SAMENVATTING In dit proefschriftwordt een verslaggegevenvan een aantalexperimenten welke gedaanworden om te onderzoekenof er enzymhistochemische en/of andere morfologische criteria zqn te vinden die in relatie staan met hydroxylerings-activiteit.Hierdoor zou meer inzicht in hydroxylerings-reacties te verkrijgenzijn. In hoofdstuk 2 wordt een literatuuroverzichtgegevenover hydroxyleringsreacties. De gegevenskunnen als volgt samengevatworden. Er bestaan tenminste twee hydroxyleringssystemen. Het ene is voornamelijkgelokalireticulum (lichte microsomen).Het zet seerdin het gladdeendoplasmatisch vooral type I substratenom. Het wordt gestimuleerddoor phenobarbitalen niet door methylcholanthreen. Voor dit systeembestaateen duidelijkverschil in activiteit tussenmannetjesen vrouwtjesratten. In vitro loopt de activiteit van het systeemsnel terug. Het tweedesysteemis vooral gelokaliseerd in het reticulum (zwaremicrosomen).Het zet vooral type II ruwe endoplasmatisch substratenom. Het wordt gestimuleerddoor phenobarbitalen methylcholanthreen. Voor dit systeem bestaat geen groot verschil in activiteit tussen mannetjesen vrouwtjes ratten. In vitro loopt de activiteit van het systeem langzamerterug dan voor type I substraten.Een aantalsubstratenkan door beide systemenomgezetworden, aÍhankelijk van het substraatbeter door het ene dan door het anderesysteem. In hoofdstuk 3 worden de gebruiktematerialenen methodenbeschreven. In hoofdstuk 4 wordt de ontwikkeling van het hydroxyleringssysteembij mannetjes en vrouwtjes ratten op verschillendemomenten gedurendede post-nataleperiode beschreven.Er werd een evenredigverband gevonden tussende histochemischbepaaldeactiviteit van de NADPH nitro-BT reductase, thiolazijnzuur esterase,naftol-AS-D esteraseenerzijdsen de biochemisch bepaaldehydroxylerings-activiteitanderzijds.De thiolazijnzuur esterasebleek gelokaliseerdte zijn op membranenvan het glad en ruw endoplasmatisch reticulum. Dit zou een aanwijzingkunnen zijn voor een verband tussen esterase-en hydroxylerings-activiteit,aangeziende laatstebiochemischgevonafkomstigvan dezemembraden wordt in lichte en zware microsoomfracties nen. Het voorkornenvan de esteraseen NADPH nitro-BT reductaseactiviteit in het centralegedeeltevan de leverlobuluszou er op kunnen wijzen, dat centralecellen in tegenstellingtot de perifereeen meer op het detoxificeringsproces gerichte metabole functie hebben. Het verschil in hydroxyleringsactiviteit tussenvolwassenmannetjesen vrouwtjesratten lijkt eerderveroorzaakt te zljn door het grotere aantal actieve centrale cellenbij de manneldke
76
dieren,dan door een grotereactiviteitper cel. In hoofdstuk 5 wordt de invloedvan phenobarbitalen methylcholanthreen In genoemdhoofdstukwerdvooralde nadrukgelegdop de verschilbeschreven. lendebeinvloedingdoordeze tweestoffenophet hydroxyleringssysteem. Pheno(een barbital stimuleertzowel de inductievan de ethylmorfine-demethylering type I substraat)als de anilinehydroxylering(een type II substraat),terwijl (een type Il methylcholanthrèenalleen de aniline-hydroxylerings-activiteit phenobarbital stimuleringde substraat)doet toenemen.We zagen, dat na histochemischbepaalde activiteit van de NADPH nitro-BT reductaseen naftol-AS-Desterasetoenam.Deze vermeerdering wasopnieuwevenredigaan de toenemingvan de biochemischbepaaldehydroxylerings-activiteit.Een soortgelijkresultaat zagenwe na phenobarbitalbehandelingwat betreft de dehydrogenase histochemischbepaaldeactiviteit van de glucose-6-fosfaat en Te oordelennaar de NADPH nitro-BT reduciso-citroenzuurdehydrogenase. na 3 dagenphenobarbital tasewordt de toenamein hydroxylerings-activiteit per cel, terwijl na 5 veroorzaakt door vermeerdering in activiteit behandeling dagenook het aantalcellenmet hogeactiviteit toeneemt.Na het stoppenvan de behandelingzagenwe een afnemingvan de hydroxylerings-activiteit die veroorzaaktwerd door een verminderingvan het aantal actievecellen in de leverlobulus. Ook na de methylcholanthreenbehandelingwerd een evenredigerelatie gevonden tussen de histochem,schbepaalde activiteit van de NADPH Tevens nitro-BT reductaseen biochemischbepaaldehydroxylerings-activiteit. vonden we een relatie tussen de histochemischbepaaldeactiviteit van de glucose-6-fosfaat dehydrogenase en hydroxylerings-activiteit. In tegenstelling tot het resultaatna de phenobarbitalbehandelingvertoondende histochemisch bepaalde activiteit van de naftol-As-D esteraseen iso-citroenzuureen dergelijkverband niet. Een ander verschil met de resuldehydrogenase taten na de phenobarbitalbehandelingwas, dat na de methylcholanthreen behandelingeerst het aantal actieve cellen toenam, terwijl pas later een verhogingvan de activiteit per cel waargenomenwerd. Dit werd beoordeeld aan de hand van de NADPH nitro-BT reductase.Naar aanleidingvan het na phenobarbitalen methylverschillendegedragvan de esterase-activiteit gedaan,dat de naftol-As-D wordt de behandeling suggestie cholanthreen esterasegebruikt zov kunnen worden om histochemischonderscheidte makentussende activiteitvan type I en type II substraathydroxyleringen.De kunnen en de isocitroenzuurdehydrogenase glucose-6-fosfaat dehydrogenase van respectievelijk voor de inductie waarschijnlijkgebruikt worden als maat type II en type I substraathydroxyleringen.Het is waarschijnlijk,dat het
77
door deze dehydrogenasen gevormdeNADPH gebruikt wordt voor de tipidsynthesevan de gei'nduceerde mernbranenen niet voor de eigenlijkehydroxyleringen. Zowel na de methylcholanthreen alsna de phenobarbitalbehandeling werd een afnamegevondenvan het mitochondrialevolume per levercel.Op grond van ultrastructurelewaarnemingenlijkt deze afname eerderveroorzaaktte zijn door het kleiner worden van de mitochondriëndan door een vermindering van het aantal. Hypertrofie van het glad endoplasmatische reticulum na phenobarbital behandelingis vooral focaal in bepaaldecellen aanwezig,terwijl de toename van glad endoplasmatisch reticulumna methylcholanthreen behandeling meer diffuus in bepaaldecellengevondenwordt. Combinatievan dezegegevens met de histochemische resultatenbetreffendede NADPH nitro-BT reductasedeed ons het volgendeveronderstellen. Phenobarbitalstimuleert de vorming van een reedsin de cel voorkomendhydroxylerings-systeem en endoplasmatisch reticulum, wat in eerste instantie leidt tot een toename van deze grootheden per cel en pas in latere fase tot een vermeerderingvan het aantal actieve cellen in de leverlobulus.Methylcholanthreendaarentegenzal de vorming van eennieuw hydroxylerings-systeem en endoplasmatisch reticulum initiëren, wat in het begin zal leiden tot een diffuse toename van beide groothedenin eengroot aantalcellenen paslater tot een duidelijk vermeerdering per cel. Ín hoofdstuk 6 werd de invloedvan 24 uur vastenop de leveronderzocht. Er werd daarbij een constanteverhoudingvan kernvolumeen cytoplasmavolume gevonden. Evenals bij het in de vorige hoofdstukken vermelde onderzoek werd opnieuw een verband gevonden tussen de biochemisch bepaaldehydroxylerings-activiteitper gram lever enerzijdsen de histochemisch bepaaldeactiviteit van de NADPH nitro-BT reductaseen naftol-As-D esteraseactiviteit anderzijds.De toenamevan de hydroxyleringsactiviteit per gram lever na het vastenwordt verooÍzaaktdoor een toenamevan het aantal cellen, terwijl de activiteit per cel slechtsweinig verandert.Het hepatocytvolume nam onder invloedvan vastenaf van t 8000 u3 naart 5700 u3. Deze afnameging gepaardmet een daling van t 30% van het RNA, fosfolipide-en eiwitgehalteper cel. De invloed van 24 uur vastenop niet behandeldeen met phenobarbitalbehandeldedierenwasgelijk. In hoofdstuk 7 wordt een slotdiscussiegegeven.Het hoofdstuk kan als volgt samengevat worden. De niet steedsoptredendeevenredigerelatie tussen de hydroxyleringsactiviteit en het volume van het glad endoplasmatischreticulum werd
78
verklaarddoor twee veronderstellingen. Ten eerstedat tijdensde inductievan hydroxyleringssystemenmembranen worden gesynthetiseerd,waarin di' hydroxyleringssystemen worden ingebouwd.Deze membranenzoudenlang zamerafgebrokenworden dan de hydroxyleringssysternen. Ten tweededat er twee soorten endoplasmatisch reticulumbestaan:membranendie relatiefveei en membranen die relatief weinig hydroxyleringssystemen bevatten. Met behulp van gecombineerdeletronenmicroscopisch, autoradiografisch en rnorfometrisch onderzoek, kan de relatie tussenendoplasmatisch reticulurn en hydroxyleringsactiviteitnader onderzochtworden. Onder experirnentele omstandigheden,als beschrevenin dit proefschrift, zouden dieren radioactieve precursorstoegediendkunnen worden voor de synthesevan respectievelijk ((6-amino-levulinezuur) het hydroxyleringssysteern en het endoplasmatisch reticulum(aminozurenof fosfolipiden). De resultatenvan ons onderzoekzouden erop kunnen wijzen dat de NADH nitro-BT reductasevoorai in kleine en barnsteenzuurdehydrogenase meer in grote mitochondriën voorkomt. Verder onderzoeknaar de relatie tussen structuur en activiteit van het mitochondrion zal zich niet mogen beperken tot bestuderingvan het totale volurne, rnaar zal ook aandacht moetenbestedenaan volume en oppervlakvan mitochondrialecristae,matrix en buitenmembraan.In het kader van het onderzoekover hydroxyleringsreactieslijkt een dergelijkonderzoekvan belang,omdat naastveranderingin hydroxyleringsactiviteitvan cellen ook andere metabole processenzullen veranderen. De vraag werd gesteld in hoeverre de verkregen resultaten toegepast kunnen worden brj de bestuderingvan leverpunctatenvan de mens. Het probleem bij histologischonderzoek van leverpunctatenis, dat niet onder gestandaardiseerde omstandighedengewerkt kan worden. De verhoudingin activiteit tussenperifereen centralecellenzal waarschijnlijkmeer informatie gevendan de bepalingvan de absoluteactiviteitper cel. Eerstdoor onderzoek van een groot aantalleverpunctatenzal een indruk verkregenkunnenworden over de "normale" activiteit bij mensen.Gebruik van de NADPH nitro-BT reductasezou in combinatiemet de klinische en functioneel-biochemische gegevensvan belang kunnen zijn voor de hydroxyleringsactiviteitin een bepaaldgeval.Hierbij werd gedachtaanpatientenmet hepatitis,levercirrhose, medicamenteuze leverbeschadiging, steroidcholestase en zwangerschapcholestase,om enkelevoorbeelden te noemen. onderzoek, Concluderendwerd vermeld dat, evenalsbij dierexperimenteel de beste kans biedt op een combinatievan methodischebenaderingswijzen Een dergelijk het verkrijgenvan meer inzicht in de hydroxylerings-processen.
79
onderzoeklijkt zeer gewenst,geziende toenemendemate waarin de mensin aanrakingkomt met stoffen die door de levermoetenworden afgebroken. Aan het slot werdennog enkeleopmerkingengemaaktover de toepassings' mogelijkhedenvan de verkregenresultatenop hydroxyleringenin steroidproducerendecellen.Het lijkt aannemelijkdat de NADPH nitro-BT reductase de niet-specifieke gebruikt kan worden als maarvoor hydroxylerings-reacties, esterasenals indicator voor microsomaleprocessenen de glucose-6-fosfaat dehydrogenaseen iso-citroenzuuldehydrogenaseals aanduiding voor de cholesterol-svnthese.
80
