DIAGNOSTIKA ALERGIÍ NA MOLEKULÁRNÍ ÚROVNI Mgr. Manuela Trojáčková Ph.D. a kolektiv Laboratoř klinické imunologie a alergologie Laboratoře AGEL a.s., Nový Jičín
ALERGIE – epidemie 21. století Alergická onemocnění (astma, alergická rýma, atopický exém, potravinová alergie) řadíme mezi civilizační choroby, jejichž výskyt v populaci stále narůstá. • asi 20 % světové populace trpí alergickým onemocněním • výskyt alergických onemocnění má stále rostoucí trend → multifaktoriální charakter (genetika + prostředí) → důležitou roli hrají změny životního stylu
Papuánci
Monitoring alergických onemocnění u dětí v ČR Systém monitorování zdravotního stavu obyvatelstva ČR (SZÚ) 18 měst asi 7000 dětí (5, 9, 13, 17 let)
za 10 let stoupl v ČR počet dětských alergiků na dvojnásobek
V ČR některou z mnoha alergií trpí přibližně 2,5 milionu obyvatel
Není alergie jako ALERGIE Jsem alergický na to, jak si neustále stěžuješ na svou alergii …
Co je to ALERGIE? Alergie je přehnaná, nepřiměřená reakce imunitního systém na látky, se kterými se běžně setkáváme v našem prostředí. Alergická reakce probíhá ve dvou fázích. 1. fáze - SENZIBILIZACE
2. fáze - ALERGICKÁ REAKCE
ALERGENY
inhalační – pyly,
prach, plísně, roztoči, látky produkované domácími zvířaty
potravinové
– ořechy, mořské plody a ryby, mléko, vejce, ovoce, zelenina, obiloviny
kontaktní
– kovy, kosmetika, latex, produkty zvířat a rostlin
léky hmyzí jed
Příznaky a projevy alergie Závisí na vnímavosti jedince (atopie), množství daného alergenu a na cestě jeho vstupu do těla. Projevy - na sliznicích dýchacího a gastrointestinální traktu - na kůži - systémové (anafylaxe)
Jak lze alergii diagnostikovat? 1. podrobná anamnéza a klinická vyšetření 2. in vivo testy – expoziční testy prick testy
3. in vitro testy – laboratorní diagnostika
LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA 1. Krevní obraz – eosinofily, bazofily 2. ↑ celkové IgE 3. alergen alergen specifické a IgG4 specifickéIgE IgE(sIgE) (sIgE) 4. funkční testy - bazofily aktivační test, CAST ELISA, test uvolnění histaminu
5. ↑ ECP, ↑ sérová tryptáza
Alergen specifické IgE (sIgE)
Stanovení alergen specifického IgE Jednoanalytové metody: umožňují stanovit jeden analyt = alergen (resp. směs alergenů)
Multiplexové metody: umožňují stanovit až několik desítek analytů (sIgE) v jedné reakční nádobce nebo reakční ploše
Mikročipy: umožňují stanovit několik stovek analytů (sIgE) v jedné reakční nádobce nebo reakční ploše současně
FEIA - vysokoafinitní fluoroenzymoimunoanalýza
Alergen navázán na pevný nosič
LEIA - chemiluminiscenční enzymová imunoanalýza
Alergen v kapalné fázi
ELISA - enzymová imunoanalýza s alergenem na papírovéme nosiči (disku)
OPTIGEN – multiplexová metoda
UNIVERZÁLNÍ panel POTRAVINOVÝ panel ATOPY panel INHALAČNÍpanel
MIKROČIPY - ImmunoCAP ISAC (Imunosolid Solid-phase Allergen Chip)
ALERGENOVÉ EXTRAKTY
směs druhově specifických i zkříženě reagujících komponent
• získány extrakcí z přírodního biologického materiálu (pyl, srst, potraviny) • variabilita zdroje = velmi obtížná standardizace • vedle hlavních alergenů přítomnost vedlejších alergenů + dalších nealergenních látek (proteiny, glykoprotieny, sacharidy) • problém se stabilitou (enzymy)
ALERGENOVÉ KOMPONENTY • nativní, purifikované (izolovány z
druhově specifické X zkříženě reagující
přírodních zdrojů) nebo produkovány rekombinantně • přesně definované = snadná standardizace • precizní charakteristika na molekulární a imunochemické úrovni • možnost přesnější diagnostiky a léčby
Alergenové extrakty x alergenové komponenty EXTRAKT = nelze rozlišit mezi primární senzibilizací a imunologickou zkříženou reaktivitou
KOMPONENTY = umožňují přesnou identifikaci zdroje, který je skutečně zodpovědný za alergickou reakci
Zkříženě reagující komponenty = molekuly s podobnou strukturou (50-70% homologie) přítomné v celé řadě často i velmi odlišných druhů
Orálně alergický syndrom - pyl-potravina až 80% pacientů s alergií na pyl břízy má také potravinovou alergii na ovoce, ořechy a zeleninu = orálně alergický syndrom (OAS) Bet v 1 (PR-10) homologní s Mal d1 (jablko), Pru p 1 (broskev) Cor a 1 (lísk.ořech Ara h 8 (arašíd) Dau c 1 (mrkev) Api g 1 (celer) Act d 8 (kiwi)
NÁZVOSLOVÍ alergenových komponent alergenová databáze on-line na www.allergen.org
Alergenové komponenty jsou pojmenovány podle jejich latinského rodového a druhového jména, přidělená čísla rozlišují různé alergeny téhož druhu a odpovídají pořadí, v jakém byly identifikovány.
bojínek luční - Phleum pretense (Phl p 1, Phl p 2) bříza bradavičnatá - Betulla verucosa (Bet v 1, Bet v 2) včela medonosná Apis mellifera (Api m 1, Api m 2)
KLASIFIKACE alergenových komponent Jednotlivé alergenové komponenty lze seskupovat na základě jejich struktury
PROTEINOVÉ RODINY • Profiliny • PR-10 (Bet v 1 homologní) • LTP • Zásobní proteiny • Polcalciny • Sérové albuminy • Tropomyoziny podobná struktura a funkce = podobné biochemické vlastnosti IgE protilátky proti proteinům ze stejné rodiny zkříženě reagují
Využití rekombinanantích alergenů v diagnostice 1. rozlišení zkřížené reaktivity od skutečné dvojí senzibilizace 2. výběr vhodných pacientů a specifických alergenů pro alergenovou imunoterapii 3. odhad rizika systémové reakce
Rozlišení zkřížené reaktivity od skutečné dvojí senzibilizace přesnější identifikace vyvolávajícího zdroje = umožní určit, co je primárním zdrojem alergické reakce a co je pouze důsledkem zkřížené reaktivity Alergie na jed blanokřídlého hmyzu • až 60 % pacientů testovaných extrakty - i1 (včela), i3 (vosa) vykazuje pozitivitu na oba jedy • skutečná dvojí pozitivita asi u 6-24% pacientů • ve většině případů z důvodu zkřížené reaktivity
Rozlišení zkřížené reaktivity od skutečné dvojí senzibilizace
Včela medonosná (Apis mellifera) Api m 1
Hlavní alergen specifický pro včelu
Api m 2
hyaluronidáza
fosfolipáza A2
sekvenční shoda mezi Api m2 a Ves v 2 je 52% = příčina zkřížené reaktivity
Vosa obecná (Vespula vulgaris) Ves v 1
Hlavní alergen specifický pro vosu
Ves v 2
hyaluronidáza
Ves V 5
specifický pro vosu
fosfolipáza A1
Alergenové extrakty Včela (i1) + Vosa (i3) +
Včela (Api m1) - negat Vosa (Ves v1, Ves v5) +
alergenové komponenty specifické pro vosu Včela medonosná (Apis mellifera) Api m 1
fosfolipáza A2
Hlavní alergen specifický pro včelu
Api m 2
hyaluronidáza
Vosa obecná (Vespula vulgaris) Ves v 1
Hlavní alergen specifický pro vosu
Ves v 2
hyaluronidáza
Ves V 5
specifický pro vosu
fosfolipáza A1
POLYSENZIBILIZACE
Rozlišení skutečné senzibilizace od zkřížené reaktivity.
Alergen-specifická imunoterapie (AIT) jediná léčba, která řeší příčinu alergických onemocnění podávání vysokých dávek alergenů s cílem navodit toleranci vůči alergenům – injekční, kapková, tabletová imunoterapie dochází ke vzniku alergen-specifických regulačních T-lymfocytů pro účinnou imunoterapii je klíčové přesně identifikovat druhově specifické komponenty, které jsou zodpovědné za klinické projevy alergie
Alergen-specifická imunoterapie (AIT) Bříza bradavičnata (Betula verucosa) Symptomy alergie na pyl břízy extrakt břízy t3 T3 (+)
T3 (-)
Molekulární alergeny Bet v 1 (PR-10), Bet v 2 (profiln) Bet v 1 (+) Bet v 2 (-) IMUNOTERAPIE
Bet v 1 (-) Bet v 2 (+)
Bojínek luční (Phleum pratense) Phl p 1 Phl p 2 Phl p 4 Phl p 5b Phl p 7 Phl p 12
skuteční alergie na pyl trav = vhodnost imunoterapie pylem trav zkřížená reakce
90 % pacientů senzibilizovaných na pyl trav má protilátky proti Phl p 1 a/nebo Phl p 5b.
Odhad rizika systémové reakce Alergeny odolné vůči teplu a trávení (LTP, zásobní proteiny) s větší pravděpodobností způsobí těžké klinické reakce, zatímco tepelně a vůči trávení labilní molekuly (profiliny, PR-10) způsobí pravděpodobně mírnější, obvykle jen lokální reakce anebo budou zcela tolerovány
Alergická reakce na arašídy
Podzemnice olejná Arachis hypogea
Alergická reakce na arašídy
Stanovení sIgE proti alergenovým komponentám LKIA Nový Jičín singleplex (ImmunoCAP) x multiplex (ISAC)
Jednotky: kU/l Metoda: FEIA (Phadia) Odběr: venózní srážlivá krev, sérum Doba odezvy: do měsíce
Výsledek vyšetření
Třída pozitivity
Hladina specifického IgE
0 - 0,34
0
negativní
0,35 - 0,69
1
nízká
0,70 - 3,49
2
střední
3,50 – 17.49
3
vysoká
17,50 – 52,49
4
velmi vysoká
52,5 – 99,99
5
velmi vysoká
≥ 100
6
velmi vysoká
ŽÁDANKA
na vyšetření sIgE proti alergenovým komponentám
Děkuji za pozornost
