De toegevoegde waarde van rpoB sequencing voor de identificatie van non-tuberculeuze mycobacteriën Rina de Zwaan1, Jakko van Ingen2, en Dick van Soolingen1,2# 1Nationaal
Referentie Laboratorium voor Mycobacteriën, RIVM, Bilthoven 2Radboud Universiteit, Nijmegen
20 juni 2014
Disclosure belangen spreker
(potentiële) belangenverstrengeling
Geen / Zie hieronder
Voor bijeenkomst mogelijk relevante relaties met bedrijven x Sponsoring of onderzoeksgeld x Honorarium of andere (financiële) vergoeding x Aandeelhouder x Andere relatie, namelijk …
2
Bedrijfsnamen x x x x
1. Mycobacterium genus 2. Methode en sample selectie 3. Resultaten 1. INNO-LiPA vs rpoB sequencing 2. 16S rDNA sequencing vs rpoB gen sequencing 4. Conclusie
3
Mycobacterium Genus Non-tuberculeuze Mycobacteriën (NTM) M. leprae M. leprae
4
M. tuberculosis complex > 150 officiële species Non-tuberculeuze Mycobacteriën (NTM) M. tuberculosis M. africanum M. avium M. avium M. bovis M. abscessus M. abscessus M. caprae M. gordonae M. gordonae M. pinnipedii M. kansasii M. kansasii M. microtii … …
Belang van goede identificatie Klinische relevantie van pulmonaire NTM isolaten
5
van Ingen J et al. Thorax 2009;64:502-506
Methode en sample selectie: 455 samples met 2 algoritmes VS #1. INNO-LiPA +16S rDNA sequencing
#2. rpoB gen sequencing 100
99
98
97
96
95
94
93
92
91
90
89
88
87
rpoB_myco
rpoB M. gordonae
93.7
M. conspicuum 92.8
99.3
92.4
M. chimaera M. intracellulare
96.6
MAC
94.5
M. avium
91.4
M. malmoense 90.7
M. simae M. haemophilum
90.3
M. interjectum
97.9
89.7
M. interjectum complex 89.2
M. lentiflavum M. marinum
88.6
M. kansasii complex
96.8
M. kansasii
88.6
M. xenopi
94.6
M. heckeshornense
91.1
M. branderi
87.5
M. terrea complex
95.0
M. terrea complex
94.2
M. arupense
95.1
89.0
M. terrae rUMS_03 M. conceptionense
94.9
M. setense 94.3 98.5 86.5
M. peregrinum M. alvei
95.1 92.5 98.8
M. houstonense M. fortuitum
91.7
rUMS_04 90.7
rUMS_05
90.1
M. iranicum
89.3
M. goodii M. mucogenicum
88.2
rUMS_06
90.5
M. phlei
90.1 87.6
M. novocastrense 95.8 94.5
M. abscessus subsp abscessus M. abscessus subsp bolletii M. chelonae
6
#1 INNO-LiPA: reversed line blot
+16S rDNA sequencing 100
99
98
97
96
95
94
16S_500
UMS_03
96.5
M. terrae 95.7 99.0 95.4
M. terrae complex M. arupense
97.0
M. mucogenicum 94.9
UMS_04 M. branderi
96.8
M. shimoidei
94.5
M. conspicuum
96.8
M. bohemicum 95.9 98.7 93.6
98.1
M. florentinum M. interjectum M. florentinum M. novocastrense
95.9
M. phlei
95.6 97.2
UMS_06 M. goodii
7
99
100
97
98
96
94
95
92
93
91
89
90
88
87
99.3%
94%
rpoB_myco
rpoB M. gordonae
93.7
#2 rpoB gen sequencing
M. conspicuum
SGM
92.8
99.3
92.4
M. chimaera M. intracellulare
96.6
MAC
94.5
M. avium
91.4
M. malmoense 90.7
M. simae
‘complex’ afkapwaarde >94% sim.
M. haemophilum
90.3
M. interjectum
97.9
89.7
M. interjectum complex 89.2
M. lentiflavum
‘species’ afkapwaarde
M. marinum
88.6
M. kansasii complex
96.8
M. kansasii
88.6
M. xenopi
94.6
M. heckeshornense
91.1
M. branderi
87.5
M. terrea complex
95.0
M. terrea complex
94.2
M. arupense
95.1
89.0
M. terrae rUMS_03 M. conceptionense
94.9
RGM
M. setense 94.3 98.5
Snel groeiende mycobacteriën (RGM) > 98.3% sim. (2)
M. peregrinum M. alvei
95.1
86.5
Langzaam groeiende mycobacteriën (SGM) > 99.3 % sim.(1)
92.5 98.8
M. houstonense M. fortuitum
91.7
rUMS_04 90.7
rUMS_05
90.1
M. iranicum
89.3
M. goodii M. mucogenicum
88.2
rUMS_06
90.5
M. phlei
90.1 87.6
M. novocastrense 95.8 94.5
M. abscessus subsp abscessus
98.3%
M. abscessus subsp bolletii M. chelonae
8
& GenBank
(1)Ben Salah I et al. 2008. rpoB sequence-based identification of Mycobacterium avium complex species. Microbiology . (2)Adekambi T, et al. 2003. rpoB-based identification of nonpigmented and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. JCM.
100
98
96
94
92
90
& GenBank
99.3%
rpoB_myco
LiPA
M. mantenii NLA000401474T (KJ729111) M. avium complex M. mantenii
97.6
M. avium complex M. avium complex 95.7
M. timonense strain 3256799 (EF584435)
99.6 9.6
M. avium complex M. timonense
98.2
94.6
M. avium complex M. avium complex M. avium (EF521911)
93.4
M. avium
M. avium
M. avium complex rUMS_001 99.9
M. kansasii
M. kansasii complex
M. kansasii
M. kansasii complex
96.7
M. kansasii ATCC 12478 (HQ880687) M. kansasii
97.3
94.3
M. kansasii M. gastri ATCC15754 (JN986748)
M. kansasii
M. kansasii complex
9
100
98
96
94
92
90
& GenBank
99.3%
94%
rpoB_myco
M. mantenii NLA000401474T (KJ729111) M. mantenii NLA000401474T (KJ729111) M.mantenii avium complex M. mantenii M.
97.6
M.avium aviumcomplex complex M. avium complex M.
95.7 99.6
M.timonense avium complex M. timonense M.
98.2
94.6 .6
timonense strain 3256799 (EF584435) M. timonense strainM. 3256799 (EF584435) M.avium aviumcomplex complex M. avium complex M. M. avium (EF521911) M. avium (EF521911)
93.4
M.avium avium M. avium M. rOMS_001 M.avium aviumcomplex complex rUMS_001 M. rUMS_001 99.9
M.kansasii kansasiicomplexM. kansasii complex M. M.kansasii kansasiicomplexM. kansasii complex M.
96.7
94.3 3
97.3
M. kansasii ATCC 12478 (HQ880687) M. kansasii ATCC 12478 (HQ880687) M.kansasii kansasii M.
M. kansasii
M. (JN986748) gastri ATCC15754 (JN986748) M. gastri ATCC15754 M.kansasii kansasiicomplexM. kansasii complex M.
LiPA resultaten: Line
probe
2 4 5 6 7 8 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23
MYC genus MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MSI MMU MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MFO TOTAL
Species name Mycobacterium species M. kansasii I M. kansasii II M. kansasii III, M. gastri M. xenopi M. gordonae M. simiae M. marinum/ M. ulcerans M. avium complex M. avium M. intracellulare M. chimaera M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae M. abscessus M. fortuitum-M. peregrinum complex
Samples (N) 38* 33 7 3 6 62 5 16 26 112 18 24 2 15 2 21 38 27 455
11
LiPA vs rpoB: Gelijke resultaten
12
line
probe
2 4 5 6 7 8 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23
MYC genus MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MSI MMU MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MFO TOTAL
Species name Mycobacterium species M. kansasii I M. kansasii II M. kansasii III , M. gastri M. xenopi M. gordonae M. simiae M. marinum/ M. ulcerans M. avium complex M. avium M. intracellulare M. chimaera M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae M. abscessus M. fortuitum-M. peregrinum complex
Samples (N) 38 33 7 3 6 62 5 16 26 112 18 24 2 15 2 21 38 27 455
LiPA vs rpoB: Meer variatie line
probe
Species name
2 4 5 6 7 8 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23
MYC genus MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MSI MMU MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MFO TOTAL
Mycobacterium species M. kansasii I M. kansasii II M. kansasii III, M. gastri M. xenopi M. gordonae M. simiae M. marinum / M. ulcerans M. avium complex M. avium M. intracellulare M. chimaera M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae M. abscessus M. fortuitum-M. peregrinum complex
Samples (N) 38 33 7 3 6 62 5 16 26 112 18 24 2 15 2 21 38 27 455
13
Meer variatie met rpoB sequencing rpoB_myco
LiPA: M. gordonae
100
98
96
94
92
90
94% M. gordonae
99.3%
M. gordonae M. gordonae M. gordonae ATCC14770T M. gordonae M. gordonae M. gordonae complex M. gordonae complex M. gordonae complex M. gordonae complex M. gordonae complex M. gordonae complex M. gordonae complex M. gordonae complex M. avium M. kansasii
14
LiPA vs rpoB: extra species gevonden met rpoB Samples (N)
line
probe
Species name
2 4 5 6 7 8 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23
MYC genus MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MSI MMU MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MFO TOTAL
Mycobacterium species M. kansasii I M. kansasii II M. kansasii III, M. gastri M. xenopi M. gordonae M. simiae M. marinum/ M. ulcerans M. avium complex M. avium M. intracellulare M. chimaera M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae M. abscessus M. fortuitum-M. peregrinum complex
38 33 7 3 6 62 5 16 26 112 18 24 2 15 2 21 38 27 455
15
100
98
94
92
90
96
LiPA vs rpoB: extra species met rpoB Claritromycine gevoeligheid:
rpoB_myco
rpoB
LiPA: M. abscesuss
M. abscessus subsp bolletii M. abscessus subsp bolletii M. abscessus subsp bolletii
94%
M. abscessus subsp bolletii CIP 108541 M. abscessus subsp bolletii M. abscessus subsp bolletii M. abscessus subsp bolletii M. abscessus subsp bolletii * M. abscessus subsp bolletii * M. abscessus ATCC 19977 M. abscessus subsp abscessus M. abscessus subsp abscessus M. abscessus subsp abscessus M. abscessus subsp abscessus M. chelonae M. fortuitum
16
98.3%
*voormalige M. massiliense
LiPA vs rpoB: M. avium complex (MAC) Line
probe
Species name
2 4 5 6 7 8 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23
MYC genus MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MSI MMU MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MFO TOTAL
Mycobacterium species M. kansasii I M. kansasii II M. kansasii III , M. gastri M. xenopi M. gordonae M. simiae M. marinum/ M. ulcerans M. avium complex M. avium M. intracellulare (sqv min A, B, C &D) M. chimaera (former sqv mac-A) M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae M. abscessus M. fortuitum-M. peregrinum complex
Samples (N) 38 33 7 3 6 62 5 16 26 112 18 24 2 15 2 21 38 27 455
17
94%
100
99.3% 99
98
97
96
95
94
93
92
rpoB_myco
Innolipa rpoB mais
M. avium complex
mais
M. vulneris
mais
M. colombiense
mais
M. colombiense
mais
M. avium complex
mais
M. avium complex
mais
M. mantenii
mais
M. avium complex
mais
M. timonense
mais
M. timonense
mais
M. timonense
mais
M. avium complex
mais
M. avium complex
min1
M. avium complex
min1
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
mais
M. intracellulare
mais
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
mais
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
min2
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
mais
M. intracellulare
min2
M. chimaera
mais
M. intracellulare
min1
M. intracellulare
min1
M. avium complex
mais
M. avium complex
min1
M. yongonense
mais
rUMS_001
mais
M. heidelbergense
M. avium complex
LiPA: M. avium complex M. intracellulare M. chimaera
Resulten: 16S rDNA sequencing vs rpoB sequencing Line
probe
2 4 5 6 7 8 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23
MYC genus MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MSI MMU MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MFO TOTAL
Samples (N) 38 33 7 3 6 62 5 16 26 112 18 24 2 15 2 21 38 27 455
Species name Mycobacterium species M. kansasii I M. kansasii II M. kansasii III, M. gastri M. xenopi M. gordonae M. simiae M. marinum/ M. ulcerans M. avium complex M. avium M. intracellulare M. chimaera M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae M. abscessus M. fortuitum-M. peregrinum complex
19
16S rDNA sequencing vs rpoB sequencing
M. novocastrense strain 73T (NR_029208) OMS_08 UMS_08
100
rpoB M. interjectum DSM44064T M. interjectum M. interjectum
M. phlei
M. interjectum complex M. interjectum complex M. interjectum complex
UMS_09 OMS_09
M. interjectum complex
M. interjectum ATCC 51457 (HM037998)
M. houstonense
M. interjectum
.
M. interjectum
M. phlei strain ATCC 11758 (NR_041906) M. phlei
M. houstonense M. houstonense ATCC49403T .
M. interjectum
M. fortuitum CIP104534T
M. interjectum
M. novocastrense CIP105546T.
M. interjectum
M. novocastrense
M. interjectum
M. phlei CIP 105389T M. phlei
M. interjectum
M. phlei
M. fortuitum M. fortuitum M. houstonense ATCC49403T (AY457067)
.
M. phlei
M. interjectum M. fortuitum CIP 104534T (AY457066)
20
95
Species 16s 500bp
90
100
99
98
rpoB_myco 97
96
95
16S_500
.
Conclusie LiPA & 16S rDNA sequencing
rpoB gen sequencing
verschillende ‘species’ (aantal)
verschillende ‘species’ (aantal)
30
(n=390)
45
(n=403)
bekende species
3
(n=56)
6
(n=44)
tot complex-groep niveau
7
(n=9)
6
(n=8)
onbekend species
21
Reversed Line Blot INNO-LiPA Snel & ‘herkenbare species’ … maar te vereenvoudigde identificatie + M. vulneris, M. mantenii…
+ subsp. bolletii, “massiliense”
22
23
Tortoli E. 2010. Standard operating procedure for optimal identification of mycobacteria using 16S rRNA gene sequences. Standards in genomic sciences 3:145-152
Identificatie ‘Eeuwige discussie’ INNO-LiPA & 16S rDNA gen sequencing
rpoB gen sequencing Hoger discriminerend vermogen
Utility of rpoB gene sequencing for identification of nontuberculous mycobacteria in the Netherlands, JCM vol. 52 No. 7
Rina de Zwaan et al.
24
Met dank aan: Jakko van Ingen & Dick van Soolingen & RIVM, IDS-BPD-MYC
25
26
