennechen T. Molucular diagnostic of thiopurine S-methyltransferase deficiency: genetic basis for azathioprine and mercaptopurine intolerance. Ann Intern. Med.126, 1997, 608 – 614. 60. Burchell B, Nebert DW,Nelson DR, et all. The UDP glucuronyltransferase gene superfamily: sudgessted nomenclature based on evolutionary divergence. DNA Cell Biot 10, 1991, 487-494. 61. Tephly T, Green M, Pui J, Irshaid Z. Endogenous substrates for UDP glucuronyltransferas. Xenobiotics 18, 1988,1201-1210. 62. Clarke DJ, Burchell B. The uridine diphosphate glukuronosyltransferase multigene family : function and regulation. In Kaufman FC, ed. Handbook of Experimental Pharmacology. Berlin, Heidelberg, Springer 112, 1994, 3-43. 63. Pommier Y, Tanizawa A, Kohn KW. Mechanism of topoisomerase I inhibitor by anticancer drug. In. Liu LF,ed. Advances in pharmacology. Academic Press, New York, 1994, p.73 64. Kawato Y, Aonuma M, Hirota Y. Intracellular roles of SN-38, a metabolit of camptothecin derivate CPT11, in the antitumor effect of CPT11. Cyncer Research 51, 1991, 4187. 65. Rivory LP, Riou JF, Haaz MCH. Identification and properties of a major metabolize of irinotecan, CPT11, isolated from the plasma of patients. Cancer Research 56, 1996, 3689. 66. Rivory LP, Robert J. Identification and kinetics of a beta glucuronide metabolite of SN-38 in human plasma after administration of the camptothecin derivate irinotecan Cancer Chemotherapy and Pharmacology 36, 1995, 176. 67. Iyer L, King C, Tephly T, Ratain MJ. UGT isoform 1.1 glukuronidates SN-38, the active matybolit of irinotecan. Proc Amer Soc Clin Oncol 16, 1997, 201a. 68. Iyer L, Whitington P, Roy SK, Ratain MJ. Genetic basis for the glukuronidation of SN-38: : role of UGT*1 isoform. Clin Pharmacol Therapy 61, 1997, 164. ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

28

69. Bosma PJ, Chowdhury RJ, Huang TJ, el all. Mechanism of inherited deficiences of multiple UDPglukuronyltransferase isoforms in two patients with Crigler-Najjar syndrome, type I. FASEB J 2, 1992, 2857-2863. 70. Wasserman E, Myara A, Paumier D, et all. Baseline bilirubin and its transient early increase predicts likelihood of severe neutropenia and diarrhea in CPT-11 based chemotherapy. Proc Am Soc Oncol 16, 1997, 219a. 71. Ratain MJ. Pharmacogenetics and cancer chemotherapy, Eur Journal of Cancer, 34, 1998, 14931499). 72. Evans DAP, White TA. Human acetylation polymorphism. J Lab Clin Medicine 63, 1964, 394403. 73. Evans DAP. N-acetyltransferase. In Kalow W, ed. Pharmacogenetics of Drug metabolism. New York, Pergamon Press 1992, 95-178. 74. Osako S, Deguchi T. Genetic polymorpism of NAT. J Biol Chem 256, 1990, 4630-4634. 75. Deitz AC, Doll MA., Hein DW. Anal Biochem 253, 1997, 219-224. 76. Lin HJ, Han CY, Lin BK, Hardy S. Slow acetylator mutations in the human polymorphic Nacetyltransferase gene in 786 Asians, Blacks, Hispanic and Whites: application to metabolic epidemiology. Am J Hum Genet 52, 1993,827-834. 77. Hadašová E, Bryšová V, Kadlčáková E. N-acetylation in healthy and diseased children. Eur. J. Clin. Pharmacol 1990;39(1):43-7. 78. Weber WW. The acetylator Genes and drug response. New York, Oxford University Press, 1987. 79. Martinez C, Agundez JAG, Olivera M, Martin R, Ledero JM. Benitez J. Lung cancer and mutation at the polymorphic NAT2 gene locus. Pharmacogenetics 5, 1995, 207-214. 80. Ladero JM, Gonzales JF, Benitez J, Vargas E, Fernandez MJ, Baki W, Diaz-Rubio M. Acetylator Polymorphism in human colorectal carcinoma. Cancer Research 51, 1991, 2098-2100. 81. Green J, Banks E, Berrington A, Darby S, Deo H, Newton R. NAT2 and bladder cancer : an overview and consideration of the evidence for gene-environment interaction. Br J of Cancer, 83(3), 2000, 412-417. 82. Ratain MJ, Rosner G, Allen S, et all. Population pharmacodynamics study of amonafide: a cancer and leucemia group B study. J Clin Oncol 13,1995,741-747. 83. Ratain MJ, Mick R, Berezin F, et all. Phase I study of amonafide dosing based on acetylator phenotype. Cancer Research 53, 1993, 2304-2308. 84. (Grem JL), 5.Fluoropyrimidines. In.: Chabner B, Longo DL (eds): Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice, 2nd Edition, Philadelphia, Pennsylvania: LB Lippincott 1996; 149212) 85. Heggie GD, Sommadossi JP, Cross DS et al. Clinical pharmacokinetics of 5-fluorouracil and its metabolites in plasma, urine and bile. Cancer Res 1987, 47, 2203-2206 ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

29

86. Collie-Duguid ESR, McLeod HL, Cassidy J. Estimation of dihydropyrimidine dehydrogenase activity: does it have a role in cancer therapy ? Annals Oncol 11,2000, 255-257 87. McMurrough J, McLeod HL. Analysis of the dihydropyrimidine dehydrogenase polymorphism in a British population. Br J Pharmacol 41,1996,425-427 88. Gonzales FJ, Fernandez-Salguerno P. Diagnostic analysis, clinical importance and molecular basis of dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency. Trends Pharmacol Sci 16,1995, 325-327 89. Heggie GD, Sommadossi JP, Cross DS et al. Clinical pharmacokinetics of 5-fluorouracil and its metabolites in plasma, urine and bile. Cancer Res 1987, 47, 2203-2206) 90. Chazal M, Etienne MC, Renée N, Bourgeon A, Richelme H, Milano G. Link between dihydropyrimidine dehydrogenase activity in peripheral mononuclear cells and liver. Clin Cancer Research 2, 1996, 507-510 91. Fleming RA, Milano G, Thyss A et al. Correlation between dihydropyrimidine dehydrogenase activity in peripheral mononuclear cells and systemic clearance of fluorouracil in cancer patients. Cancer res 52, 1992, 2899-2902 92. Etienne MC, Chatelut E, Pivot X et al. Co-variables influencing 5-fluorouracil clearance during continuous venous infusion. A NONMEM analysis. Eur J. Cancer 34,1998,92-97 93. Milano G, McLeod HL. Can dihydropyrimidine dehydrogenase impact 5-fluorouracil-based treatment ? Eur J Cancer 36,2000,37-42 94. Valík D. Encephalopathy, lactic acidosis, hyperammonaemia and 5-fluorouracil toxicity. Br J Cancer. 1998 May;77(10):1710-2 95. Ridge SA, Sludden J, Wei X et al. Dihydropyrimidine dehydrogenase pharmacogenetics in patients with colorectal cancer. Br J Cancer 77,1998,497-500 96. Harris BE, Song R, Soong SJ, Fiasko RB. Circadian rhythm of rat liver dihydropyrimidine dehydrogenase. Possible relevance for fluoropyrimidine therapy. Biochem Pharmacol 37,1988,47594762 97. Grem JL, Yee LK, Venzon DJ, Takimoto CH, Allegro CJ. Inter and intraindividual variation in dihydropyrimidine dehydrogenase activity in peripheral blood mononuclear cells. Cancer Chemother Pharmacol 40,1997,117-125 98. Beck A, Etienne MC, Cheradame S et al. A role for dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidylate synthase in tumour sensitivity to fluorouracil Eur J Cancer 30A, 1994, 1517-1522 99. Heidelberger C, Chaudhuri NK, Danneberg P, Mooren D, Griesbach L, Duschinsky R, Schnitzer RJ, Pleven E, Scheiner J. Fluorinated pyrimidines, a new class of tumour-inhibitory compounds. Nature. 1957 Mar 30;179(4561):663-6 100. Tuchman M et al. Familial pyrimidinemia and pyrimidinuria associated with severe fluorouracil toxicity. NEJM 1985: 313, 25-49 101. Diasio RB et al. Familial deficiency of dihydropyrimidine dehydrogenase. Biochemical basis for familial pyrimidinemia and severe 5-fluorouracil -induced toxicity. J Clin Invest 1988:81,47-51 ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

30

102. Brockstedt et al. A new case of dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency. J Inherit Metab Dis. 1990:13,121-3 103. Milano G, Etienne MC. Potential importance of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) in cancer chemotherapy. Pharmacogenetics1994:4,301-6) and references therein 104. Van Kuilenburg ABP, et al, Dihydropyrimidinase deficiency and severe 5-fluorouracil toxicity. Clin Cancer Res, 2003:9, 4363-67 105. Sloan JA, Goldberg RM, Sargent DJ, et al. Women experience greater toxicity with fluorouracilbased chenotherapy for colorectal cancer. J Clin Oncol 2002;1491-8 106. Fleming RA, Milano GA, Etienne MC, et al. No effect of dose, hepatic function, or nutritional status on 5-fluorouracil clearance following continuous (5 days), 5-FU infusion. Br J Cancer 1992;66:668-72 107. Maring JG, Piersma H, van Dalen A, et al. Extensive hepatic replacement due to liver metastases has no effect on 5-fluorouracil pharmacokinetics. Cancer Chemother Pharmacol 2003;51:167-73 108. Etienne MC, Lagrange JL, Dassoville O, et al. Population study of dihydropyrimidine dehydrogenase in cancer patients. J Clin Oncol 1994;12:2248-53 109. Grem JL, Yee LK, Venzon DJ, et al. Inter- and intraindividual variation in dihydropyrimidine dehydrogenase activity in peripheral blood mononuclear cells. Cancer Chemother Pharmacol 1997;40:117-25 110. Langouet AM, Metzger G, Comisso M, et al. Plasma concentration of 5-fluorouracil and mononuclear cell dihydropyrimidine dehydrogenase activity in patients treated with different chronomodulated chedules (abstract no 135). Biol Rhytm Res 1995;26:409 111. Maring JG, van Kuilenburg ABP, Haasjes J, et al. Reduced 5-FU clearance in a patient with low DPD activity due to heterozygosity for a mutant allele of the DPYD gene. Br J Cancer 2002;86:102833 112. Van Kuilenburg AB, Haasjes J, Richel DF, et al. Clinical implications of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) deficiency in patients with severe 5-fluorouracil-associated toxicity: identification of new mutations in DPD gene. Clin Cancer Res 2000;6:4705-12 113. Pullarkat ST, Stoehlmacher J, Ghaderi V, et al. Thymidylate synthase gene polymorphism determines response and toxicity of 5-FU chemotherapy. Pharmacogenomics J 2001;1:65-70 114. Marsh S, McKay JA, Cassidy J, et al. Polymorphism in the thymidylate synthase promoter enhancer region in colorectal cancer. Int J Oncol 2001; 19:383-6 115. Lecomte T, Ferraz JM, Zinzindohoue F, et al. Thymidilate synthase gene polymorphism predicts toxicity in colorectal cancer patients receiving 5-fluorouracil based chemotherapy. Clin Cancer Res 200;10:5880-8 116. Tomiak A, Vincent M, Earle CC, et al. Thymidylate synthase expression in stage II and III colon cancer. A retrospective review. Am J Clin Oncol 2001;24:597-602 ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

31

117. Westra JL, Hollema H, Schaapveld M, et al. Predictive value of thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase protein expression on survival 118. Wisotzkey JD, Toman J, Bell T, et al. MTHFR (C677T) polymorphism and stage III colon cancer: response to therapy. Mol Diagn 1994;4:95-9 119. Etienne MC, Formento JL, Chazal M, et al. Methylenete-tetrahydrofolate reductase gene polymorphism and response to fluorouracil-based treatment in advanced colorectal cancer patients. Pharmacogenetics 2004;14:785-92 120. Maring JG, Groen HJM, Wachters FM, et al. Genetic factors includencing pyrimidine-antagonist chemotherapy. Pharmacogenomics J 2005;5:226-43 121. Johnson MR, Wang K, Tillmanns S, et al. Structure organisation of the human dihydropyrimidine dehydrogenase gene. Cancer Res 1997;57:1660-3 122. Wei X, Elizondo G, Sapone A, et al. Characterization of the human dihydropyrimidine dehydrogenase gene. Gemomics 1998;51:391-400 123. Meinsma R, Fernandez-Salguero P, van Kuilenburg AB, et al. Human polymorphism in drug metabolism: mutation in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene results in exon skipping and thymine uraciluria. DNA Cell Biol 1995;14:1-6 124. Yokota H, Fernandez-Salguero P, Furuya H, et al. cDNA cloning and chromosome mapping of human dihydropyrimidine dehydrogenase, an enzyme associated with 5-fluorouracil toxicity and congenital thymine uraciluria. J Biol Chem 1994;269:23192-6 125. Santini J, Milano G, Thyss A, et al. 5-FU therapeutic monitoring with dose adjustment leads to an improved therapeutic index in head nd neck cancer. Br J Cancer 1989;59:287-90 126. Gamelin E, Boisdron-Celle M, Delva R, et al. Long-term weekly treatment of colorectal metastatic cancer with fluorouracil and leucovorin: results of multicentric prospective trial of fluorouracil dosage optimization by pharmacokinetic monitoring in 152 patients. J Clin Oncol 1998;16:1470-8 127.Yoshida T, Araki E, Iigo M, et al. Clinical significance of monitoring serum levels of 5fluorouracil by continuous infusion in patients with advanced colonic cancer. Cancer Chemother Pharmacol 1990;26:352-4 128.Milano G, Etienne MC, Renee N, et al. Relationship between fluorouracil systemic exposure and tumor response and patient survival. J Clin Oncol 1994;12:1291-5 129. Hillcoat BL, McCulloch PB, Figueredo AT, et al. Clinical response and plasma levels of 5fluorouracil in patients with colonic cancer treated by drug infusion. Br J Cancer 1978;38:719-24 130. Mohammad O. Hoque et al. Dihydropyrimidine dehydrogenase mRNA level correlates with the response to 5-fluorouracil-based chemo-immuno-radiation therapy in human oral squamous cell cancor. Int J of Oncology 19: 953-958, 2001

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

32

131. Farber S, Diamond LK, Mercer RD, et al. Temporary remission of acute leukemia in children produced by folic acid antagonist, 4-aminopteroylglutamic acid (aminopterin). NEJM 238, 1948, 187793 132. Refsum H, Wesenberg F, Ueland PM. Plasma homocysteine in children with acute lymphoblastic leukemia: changes during a chemotherapeutic regimen including methotrexate. Cancer Res. 1991 Feb 1;51(3):828-35 133. Valik D, Radina M, Sterba J, Vojtesek B. Homocysteine: exploring its potential as a pharmacodynamic biomarker of antifolate chemotherapy. Pharmacogenomics. 2004 Dec;5(8):1151-62

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

33

6. Cíle práce :

Výše uvedený teoretický základ společně s vlastními klinickými a částečně i laboratorními zkušenostmi vedly k definování dvou základních projektů týkajících se farmakogenetiky a biomarkerů jako prediktivních faktorů při individuální terapii pacientů při podávání některých cytostatik, a to konkrétně methotrexatu a 5-fluorouracilu. Řešení těchto dvou projektů bylo předmětem této dizertační práce. Projekt A (Farmakogenetické souvislosti při podávání fluoropyrimidinové chemoterapie) je připravován k publikaci, dílčí výsledky byly uvedeny zatím ve formě posteru a přednášky. Cíl, metodika, výsledky a diskuse k tomuto projektu jsou uvedeny v textu níže. Projekt B (Biomarkery ve sledování farmakodynamiky methotrexatu) byl již součástí několika publikovaných prací in extenso, tyto jsou přiloženy v závěru disertační práce v plném znění.

6.1 Projekt A - Farmakogenetické souvislosti při podávání fluoropyrimidinové chemoterapie

Primární cíl projektu : Prospektivní zhodnocení farmakogeneticky determinované interindividuální variability pacientů léčených 5-fluorouracilem. Primárním cílem bylo vyhodnotit a korelovat výsledky získané farmakokinetickým monitorováním 5-FU , molekulární analýzou vybraných mutací DPD a souborem klinických dat, zejména ve vztahu k pozorovaným nežádoucím účinkům podávané chemoterapie s 5fluorouracilem.

6.2 Projekt B - Biomarkery ve sledování farmakodynamiky methotrexatu

Primárním cílem tohoto projektu bylo vyhodnocení a návrh případného klinického využití při monitorování plazmatických hladin homocysteinu jako možného biomarkeru účinnosti léčby při podávání vysokodávkovaného methotrexatu u dětí s diagnózami akutní lymfoblastické leukémie (ALL) nebo non-hodgkinského lymfomu (NHL). Hodnocení výsledků bylo prováděno na základě dat získaných stanovením plazmatických hladin endogenních folátů před zahájením léčby, plazmatických koncentrací homocysteinu v průběhu podávání methotrexatu a souboru klinických dat dětských pacientů s výše uvedenými diagnózami.

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

34

6.1 Projekt A - Farmakogenetické souvislosti při podávání fluoropyrimidinové chemoterapie

6.1.1. Primární cíl projektu :

Prospektivní zhodnocení farmakogeneticky determinované interindividuální variability pacientů léčených 5-fluorouracilem. Primárním cílem bylo vyhodnotit a korelovat výsledky získané farmakokinetickým monitorováním 5-FU, molekulární analýzou vybraných mutací DPD a souborem klinických dat, zejména ve vztahu k pozorovaným nežádoucím účinkům podávané chemoterapie s 5fluorouracilem.

Do projektu byli dle níže uvedených vstupních a vylučujících kritérií zařazováni pacienti léčení v Masarykově onkologickém ústavu, a to po podepsání Informovaného souhlasu schváleného Etickou komisí MOÚ.

6.1.2. Vstupní kritéria: -

histologicky verifikované zhoubné nádorové onemocnění trávicího traktu (jícen,žaludek, tlusté střevo, konečník), prsu nebo hlavy a krku

-

plánovaná cytostatická terapie s 5-FU (bolusový Mayo režim nebo kontinuální podání dle deGramonta po dobu 48-120hod)

-

performance status 0-2 dle WHO

-

uspokojivé hematologické parametry (leukocyty > 3,5 x 109/L, hemoglobin > 8 g/100ml, trombocyty > 100 x 109/L)

-

předpoklad přežití minimálně 3 měsíce

-

předpoklad spolupráce

-

podpis informovaného souhlasu

6.1.3. Vylučující kritéria: -

aktivní infekční onemocnění

-

známá přecitlivělost na 5-fluorouracil

-

špatný nutriční stav

-

městnavá srdeční slabost, nestabilní angina pectoris, závažná arytmie

-

infarkt myokardu v posledních 6 měsících před zahájením léčby

-

závažné neurologické nebo psychiatrické onemocnění včetně demence, alkoholismus

-

jiné závažné onemocnění, které by znamenalo kontraindikaci k plánované chemoterapii

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

35

Podmínkou zařazení bylo samozřejmě léčebné podání chemoterapeutického režimu obsahujícího 5fluorouracil, a to v možných následujících variantách :

režim s kontinuálním podáváním 5-FU v režimu dle deGramonta (FU/FA deGramont) (leukovorin 200 mg/m2 i.v. v infuzi na 2hod, následně bolus 5-FU 400 mg/m2 i.v.s navazujícím podáním 5-FU 600 mg/m2 i.v. v infuzi na 22 hod, a to den 1 a 2, interval 28 dní)

režim s bolusovým podáním 5-FU (FU/FA Mayo) (5-FU 425 mg/ m2 i.v. bolus, leukovorin 20 mg/ m2 . i.v. bolus, opakovaně den 1-5, interval 21-28 dní ) (případně režimy FOLFIRI a FOLFOX, kde je ke kontinuálnímu režimu s 5-FU dle deGramonta předřazeno ještě podání irinotecanu nebo oxaliplatiny) 6.1.4. Přehled vyšetření, sběr dat a metodika Realizace projektu předpokládala získání dat ve třech základních částech :


A/ farmakokinetické části projektu - stanovením plazmatických hladin 5-FU, jeho metabolitu 5,6-DHFU a vyhodnocením základních farmakokinetických parametrů




B/ farmakogenetické části projektu - molekulární analýzou vybraných mutací DPD




C/ klinické částí projektu - zhodnocením klinických dat pacientů.

Za tímto účelem byla před zahájením léčby a v jeho průběhu prováděna následující vyšetření:

Ad A/ odběry na farmakokinetiku byly provedeny u všech pacientů vždy při první sérii chemoterapie. Objem odebírané krve byl 1,5 ml/každý vzorek, frekvence a čas odběrů byl závislý na zvoleném režimu chemoterapie.

Časování odběru vzorků :

FU/FA deGramont, FOLFIRI, FOLFOX : 0min, +10min, +30min, +2,5hod, +12hod, +24hod, +36hod, +48hod od zahájení chemoterapie, odběr proveden z kanyly druhostranné žíly

FU/FA Mayo : 0min, +10min, +20min, +30min, +40min, +60min, +90min, +120min od zahájení chemoterapie v den 1, odběr proveden z kanyly druhostranné žíly

Ad B/ k farmakogenetické analýze byl realizován jednorázový odběr plné krve.

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

36

Ad C/ ke klinické části protokolu byla prováděna následující vyšetření pacientů : anamnéza a fyzikální vyšetření, zaznamenání počtu konkomitantně užívaných léčiv, ECOG performance status, EKG a ECHO vyšetření srdce, hematologie včetně koagulace (krevní obraz + diferenciál,INR, aPTT, fibrinogen) a biochemie (glykemie, urea, kreatinin, Na,K, Cl, bilirubin, AST, ALT, ALP, GMT, albumin, celková bílkovina) , průběžné sledování a zaznamenání nežádoucích účinků chemoterapie.

Metodika : Ad A/ Metodika stanovení plazmatických hladin 5-FU a metabolitu 5,6-DHFU metodou HPLC, vlastní farmakokinetický výpočet

Vzorek periferní krve byl odebrán do zkumavky Sarstedt (s lithium heparinem). Identifikace pacienta, datum a čas odběru byl uveden na průvodní žádance, která byla společně se vzorkem krve předána na odd. laboratorní medicíny MOÚ, kde byl vzorek následně centrifugován při 2100g a získaná plazma zamražena na – 70 °C do doby , než byla provedena analýza. Před vlastní analýzou byla plazma deproteinizována za pomocí kyseliny perchlorové, jako interní standard byl použit 5-chlorouracil. Pro vlastní stanovení bylo použito 20 µl deproteinátu metodou HPLC (Waters Alliance), vybaveného analytickou kolonou Atlantis C18, 3.5µ při 20 °C, vlastní signal detekován za pomocí Waters 2996 diode-array detector s vlnovou délkou 195 - 295 nm, průtoková rychlost mobilní fáze 0.4 ml/min. Kalibrace přístroje provedena za pomoci 5-FU (Sigma) and 5,6-DHFU s možností detence hladin v rozmezí 0,5 – 100 µmol/l (5,6-DHFU poskytnut od Dr. Angela Perrin, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland). Vlastní farmakokinetický výpočet byl proveden pomocí software MWPHARM 3.02 (MediWare, Groningen, Netherlands). Vzhledem k literárním údajům publikovaným k tomuto tématu, ze kterých vyplývá, že farmakokinetický parametr AUC lze považovat za nejvhodnější proměnnou, která má určitou prediktivní hodnotu ve vztahu k očekávané farmakodynamice léčiva, zvolila jsem tento parametr jako stěžejní při vyhodnocování získaných dat. Výpočet AUC0-48h pro kontinuální režim, resp. AUC0-120min pro jednorázové bolusové podání byl proveden jak u mateřského léčiva 5-FU, tak i u jeho metabolitu 5,6-DHFU. Následně byl vypočten poměr AUC5-FU /AUC5,6-DHFU ((µmol.l-1.min-1) a provedena statistická korelace mezi naměřenými hodnotami a nežádoucími účinky léčiva.

Ad B/ Pro molekulárně-genetickou analýzu genu pro DPD byla využita genomová DNA izolovaná z leukocytů periferní krve. Krevní vzorek byl odebrán před zahájením léčby za použití zkumavky K3EDTA, tj. SARSTEAD (na krevní obraz). Zkumavku bylo nutno nenechávat u zdroje tepla nebo na slunci a nejpozději do 15 minut odnést do Laboratoře prediktivní onkologie MOÚ, kde byla následně zamražena. ________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

37

Mutační analýza kódující sekvence DPD pomocí sekvenování cDNA byla provedena v laboratoři P&R Lab v Novém Jičíně standardními postupy dle doporučení výrobce, a to u 23 pacientů základního souboru, u kterých se projevily nežádoucí účinky po podání 5-fluorouracilu. Izolace genetického materiálu (DNA a celkové RNA) z periferní krve byla provedena standardními postupy dle protokolu výrobce. Testováno bylo celkem 23 exonů. Ad C/ U všech pacientů bylo v průběhu chemoterapie a následně i po jejím ukončení provedeno hodnocení nežádoucích účinků dle mezinárodně platných NCI-CTC kritérií (verze 3.2, http://ctep.cancer.gov/forms/CTCAEv3.pdf). Nežádoucí účinky chemoterapie tak byly skórovány dle jejich četnosti a stupně závažnosti (ve škále 0 (žádný) – 4 (maximální). 6.1.5. Výsledky Tabulka 1. Souhrnná charakteristika souboru (n = 41) Hodnocené parametry

Hodnoty souboru 1

Muži / ženy věk (roky) Dg. skupiny C18 – C20 C16 C80 C25 C22 CHT režimy s 5-FU FU/FA Mayo FU/FA de Gramont FOLFIRI FOLFOX Klinické údaje a vyšetření Souběžná medikace: počet 0 1-2 >2 Interkurence 0 1-2 >2

N = 23 (56.1 %) / 14 (43,9 %) 59 (44; 74)

Clearance (ml.s-1) Albumin (g.l-1) Celková bílkovina (g.l-1) INR Hodnocený farmakokinetický parametr (plocha pod křivkou AUC) (log-scale) 2 AUC5-FU 0-48h (µmol.l-1.min-1)

N = 26 (63.0 %) N = 6 (14.6 %) N = 4 (9.8 %) N = 2 (4.9 %) N = 3 (7.3 %) N = 18 (43.9 %) N = 13 (31.7 %) N = 6 (14.6 %) N = 4 (9.8 %)

N = 5 (12.2 %) N = 23 (56.1 %) N = 13 (31.7 %) N = 9 (21.9 %) N = 20 (48.8 %) N = 12 (29.3 %) 1.62 (1.17; 2.08) 40 (34; 44) 71 (63; 80) 1.03 (0.95; 1.19)

2.01 (0.80; 3.22)

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

38

AUC5,6-DHFU 0-48h (µmol.l-1.min-1) AUC5-FU /AUC5,6-DHFU Dosažená léčebná odpověď CR (komletní remise) PR/MR (parciální remise) SD (stabilizace onemocnění) PD (progrese) Jiné 3

1.95 (1.09; 2.72) 0.69 (0.33; 1.32) N = 15 (36.6 %) N = 5 (12.2 %) N = 4 (9.8 %) N = 5 (12.2 %) N = 12 (29.2 %)

1

spojité veličiny sumarizovány jako medián s uvedením 10 % - 90 % percentilu (v závorce) hodnoty AUC a jejich vzájemný poměr byl logaritmizován funkcí: Xtr = Ln[X+1] 3 Terapeutická odpověď nehodnocena z důvodu objektivních klinických příčin : ukončení terapie z důvodu brzké progrese onemocnění, nesouhlas pacienta nebo úmrtí 2

Korelace nežádoucích účinků a vybraného farmakokinetického parametru AUC při podávání 5-fluorouracilu Nejčastěji pozorované nežádoucí účinky jsou sumarizovány v tabulce 2. Z ní také vyplývá, že u více než poloviny pacientů byl zaznamenán minimálně jeden nežádoucí účinek související s podávanou chemoterapií. Nejčastěji se objevovaly průjem a mukositida, tedy očekávaná slizniční toxicita ve vztahu k 5-FU, a dále pak nechuť k jídlu a granulocytopenie. Stupeň závažnosti byl u uvedených nežádoucích účinků podobný, nejčastěji se pohyboval mezi stupněm 1-2, pouze v případě granulocytopenie bylo dosahováno závažnějšího stupně 2–4. Lze obecně konstatovat, že žádný ze zaznamenaných nežádoucích účinků nebyl dominující, a že celkově byl stav pacienta komplikován spíše kumulací jednotlivých nežádoucích účinků. Současně lze také vysledovat, že narůstající počet nežádoucích účinků u daného pacienta povětšinou koreluje se závažnějším stupněm zaznamenané toxicity, která rovněž v čase narůstá . Na základě těchto faktů bylo pro hodnocení toxicity navrženo komplexní skórování toxicity („comprehensive severity score“), které logicky agreguje četnost a stupeň závažnosti včetně jejich vývoje v čase. Navrženy tak byly 4 základní skupiny, které lze popsat následovně :

-

I: Pacienti bez jakýchkoliv nežádoucích účinků, a to jak během první série chemoterapie, tak i během následné léčby

-

II: Pacienti s mírnou toxicitou, s maximálně 2 typy zaznamenaných nežádoucích účinků, nejvyšší dosažený stupeň závažnosti 1

-

III: Pacienti se středně závažnou toxicitou, s maximálně 3 typy zaznamenaných nežádoucích účinků, stupně závažnosti 2-3

-

IV: Pacienti se závažnou toxicitou a kumulací nežádoucích účinků, počtem nežádoucích účinků vždy >2 a vysokým stupněm závažnosti (2-4). Všichni pacienti měli současně závažné nežádoucí účinky i během následné terapie.

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

39

Tabulka 2. Agregace incidence a stupně závažnosti zaznamenaných nežádoucích účinků v komplexním skórování toxicity I –IV (navrhované „comprehensive severity score“)

Stupeň závažnosti nežádoucích účinků (grade) 1

Pacienti s následně zvyšující se toxicitou v čase (%)

Počet nežádoucích účinků/pacienta (v průběhu 1. série chemoterapie) 0 (N = 20) 1 -2 (N = 13) 3-4 (N = 8)

1 (1; 2) 2 (1; 4)

35 % 23 % 63 %

Nejčastější typy nežádoucích účinků Průjem (N = 13) Nechuť k jídlu (N = 11) Mukositida (N = 10) Granulocytopenie (N = 7) Nauzea (N = 7) Leukopenie (N = 6) Únava (N = 6)

1 (1; 2) 1 (1; 2) 1 (1; 2) 2 (2; 4) 1 (1; 2) 1 (1; 2) 1 (1; 2)

Navrhované „comprehensive severity score“ 2 I (N = 13; 31.7 %) 0 II (N = 13; 31.7 %) 1 (1; 2) III (N = 10; 34.4 %) 2 (1; 3) IV (N = 5; 12.2 %) 2 (2; 4) 1 2

0% 38.5 % 50.0 % 100 %

stupeň závažnosti (grade1 – 4) sumarizován jako medián a MIN/MAX hodnota (v závorce) Popis skupin I – IV viz výše

Obr. 1. „modelové“ grafické znázornění průběhu plazmatických hladin 5-FU a 5,6-DHFU pac. A (FU/FA Mayo) 120 100

umol/l

80 5-FU (µmol/l) 60

DHFU (µmol/l)

40 20 0 0

10

30

60

120

m in

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

40

Pac. B (FU/FA deGramont) 120 100

umol/l

80 5-FU (µmol/l)

60

DHFU (µmol/l)

40 20

21 60 28 80

14 40

72 0

15 0

30

10

0

0

m in

Jak již bylo uvedeno výše, stanovení AUC0-48h pro kontinuální režim, resp. AUC0-120min pro

jednorázové bolusové podání, bylo provedeno jak u mateřského léčiva 5-FU, tak i u jeho metabolitu 5,6-DHFU Následně byl vypočten poměr obou AUC a provedena statistická korelace mezi zjištěnými hodnotami a nežádoucími účinky léčiva ve skupinách I – IV. Primární hodnoty AUC byly při statistickém vyhodnocení z důvodu dosažení symetrického rozložení a homogenní odchylky logaritmizovány. Statistickou analýzou byla následně potvrzena statisticky významná závislost mezi parametry AUC (5-FU, 5,6-DHFU) a nežádoucími účinky podávané chemoterapie s 5-FU (přehledně a detailněji níže i tab 3 a obr. 1)

-

AUC5-FU dosahuje signifikantně vyšších hodnot u všech skupin pacientů, u kterých byly zaznamenány jakékoliv nežádoucí účinky bez ohledu na stupeň jejich závažnosti (tedy u skupin II-IV při použití komplexního skórování toxicity). U skupiny II a III-IV jsou průměrné hodnoty AUC 2,6 (1.4,3.3) µmol.l-1.min-1, resp. 2,5 (1.5; 3.5) µmol.l-1.min-1 , ve srovnání se skupinou I (bez toxicity), AUC 1.2 (0.4; 2.4) µmol.l-1.min-1 , p=0,012

-

průměrné hodnoty AUC5,6-DHFU v jednotlivých skupinách I – IV nevykazovaly statisticky významné rozdíly, důvodem může být i poměrně vysoká intra-skupinová variabilita hodnot

-

poměr AUC5-FU /AUC5,6-DHFU se jeví jako nejsilnější součinitel vzájemné korelace mezi sledovanými veličinami, tento poměr se signifikantně zvyšuje s narůstajícím stupněm závažnosti nežádoucích účinků (I → IV). V kontrastu s průměrnými hodnotami AUC5-FU je poměr AUC5-FU /AUC5,6-DHFU jednoznačně zvýšen ve skupině IV - 0.9 (0.7; 1.8), p=0,006, tedy ve skupině s nejvyšším počtem i stupněm závažnosti pozorovaných nežádoucích účinků.

________________________________________________________________________ © Regina Demlová 2008

41