11/9/2007
Topik 10.2
METODE EVALUASI KOMPONEN NON GIZI: Evaluasi in vivo aktivitas anti kanker, imunomodulator/anti alergi,hormonal
Fransiska R Zakaria
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR - 2007 PPt e-Learning ENBP
Distance Education Program Evaluation on Biological Value of Food (EBVF) Course Sub topik 2: Secara in vivo aktivitas anti kanker, imunomodulator/ anti alergi, hormonal
Kanker dimulai dari kerusakan gen dalam sel, Kerusakan gen yang lebih lanjut menghasilkan sel kanker ganas (malignan). Penyebab utama kerusakan gen sel adalah senyawa kimia, virus, dan sinar UV. WHO th 2002 menyatakan bahwa kanker adalah penyakit yang dapat dicegah
• Evaluasi aktivitas anti kanker, imunomodulator/anti alergi dan hormonal pangan dapat dilakukan secara in vivo, yaitu melalui pemberian makan pada manusia maupun pada hewan percobaan. • Merupakan sebagian dari aktivitas atau fungsi pangan yang dapat dievaluasi. • Fungsi-fungsi lain meliputi: anti arterosklerosis, anti depresi, anti obesitas, anti diabetes, dsbnya • Beberapa contoh diharapkan dapat menjadi dasar untuk pengembangan atau penerapan evaluasi fungsi-fungsi pangan lainnya • Uji in vivo sering dapat digabung dengan uji in vitro.. Gabungan evaluasi in vivo dan in vitro akan memberikan hasil yanglebih akurat meskipun biaya dari segi waktu, tenaga dan uang.
1
11/9/2007
Evaluasi ativitas anti kanker • secara in vivo pada hewan percobaan dapat dilakukan dengan cara pemberian senyawa pemicu pertumbuhan kanker (mengsimulasi proses inisiasi) • Cara lain: mentransplantasi sel kanker pada hewan percobaan (mensimulasi kemampuan untuk tumbuh dan kondisi metastase). Hanya dapat dilakukan pada hewan penerima yang sejenis dan mempunyai sifat genetika yang sama dengan hewan penghasil sel kanker (donor sel kanker) • Berikut ini adalah contoh evaluasi aktivitas anti kanker gel cincau hijau. • Hewan percobaan :mencit C3H, yaitu mencit yang gennya sama dengan gen mencit yang menjadi sumber sel kanker. • Setiap kelompok : 5 ekor. • Satu kelompok diberi makan diet normal (kel kontrol) • Untuk kelompok perlakuan: diet mendapat tambahan minuman bahan uji. • Semua kelompok mencit diberi pemicu kanker berupa suspensi sel kanker yang ditransplantasi dibawah kulit perut (subkutanus) dengan cara penyuntikkan. • Percobaan dilakukan selama satu bulan. Pada akhir percobaan, limfa mencit diambil sebagai sumber sel-sel imun (darah mencit sangat sedikit) • Sel imun diuji secara in vitro dengan metode kultur sel secara • Hati mencit diambil untuk dianalisa klinis aktivitas berbagai jenis enzim antioxidan dan kapasitas antioxidan. • Pada contoh metode evaluasi ini uji in vivo digabung dengan uji in vitro.
C3H Mice n=5
Fed with powder for 4-wk (12.1g/kg)
Tumor transplantation Tumor latent period (days) Killed , Day 57
Tumor volume (Moving pen, Tajima)
Tumor Healthy and necrotic
Liver
Spleen
Spleen cells Tumor cells Resistance to H2O2 (MTT)
T cell (Rosette)
In vitro cytotoxic toward tumor cell
2
11/9/2007
LIVER
SOD (Adenochrome asay Misra. H.P.
GSH-PX (Paglia and Valentine, 1967
CATALASE Colometri, Sinha 1972
MDA (TBA, Buege and Aust)
Total Glutathion DTNB, Ellman. 1982
Sel darah putih (leucocyte) merupakan bagian dari sistim imun, sel-sel ini menghancurkan dan mengeluarkan: sel-sel tubuh yang aus atau rusak, sel-sel mikroba patogen dan makromolekul asing. Contoh penelitian imunomodulator dan hormon klik responden manusia Untuk contoh penelitian antikanker secara in vivo pada hewan klik evaluasiantikanker2 . Pada evaluasi ini, mencit sebagai hewan percobaan diberi makan diet normal..Untuk kelompok perlakuan disamping mendapat diet yang sama dengan diet kelompok kontrol mendapat tambahan minuman bahan uji. Mencit diberi pemicu kanker berupa sel kanker yang ditransplantasi pada tubuh mencit. Pada kedua penelitian ini uji in vivo digabung dengan uji in vitro. Setelah pemberian makan pada responden sampel darah manusia diambil dan digunakan sebagai sumber sel-sel imun untuk uji aktivitas proliferasi sel, yang merupakan uji aktivitas imunomodulator. Pada hewan percobaan, limfa hewan (dalam penelitian ini, mencit) yang diambil sebagai sumber sel-sel imun karena darah mencit sangat sedikit dan tidak cukup sebagai sumber sel untuk analisis. Pada manusia, sumber sel imun yang aman dan banyak adalah darah. 1ml darah manusia mengandung 9 × 106 leukocytes (1.0% of blood volume) : Untuk satu analisis secara micro culture diperlukan hanya 105 sel. Uji in vitro tsb merupakan uji fungsi sel. ika fungsi sel lebih baik dari kontrol maka dapat disimpulkan bahwa zat/bahan uji bersifat imunomodulator.
Peralatan laboratorium kultur sel hewan terdiri dari : 1. Laminar hood (lemari steril) 2. Inkubator CO2 Semua pekerjaan dilaksanakan dalam laminar hood secara aseptis Kontaminasi oleh mikroorganisme (bakteri, cendawan, virus) akan menggagalkan percobaan
3
11/9/2007
Pelaksanaan Intervensi Uji in vivo dengan manusia sebagai subjek. Evaluasi nilai biologis bubuk bebas lemak kakao terhadap fungsi sel imun (limfosit) Waktu pelaksanaan sesuai rancangan, mis 25 hari, setiap hari jam 07.00 pagi Kelompok kakao, mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak, sedangkan kelompok kontrol hanya mengkonsumsi minuman yang terdiri atas susu skim + gula Semua responden disediakan sarapan pagi dan juga makan malam Dilakukan pengukuran status gizi berdasarkan Body Mass Index (BMI), dua kali sebelum dan sesudah pelaksanaan intervansi
Pembuatan Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Untuk intervensi (pemberian minum). Semua minuman harus standar (takaran sama) untuk semua responden
Persiapan Responden Mahasiswa IPB, umur 22 – 27 Tahun, perempuan, tandatangan inform consent, sehat
Kelompok kakao 9 orang
Kelompok kontrol 9 orang
4
11/9/2007
Pengambilan Darah
Tempat : Klinik Farfa Darmaga Sebelum dan sesudah intervensi Pengambilan darah sebagai sampeluntuk isolasi sel-sel limfosit yang akan diuji aktivitasnya. Makin tinggi aktivitas makin baik nilai biologis bubuk kakao Tabung vakutener yg telah terisi sampel darah
Isolasi Sel Limfosit Lapisan limfosit
Sentrifuse
Dilewatkan dalam ficoll
Sentrifus
Cincin limfosit
Suspensi sel limfosit + Serum AB 10%
Analisa Kadar Glutation Sel Limfosit Suspensi sel limfosit yang telah dilisis Glutation (GSH) adalah antioksidan endogenus (dihasilkan dalam tubuh) dan merupakan tripeptida yang terdiri dari asam-asam amino glisin, glutamat dan sistein (.gamma.-LGlutamyl-Lcysteinylglycine). Kadar GSH yang tinggi dalamsel limfosit menunjukkan kapasitas antioksidan sel yang tinggi
+ Asam sulfosalisilat, disentrifus pada 2500 rpm Supernatan (100 μl) Dimasukkan ke lempeng mikro 96 sumur Ditambah larutan PBS, pereaksi Ellman Diukur Absorbansi,λ = 415 nm, kadar glutation sel limfosit ditentukan berdasarkan kurva standar
5
11/9/2007
Analisa Aktivitas Antiradikal Bebas Sel Limfosit Dengan Metode DPPH Suspensi sel limfosit yang telah lisis + metanol pa dan DPPH, dikocok, disimpan dalam ruang gelap Diukur dengan spektrofotometer, λ = 517 nm Antiradikal = Bebas
X 100%
Kontrol : campuran larutan DPPH dan metanol
Uji Respon Proliferasi Limfosit dengan Metode MTT: uji in vitro, sehingga merupakan gabungan evaluasi in vivo dan in vitro ditambah mitogen Con A, mitogen LPS, kontrol ditambahkan RPMI
+ garam MTT, inkubasi 4 jam, + HCl dlm isopropanol
Di inkubasi, 3 x 24 jam
Dihitung aktivitas proliferasi (Nilai IS) IS = Makin tinggi abrosbansi makin tinggi aktivitas proliferasi makin baik fungsi sel limfosit, makin baik nilai imunomodulator bubukkkao
Uji Ketahanan Sel Limfosit Terhadap Oksidator: uji in vitro, sehingga merupakan gabungan evaluasi in vivo dan in vitro Inkubasi 1 jam
H2O2 Formalin Erithrosin RPMI
Aktivitas Proliferasi
Aktivitas Proliferasi dengan Metode MTT
IS =
6
11/9/2007
Terima Kasih
7
