Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
311
Laboratory Science
Identiication Insertion/Deletion 6bp of 3’-Untranslated Region Thymidylate Synthase Gene in Orbital Region Basal Cell Carcinoma Lady Kavotiner, Ibrahim, Irsan Saleh Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Sriwijaya University Mohammad Hoesin Hospital, Palembang, South Sumatera
ABSTRACT Background: Basal cell carcinoma (BCC) is the most common eyelid malignancy tumor. The risk factor for development of BCC related to environtmental factor especially prolonged sun exposure and individual factor. One of the internal risk factor contributes to BCC development is genetic instability including defects in folic acid synthesis or DNA synthesis. Enzyme participates in this process is 3’-untranslated region Thymidylate synthase gene (UTR TS). This study is to identify the insertion or deletion of 6bp of 3’-UTR TS gene in orbital region BCC. Methods: This study was a descriptive explorative study with case series which involved 13 orbital region basal cell carcinoma (BCC). The diagnosis was based on histological examination of the tumor. The frequencies of insertion/deletion 6bp of 3’-UTR TS gene were assessed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses using Dra I as restriction enzyme. Results: Thirteen patients consist of 9 males (69%) and 4 females (31%). Majority of subjects have history of sun exposure. The most common type of BCC is nodular type (80%). There was two subject with recurrent case. Identiication result of insertion/deletion 6bp 3’-UTR TS gene found heterozigot mutant -6bp/+6bp in 7 samples (54%) at 152bp band and 158 bp band, homozigot mutant -6bp/-6bp in 6 samples (46%) at 152bp band. Conclusion: The results of this study were 7 samples (54%) are heterozigot mutant -6bp/+6bp and 6 sample (46%) are homozigot mutant -6bp/-6bp. Karsinoma sel basal (KSB) adalah tumor ganas terbanyak pada palpebra, sekitar 90% dari semua keganasan pada palpebra. KSB sering berlokasi di palpebra inferior (50-60%), dekat dengan kantus media (25-30%), palpebra superior (15%) dan kantus lateral (5%). Faktor resiko utama KSB adalah paparan sinar matahari khususnya UVB, kulit terang, bermata biru, rambut pirang dan usia. KSB berasal dari lapisan basal epidermis atau sel basaloid pluripotent pada adneksa dan banyak terlihat pada daerah tubuh yang sering
terpapar sinar matahari dan daerah berambut. Metastasis pada KSB jarang terjadi, namun destruksi lokal dan kerusakan jaringan sering terjadi. KSB biasanya terlihat datar, meninggi, kemerahan, translusen, mengkilat dengan ukuran tumor dapat bervariasi. Frekuensi KSB meningkat pada negara berkembang, sekitar 1.000.000 kasus baru didiagnosa setiap tahunnya dan lebih dari 10.000 kematian (2% dari seluruh kematian akibat kanker).1-4
312
KSB dapat terjadi pada semua jenis kulit namun pada populasi kulit gelap lebih jarang terjadi dibanding dengan kulit terang. Pada populasi kulit putih, KSB terdapat sekitar 95%dari seluruh kanker kulit. KSB pada palpebra biasanya terjadi pada dekade 6 sampai 8, tetapi 15% bisa terjadi pada umur yang lebih muda. Pada penelitian yang dilakukan di RSMH Palembang, ditemukan peningkatan insidensi KSB sebanyak 0,30% sejak tahun 2000. Jenis kelamin pada laki-laki lebih sering 3080% dibandingkan perempuan, kemungkinan disebabkan faktor pekerjaan yang lebih banyak terkena paparan sinar matahari. Lebih dari 96% individu yang terkena berusia diatas 40 tahun.5-7 Faktor resiko interna yang dianggap berperan dalam berkembangnya karsinoma sel basal adalah adanya faktor genetik yaitu gen yang berlokasi pada kromosom 9q22.3-q31 yang meliputi mutasi dalam repair gen, defek dalam sintesis asam folat atau sintesis DNA. Mutasi akan menyebabkan beberapa faktor genetik yang mengubah sintesis folat yang rendah dalam serum, hal ini mendukung bahwa fotolisis juga terjadi secara in vivo. Diketahui juga bahwa metabolisme folat terlibat dalam sintesis dan repair DNA. Beberapa penelitian mendapatkan bahwa folat dapat mencegah berkembangnya beberapa kanker, peran ini disebabkan karena fungsinya dalam sintesis timidilat dan purin de novo dan produksi 5-adenosilmetionin, suatu donor grup metil.7-11 Salah satu enzim yang berperan sebagai ko-faktor pada metabolism asam folat dan sintesis DNA yaitu Thymidylate synthase (TS atau TYMS). TS berlokasi pada rantai pendek kromosom 18 yaitu suatu enzim yang bertanggung jawab pada transformasi dari dUMP (deoxyuridine monophosphate) menjadi dTMP (thymidine monophosphate), fungsi protein, dan kapasitas repair kerusakan DNA yang akan merangsang efek karsinogenik. Terdapat dua polimorisme TS yaitu TS 5’untranslated enhanced region (TSER) dan insersi/delesi 6bp 3’-untranslated region TS (TS 3’-UTR) yang dianggap mempunyai hubungan dengan terjadinya resiko kanker. Insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS terdapat pada posisi 1494 yang berperan pada proses translasi dan
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
stabilitas mRNA. Bagian yang tidak terubah pada TS diketahui berperan penting pada transkripsi dan translokasi.12-18 Mutasi pada gen TS mengakibatkan akumulasi homocystein, penurunan sintesis methionin dan penurunan kadar TS mengakibatkan defek pada sintesis dTMP. Hal ini menghasilkan delesi single atau double strand melalui misincorporation urasil. Thymidylate sebagai nukleotida yang berperan pada sintesis dan repair DNA yang seharusnya ada untuk meminimalisir misincorporation urasil menjadi DNA, pemecahan kromosom.18-26 Pada penelitian sebelumnya memperlihatkan hubungan polimorisme 3’-UTR gen TS dengan resiko terjadinya KSB, yaitu oleh Sang Yoon Kang, bahwa genotip 6bp/6 bp pada insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS berperan pada peningkatan resiko terjadinya KSB. Pada penelitin oleh Xiangjun Zhai ditemukan bahwa insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS berkontribusi terhadap terjadinya resiko kanker.17,24,25 Penelitian ini untuk mencari frekuensi insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada penderita KSB regio orbita belum pernah diteliti sebelumnya, mengingat bahwa KSB lebih beresiko pada area yang banyak terpapar sinar matahari (sebagai faktor resiko utama) yaitu head dan neck, oleh karena itu peneliti tertarik melakukan penelitian untuk mencari insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada KSB regio orbita di Rumah Sakit Dr. Mohammad Hoesin Palembang. MATERIAL DAN METODE Penelitian ini merupakan suatu case study yang bersifat observasional eksploratif untuk menganalisis pengaruh insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada karsinoma sel basal regio orbita. Penelitian dilakukan di Poliklinik Subdivisi Tumor Departemen Mata, Poliklinik IK Kulit dan Kelamin FK UNSRI/Rumah Sakit Dr. Mohammad Hoesin (RSMH), Poliklinik Mata rumah sakit jejaring dan Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi FK UNSRI/ RSMH dalam kurun waktu pelaksanaan dimulai bulan Juni 2013 sampai dengan November 2013. Populasi target adalah semua penduduk Sumatera Selatan. Populasi terjangkau pada penelitian ini adalah semua penderita karsinoma
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
sel basal regio orbita yang berobat ke Rumah Sakit Dr. Mohammad Hoesin Palembang. Sampel pada penelitian ini diambil dari penelitian tandem yang sudah diambil darahnya dan sampel baru yang diambil sampai November 2013. Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah: 1) semua penderita BCC regio orbita yang berobat ke Poliklinik Mata Subdivisi Tumor RSMH dalam kurun waktu Juni 2013 sampai 2013 yang dikonirmasi dengan pemeriksaan biopsi atau histopatologi; 2) penderita dengan pekerjaan yang mempunyai risiko terpapar sinar matahari 6-8 jam/hari atau dari jam 10 pagi sampai jam 4 sore, seperti petani, buruh, nelayan, dan sebagainya; 3) seluruh penduduk etnik asli Indonesia yang berasal dari suku-suku asli, seperti Melayu, Sunda, Jawa, Dayak, dan lainnya; dan 4) bersedia mengikuti penelitian yang dinyatakan dengan menandatangani informed consent. Pengukuran frekuensi insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada penelitian ini menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)-RFLP (restriction fragment length polymorphism). Alat PCR yang digunakan pada penelitian ini adalah DNA thermal Cycler merk I-cycle produksi Biorad® USA. Kit elektro-foresis yang digunakan adalah merk Power Pac Basic produksi Biorad® dan alat sentrifuse merk Biofuge Prim. Untuk deteksi produk PCR dan RFLP digunakan alat elektroforesis gel agarose (4%) selama 60 menit serta alat visualisasi hasil PCR yaitu Geldoc produksi Biorad® dengan ultraviolet pada panjang gelombang 300 nm yang dihubungkan dengan kamera digital dan perangkat komputer yag berisi software Quantity One. Cara untuk mendeteksinya yaitu dengan isolasi DNA dengan menggunakan enzim Dra I pada suhu 370C selama satu jam dan kemudian fragmen dipisahkan dengan elektroforesis pada 4% gel agarosa, yang dibatasi oleh Primer 1 (sense) 5’-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3’ dan Primer 2 (antisense) 5’-CAGATAAGTGGCAGTACAGA-3’. Frekuensi insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS yang terdapat pada PCR, akan dihitung dan di catat berapa ins/del yang muncul yaitu: 1) genotip +6bp/+6bp, yang berada pada 158 bp; 2) genotip -6bp/-6bp, yang berada pada 152 bp; dan 3) genotip +6bp/-6bp, yang berada pada 158 bp dan 152 bp.
313
Dilakukan pengambilan sampel darah untuk ekstraksi DNA. Sampel darah diambil melalui punksi vena antecubiti sebanyak 2 cc. Sebelum punksi dilakukan tindakan antiseptik dengan alkohol pad. Sampel darah ini dimasukkan ke tabung reaksi yang mengandung Ethylen Diamine Tetra Acetic (EDTA) lalu disimpan pada suhu maksimal 4o sampai pemeriksaan Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan. Ekstraksi (isolasi) DNA dari darah vena subjek yang telah dicampur dengan antikoagulan ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) dilakukan dengan metode Chelex-100. Ekstraksi dilakukan sesuai dengan prosedur standar. Isolate yang diperoleh disimpan dalam kulkas pendingin dengan suhu -200 hingga -700C. Data responden dicatat dalam suatu formulir data yang telah disiapkan, kemudian disusun dalam suatu tabel induk dengan menggunakan program Microsoft Word for Windows. Data dianalisis secara univariat berupa frekuensi insersi/delesi 6bp 3’UTR gen TS pada karsinoma sel basal regio orbita. HASIL Pada penelitian ini didapatkan subjek penelitian sebanyak 13 orang, jenis kelamin pria adalah sebanyak 9 orang (69%) dan wanita sebanyak 4 orang (31%). Sedangkan usia penderita karsinoma sel basal regio orbita adalah berkisar antara usia 47 hingga 77 tahun. Tingkat pendidikan pada penelitian ini adalah SD yaitu sebanyak 9 orang, sedangkan SMP 3 orang dan SMA 1 orang. Distribusi pekerjaan pada subjek penelitian ini yaitu petani 8 orang (62%), buruh 2 orang (15%) dan pedagang 1 orang (8%), dan ibu rumah tangga 2 orang (2%) yang mempunyai riwayat pekerjaan dahulu sebagai petani. Tidak ada penderita yang memiliki riwayat penyakit yang sama dalam keluarga. Semua penderita memiliki riwayat terpapar sinar matahari yang lama, Pada penelitian lain didapatkan tidak ada perbedaan yang bermakna terjadinya KSB pada jenis kelamin laki-laki dan perempuan. Tipe karsinoma sel basal yang tersering pada penelitian ini adalah tipe nodular yaitu sebanyak 84%, sedangkan sisanya adalah tipe campuran iniltrating-nodular (8%) dan adenoid kistik (8%). Terdapat dua kasus pada penelitian ini yang mengalami rekurensi dan tidak satupun
314
penderita mengalami pembesaran kelenjar getah bening. Pada penelitian ini mengidentiikasi insersi/ delesi 6bp 3’-UTR gen TS dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Adanya produk PCR dideteksi menggunakan elektroforesis, diwarnai dengan ethium bromide dan pita DNA divisualisasi dengan transluminator ultraviolet. Hasil PCR (amplicon) gen TS pada 152 bp dan 158 bp (gambar 1). Untuk mendeteksi insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS digunakan enzim retriksi Dra I. Pada penelitian ini didapatkan visualisasi base pair seperti yang terlihat pada gambar 2.
Gambar 1. Hasil PCR gen TS pada 152 bp dan 158 bp
Gambar 2. Hasil visualisasi produk PCR-RFLP pada penderita setelah direstriksi menggunakan enzim Dra I. Genotip -6p/+6bp terdapat pada pita 158 bp dan 152 bp, sedangkan -6bp/-6bp terdapat pada pita 152 bp.
DISKUSI Penelitian ini merupakan suatu penelitian case study dengan rancangan deskriptif eksploratif yang digunakan untuk menganalisis pengaruh
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada penderita karsinoma basal sel regio orbita. Populasi pada penelitian ini adalah semua penderita KSB yang berobat ke Poliklinik Mata Subdivisi Tumor RSMH Palembang pada kurun waktu bulan JuniNovember 2013. Dari hasil penelitian didapatkan sebaran usia penderita yang berjumlah 13 orang adalah 47 hingga 77 tahun, dengan usia rata-rata adalah 62 tahun. Penelitian Gloster mendapatkan bahwa KSB paling sering mengenai populasi yang berusia di atas 50 tahun dengan riwayat paparan sinar matahari yang lama. Claudia Moteoiu dkk melaporkan bahwa KSB biasanya terjadi pada usia 51-70 tahun (49,92%).3,7 Tipe karsinoma sel basal yang terbanyak yang diderita adalah tipe nodular yaitu sebesar 85%, sisanya adalah tipe campuran. Penelitian Vantuchoya mengenai tipe histologi KSB, didapatkan bahwa tipe nodular adalah yang paling sering dan paling beresiko rendah terjadinya metastasis. Dari tiga belas kasus pada penelitian ini, dua kasus merupakan kasus rekuren dengan hasil histopatologi tipe nodular. KSB regio orbita mempunyai resiko terjadi rekurensi lebih besar dari KSB pada kulit bagian lain. Faktor resiko KSB regio orbita untuk terjadinya rekurensi adalah tumor rekuren sebelumnya, lesi besar >2cm, lokasi di kantus medial atau palpebra inferior, keterlibatan segmen palpebra yang multipel, riwayat terapi radiasi sebelumnya, riwayat eksisi yang inkomplit, kondisi imunosupresi pasien sendiri, usia kurang dari 35 tahun, invasi ke tarsus dan perluasan ke orbita, hidung, sinus atau sistem syaraf.6,11 Dari penelitian ini tidak didapatkan adanya pembesaran kelenjar getah bening maupun metastase KSB pada semua subjek penelitan. KSB tumbuh secara lambat, jarang bermetastase namun menginvasi jaringan. Dilaporkan bahwa karsinoma sel basal metastase berkisar antara 0,028% hingga 0,5%. Metastase biasanya pada kelenjar getah bening, paru-paru, dan tulang namun hal ini jarang terjadi.13 Pada penelitian ini, dilakukan analisis PCR gen TS dan didapatkan bahwa jumlah genotip heterozigot tipe mutan adalah sebesar 7 sampel (54%), dan 6 genotip homozigot (46%). Hal ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian sebelumnya.17 Pada penelitian Sang Yoon Kang dkk, didapatkan bahwa visualisasi 3’-UTR gen
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
TS pada 100 pasien KSB di Korea ditemukan genotip homozigot dengan adjusted odds ratio (AOR) sebanyak 7,539 dan genotip heterozigot dengan AOR: 2,821. Dari penelitian case-control yang dilakukan oleh Sang Yoon Kang dkk yang mengikutsertakan 100 pasien KSB. Didapatkan bahwa pada kelompok kasus homozigot 6bp/6bp (AOR: 7,539) dan heterozigot 0bp/6bp (AOR: 2,821) dan kombinasi mutasi heterozigot dan homozigot 0bp/6bp+6bp/6bp (AOR: 3,079). Didapatkan bahwa terdapat hubungan antara insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS terhadap resiko terjadinya karsinoma sel basal.17,21
315
9.
10. 11.
12.
13.
14.
KESIMPULAN Telah dilakukan analisis PCR gen TS pada 13 pasien KSB dan pada hasil akhir elektroforesis didapatkan hasil yang tidak jauh berbeda dengan penelitian sebelumnya yaitu terdapatnya insersi/ delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada pasien KSB, yaitu genotip heterozigot tipe mutan (-6bp/+6bp) sebanyak 7 sampel dan homozigot tipe mutan (-6bp/-6bp) sebanyak 6 sampel. Keterbatasan penelitian ini adalah jumlah sampel yang masih minim, tidak adanya kelompok kontrol untuk membandingkan perbedaan dengan individu normal sehingga belum dapat ditarik suatu kesimpulan adanya peranan insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen Thymidylate synthase terhadap kejadian karsinoma sel basal regio orbita. REFERENSI 1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
G. Sánchez,J. Nova,F. de la Hoz. Risk Factors for Basal Cell Carcinoma: A Study From the National Dermatology Center of Colombia. Actas Dermosiiliogr. 2012;103:294-300. Lear W, Dahlke E, Murray CA.Basal cell carcinoma: review of epidemiology, pathogenesis, and associated risk factors. J Cutan Med Surg. 11(1):19-30, 2007. Yahya YF dkk, Proil Karsinoma Sel Basal Primer di RSUP M. Hoesin Palembang, (MDVI 2011; 38/2:78-83). Kim GK, Rossa JQ, Bellew S, Skin Cancer in Asia, Clinical aesthetic dermatology, 2009, 2, 39-42. Suriadiredja AS, Editorial Epidemiologi Kanker Kulit, Departemen IK Kulit dan Kelamin FKUI/RSUPN dr.Cipto Mangunkusumo. Claudia Mateoui, Claudia-Valentina Georgescu. Cristina Simionescu. Histopathological study of Basal Cell Carcinoma. Current Health Science Journal. 2009. Vol.35, No.2. Cheng-Hsien Chang, Sheng-Ming Chang, Yu-Hung Lai, Jason Huang. Eyelid Tumors in Southern Taiwan: A 5-year Survey from a Medical University. Kaohsiung J Med Sci 2003;19:549–54 N.R.Telfer, G.B.Colver andP.W.Bowers. Guidelines for the management of basal cell carcinoma. British Journal of Dermatology 1999; 141: 415-423.
15. 16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24. 25.
26.
Lacour JP. Carcinogenesis of basal cell carcinomas:genetics and molecular mechansisms. Br J Dermatol 2002;146(Suppl 61):17–19. Vantuchoya Y, Curik R, histological types of basal cell carcinoma, Scripta Medica, 79 (5-6), 261-270, 2006. Leffel DJ, Headington JT, Wong DS et al. Aggressive growth basal cell carcinoma in young adult. Arch Drmatol 1991, 127: 1663-1667. Joshua M. Berlin, MD, Michael R. Warner, MD, and Philip L. Bailin, MD. Metastatic Basal Cell Carcinoma Presenting as Unilateral Axillary Lymphadenopathy: Report of a Case and Review of the Literature. Dermatol Surg 2002;28:1082–1084. Recep Bedir, Rustu Kose, Hasan gucer, Nursel dilek. Nodular Basal Cell Carcinoma in non exposed skin: a case report. Egyptian Dermatology online journal. Vol.7 No. 2:9, Desember 2011 Tilli CML, Steensel MAM, et al in Molecular aetiology and pathogenesis of basal cell carcinoma British Journal of dermatology, 152, 1108 – 1124,2005 Kim Y I. cancer Epidemiology Biomarker. Prev. 2004, 13,511-519 Sang Yoon Kang, sung Jun Lee, Seung Ho Hong et al. Polymorphisms of 5,10-methylenetetrahydrofolatereductase and thymydilate synthase in squamous Cell Carcinoma and Basal Cell Carcinoma of the skin.Molecular Medicine Reports,2010. Vol 3:741-747 Sanjay Agarwalla, Sherry LaPorte, Lu Liu, Janet FinerMoore, Robert M. Stroud, and Daniel V. Santi. A Novel dCMP Methylase by Engineering Thymidylate Synthase. Biochemistry 1997, 36, 15909-15917 Goto Y, Yue L, Yokoi A, Nishimura R, Uehara T, Koizumi S and Saikawa Y: A novel single-nucleotide polymorphism in 3’-Untranslated region of the human dihydrofolate reductase gene with enhanced expression. Clin Cancer Res 7:1952-1956, 2001 Mandola MV, Stoehlmacher J, Zhang W, Groshen S, Yu MC, Ibal S, Lens HJ and Ladner RD: A6 bp polymorphism in the tymidylate synthase gene causes message instability and is associated with decreased intratumoral TS mRNA levels. Pharmacogenetics 14: 319-327, 2004 Festa F, Kumar R, Sanyal S, Unden B, Nordfors L, Lindholm B, Snellman E, Schalling M, Forsti A and Hemminki K : Basal cell carcinoma and variants in gene coding for immune response, DNA repair, folate, and iron metabolism. Mutat Res 574:105-111, 2005 Kastan MB, onkyekwere O, Sidransky D et al.participant of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer res 1991; 51; 6304-11 Mannor GE, Chern PL, Barnette D. Eyelid and Periorbital Skin Basal Cell carcinoma, oculoplastic Management and Surgery, International Ophthalmology Clinics, 49, 1-16, 2009. Nemet AY et al, Management of Periocular Basal and Squamous Cell carcinoma: a series of 485 cases. American Journal of Ophthalmology, 2006, 142: 293-297 Ibrar Hussain, Mahmooda Soni, Bakht Samar Khan, Mohammad Daud Khan. Basal Cell Carcinoma Presentation,Histopathological Features and Correlation with Clinical Behaviour. Pak J Ophthalmol 2011, Vol. 27 No. 1 Homo sapiens thymidylate synthase gene, partial cds; and upstream region. Availabale at http://www.metalife.com/ Genbank/5478495
