1
Jurnal Bioteknologi Pertanian, Vol. 10, tanaman No. 1, 2005, pp. 1-6 Embriogenesis somatik langsung pada cendana
Embriogenesis somatik langsung pada tanaman cendana Direct somatic embryogenesis on sandalwood Deden Sukmadjaja Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Jalan Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111, Indonesia
ABSTRACT
PENDAHULUAN
Sandalwood (Santalum album L.) is a commercially important commodity of Indonesia, particularly in West and East Nusa Tenggara. However, the population has significantly decreased and the planting materials are difficult to be provided through conventional methods. A study was conducted to propagate sandalwood by using in vitro technology through somatic embryogenesis. Primary somatic embryos were formed on immature or mature zygotic embryos planted on MS basal medium containing benzyl-aminopurine or thidiazuron. Primary somatic embryos then formed secondary embryos when they were transferred to MS medium with or without indoleacetic acid. Transferring somatic embryos onto MS medium containing gibberrelic acid could not convert the embryos into plantlets, but they regenerated forming shoot multiplication. Culturing shoots from somatic embryo on MS induction medium enriched with indole butyric acid produced a few number of roots.
Cendana (Santalum album L.) merupakan salah satu komoditas yang bernilai ekonomi tinggi. Tanaman ini banyak terdapat di Nusa Tenggara Timur, namun populasinya cenderung menurun akibat tidak seimbangnya antara eksploitasi dan upaya pelestariannya. Di Pulau Sumba, misalnya, tanaman cendana telah punah, sedangkan di Pulau Timor cendana akan mengalami nasib serupa apabila tidak ada upaya penyelamatannya. Eksploitasi kayu cendana terutama disebabkan oleh permintaan pasar yang tinggi, baik di dalam maupun luar negeri (Musakabe 2000). Oleh karena itu perlu segera dilakukan upaya pengembangannya. Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan pengembangan tanaman cendana adalah ketersediaan bibit yang bermutu. Penyediaan bibit melalui perbanyakan secara konvensional kurang memadai untuk suatu tanaman yang akan dikembangkan secara luas. Teknologi yang biasa digunakan dan memberikan harapan dalam penyediaan bibit dalam jumlah besar dan waktu singkat ialah kultur in vitro. Aplikasi bioteknologi dalam bidang pertanian bukan hanya untuk perbanyakan, tetapi juga untuk perbaikan karakter tanaman. Perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan dapat dilakukan melalui tiga cara, yaitu pembentukan tunas adventif, proliferasi tunas lateral, dan embriogenesis somatik. Penelitian perbanyakan tanaman cendana melalui proliferasi tunas telah dilakukan oleh Kamil dan Umboh (1990). Di masa mendatang, perbanyakan klonal melalui embriogenesis somatik untuk produksi benih sintetis tanaman kehutanan akan lebih banyak mendapat perhatian dibandingkan cara lainnya (Attree et al. 1990). Embriogenesis somatik merupakan suatu proses di mana sel-sel somatik (baik haploid maupun diploid) berkembang membentuk tumbuhan baru melalui tahapan perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet (Williams dan Maheswara 1986). Regenerasi melalui embriogenesis somatik memberikan
[Keywords: Santalum album, somatic embryogenesis, primary somatic embryo, secondary somatic embryo]
ABSTRAK Cendana (Santalum album L.) merupakan salah satu tanaman yang bernilai ekonomi tinggi bagi Indonesia khususnya di Nusa Tenggara Barat dan Timur. Namun, populasi tanaman tersebut cenderung menurun dan penyediaan bahan tanaman secara konvensional sulit dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk memperbanyak tanaman cendana secara in vitro melalui embriogenesis somatik secara langsung. Embrio somatik primer diperoleh dengan cara menanam eksplan embrio zigotik muda dan dewasa pada media dasar MS yang mengandung bensil-aminopurin atau thidiazuron. Pada tahap selanjutnya, embrio somatik primer akan membentuk embrio somatik sekunder setelah disubkultur pada media dasar MS dengan atau tanpa penambahan asam indolasetat. Pemindahan embrio somatik pada media pendewasaan atau perkecambahan MS yang mengandung asam giberelat tidak dapat mendorong embrio menjadi plantlet, tetapi mengarah pada proses regenerasi membentuk multiplikasi tunas. Induksi akar pada tunas-tunas yang berasal dari embrio somatik pada media dasar MS yang mengandung asam indol butirat hanya menghasilkan akar dalam jumlah yang sedikit. [Kata kunci: Santalum album, embriogenesis somatik, embrio somatik primer, embrio somatik sekunder]
2 banyak keuntungan, antara lain: (1) waktu perbanyakan lebih cepat; (2) pencapaian hasil dalam mendukung program perbaikan tanaman lebih cepat; dan (3) jumlah bibit yang dihasilkan tidak terbatas jumlahnya (Mariska 1996). Di samping itu, dengan strukturnya yang bipolar dan kondisi fisiologis yang menyerupai embrio zigotik maka perbanyakan melalui pembentukan embrio somatik lebih menguntungkan daripada pembentukan tunas adventif yang unipolar. Embriogenesis somatik pada tanaman kehutanan mempunyai beberapa tahapan perkembangan yang spesifik, seperti induksi kalus embriogenik atau embrio somatik (pembentukan langsung), pemeliharaan, pendewasaan, perkecambahan, dan aklimatisasi (Lelu et al. 1993). Pembentukan embrio somatik secara langsung lebih disukai karena dapat menekan masalah sulitnya pembentukan benih somatik pada tahap perkecambahan (Rai dan McComb 2002). Keberhasilan regenerasi melalui embriogenesis somatik dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain formulasi media yang berbeda pada setiap tahap perkembangan embrio somatik serta jenis eksplan yang digunakan. Pada tahap pembentukan struktur globular dan hati sering digunakan zat pengatur tumbuh sitokinin seperti benzyladenin (BA) atau yang mempunyai peran fisiologis yang sama yaitu thidiazuron (Husni et al. 1997) atau 2,4-D, dan NAA apabila embrio somatik melalui fase kalus (Hutami et al. 2002). Untuk tahap pendewasaan, konsentrasi sitokinin diturunkan dan untuk tahap perkecambahan sering ditambahkan GA3 (Mariska et al. 2001a; 2001b; Rai dan McComb 2002). Sebagai eksplan umumnya digunakan jaringan atau organ yang bersifat embriogenik seperti embrio zigotik, kotiledon, mata tunas, dan hipo/epikotil. Di India, penelitian perbanyakan klonal pada tanaman cendana dikembangkan dengan menggunakan bioreaktor dengan cara memanipulasi berbagai faktor yang mempengaruhi proses produksi embrio somatik pada setiap tahapannya, seperti komposisi sukrosa, nitrogen, asam absisic (Das et al. 2001) atau ion kalsium dalam media (Anil dan Rao 2000). Dengan demikian, perbanyakan tanaman melalui embriogenesis somatik memerlukan beberapa tahapan dengan formulasi media yang berbeda, bergantung pada tahap perkembangan embrio somatik. Penelitian ini bertujuan mempelajari sistem regenerasi dan perbanyakan secara in vitro tanaman cendana melalui pembentukan embrio somatik secara langsung.
Deden Sukmadjaja
BAHAN DAN METODE Penelitian dilaksanakan di laboratorium kultur jaringan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian pada bulan Februari sampai Desember 2003. Bahan tanaman yang digunakan adalah embrio dari buah cendana muda dan dewasa yang diperoleh dari Nusa Tenggara Barat dan Yogyakarta. Bagian luar kulit buah (pericarp) dibuka/dipecah, kemudian benih dikeluarkan dan dikumpulkan. Benih dikeringanginkan di atas cawan petri di dalam laminar selama 5-10 menit. Embrio yang berada di bagian dalam benih dikeluarkan dengan menggunakan pinset steril, kemudian ditanam dalam media perlakuan yang sudah disiapkan di dalam botol kultur. Media yang digunakan sebagai perlakuan disesuaikan dengan tahapan percobaan yaitu: • Tahap induksi embrio somatik: MS + BA 0,5 mg/l; MS + BA 1 mg/l; MS + BA 2 mg/l; MS + thidiazuron 0,5 mg/l; MS + thidiazuron 1 mg/l dan MS + thidiazuron 2 mg/l. • Tahap pembentukan embrio somatik sekunder: MS + IAA 0,5 mg/l dan MS + IAA 1 mg/l. • Tahap perkecambahan/pembentukan plantlet: MS1/2 tanpa GA 3; MS1/2 + GA 3 0,5 mg/l; MS1/2 + GA3 1 mg/l; MS tanpa GA3; MS + GA3 0,5 mg/l dan MS + GA3 1 mg/l. • Tahap perakaran: MS + IBA 5 mg/l dan MS + IBA 10 mg/l. Medium dasar MS (Murashige dan Skoog 1962) dilengkapi dengan sukrosa 3% (w/v), serta dibuat padat dengan menambahkan agar 0,2% (Phytagel/Gelrite). Selanjutnya, pH media dibuat 5,8 dengan menambahkan 1 N NaOH atau 1 N HCl sebelum diotoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Biakan diinkubasi pada suhu 25 + 2oC di bawah cahaya neon 1.000-2.000 lux selama 16 jam. Dalam media induksi, eksplan embrio somatik akan membentuk sel-sel embriogenik yang kemudian berkembang membentuk fase globular (fase embrio somatik primer). Eksplan kemudian dipindahkan ke dalam media pendewasaan untuk mengoptimalkan pembentukan embrio somatik sekunder. Embrio somatik yang telah membentuk kotiledon dipindahkan ke dalam media perkecambahan untuk pembentukan plantlet. Kondisi penyimpanan biakan pada semua tahap perlakuan adalah sama.
3
Embriogenesis somatik langsung pada tanaman cendana
Setelah plantlet cukup kuat untuk dipindahkan, dilakukan aklimatisasi di kamar kaca. Media tanam yang digunakan berupa campuran tanah dan pupuk kandang atau kasting (1:1) dalam pot plastik. Di samping itu, pada pot tersebut disediakan bibit tanaman cabai yang diharapkan berfungsi sebagai tanaman inang. Pengamatan dilakukan terhadap persentase eksplan membentuk embrio primer, persentase embrio primer membentuk embrio somatik sekunder, jumlah embrio somatik yang berkecambah, dan persentase plantlet/ tanaman yang tumbuh. Data dianalisis menggunakan uji Duncan pada p < 0,05. HASIL DAN PEMBAHASAN Bahan tanaman (buah) yang digunakan sebagai eksplan berasal dari Yogyakarta untuk buah masak (mature) dan dari NTT untuk buah masak dan muda (immature). Embrio zigotik dari kedua tingkat kemasakan buah tersebut diisolasi dan ditanam pada media perlakuan untuk induksi embrio somatik. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa setelah berumur 8 minggu, eksplan yang berasal dari Yogyakarta tidak menunjukkan adanya pertumbuhan pada semua media perlakuan yang dicobakan. Hal ini diduga karena bahan tanaman (biji) sudah tidak mempunyai viabilitas lagi akibat disimpan terlalu lama. Eksplan dari buah yang berasal dari NTT memberikan respons yang berbeda dalam membentuk embrio somatik pada beberapa perlakuan media yang diberikan. Secara umum, media dasar MS yang diperkaya dengan BAP menunjukkan respons yang lebih baik dalam membentuk embrio somatik dibandingkan dengan MS + thidiazuron, baik untuk eksplan embrio muda maupun embrio dewasa. Persentase pembentukan embrio somatik dari eksplan embrio zigotik muda pada media MS + BAP 2 mg/l menunjukkan nilai tertinggi (71,4%), sedangkan untuk eksplan embrio zigotik dewasa, nilai tertinggi (63,6%) diperoleh pada media MS + BAP 1 mg/l (Tabel 1). Keberhasilan pembentukan embrio somatik sekunder dari embrio zigotik dewasa dengan perlakuan MS + IAA 0; 0,5; dan 1 mg/l tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (Tabel 2). Namun demikian, media MS tanpa IAA menunjukkan persentase keberhasilan paling tinggi (87,5%) diikuti MS + IAA 0,5 mg/l sebesar 73%. Pada embrio somatik muda, keberhasilan regenerasi eksplan membentuk embrio somatik sekunder pada media MS + IAA 1 mg/l hanya 15% dan tidak berbeda nyata dengan MS + IAA 0,5 mg/l sekitar
Tabel 1. Pengaruh zat pengatur tumbuh dalam media dasar MS terhadap pembentukan embrio somatik dari eksplan embrio zigotik muda dan dewasa pada cendana setelah 8 minggu. Table 1. Effect of plant growth regulators in MS basal medium on somatic embryo formation from mature and immature zygotic embryo explant of sandalwood after 8 weeks. Persentase embrio somatik Zat pengatur tumbuh Percentage of somatic embryo Plant growth regulator (mg/l) Dewasa/Mature Muda/Immature MS MS MS MS MS MS
+ + + + + +
BAP 0,5 BAP 1 BAP 2 thidiazuron 0,5 thidiazuron 1 thidiazuron 2
33,3a 63,6a 23,1a 16,7a 18,7a 33,3a
46,1a 53,8a 71,4a 15,0b 14,8b 18,7b
Keterangan/Notes: Angka pada satu kolom yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji Duncan. Numbers at each column followed by the same letter are not significantly different at 5% Duncan test.
Tabel 2. Pengaruh media terhadap persentase embrio primer yang membentuk embrio sekunder dari eksplan embrio zigotik muda dan dewasa cendana umur 7 minggu. Table 2. Effect of media on percentage of primary embryos to form secondary embryos from mature and immature zygotic embryo explant of sandalwood after 7 weeks. Media Media MS (kontrol) MS + IAA 0,5 mg/l MS + IAA 1 mg/l
Persentase embrio somatik Percentage of somatic embryo Dewasa/Mature
Muda/Immature
87,5a 73a 52a
71,25a 43,25ab 15b
Keterangan/Notes: Angka pada satu kolom yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji Duncan. Numbers at each column followed by the same letters are not significantly different at 5% Duncan test.
43,25%. Persentase embrio somatik sekunder tertinggi (71,25%) diperoleh dari media MS tanpa penambahan IAA. Media MS tanpa zat pengatur tumbuh IAA tampaknya selalu memberikan hasil yang lebih tinggi, baik untuk embrio zigotik muda maupun dewasa. Embrio zigotik terdiri atas jaringan yang sangat muda dan bersifat embrionik sehingga tanpa zat pengatur tumbuh pun tetap dapat beregenerasi. Kandungan garam-garam anorganik yang tinggi dalam media MS serta adanya vitamin dan sukrosa cukup memadai untuk mendukung proses pembentukan dan perkembangan sel-sel somatik dari embrio zigotik menjadi
4 embrio somatik. Rai dan McComb (2002) pada tanaman cendana dengan menggunakan embrio zigotik dewasa berhasil pula meregenerasikan eksplan membentuk embrio somatik dewasa. Namun, Becwor et al. (1987) pada tanaman Picea abis dan Lelu et al. (1994) pada tanaman hibrida antara Larix dan Leptoeuropaca menggunakan embrio zigotik muda. Berdasarkan hasil penelitian ini, penggunaan kedua jenis eksplan, yaitu embrio zigotik muda dan dewasa memberikan persentase keberhasilan yang cukup tinggi, berturutturut 71,25% dan 87,5%. Dengan demikian, perbanyakan tanaman cendana melalui pembentukan embrio somatik memberikan kemudahan dalam pengangkutan biji sebagai sumber eksplan mengingat produksi biji pada cendana relatif lama. Gambar 1 menunjukkan embrio zigotik yang digunakan sebagai eksplan serta pembentukan dan perkembangan embrio somatik tanaman cendana. Setelah disubkultur pada media perkecambahan, embrio soma-
Deden Sukmadjaja
tik dewasa ternyata tidak langsung membentuk benih somatik, tetapi bermultiplikasi membentuk tunas (Tabel 3; Gambar 2). Multiplikasi paling tinggi (92%) terdapat pada media MS1/2 + GA 3 namun tidak berbeda dengan perlakuan lainnya kecuali MS. Dengan demikian media MS yang konsentrasi makronya dicairkan sampai setengahnya lebih baik dibandingkan media MS konsentrasi penuh. Pengenceran media MS sebagai media perkecambahan dilakukan pula oleh Rai dan McComb (2002) pada tanaman cendana, serta Rout et al. (1995) pada tanaman Acacia catechu. Tremblay (1990) melakukan pengenceran garam makro media Schenk dan Hilderbrandt sampai seperempatnya. Menurut Rout et al. (1995), pengenceran media pada tahap perkecambahan dimaksudkan untuk menghindari pengkalusan kembali pada dasar tunas atau struktur embrio somatik. Kelompok tunas pada media perkecambahan menunjukkan bentuk yang normal dan tidak normal.
Gambar 1. Pembentukan embrio somatik dari eksplan embrio zigotik pada tanaman cendana; a = embrio zigotik sebagai eksplan, b = tahap globular, c = tahap bentuk hati, d = tahap torpil (torpedo), e dan f = konfigurasi kotiledon embrio somatik. Fig. 1. Development of somatic embryos from zygotic embryo explant on sandalwood; a = zygotic embryo explant, b = globular stage, c = heart shaped stage, d = torpil stage, e and f = configurations of somatic embryos cotyledon.
5
Embriogenesis somatik langsung pada tanaman cendana Tabel 3. Pengaruh komposisi media perkecambahan terhadap rata-rata persentase biakan berorganogenesis serta jumlah tunas normal dan abnormal dari embrio somatik pada cendana. Table 3. Effect of germinating media compositions on percentage of cultured organogenesis, number of normal and abnormal shoots from somatic embryos of sandalwood. Media Media MS1/2 MS1/2 + GA 3 0,5 mg/l MS1/2 + GA 3 1 mg/l MS MS + GA 3 0,5 mg/l MS + GA 3 1 mg/l
Persentase biakan berorganogenesis Percentage of cultured organogenesis
Jumlah tunas normal Number of normal shoots
Persentase tunas abnormal Percentage of abnormal shoots
4 8 ab 92 a 88 a 0b 60 a 4 8 ab
2,8bc 5,8ab 9,2a 0c 1,6bc 2,4bc
0 9,4 0 0 33,3 25
Keterangan/Notes: Angka pada satu kolom yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji Duncan. Numbers at each column followed by the same letters are not significantly different at 5% Duncan test.
Gambar 2. Pertumbuhan embrio somatik tanaman cendana pada media pendewasaan (a) dan perkecambahan (b). Fig. 2. Somatic embryo growth of sandalwood on maturing media (a) and germination media (b).
Jumlah tunas normal paling banyak (rata-rata 9,2 tunas) diperoleh dari media MS1/2 + GA3 1 mg/l namun tidak berbeda nyata dengan MS1/2 + GA 3 0,5 mg/l sebanyak 5,8 tunas, sedangkan tunas abnormal yang paling banyak berasal dari media MS + GA3 0,5 mg/l. Tampaknya media MS konsentrasi penuh selalu memberikan hasil yang lebih rendah dibandingkan media MS yang diencerkan setengahnya. Hal ini kemungkinan disebabkan pengaruh nutrisi yang terlalu kaya sehingga mengakibatkan induksi pertumbuhan yang abnormal. Pada media perkecambahan/pendewasaan, embrio somatik dewasa tidak dapat membentuk akar seperti yang diharapkan. Untuk itu pada tahap selanjutnya tunas disubkultur pada media perakaran (Tabel 4; Gambar 3). Sampai umur 3 minggu, akar hanya tumbuh pada beberapa biakan yang diberi perlakuan IBA 5 mg/ l dengan rata-rata jumlah akar 0,6. Perlakuan IBA 5 dan 10 mg/l tidak menunjukkan perbedaan pada jumlah dan tinggi tunas yang dihasilkan.
Tabel 4. Rata-rata tinggi serta jumlah tunas dan akar dari eksplan kecambah embrio somatik cendana pada media induksi perakaran umur 4 minggu. Table 4. Average of height and number of shoots and roots from somatic embryo explant of sandalwood on root induction media after 4 weeks. Media Media MS + IBA 5 mg/l MS + IBA 10 mg/l
Jumlah tunas Tinggi tunas Jumlah akar Shoot Shoot Root number height n u m b er 3,75 4,25
1,72 1,55
0,6 0,0
KESIMPULAN Pembentukan embrio somatik tanaman cendana secara langsung dengan eksplan embrio zigotik dewasa mencapai 63,6% dengan menggunakan media MS + BAP 1 mg/l dan untuk eksplan embrio zigotik muda 71,4% pada media MS + BAP 2 mg/l. Pada media MS,
6
Deden Sukmadjaja
Gambar 3. Pertumbuhan biakan cendana pada media induksi perakaran. Fig. 3. Growth of sandalwood culture on root induction media.
persentase embrio somatik sekunder yang dihasilkan relatif sama antara embrio zigotik muda dan dewasa. Pada media perkecambahan, embrio somatik yang paling banyak bermultiplikasi membentuk tunas terdapat pada media MS1/2 + GA3 0,5 mg/l. Umumnya media MS yang diencerkan setengahnya menghasilkan jumlah tunas yang lebih tinggi dibandingkan media MS penuh untuk setiap penambahan GA 3. Media MS + GA3 0,5 dan 1 mg/l menghasilkan tunas abnormal paling tinggi, yaitu masing-masing 33,3% dan 25%. Induksi perakaran belum memberikan hasil yang memuaskan, meskipun akar dapat terbentuk pada media MS + IBA 5 mg/l dengan jumlah yang masih sedikit. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Direktur SEAMEO-BIOTROP yang telah memberikan dukungan dana terhadap penelitian ini melalui Bagian Proyek Pengembangan Biologi Tropika Indonesia Bogor TA 2003. DAFTAR PUSTAKA Anil, V.S. and K.S. Rao. 2000. Calcium-mediated signaling during sandalwood somatic embryogenesis. Role for exogenous calcium as second messenger. Plant Physiol. 123: 1301-1312. Attree, S.M., S. Budimirand, and L.C. Fawke. 1990. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured shoots and cotyledons of seedlings from stored seeds of black and white spruce (Picea mavina and P. glauca). Can. J. Bot. 68: 30-34.
Becwor, M.R., T.L. Noland, and S.R. Wann. 1987. Somatic embryo development and regeneration from embryogenic Norway spruce callus. Tappi J. 70: 155-160. Das, S., S. Ray, S. Dey, and S. Dasgupta. 2001. Optimation of sucrose, inorganic nitrogen and absisic acid levels for Santalum album L. somatic embryo production in suspension culture. Process Biochem. 37(1): 51-56. Husni, A., I. Mariska, dan M. Kosmiatin. 1997. Embriogenesis somatik tanaman lada liar. Makalah Seminar Mingguan Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor, 5 September 1997. Hutami, S., I. Mariska, R. Purnamaningsih, M. Herman, D. Damayanti, and T.I. Utami. 2002. Regeneration of papaya (Carica papaya) through somatic embryogenesis. Proc. the 2nd Indonesian Biotechnology Conference. Indonesian Biotechnology Consortium, Jakarta. Kamil, H. and M.I.J. Umboh. 1990. Root induction of Santalum album by using IBA and NAA. Proc. The Symposium on Biotechnology for Forest Tree Improvement. Bogor, 21-23 March 1990. Biotrop Special Publication No. 49. Lelu, M.A., K.K. Klimaszewska, C. Jones, C. Ward, P. Van Aderkas, and P.J. Charest. 1993. A laboratory guide to somatic embryogenesis in spruce and larch. Information Report. Petawawa National Forestry Institute, Canada. Lelu, M.A., K.K. Klimaszewska, C. Jones, C. Ward, P. Van Aderkas, and P.J. Charest. 1994. An improved method for somatic plantlet production of hybrid larch (Lorix x Leptoeuropaea) Part 2 Control of germination and plantlet development. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36: 117-127. Mariska, I. 1996. Embriogenesis somatik tanaman kehutanan. Prosiding Kursus Bioteknologi, 4-9 November 1996. Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. Serpong. 13 hlm. Mariska, I., S. Hutami, M. Kosmiatin, dan W.H. Adil. 2001a. Regenerasi massa sel embriogenik kedelai setelah diseleksi pada kondisi Al berbeda dan pH rendah. Berita Puslitbangtan No. 20: 1-3. Mariska, I., D. Sopandie, S. Hutami, E. Syamsudin, dan M. Kosmiatin. 2001b. Peningkatan ketahanan terhadap Al pada tanaman kedelai melalui kultur in vitro. Laporan Riset Unggulan Terpadu VIII. Kantor Menristek dan LIPI, Jakarta. Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15: 473-497. Musakabe, H. 2000. Peluang dan kendala cendana dalam perekonomian Propinsi Nusa Tenggara Timur. Kumpulan makalah Seminar Nasional Kajian terhadap Tanaman Cendana (Santalum album L.) sebagai Komoditi Utama Perekonomian Propinsi Nusa Tenggara Timur (NTT) Menuju Otonomisasi. Pemda NTT dan LIPI, Jakarta. 26 Juni 2000. Rai, V.R. and J. McComb. 2002. Direct somatic embryogenesis from mature embryos of sandalwood. Plant Cell Tissue and Organ Culture 69: 65-70. Rout, G.R., S. Samantaray, and P. Das. 1995. Somatic embryogenesis and plant regeneration from callus culture of Acacia catechu a multipurpose leguminous tree. Plant Cell Tissue and Organ Culture 42: 283-285. Tremblay, F.M. 1990. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from embryos isolated from stored seeds of Picea glauca. Can. J. Bot. 68: 236-242. Williams, E.G. and Maheswara. 1986. Somatic embryogenesis factors influencing coordinated behaviour of cells as on embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-462.
