Digitaliseren FISH en automatisch scoren

Digitaliseren FISH en automatisch scoren Dr. Elise van der Logt

Conflict of interest Elise van der Logt:

Company:

Meeting travel expenses reimbursed

Menarini Benelux

Klinisch moleculair bioloog in de pathologie (in opleiding) Universitair Medisch Centrum Groningen / Moleculaire Pathologie

Supervised digital FISH HER2 validation: Unrestricted grant covering reagents

Pathologie Friesland / Moleculaire Diagnostiek

Menarini Benelux

(no influence on study design, analysis, conclusions and writing of the paper)

WMDP

8e

Moleculaire dag

31 januari 2014

• Digitaliseren FISH: hoe werkt dat?

Digitaliseren FISH: hoe werkt dat?

• Welke systemen en analyse modulen zijn er?

- opstelling: o.a. digitale microscoop

I N D E L

• Niet meer handmatig scoren maar automatisch: hoe werkt dat?

- instellen live beeld - Z-stack acquisitie

I N

- scannen coupe

• Digitalisering FISH HER2neu: validatie studie

- foto’s FISH coupes

G

• Vergelijken handmatige en automatische procedure

1

D

Opstelling (I)

D

I

I

Opstelling (II)

G

G

- gemotoriseerde microscoop:

I

I

T

T

A

A

L

L

I

I

S

S

E

E

R

R

E

E

verplaatsing tafel switchen objectieven / filters

- filters voor FISH acquisitie (b.v. DAPI / groen / rood)

N

lichtbron

digitale microscoop

aansturing / analyse

-objectieven (4x / 10x / 20x / 40x / 100x)

- monochroom camera

N

D

Instellen live beeld (I):

I

Scan FISH coupe + inzoomen:

I

- DAPI / groen / rood filter (exposure)

G

geselecteerd gebied patholoog

G

D

I

I

T A L

T

pre-scan (4x)

live beeld (100x)

A L

I

I

S

S

E

E

R

R

E

E

N

N

2

D

Instellen live beeld (II):

D

I

- Vlaggen zetten

I

foto betreffende gebied

G

G

I

Z-stack acquisitie Combinatie beelden van verschillende niveaus

overlay

I

klein / groot gebied

T A L

T A L

I

I

S

S

E

E

R

R

E

E

N

N

Z-stack acquisitie: spots op verschillende niveaus zichtbaar

D

Z-stack

overlay

Z-stack acquisitie: 3 filters DAPI (live)

overlay = foto

bewerking achtergrond

I

9 8 7 6 5 4 3 2 1 13 12 11 0 G I

1 foto

T A

SpecGreen

L I S E R

SpecOrange

overlay 3 filters

E N

3

D

Foto

D

geselecteerd gebied

Archiveren foto’s (overlay) FISH coupes

I

I

HER2neu probe

G

G

I

geen amplificatie

I

groot T

T

klein

A

A

L

L

I

I

S

S

E

E

R

R

E

E

N

N

amplificatie

D

Archiveren foto’s (overlay) FISH coupes

D

Archiveren foto’s (overlay) FISH coupes

I

Translocatie probe

I

Translocatie probe

G

ALK break apart

G I

c-myc break apart

c-myc/IgH fusie breuk

geen fusie

I

T

T

A

A

L

L

I

I

S

S

E

E

R

R

E

E

N

N

ALK break apart breuk

geen breuk polysomie

4

D

Archiveren foto’s: training beoordelen FISH patronen

D

Archiveren foto’s: vastleggen kwaliteitscontrole

I

Normaal weefsel translocatie probe

I

Normaal weefsel translocatie probe

breuk patronen

G

= breuk

A

I

G

bepalen afkapwaarden

A

= breuk

I

cmyc b.a. N = 100 kernen

T

T

# positieve kernen

A

A

Analist:

1

2

L

L

T37K

6

13

7

T4C

8

7

6

T24E

6

5

8

T39B

11 10

6

T36O

4

6

I

I

S

S

3

E

E

R

R

afkapwaarde = 14,7%

E

E

(= gemiddelde + 3x SD)

N

N

Digitaliseren FISH coupes Welke systemen en analyse modulen zijn er?

4

foto’s

D-Sight fluo 5 platform (5 coupes of 200 coupe-lader) S

- digitaliseren FISH coupes - automatisch scoren FISH

foto’s

Y

-Ariol capture & analysis (1 coupe of 200 coupe-lader)

S

-GSL scanning platform (10 coupes of 120 coupe-lader)

T E M

Pannoramic scanners -250 Flash (250 coupes) -Scan (150 coupes) -Midi (12 coupes)

E N

BioView Duet-3 scanner (50 coupe-lader) GenASIs capture & analysis (9 coupes of 81 coupe-lader)

5

A

Automatisch scoren

N

D-Sight analyse module

A

Niet meer handmatig scoren maar automatisch: hoe werkt dat?

(amplificatie HER2/neu / translocatie ALK FISH) L Y

-Ariol (klinisch gevalideerd HER2/neu FISH Pathvysion / translocatie ISH) -CytoVision software (amplifcatie / translocatie ISH)

S E

-

D-Sight FISH analyse modules

-

automatische nucleus selectie

-

spot detectie

-

spot telling

-

checken / correctie

FISHQuant module (amplificatie / translocatie ISH) -Duet-Solo workstation (HER2/neu FISH / translocatie ISH)

M

-Accord (1 coupe; HER2/neu FISH / translocatie ISH) -Legato (microscoop uitbreidingsset)

O D

FISHView / Spotscan

U

(HER2/neu FISH / ALK FISH / UroVysion)

L E

TissueStudio software (ISH)

Klinische validatie door laboratoria

Overzicht D-Sight FISH HER2 module foto’s

D-Sight FISH analyse module: foto’s / objectieven B

hulpknoppen

hulpknoppen

E O O

objectieven analyse

foto’s (overlay)

R D E L E N

foto klein of groot vergroting selectie gebied

6

D-Sight FISH analyse module: hulpknoppen

D-Sight FISH analyse module: score + uitslag

B

B

preview

E

switchen filters

+ nucleus

O

E

HER2neu

ALK

O

O R

barcode

aan/uit nucleus selectie

- nucleus

opslaan

analyse per nucleus

+/- spot

D

O R D

E

foto opslaan

galerij nucleus selectie

E

Z-stack

E

L

L

E N

N

Automatische nucleus selectie + spot detectie Automatische nucleus selectie + spot detectie B

HER2neu

E O O R D E L E N

geen amplificatie

amplificatie

7

Checken analyse Checken en correctie: nucleus selectie B E O O R D E L E N

100x objectief 2x inscannen: ≥ 2 foto’s 2 onafhankelijke beoordelaars + of - nucleus herberekening ratio

A N

D-Sight FISH HER2 module B

A

E

L

Automatische nucleus selectie + spot detectie: FISH ALK breuk

O

Y

O

S

R

E

D

spot telling en uitslag M O D

L

score richtlijn:

E

ratio HER2 en CEP17 signalen

U L

ratio ≥2.2

E

N

amplified

E

8

Checken analyse: translocatie FISH

A N

B

A

E O

D-Sight FISH ALK module

L

afstand tussen signalen bepalend

O

Y S

R

E

spot telling en uitslag

D E

M

L E N

O

score richtlijn:

D

positief = ALK-breuk

U L E

Moleculaire diagnostiek: T O

• Validatie moleculaire diagnostiek: FISH HER2neu mamma tumoren

E

L

P A S

• Digitaliseren HOVON pilot: FISH translocaties lymfomen

D

• automatische FISH kleuring (Bond, Leica)

A T

I

G

FISH HER2neu mamma tumoren volledig automatisch procedure

I

S

N

V A

• digitale analyse/automatisch scoren (D-Sight, Menarini)

I

• In samenwerking UMCG: standaardiseren scoren FISH translocaties

E

• bepalen concordantie -handmatig FISH kleuring + score (Abbott) -automatisch FISH kleuring + score (Leica + D-Sight)

9

Digitale analyse m.b.v. D-Sight platform

Leica FISH HER2 kleuring V A

V

- Bond systeem

A

overnacht kleuring

L

L

I

I

D

D

A

A

T

T

I E

- Leica HER2 FISH kit

I

probes overeenkomstig handmatige PathVysion kit Abbott HER2 probe:

E

SpectrumOrange (17q11.2-q12)

CEP17 probe: SpectrumGreen (centromeer regio; 17p11.1-q11.1)

1) digitale foto’s

Paraffine coupes (4 µm) invasieve mamma tumoren • technische validatie M

tissue microarray

• klinische validatie

resecties / biopten

n = 328(2,3) n = 100(1)

Technische validatie: automatisch vs handmatig n = 328 (IHC-/+/++/+++) 98.8% (κ = 0.94)

Concordant

U

T

2

1

L T

O D

E S

E

H

R

2) gesuperviseerde automatische analyse

A

3

T

E

Klinische validatie: automatisch vs handmatig n = 50 (IHC-/+/++/+++) Concordant 100%

E

Vergelijking - Leica FISH automatisch

N

n = 50 (IHC++) Concordant 93.8% (κ = 0.88)

- Abbott FISH/DAKO IHC handmatig

10

D I

Automatische FISH HER2 procedure: kleuring + analyse

A G

D I A

Sinds oktober 2012 – heden

N

N O

Rondzendingen:

S

I

S

SKML

oktober 2012 / oktober 2013

NordiQC

oktober 2012 / februari 2013 / oktober 2013

E K

D I

100% score consensus

D

autorisatie patholoog

I

A

A G

N

N

O

≥ 2 analisten

moleculaire uitslag

uitslag T-nummer

O

S

(bijlage LMS)

(M-nummer LMS; conclusie T-nummer)

(rubriek moleculaire PA en MD conclusie)

S

I

T

T-nummer:autorisatie autorisatieKMBP patholoog M-nummer:

pre-scan

pre-screen coupe

100x

≥ 2 foto’s per analist

I

G

T

20x

beoordeling

autorisatie KMBP

autorisatie patholoog

K

FISH HER2 analyse: beoordelen autorisatie KMBP

10x

T

E

beoordeling

4x

G

O

T

FISH HER2 analyse: digitaliseren en beoordelen

I

E

E

K

K

Conclusie • Standaardisatie van de HER2neu bepaling kan worden bereikt met het toevoegen van gesuperviseerde automatische digitale analyse aan automatisch kleuren. • De combinatie van het Leica FISH systeem met het D-Sight digitale scan platform is een geschikte methode voor het bepalen van de HER2neu status in de klinische praktijk voor patiënten met borstkanker.

11

S

Vergelijken handmatige en automatische procedure

Ter overweging:

A

Handmatig

Automatisch

+++ +

+ ++ (archief)

+ (deel coupe)

++ (totale coupe)

++

+++

Analisten

≥2

≥2

I

Herbeoordeling

lastig

optimaal (zelfde gebied)

N

Fouten

++

+

G

Standaardisatie

+

+++

M E

Tijd

V

Kleuring Scoren

N

Kosten Kleuring

A

Digitaliseren

T T

• FISH is lastige bepaling; complexe beoordeling (meerdere analisten) • Standaardiseren d.m.v. digitaliseren helpt; -herbeoordeling mogelijk op hetzelfde gebied -uitslag integreren in laboratorium management systeem • Kwaliteit borgen: -validatie nieuwe methoden -deelname rondzendingen

Bedankt voor uw aandacht! Pathologie Friesland, Leeuwarden

Universitair Medisch Centrum Groningen

Moleculaire Diagnostiek

Pathologie, Moleculair Diagnostiek

Robby Kibbelaar (MD patholoog)

Ed Schuuring (KMBP)

Ed Schuuring (KMBP)

MD team

MD team

Bert van der Vegt (patholoog)

- Deborah Kuperus - Jan van Setten - Jelle Conradie Marius van den Heuvel (patholoog)

Isala klinieken, Zwolle Pathologie Evan Boers (patholoog)

Menarini Benelux

[email protected] [email protected]

12