Csontműtéteknél alkalmazható antibiotikumtartalmú lokális hatóanyagfelszabadító rendszerek tervezése és vizsgálata

Csontműtéteknél alkalmazható antibiotikumtartalmú lokális hatóanyagfelszabadító rendszerek tervezése és vizsgálata Doktori értekezés

Laki Mónika

Semmelweis Egyetem Gyógyszerésztudományok Doktori Iskola

Témavezető: Konzulens:

Dr. Antal István egyetemi docens, Ph.D. Dr. Hajdú Mária egyetemi adjunktus

Hivatalos bírálók: Dr. Sátory Éva egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Bácskay Ildikó egyetemi adjunktus, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Tekes Kornélia egyetemi tanár, C.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Újhelyi Gabriella c. egyetemi docens, Ph.D. Dr. Vecsernyés Miklós egyetemi docens, Ph.D.

Budapest 2010

Tartalomjegyzék

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................... 5 1. BEVEZETÉS .................................................................................................. 7 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................ 10 2.1. A gyógyszerforma hatóanyagleadásának jelentősége ........................................ 10 2.2. Baktériumok jelentősége az ortopédiai klinikai gyakorlatban ......................... 10 2.3. Csontinfekciók kezelésében alkalmazott antibiotikumok.................................. 12 2.3.1. Vancomycin...................................................................................................... 13 2.3.2. Gentamicin ....................................................................................................... 15 2.3.3. Ciprofloxacin .................................................................................................... 16 2.3.4. Oxytetracyclin .................................................................................................. 17 2.3.5. Tobramycin....................................................................................................... 18 2.3.6. Mupirocin ......................................................................................................... 19 2.3.7. Antibiotikumok újabb generációi ..................................................................... 19 2.3.8. Antibiotikum kombinációk............................................................................... 20 2.4. Ortopédiában alkalmazott lokális hatóanyagleadó rendszerek ........................ 21 2.4.1. Nem biodegradábilis hordozók......................................................................... 22 2.4.2. Biodegradábilis hordozók................................................................................. 24 2.5. Csontviasz alkalmazásának jelentősége .............................................................. 31 2.6. Egyéb, helyi alkalmazású terápiás rendszerek ................................................... 32 2.7. A hatóanyagok kvantitatív meghatározásának ismert módszerei .................... 33 2.8. Analitikai módszerek validálásának irányelvei .................................................. 36 2.9. Implantátumok hatóanyagleadásának vizsgálata .............................................. 38

2

3. CÉLKITŰZÉSEK.......................................................................................... 39 4. KÍSÉRLETI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK.................................................. 40 4.1. Felhasznált anyagok .............................................................................................. 40 4.1.1. Modell hatóanyagok ......................................................................................... 40 4.1.2. Segédanyagok................................................................................................... 40 4.1.3. Vegyszerek, oldószerek .................................................................................... 43 4.2. Módszerek .............................................................................................................. 43 4.2.1. Gélek előállítása ............................................................................................... 43 4.2.2. Hordozók előállítása ......................................................................................... 44 4.2.3. Fizikai vizsgálatok............................................................................................ 46 4.2.4. In vitro hatóanyagleadás vizsgálata.................................................................. 47 4.2.4.1. Hatóanyagok kvantitatív meghatározása ....................................................... 49 4.2.4.2. Az alkalmazott analitikai módszerek validálása............................................ 52 4.2.7. Egyéb vizsgálatok............................................................................................. 55 5. EREDMÉNYEK ............................................................................................ 58 5.1.

A hordozórendszerek in vitro fizikai vizsgálatai ........................................... 58

5.2.

Vizsgált rendszerek hatóanyagleadásának meghatározása.......................... 59

5.2.1. Vancomycin analitikai meghatározása ........................................................... 60 5.2.2. Gentamicin analitikai meghatározása............................................................. 65 5.2.3. Ciprofloxacin analitikai meghatározása ......................................................... 69 5.3.

Hatóanyagleadó rendszerek kioldódásprofiljainak vizsgálata..................... 70

5.3.1. Gélek kioldódási tulajdonságainak vizsgálata................................................ 70 5.3.2. Hordozórendszerek hatóanyagleadó-képességének vizsgálata ...................... 72 5.4.

Hordozórendszerek mikrobiológiai vizsgálatai ............................................. 78

5.5.

Hordozórendszerek in vivo állatkísérletes vizsgálatai .................................. 80

6. MEGBESZÉLÉS .......................................................................................... 82

3

6.1. Analitikai vizsgálatok ............................................................................................ 82 6.2 Fizikai-kémiai vizsgálatok eredményei................................................................. 82 6.3. Kioldódási vizsgálatok........................................................................................... 83 6.3.1. Gélek kioldódási eredményei ........................................................................... 84 6.3.2. Hordozórendszerek kioldódási eredményei...................................................... 84 6.4. Mikrobiológiai vizsgálatok eredményei............................................................... 86 6.5. In vivo vizsgálatok eredményei ............................................................................ 87 7. KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................. 88 8. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................... 91 9. SUMMARY................................................................................................... 92 10. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................... 93 11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE........................................................ 105 10.1. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények...................................... 105 10.2. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó, teljes terjedelmében megjelent összefoglalók ............................................................................................................ 106 10.3. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó előadások ........................................... 106 10.4. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó poszterek............................................ 107 10.5. Egyéb közlemények......................................................................................... 110 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...................................................................... 111 13. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK KÜLÖNLENYOMATAI ................................................................................... 112

4

Rövidítések jegyzéke APCI

~ atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció

APPI

~ atmoszférikus nyomású fotoionizáció

ARI

~ aripriprazol

As

~ szimmetria faktor

Bst

~ belső standard

CFU

~ csíraszám (Colony Forming Unit)

CPFX

~ ciprofloxacin

DNS

~ dezoxiribonukleinsav

DSC

~ pásztázó differenciálkalorimetria (Differential Scanning Calorimetry)

ELSD

~ evaporative light scattering detector

ESI

~ electrospray ionforrás

FDA

~ amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrző Hatóság (Food and Drug Administration)

GEN

~ gentamicin

HPLC

~ nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia

HPLC-MS

~ nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia tömegspektrométerrel kapcsolva

ICH

~ International Conference on Harmonization

k’

~ kapacitásfaktor

LADME

~ liberalizáció, abszorpció, disztribúció, metabolizmus, elimináció

LC-UV

~ folyadékkromatográfia UV detektálással

LOD

~ kimutatási határ (Limit of detection)

LOQ

~ mennyiségi kimutatás alsó határa (Limit of quantitation)

MIC

~ minimális inhibitor koncentráció

MRSA

~ methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus

MRSE

~ methicillin-rezisztens Staphlococcus epidermidis

NODS

~ szemészeti hatóanyagleadó rendszer (New Ophtalmic Delivery System)

OTC

~ oxytetracyclin

PEG

~ poli(etilén-glikol)

PEMA

~ poli(etil-metakrilát)

PGA

~ poli(glikolsav)

5

Ph. Hg.

~ Magyar Gyógyszerkönyv (Pharmacopoeia Hungarica)

PLA

~ poli(tejsav)

PLGA

~ poli(laktil-glikolid)

PMMA

~ poli(metil-metakrilát)

PVA

~ poli(vinil-alkohol)

QC

~ minőségellenőrző minta

RNS

~ ribonukleinsav

R.S.D.

~ relative standard deviation

TBC

~ tuberkulózis

USP

~ Amerikai Gyógyszerkönyv (United States Pharmacopoeia)

UV-VIS

~ ultraibolya (ultraviolet)-látható (visible) tartomány

VCM

~ vancomycin

w0,05

~ a csúcsmagasság huszadánál mért csúcsszélesség

6

1. Bevezetés Napjaink egyik leggyakoribb megbetegedései közé tartoznak a mozgásszervi megbetegedések. A hosszan tartó fájdalom és mozgáskorlátozottság hátterében általában a csont- és izomrendszer betegségei állnak. A kezelésben a konzervatív gyógymódoknak és a műtéti eljárásoknak egyaránt jelentőségük van [1]. Arthroplasticának nevezzük azokat a műtéteket, ahol ízületi felszínek, ízületi végek újraképzésével, esetleg pótlásával, cseréjével, vagy az ízületi végek eltávolításával javítjuk az ízület mozgásait. A műtét célja a fájdalom csökkentése, megszüntetése [2]. Több típusa közül a legkorszerűbb és legelterjedtebb módja a szövetbarát anyagokból, mint például fémből, biokerámiából, műanyagokból készült endoprotézisek beépítése. Ma már alig van olyan ízületünk, amely helyettesítésére endoprotézissel ne lenne mód. Az endoprotézisekkel történő ízület-pótlás a népbetegségnek számító ízületi kopás (osteoarthrosis) egyeduralkodó műtéti kezelésévé vált [1]. A szervezetben hosszú ideje lévő implantátumok különböző technikai, biológiai szövődményeket okozhatnak. A legközismertebb, az ízületi protézisek mechanikai kilazulása (1. ábra), ami átlagosan a beültetést követő 10-15 éven belül okoz a betegek számára panaszt. Ekkor a kilazult protézis a befogadó csontágyban csontveszteséget, ún. osteolysist okoz. Másik szövődmény a beültetett idegen anyag körül kialakuló ízületi gennyesedés, az ún. periprotetikus infekció (2. ábra). Ilyenkor a protézis felszínén és a csontágyban baktériumok szaporodhatnak el, másodlagosan osteolysist okozva [3]. Az ortopéd sebészeti gyakorlatban az ún. revíziós műtéteknél (protézisek cseréje) széles körben használatosak különféle csontpótló eljárások, melyek közül a legelterjedtebb az ún. homológ csontgraft (csontbankból vett humán csont) alkalmazása. A csontbeültetés során a csontőrlemény zömítéses technikát alkalmazva tölti ki a keletkezett üreget. Mivel a beültetett csont nem rendelkezik saját keringéssel, bizonyos idő elteltével beépül a gazdaszervezetbe, a befogadó csonttal struktúrálisan és vaszkularizációt tekintve is egyesül (ezt nevezzük oszteointegrációnak). A beültetés és az oszteointegráció közötti időben (4-6 hét) azonban a homogén csontgraft védtelen az exogén és endogén kórokozókkal szemben, melyek vagy a véráram segítségével jutnak a beültetés helyére, vagy közvetlen ráterjedés is előfordulhat.

7

1. ábra Szeptikus protézis lazulás röntgen képe∗

2. ábra A szeptikus protézis műtéti képe*

A protézisek csontokhoz, csontokba való rögzítésének módja elsősorban az ízület jellegétől és a csont szerkezetétől függ. Legáltalánosabb a csontcementtel való rögzítés, de speciális felszínű protézisek esetén lehetőség van a cement nélküli rögzítésre is. Ezek mellett természetesen lehetőség van a hibrid rögzítésre is, amikor az endoprotézis egyik elemét csontcementtel, a másik elemét cement nélkül rögzítik. Az endoprotézisek későbbi problémája az ún. aszeptikus lazulás, mely az esetek egy részében már néhány évvel a műtét után megtörténhet. Az endoprotézis és a csonthatáron létrejövő csontreszorpció miatt a protézis lazulása, azaz terhelésre jelentkező rendellenes mozgása alakulhat ki, melyre rendszerint a kialakuló fájdalom miatt figyelünk fel.

∗

Dr. Zahár Ákos felvételei (Semmelweis Egyetem, Ortopédiai Klinika, Budapest)

8

A cementes rögzítésnél az implantátum poli(metil-metakrilát) (PMMA) kötőanyag felhasználásával kerül beültetésre, míg a cement nélküli rögzítés esetén a protézis kezdetben ékhatás, később ún. biológiai rögzülés segítségével rögzül (a csont ránő a fém felszínre). A cementes technikánál lehetőség van antibiotikum cementhez történő keverésére, míg a cement nélküli illetve a zömítéses csontgraft technikánál eddig nem volt lehetőség antibiotikumok hozzákeverésére. Így a második esetben a beültetett csont az oszteointegráció bekövetkeztéig csak a keringésből kaphat bizonyos koncentrációban antibiotikumot, ami a rossz perfúziós viszonyok miatt nem elegendő a baktericid hatás eléréséhez. A krónikus osteomyelitis kezelése különösen nehéz lehet, mivel a betegség gyakran a csont nekrózisával párosul, valamint a szöveti perfúzió romlásával a környező szövetek fertőzésének veszélye is fennáll [4]. Az antibiotikumok orális, illetve intravénás adagolása a lehetséges mellékhatások miatt sokszor aggályos, ezért van nagy igény új módszerek kifejlesztésére. Csont-izületi fertőzések során gyakran jelentkezik igény csontpótlásra. Lokálisan ható antibiotikumok alkalmazása előnyös a kórokozók elleni küzdelemben, akár osteomyelitises üregek kitöltésekor [5, 6], vagy fertőzött endoprotézisek revíziója esetén [7, 8]. A lokális antimikróbás hatás előnye a szisztémás alkalmazás mellett, hogy a terápiás vérszintnél lényegesen magasabb koncentrációt lehet elérni a gazdaszervezet károsítása nélkül [9, 10]. A

Semmelweis

Egyetem

két

intézete,

az

Ortopédiai

Klinika

és

a

Gyógyszerészeti Intézet a T049480 számú OTKA pályázat keretében foglalkozott olyan technológia és különleges hordozórendszerek kutatásával, amelyek lehetővé teszik csontgraftok és egyéb biokompatibilis anyagok antibiotikumokkal történő bevonását, így ellenállóvá téve a csontágyat a kórokozókkal szemben. Célul tűztük ki, hogy az előállított hordozórendszerek több héten keresztül biztosítsák a hatékony antibiotikum koncentrációt a csontpótlás helyén. Az antibiotikumok csontból történő kontrollált kiáramlása jelentősen csökkentheti a revíziós műtéteknél a szeptikus szövődmények előfordulási gyakoriságát. Ezzel a betegek további műtéteket kerülhetnének el, a kórházak

pedig

az

ismételt

műtétek

költségeit

nemzetgazdasági jelentősége is van.

9

takaríthatnák

meg,

aminek

2. Irodalmi áttekintés 2.1. A gyógyszerforma hatóanyagleadásának jelentősége Gyógyszerek adásakor a hatóanyag felszabadulásának módját és sebességét befolyásolják a befogadó fiziológiás környezet (például pH, hőmérséklet, enzimek, perisztaltika, béltartalom) és a készítmény paraméterei (például oldhatóság, nedvesedés, szétesés, kioldódás). A készítmény tervezésekor tehát a várható fiziológiás paraméterekből szükséges kiindulni és a gyógyszerforma megválasztásával, megfelelő segédanyagokkal és az alkalmazott technológiával biztosíthatjuk a hatóanyaghordozórendszer megfelelő kioldódási paramétereit. A hatóanyagok szervezetbeni, konszekutív lépésekből álló sorsát a LADME rendszer

felhasználásával

modellezhetjük.

Ezen

modell

alkalmazásával

a

gyógyszerkészítmény, a hatóanyag és a szervezet kapcsolatrendszere írható le. A gyógyszerek alkalmazási célja lehet helyi hatás, vagy szisztémás hatás, amelynek feltétele, hogy a hatóanyag a véráram segítségével jusson el a receptorokhoz. Szisztémás adagolás esetén a készítmény közvetlenül az érpályába juttatható. Érpályán kívüli gyógyszerbevitel esetén a hatóanyag felszívódás révén képes megfelelő mennyiségben bejutni a véráramba. Amennyiben helyi hatás elérése a cél, a közvetlen befecskendezés vagy beültetés különleges sajátsága miatt biztosítható a hatóanyag magas koncentrációja a célszervben illetve szövetben. A gyógyszeres implantátumok általában beültethető, szilárd és steril készítmények, amelyek hosszú időn át és folyamatosan adják le a hatóanyagot [11].

2.2.

Baktériumok

jelentősége

az

ortopédiai

klinikai

gyakorlatban A csontokat, melyek általában védettek a fertőzésekkel szemben, háromféle módon érhetik el a kórokozók: a vérárammal (mely fertőző kórokozókat szállíthat a csontokba a szervezet más részeiből), bejuthatnak közvetlenül a csontokba, nyílt töréseken keresztül, továbbá csontműtétek során, vagy olyan fertőzött tárgyakról, melyek a csontig hatolnak.

10

A klinikai gyakorlatban Staphylococcus aureus és Staphylococcus epidermidis törzsek okoznak leggyakrabban periprotetikus infekciót, ezek közül is elsősorban a polirezisztens törzsek [12-14]. A Staphylococcusok a normál flóra tagjai, előfordulnak az ember bőrén, szőrtüszőkben, faggyúmirigyekben, az orrban, az orr-garatüregben és egyéb nyálkahártyákon. Gömb alakú (0,8-1 µm átmérőjű) baktérium, mely szőlőfürtszerű halmazokat képez. Igénytelen, fakultatív anaerob baktériumok, melyek jól szaporodnak mind aerob, mind anaerob körülmények között. A Staphylococcus aureus koagulázt termel, melynek hatására a coccusok körül fibrin védőburkot képez. A Staphylococcus epidermidis viszont koaguláz-negatív. Az ortopédiai gyakorlatban az általuk okozott periprotetikus infekció valamint az osteomyelitis bír nagy jelentősséggel. Megjelentek már MRSA és MRSE törzsek is, melyek ellen egyre kevesebb antibiotikum hatékony [15]. A Mycobacterium tuberculosis (a TBC kórokozója) is megfertőzheti pl. a csigolyákat és osteomyelitist okozhat. Ha a fertőzést okozó baktériumot nem sikerül azonosítani, akkor szélesspektrumú antibiotikum alkalmazása szükséges, mint például a carbapenemek, amelyek azonban nem hatékonyak Staphylococcusokkal szemben. A Propionibacteriumok is a normál bőrflóra részei, legtöbbször nem patogének. Ugyanakkor ortopédiai műtétek során, főként idegen test beültetésekor, klinikailag jelentős fertőzéseket okozhatnak [16]. A mikróbák fimbráikkal vagy fibrillaris proteinekkel képesek a különböző felszínekhez kötődni, majd a termelődő exo-poliszaccharidok segítségével stabil kapcsolat alakul ki a felszín és a mikróba között. Ebbe a mátrixba más mikróbák is beágyazódhatnak és ún. biofilmet képeznek. A biofilm felszínéről időről-időre mikróbák szakadnak le és kerülnek a véráramba. Ezek a biofilmek védelmet nyújtanak a mikroorganizmusoknak a különböző kémiai hatásokkal szemben. A biofilmeknek három területen van jelentőségük: •

Nyálkahártyákon a normál flóra alkotta biofilm védelmet nyújt a patogénekkel szemben.

•

Kóros folyamatokban kialakult biofilmek (osteomyelitis) esetében sem az immunválasz, sem az alkalmazott antimikróbás terápia nem hatásos.

11

•

A szervezetbe beültetésre kerülő idegen eszközökön (fém-, gumi- vagy műanyag eszközök) kialakuló biofilmek állandó fertőzési gócot jelentenek [15].

Az

ízületi

infekciókra

szisztémásan

adagolt

antibiotikum

kezelés

eredménytelenségét gyakran a betegséget okozó baktériumtörzsek biofilm-képzése okozza, valamint az, hogy a biofilm belsejében növekedő sejtek egyre nagyobb rezisztenciát mutatnak az alkalmazott antibiotikumokkal szemben [17, 18]. Az eddig végzett kutatások szerint különbözőségek figyelhetők meg az ortopédiában használatos anyagokhoz való tapadás szerint a Staphylococcus epidermidis és a Staphyloccus aureus törzsek között. A különböző törzsek által termelt adhezinek, valamint a felhasznált anyag felszíni tulajdonságai, mint például a felszíni energiája, hidrofób tulajdonsága, érdessége, kémiai összetétele befolyásolhatja a baktériumtörzsek tapadását a felszínre. A biofilmek vizsgálatát végző kutatócsoport ugyanakkor megállapította, hogy nincs egyetlen olyan antibiotikum sem, amely egyszerre hatékony a Propionibacterium acnes és a Staphylococcus törzsek ellen, amelyekről köztudott, hogy csípőízületi infekciók kórokozói [19].

2.3. Csontinfekciók kezelésében alkalmazott antibiotikumok Az antibiotikumok alkalmazásának három fő oka lehet az ortopédiában: elősegíteni a befogadó szervezet válaszreakcióját, a seb környékének optimalizálása valamint annak meggátolása, hogy a sebészeti beavatkozás során a szervezetbe kerülő mikroorganizmusok szaporodásnak induljanak. Napjainkban egyre gyakrabban kell szembe nézni polirezisztens koaguláz-negatív Staphylococcusokkal vagy MRSA-val, ezért

az

oxacillinre

vagy

aminoglikozidokra

rezisztens

baktériumok

ellen

glikopeptideket (például vancomycin) kell alkalmazni [20, 21]. Annak ellenére, hogy az antibiotikumok használata általánosan elterjedt és elfogadott, alkalmazását nehezíti, hogy profilaxisban való alkalmazásakor meg kell találni a megfelelő hatóanyagot, a megfelelő időpontot a kezelés megkezdésére és ennek megfelelő időtartamára, kiegészítő antimikróbás terápia szükségességét is át kell gondolni.

12

A profilaktikus antimikróbás szerrel szemben támasztott főbb követelmények: •

megfelelő in vitro és in vivo aktivitás, főleg a Staphylococcus és Streptococcus törzsek ellen,

•

viszonylag hosszú szérum felezési idő,

•

kiváló szöveti penetráció,

•

alacsony toxicitás,

•

kedvező ár [22].

Részletesebben azokat az antibiotikumokat foglalom össze a továbbiakban, melyekkel kísérletes munkám során foglalkoztam. A teljesség igénye nélkül megemlítem a további, ortopédiai gyakorlatban jelentős szereket. A jelentős stabilitással rendelkező aminoglikozidok jó antibakteriális hatást mutatnak, relatív alacsony a rezisztencia kialakulásának esélye és elfogadható a biztonsági profilja egyszeri adagolás után (elsősorban a gentamicint [23] és a tobramycint alkalmazzák). Csont-, ízületi fertőzésekben szisztémás adagolásuk nem gyakran indokolt. A fluorokinolonok biztonságosak és gyors hatást fejtenek ki a legtöbb olyan mikroorganizmus ellen, melyek polimerhez kapcsolódva okoznak fertőzéseket. A makrociklusos szerkezetű rifampicin hatékony a lassan növekedő és adherens Staphylococcus törzsek ellen. Mindig kombinációban kell alkalmazni, különben fennáll a rezisztencia kialakulásának veszélye [24].

2.3.1. Vancomycin A

vancomycin

(VCM,

3.

ábra)

1958-ban

került

forgalomba,

mint

Staphylococcus ellenes szer, klinikai jelentősége a hetvenes években kezdett nőni, ami a methicillinrezisztens

Staphylococcusok

okozta

infekciók

növekedésének

volt

köszönhető. A VCM glikopeptid típusú antibiotikum, bonyolult szerkezetű, nagy glikoprotein molekula. Antibakteriális hatását a sejtek glikopepetid szintézisének gátlásán keresztül fejti ki. Baktericid hatású a Staphylococcus aureus és epidermidis methicillinérzékeny és –rezisztens törzseire is. Hat a diphteroidokra (köztük a Corynebacterium

jeikumra),

a

streptococcusokra,

13

az

enterococcusokra.

Aktív

clostridiumok, valamint propionibacteriumok ellen. Gram negatív kórokozók ellen hatástalan.

3. ábra A vancomycin-hidroklorid szerkezeti képlete

A glikopeptidek ellen kialakuló rezisztencia ma még viszonylag ritka. Azonban ha a baktérium sejtfalát alkotó egyik aminosav megváltozása miatt a VCM kötődése nem lehetséges, kialakulhat rezisztencia. A VCM a béltraktusból nem szívódik fel, intramuszkulárisan adagolva szövetizgató hatású, ezért intravénásan adagolják. Vesén át ürül ki a szervezetből, felezési ideje egészséges veseműködés esetén 6 óra, veseelégtelenség esetén a féléletidő hosszabb. Napi dózisát a vesefunkcióhoz kell igazítani. A jelenleg elfogadott álláspont szerint a VCM maximumkoncentrációját 25-40 mg/l, minimumkoncentrációját pedig 5-10 mg/l között célszerű tartani. A vérszint monitorozása szükséges jelentősen beszűkült vagy változó vesefunkció, tartós terápia, aminoglikoziddal

vagy

amphotericinnel

való

kombináció,

idős

beteg,

akut

cardiovasculáris elégtelenség esetén. A VCM-kezelés mellékhatása lehet a Red-man szindróma, amely a direkt hisztamin-felszabadító tulajdonságának köszönhető. Ez a megfelelően lassú beadással megelőzhető. A VCM-kezelés nephrotoxicitáshoz is vezethet, éppen ezért szükséges a fent felsorolt esetekben a vérszint monitorozása [25]. Klinikai gyakorlatban indikációs területe a bizonyított vagy valószínű methicillin-rezistens Staphylococcus aureus vagy Staphylococcus epidermidis okozta

14

infekció,

ampicillinrezisztens

Enterococcus

fertőzés,

valamint

Streptococcus

pneumoniae okozta meningitis vagy gyanúja [26].

2.3.2. Gentamicin OH HN

R1

O CH3

HN R2 H C R3 3 OH

O

HO O

CH3

Gentamicin

x H2SO4

O NH2

H2N

R1

R2

R3

C1

CH3

CH3

H

C1a

H

H

H

C2

H

CH3

H

C2a

H

H

CH3

C2b

CH3

H

H

4. ábra A gentamicin-szulfát szerkezeti képlete

A gentamicin (GEN, 4. ábra) az aminoglikozid antibiotikumok közé tartozó hatóanyag [27]. Az aminoglikozidok glikozidkötéssel összekapcsolt aminocukrok. GEN esetében a központi helyzetben 2-deoxi-streptidin található. Az aminoglikozidok nagyon gyorsan ölik el a baktériumokat. Azonban a baktérium belsejébe aktív transzporttal jutnak, ami gátolható két vegyértékű kationokkal, hiperozmolaritással, alacsony pH-val, anaerob körülményekkel. A sejtmembránon belül az aminoglikozidok a riboszóma 30S és 50S alegységéhez kötődnek, a fehérjeszintézisben okoznak súlyos zavart. Antibakteriális hatásuk koncentrációfüggő. Kísérleti és klinikai adatok szerint az optimális baktericid hatás akkor érhető el, ha az aminoglikozid koncentrációja 8-10-szer meghaladja a baktérium MIC értékét. A hatásspektrum legfontosabb részét a Gram-negatív aerob baktériumok képezik; E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Serratia, Pseudomonas törzsek 90%-a eredetileg érzékeny volt az aminoglikozidokra. Aktívak Staphylococcusok,

15

Neisseria törzsek ellen is. Ma a klinikai gyakorlatban egyre inkább elterjedőben vannak a gentamicin-, tobramycin-rezisztens törzsek. Az aminoglikozidok ellen rezisztencia többféle módon fejlődhet ki. Klinikailag legjelentősebb a plazmidokkal terjedő rezisztenciaforma, amely során olyan enzimek termelődése indul meg, amelyek az aktív amino- vagy hidroxicsoportokat inaktiválják. Valamennyi aminoglikozid vízoldékony, intravénásan vagy intramuszkulárisan alkalmazva is hatékony. Szájon át alkalmazva nem szívódnak fel. A központi idegrendszerbe nem jutnak be. Plazmafehérjékhez való kötődésük csekély. Nem metablizálódnak,

a

vesén

keresztül

ürülnek.

Egyedülálló

farmakokinetikai

tulajdonságuk, hogy a veseszövetben, különösen a kéregben felhalmozódnak. Mellékhatásként felléphet a VIII. agyideg károsodása (halláskárosodás), valamint vesekárosodás. Előfordulhat még allergia, bőrkiütés, hányás, hasmenés, zavartság, ritkán perifériás ideggyulladás. A GEN alkalmazási területe a cefalosporinok, fluorokinolonok megjelenésével ugyan visszaszorult, mégis még ma is nélkülözhetetlen antibiotikum. A GEN súlyos fertőzések rövid időtartamú kezelésére alkalmas, ha azokat GEN-re érzékeny aerob Gram negatív baktériumok okozták, beleértve a pseudomonas törzseket is: •

bacteraemia

•

alsólégúti fertőzések,

•

szövődményes húgyúti fertőzések,

•

intraabdominális fertőzések, peritonitis,

•

fertőzött sebek,

•

bőr és lágyrész fertőzések, égések,

•

genitális fertőzések.

2.3.3. Ciprofloxacin A ciprofloxacin (CPFX, 5. ábra) olyan antibiotikus hatású vegyület, amely fluorokinolonok csoportjába tartozik. A baktériumok DNS-giráz enzimének működését gátolja azáltal, hogy a topoizomeráz II-vel komplexet képez, és ezzel megakadályozza a DNS

kettős

spirál

kialakulását.

Ebből

következően

nem

képes

bejutni

a

baktériumsejtbe, ezért a baktériumsejt elpusztul. A CPFX Gram-pozitív és Gram-

16

negatív baktériumok ellen egyaránt hatékony kemoterápiás szer, a gastrointestinális traktusból jól felszívódik és megfelelő vérszintje miatt szisztémás fertőzések kezelésére is alkalmazható. Antibakteriális hatása koncentráció és időfüggő, a baktericid hatás kifejtéséhez magas antibiotikum szint szükséges. A vesén át ürül ki a szervezetből, felezési ideje 3 és 11 óra között változik. Leggyakoribb

mellékhatásai

a

hányinger

és

a

hányás,

a

központi

idegrendszerben a fejfájás, de felléphet fototoxicitás is. Két és három vegyértékű kationokkal oldhatatlan kelátot képez, ezzel megnehezítve a béltraktusból való felszívódást, ill. gátolja a teofillin lebomlását a máj mikroszómális enzimrendszerén keresztül. A ciprofloxacint II. generációs fluorokinolonként tartják számon és elsősorban a húgyúti fertőzések antimikróbás terápiájában alkalmazzák [26].

5. ábra A ciprofloxacin-hidroklorid szerkezeti képlete

2.3.4. Oxytetracyclin Az oxyteracyclin (OTC, 6. ábra) a tetracyclinek közé tartozó antibiotikum. Hatását a 30 S riboszómához kapcsolódva fejti ki, megakadályozza az aminosav hozzákapcsolódását a növekvő polipeptid lánchoz, így a fehérjeszintézist gátolja meg. A tetracyclinek ellen gyakran plazmidos jellegű rezisztencia fejlődik ki, amely a sejtmembrán áteresztőképességének csökkenésén alapul. Bevezetésük idején igen hatékonyak voltak a Gram-pozitívok közül a staphylococcusok, a streptococcusok ellen, ma e törzsek 30-40%-a rezisztens. Hatékonyak a chlamydiák, mycoplasmák, rickettsiák, treponemák, az Erlichia, Actinomyces, Pasturella és Vibrio törzsek ellen. Az oxytetracyclin a rövid hatású tetracyclin-származékok közé tartozik. A bélrendszerből a bevitt gyógyszer 70%-a szívódik fel, orális dózisa (2 g/24 h)

17

viszonylag nagy. Elsősorban vesén keresztül ürül, eliminációs felezési ideje 8 óra körül van. A tetracyclinek kémiai szerkezetük következtében kelátképzők, azaz több vegyértékű

fémekkel

oldhatatlan

komplexek

képeznek.

Ezen

tulajdonság

hatáscsökkentő interakcióra vezet vas, magnézium, kalcium, aluminium együttadása esetén. Ennek a tulajdonságnak következménye, hogy a fejlődő csont kalciumához kötődik, ami magzatban és 8 év alatti gyermekeknél csont- és fogfejlődési zavarokhoz vezet. A tetracyclinek fotoszenzibilitást okoznak [26].

·HCl

6. ábra Az oxytetracyclin hidroklorid szerkezeti képlete

2.3.5. Tobramycin Tobramycin (7. ábra) szintén az aminoglikozidok csoportjába tartozó antimikróbás szer, melyet gyakran alkalmaznak csontinfekciók kezelése során. A baktérium riboszómájához kötődve fejti ki hatását, gátolja annak fehérjeszintézisét.

7. ábra A tobramycin szerkezeti képlete

18

2.3.6. Mupirocin A mupirocint (8. ábra), melyet a Pseudomonas fluorescens termel, 1985-ben kezdték el alkalmazni a klinikai gyakorlatban, Staphylococcus aureus és Streptococcus pyogenes elleni terápiában, azonban sajnos a bevezetését követően rövid időn belül előfordultak már rezisztens törzsek [28]. A mupirocin gátolja az izoleucin-t-RNS-szintetázt, meggátolva ezzel a baktérium fehérjeszintézisét. Ennek a hatásmechanizmusnak és különleges kémiai szerkezetének köszönhetően a mupirocin nem mutat keresztreakciót a klinikumban alkalmazott más antibiotikummal. Előírásszerű alkalmazása esetén kicsi a kockázata rezisztens baktériumok kiválasztódásának. Jelenleg csak kenőcs gyógyszerformában alkalmazzák.

8. ábra A mupirocin szerkezeti képlete

2.3.7. Antibiotikumok újabb generációi Az egyre gyakrabban megjelenő rezisztencia miatt szükséges újabb, hatékony szerek után kutatni, mint például a következők: •

Quinupristin-dalfopristin (9. ábra), amely az 50S riboszóma egységhez kapcsolódva gátolja meg a fehérjeszintézist. Hatékony az Enterococcus faecium (beleértve a vancomycin rezisztens genusokat is) és a Staphylococcus aureus (MRSA) ellen is, nem hat azonban az Enterococcus faecalisra.

•

Daptomycin (10. ábra) egy ciklikus lipopeptid, a mely számos Gram-pozitív baktérium

ellen,

még

az

MRSA,

Staphylococcus ellen is hatékony [17, 29].

19

valamint

vancomycin

rezisztens

•

Linezolid (11. ábra), az első tagja az oxazolidinone nevű gyógyszercsaládnak, amely a riboszóma két alegységének összekapcsolódásának gátlásán keresztül a fehérjeszintézist akadályozza [30]. Biohasznosíthatósága mind intravénás, mind orális alkalmazást követően 100%.

A

B

9. ábra Quintupristin (A) és dalfopristin (B) szerkezeti képlete

10. ábra Daptomycin szerkezeti képlete

11. ábra Új generációs antibiotikum, a linezolid szerkezeti képlete

2.3.8. Antibiotikum kombinációk Kevés

tanulmány

született

eddig,

amely

csontcementből

vizsgálta

antibiotikumok kombinációjából a vancomycin és a tobramycin kioldódását. Az aminoglikozidok és a penicillinek együttes alkalmazásakor inaktiválódás léphet fel. A

20

béta-laktám gyűrű felnyílik, mely az aminoglikozid aminocsoportjához kapcsolódva amidot eredményez [31].

2.4.

Ortopédiában

alkalmazott

lokális

hatóanyagleadó

rendszerek A lokális hatóanyag-leadó rendszerek fejlesztéséhez meg kell találni a megfelelő antibakteriális hatású anyagot, amely: •

aktív a legismertebb osteomyelitist okozó baktériumtörzsek ellen,

•

helyileg a MIC-et (Minimális inhibitor koncentráció) meghaladó (legalább tízszer nagyobb) koncentrációban szabadul fel az implantáció teljes ideje alatt,

•

nem okoz mellékhatásokat, nem kerül be a szisztémás keringésbe,

•

testhőmérsékleten stabil és vízben oldódik [32]. A revíziós műtétek során alkalmazott irrigátor oldatok (amelyek gyakran csak só

oldatok) alkalmasak a keletkezett vérrögök, törmelékek és a jelenlévő mikróbák mechanikai eltávolítására. Ugyanakkor ezek az oldatok kimoshatják a csontból az alkalmazott antibiotikumokat, így az nem megfelelő koncentrációban lesz jelen a szervezetben. Antibiotikum tartalmú irrigátor folyadékok hatékonyságát eddig még nem vizsgáltak, annak ellenére, hogy használatuk indokolt lenne a teljes ízületi pótlást biztosító műtétekben [33]. Az antimikróbás hatóanyag felszabadulása lokális hatóanyagfelszabadító rendszerekből a hatóanyag kioldódásának függvénye. A magas vízoldékonyságú hatóanyagok esetén a felszabaduló hatóanyag mennyisége a felülettől valamint a kezdeti hatóanyagtartalomtól függ. Rossz vízoldékonyságú hatóanyagok esetén (pl. kinolonok) a hatóanyagleadás a mátrix rendszer porozitásának, valamint a hatóanyag mátrixban való oldékonyságának függvénye. A lokális antibiotikum-felszabadító rendszereket (1. táblázat) két csoportba soroljuk: nem biodegradábilis és biodegradábilis rendszerek [34, 35].

21

1. táblázat Lokális hatóanyagleadó rendszerek és alkalmazott antibiotikumok [34] Lokális hatóanyagleadó rendszer

Alkalmazott antibiotikum

Nem biodegradábilis hordozórendszerek PMMA csontcement

gentamicin tobramycin

PMMA gyöngyök

gentamicin

Biodegradábilis hordozórendszerek Kollagén-gentamicin szivacs

gentamicin

Apatit-wollastonit üveg kerámia tömbök

cefmetazol isepamicin

Hidroxi-apatit tömbök

cefmetazol isepamicin arbekacin

Poli(laktid)/poli(glikolid) implantátumok

gentamicin

Dilaktát polimerek

ciprofloxacin perfloxacin flerofloxacin

Poliuretánok

flucloxacillin gentamicin ciprofloxacin fosfomycin

Fibrin alvadék

ciprofloxacin

Rostanyagok

tetracyclinek

2.4.1. Nem biodegradábilis hordozók A csoport fő képviselője a poli(metil-metakrilát) (PMMA) készült gyöngyök. Két formában ismertek [33]: •

antibiotikummal impregnált csontcement [31, 36-38], amit elsősorban arthroplasticában, valamint

•

az antibiotikummal impregnált PMMA láncok, amit musculoskeletalis infekciókban alkalmaznak [39, 40].

22

Az antibiotikummal impregnált csontcementet Európában több, mint 3 évtizede alkalmazzák, a legtöbb hatóság engedélyezi használatát. Az FDA (Food and Drug Administration) 2003-ban engedélyezte bevezetését [41]. Az antibiotikummal történő impregnáláshoz tobramycint, gentamicint és vancomycint használnak [42-44]. A kereskedelemben meghatározott nagyságú (7 mm) gyöngyök vannak forgalomban (Septopal®) [45], azonban vannak nem kereskedelmi készítmények is, melyeket sebészek készítenek. Ezek hátránya, hogy alacsonyabb benne az antibiotikum hozzáférhetősége, mert nem egyforma a gyöngyök mérete, valamint az antibiotikum hozzákeverése a gyöngyökhöz sem megfelelő. Krónikus osteomyelitis esetén a seb gyógyulása PMMA gyöngyök beültetését követően 5 nap múlva várható, a gyöngyök a betegben maradnak, kb. 4 hétig majd újabb sebészi beavatkozással távolítják el őket. Ez a PMMA gyöngyök legnagyobb hátránya, hiszen az újabb sebészi beavatkozás magában hordozza az újabb fertőzés lehetőségét. Azonban vizsgálatok azt mutatják, hogy ezen idő alatt a hatóanyag kevesebb, mint 50% szabadul fel. A standard kezeléssel kombinált PMMA csontcement alkalmazásának sikere 40-90% között van [46, 47]. A PMMA gyöngyök eltávolításának oka a szervezet késői válaszreakciója, melyet nagy valószínűséggel a PMMA észter-csoportjainak hidrolízise következtében megváltozó felszíni paraméterek okoznak [48]. A PMMA makromolekulák közé lehet inkorporálni vizes oldatot, így vízben oldódó hatóanyagot is, az össztömeg 2-5%-ának megfelelő mennyiségben. Így a vízoldékony hatóanyagok a környezetben lévő folyadékba képesek diffundálni. A felszabaduló antibiotikum mennyiségét a csontcement felszíne, az antibiotikum koncentrációja valamint a cement környékén lévő folyadék mennyisége határozza meg [49, 50]. A 2. táblázat a PMMA csontcement in vitro kioldódási vizsgálatainak kumulatív eredményeit mutatja. A táblázatban jól látható, hogy mind a kinolonok, mint az aminoglikozidok nagyon magas koncentrációt érnek el. A csúcskoncentrációt minden esetben az első napon mérték.

23

2. táblázat Különböző antibiotikumok PMMA gyöngyökből való in vitro felszabadulásának vizsgálatai (a beültetést követő 1. napokon) [34]

Felhasznált

Hatóanyagleadás

Legnagyobb

antibiotikum

időtartama (nap)

hatóanyagleadás (mg/L)

tobramycin

30

234-299

gentamicin

30

125-355

cefazolin

28

250

ciprofloxacin

28

74,5

clindamycin

28

407

Kuercle és

amikacin

5

200

mtsai

vancomycin

5

250

clindamycin

220

>250

tobramycin

220

>250

vancomycin

12

>200

Tanulmány

Nelson és mtsai

Adams és mtsai

Mader és mtsai

2.4.2. Biodegradábilis hordozók Az implantációra kerülő biodegradábilis polimerek legfontosabb tulajdonságai:


biokompatibilitás,




minimális irritáló hatás,




belőle keletkező bomlástermékek nem toxikus hatásúak.

Ezen polimerek nem vízoldékonyak, amelyek a szervezetben kémiai bomlást szenvednek, melynek következtében vízben oldódó monomerek vagy kisebb polimer egységek keletkeznek. A biodegradábilis polimerek csoportjait a 3. táblázat foglalja össze. A biodegradábilis anyagok kategóriája magába foglalja a kollagén-gentamicin szivacsot,

hidroxiapatit

tömböket,

poli(laktil)/poli(glikolid) implantátumokat és

apatit-wollastonite

üvegtömböket,

poli(laktát) polimereket, valamint

poliuretánokat. Ezeket, ellentétben a PMMA gyöngyökkel, nem kell sebészileg eltávolítani az antibiotikum felszabadulása után.

24

Doktori munkám során olyan hordozórendszer fejlesztésével foglalkoztam, amely biodegradábilis és a hatóanyagot megfelelő koncentrációban több héten keresztül képes leadni. Az irodalmi adat ilyen típusú hordozórendszerről nem található.

3. táblázat A biodegradábilis polimerek csoportjai

Polimerek

Képviselői

csoportjai

Természetes eredetűek: kollagén, zselatin, albumin Poli(amidok)

Szintetikus eredetűek: poli(glutaminsav), β-benzyl-Laszpartát/α-metil-glutamát, poli(glutaminsav/etil-glutamát) poli(glikolsav), poli(D,L-tejsav), poli(glikolid-ko-laktid), ε-

Poli(észterek)

caprolakton, δ-valerolakton

Poli(orthoészterek)

poli(orthoészter) II

Poli(anhidridek)

poli(bis-p-carboxi-fenoxi)metán poli(alkil-2-cyancrylate), poli(dihidropiran), poli(acetál),

Egyebek

poli(foszfazén), poliuretán, poli(dioxinon)

2.4.2.1. Kollagén-gentamicin szivacs A kollagén-gentamicin szivacs (12. ábra) a poli(metil-metakrilát) gyöngyökhöz hasonlóan egyre inkább elterjedt, a kereskedelemben 15 éve elérhető. Sterilezett (etiléndioxidos vagy gamma sugársterilezés) szarvasmarha ínből és gentamicinből állítják elő. A szervezetben 8 hét alatt teljesen lebomlik. Néhány tanulmány azt mutatja, hogy sajnos az antibiotikum leadása 4 nap alatt lezajlik, így a terápiás cél nem valósulhat meg [42, 51-53].

25

12. ábra Kollagén alapú szivacs szerkezete (Garamycin® Schwamm)

2.4.2.2. Laktil polimerek A

polimerizált

tejsav

szintén

ígéretesnek

tűnik

klinikai

alkalmazás

szempontjából. Legnagyobb előnye a szervezetbeli lebomlás valamint a rendszer előnyös farmakokinetikai viselkedése. Két formájuk létezik: 1. poli(laktid)/poli(glikolid) összetételű gyöngyök, 2. különböző molekulatömegű polimerizált dilaktidok. A PLA és PGA (poli(laktid) és poli(glikolid)) tartalmú kopolimereket különböző összetételben állítják elő, mely összetétel 90:10 és 50:50 között változhat. In vitro vizsgálatok szerint a 90:10 arányú kopolimer a stabilabb, lebomlása később következik be, valamint a hatóanyagleadása is előnyösebbnek mutatkozott clindamycin, vancomycin és tobramycin esetében [54]. Poli(glikolid)-poli(laktil) kopolimer (90:10) használatos törések fixálásánál [55, 56]. Néha azonban előfordul, hogy ez a fixálás nem megfelelő, melynek okát még nem tisztázták. A PGA és a PLA alapja glikolát és laktát. Ha ezeket polimerizáljuk, majd megolvasztjuk, akkor öntéses technikával vagy kihúzással pálcává, rúddá, lemezekké formázhatók. Ezek a polimerek a szénhidrát metabolizmus termékeivé alakulnak, melytől a szervezet a kilélegzett levegő segítségével válik meg [57]. Annak ellenére, hogy a glikolát és a laktát az emberi testben természetes módon is jelen van, néhány betegben mégis helyi allergiás reakció alakult ki, melynek oka még

26

ismeretlen. Valószínűsíthető, hogy ennek köze van a nagyon gyorsan bomló PGA-hoz [58]. Különböző antibiotikumok kioldódását vizsgálták ezen polimerekből. A gentamicin több mint 80%-a szabadult fel 3 hét után poli(laktát) mikrokapszulákból. Cefazolin és gentamicin kombinációját a rendszer 2-4 hét alatt adta le. VCM tartalmú 50:50 poli(D,L-laktid):ko-glikolid kopolimert is állítottak elő. A VCM tartalmú PLGA rendszereket in vitro kioldódási eredmények, valamint in vitro antimikróbás hatékonyságuk alapján értékelték, ezek között összefüggés is megállapítható volt. Az így előállított gyöngyök átmérőjének nagysága jelentősen befolyásolta a hatóanyag kioldódását [59]. Új-Zélandi nyulakon végzett összehasonlító in vivo vizsgálatok szerint ezen VCM tartalmú PLGA rendszerek hatékonyabbak az osteomyelitis kezelésében, mint a parenterálisan adagolt antibiotikumok [60].

2.4.2.3. Apatit-wollastonit Az apatit-wollastonite üveg kerámiatömböknek a porozitás szempontjából két típusa létezik. Ennek a rendszernek kiváló előnyös tulajdonsága, hogy a beültetett anyag osteogenesist vált ki, így a csont defektus teljes pótlása történik meg [61].

2.4.2.4. Poliuretánok Poliuretán

(poli(oxytetrametilén-glikol))

diszkek

előállításához

oldószer-

elpárologtatásos technikát alkalmaztak, a rendszerbe ciprofloxacint, gentamicint, fosfomicint, flucloxacillint inkorporáltak, oldással vagy szuszpendálással. A jó fizikaikémiai kompatibilitású anyagok poliuretán mátrixba ágyazva képesek a nyújtott hatóanyagleadásra.

Ezek

a

rendszerek

hatékonyak

a

bakteriális

kolonizáció

megelőzésében [62].

2.4.2.5. Hidroxiapatit A hidroxiapatit csontcement antibiotikummal impregnálva a PMMA és az intravénás antibiotikum használatára jelenthet alternatívát. Ez az anyag biztosítani tudja, hogy belőle a felszabaduló antibiotikum baktericid koncentrációban legyen jelen hosszú

27

időn át. Utólagos eltávolítására nincs szükség, mivel felszívódik (ellentétben a PMMAval). A felszívódás ideje hetektől a hónapokig változhat, a gyöngyök méretétől függően. Előnyös tulajdonsága, hogy a hidroxiapatitot lassan új csontszövet helyettesíti [63-65]. Zelken és munkatársai összehasonlító vizsgálatokat végeztek hidroxiapatit pasztákkal és PMMA csontcementtel. Az in vitro vizsgálatok szerint a két anyag közel azonos VCM leadási profillal rendelkezik, ugyanakkor a kevés állatszámú, osteomyelitis modellen végzett vizsgálatok szerint az osteomyeltis kezelésében a PMMA előnyösebbnek bizonyult [66]. Padilla

és

munkatársai

GEN

tartalmú

hidroxiapatit-PMMA-PEMA

hordozórendszereket vizsgáltak. A hatóanyagleadásban 3 fázist tudtak elkülöníteni. Az első fázisban a hatóanyagleadás nagyon gyors (kb. 30% 10 óra alatt), a második fázisban lassabb (ez kb. 10-16 napig tart, a hatóanyag összmennyiségének 60%-át adja le a rendszer), a harmadik a leglassúbb fázis, amikor a hatóanyag kb. 10% szabadul fel a rendszerből (ez 16-70 napot vesz igénybe) [67, 68]. A hidroxiapatitot titán implantátumok bevonataként is lehet alkalmazni. Stigter és munkatársai olyan hidroxiapatit rendszerrel vontak be implantátumokat, amelyek antibiotikumot is tartalmaztak. A kísérletek során megállapították, hogy a savas karakterű antibiotikumok lassabban szabadulnak fel a bevonatból [69].

2.4.2.6. Kálcium-szulfát A kálcium-szulfát használata az ortopédiában a 19. században elkezdődött. Előnyös tulajdonságai közé tartozik, hogy nem szükséges a terápia befejeztével eltávolítani és az anyag elősegíti a csont újjáépülését [70, 71]. Hátránya, hogy citotoxikus tulajdonságú, gyulladásos reakciót idéz elő, amelyet már több tanulmányban is bemutattak, illetve az antibiotikum megkeményedés előtti hozzáadása csökkenti az antibakteriális aktivitást [72]. Ezen hátrányok kivédése miatt folytattak kutatásokat, mégpedig nanokristályos hidroxiapatitot kálcium-szulfátba ágyazott rendszereken. A vizsgálatok alapján in vitro körülmények között az előállított rendszerek nem mutatnak citotoxicitást és jobb biokompatibilitással bírnak, mint a tiszta kálcium-szulfát, melynek akár 50%-a is helyettesíthető nanorészecskés hidroxiapatittal.

28

2.4.2.7. Alginátok Kálcium-alginátot is impregnáltak VCM-nel, sebészi fertőzések kezelésére. Az alginátok széleskörűen vizsgált anyagok, amelyek nem toxikusak, nem okoznak allergiát és teljesen biodegradábilisek. Ugyanakkor, ha a szervezetben maradnak hosszabb ideig, akkor idegen test reakciót válthatnak ki [73-75].

2.4.2.8. Ciano-akrilátok A ciano-akrilátok biodegradábilis, hemosztatikus, nem allergén szövetadhezív anyagok,

lokális

antibakteriális

hatékonysággal.

Használatosak

arteriovenózus

elváltozások, aneurizmák, retina ruptúrák és bőr-sérülések kezelésében. Nem biológiai környezetben ciano-acetáttá és formaldehiddé hidrolizálnak, míg biológiai közegben alkalmazva lebomlásuk során szén-dioxid és kis mennyiségű ciano-acetát keletkezik, amely rendszerint a vizelettel és a széklettel ürül [76-78]. Eskandari és munkatársai VCM-tartalmú ciano-akrilát hatóanyagleadó rendszert állítottak elő. Az in vivo vizsgálatokat követő hisztológiai vizsgálatok kimutatták, hogy lokális gyulladást okoz a rendszer, ugyanakkor a hatóanyagleadás nyújtott, akár a 6 hetet is elérheti [76].

2.4.2.9. Poli(ε-caprolakton) A

Nantes-i

egyetem

kutatócsoportja

kifejlesztett

egy

injektálható

csonthelyettesítőt, amely poli(ε-caprolakton) mikropartikulák kombinációja bifázisos kálcium-foszfát granulákkal. Az antibiotikum mikrorészecskékbe történő kapszulázása megvédi a hatóanyagot, kontrollálja a hatóanyag-felszabadulást és megőrzi az anyag reológiai tulajdonságait. Korábbi kutatások leírtak egy injektálható csonthelyettesítőt, amely bifázisos kálcium-foszfát granulákból és cellulóz hidrogélből állt. Ezekben a kutatásokban a kristályrészhez adszorpcióval kapcsolódik a hatóanyag, így azonban nehéz kontrollálni a ténylegesen kötődő hatóanyag mennyiségét és a kioldódás kinetikája is változékony. 80-200 µm nagyságú kálcium-foszfátot inkorporáltak cellulóz gélbe (50/50 w/w). A hatóanyag felszabadulását a polimer mátrixon keresztüli diffúzió irányítja. A vizsgálatok során különböző mennyiségű mikrorészecskét tettek a rendszerbe. A megfigyelések azt mutatják, hogy 45% a legmagasabb arány, amelyben

29

még lehet mikrorészecske, és amikor még nem változik meg az injektábilitás jelentősen. Ezen összetételből még több hét után is kimutatható hatóanyag felszabadulás [79].

Az antibiotikummal impregnált biodegradábilis hordozórendszerek szerepe akkor nő meg igazán, ha lehetőség lesz arra, hogy belőlük lemezeket, vagy apró rudakat formázzanak törések kezelésére, vagy ízületi pótlásnál tűként, bevonatként vagy lemezként alkalmazhatók lesznek [80]. Mindazonáltal a fentebb említett biodegradábilis rendszerek nem jelentik az egyetlen lehetőséget az osteomyelitis kezelésében. Gyakran az osteomyelitis miatt kialakult osteolízist csontgraftok felhasználásával kezelik. Lehetőség van arra, hogy az antimikróbás hatóanyagot ehhez a csontbankból származó csonthoz (13. ábra) adják hozzá, keveréssel, ráfecskendezéssel, vagy esetleg bevonással. Ezekkel szemben az a tapasztalat, hogy a beültetett anyag körül gyorsan nagy lesz az antibiotikum koncentrációja, majd hosszú ideig egy alacsonyabb koncentráció perzisztál. Az elvégzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a lokális magas antibiotikum koncentráció (mely a MIC érték 220-szorosát is elérheti) nem zavarja az allograft integrációját [81]. Ugyanakkor a széles körű alkalmazás miatt a rezisztencia egyre terjed, éppen ezért csak a szükséges esetekben (mikor az adott baktérium jelenlétének fenn áll a veszélye, illetve revíziós műtétek esetén indokolt az alkalmazásuk) [82-84]. Az antibiotikummal történő impregnálás nem befolyásolja a csont beépülését, melyet hisztológiai, radiológiai és immunhisztokémiai vizsgálatok is alátámasztották [85]. Winkler és mtsai vancomycinnel és tobramycinnel impregnáltak humán csontgraftokat. A sterilezett graftokat 24 órán keresztül hagyták állni a 100 mg/ml VCM, illetve a 80 mg/ml koncentrációjú tobramycin oldatokban. Vizsgálataik szerint az így impregnált csontgraft a hatóanyagot a környezetébe leadja, előbb nagy koncentrációban, aztán egyre csökkenő koncentrációban. Ez a farmakokinetika megfelelőnek tűnik csontinfekciók kezeléséhez, ahol a legmegfelelőbb terápia a kezdeti magas dózisú antibiotikum [86].

30

1000 µm

13. ábra Humán liofilizált, gázsterilizált csont mátrix zselatin

Az elmúlt néhány évben megnőtt az érdeklődés olyan hatóanyagleadó rendszerek fejlesztése iránt, melyek injekció formájában alkalmazhatók. Ezen rendszerek nagyon előnyös tulajdonsága, hogy alkalmazásuk egyszerű, a kívánt hatás helyén hatnak, a hatóanyagot hosszú időn keresztül adják le, kevesebb a mellékhatás, jobb a betegek complience-e [87]. Az említett hordozórendszerek mellett folynak kutatások antibiotikum tartalmú gélrendszerek kifejlesztésére is. Ígéretesnek tűnik a Poloxamer® 407 felhasználása, amely reverzibilis termális gélesedést mutat: folyékony formában lokális injekcióként az érintett területre kell juttatni, majd a rendszer in situ, testhőmérsékleten gélesedik. Előnye, hogy vízoldékony, nem toxikus, a szervezet számára közömbös [88, 89].

2.5. Csontviasz alkalmazásának jelentősége A csont élő, keringéssel ellátott szerv. Műtétek során előfordulhat, hogy a csont elkezd vérezni, amelynek elállítása nagy problémát jelenthet, főként az erősen vaszkularizált csontok esetén [90, 91]. A múltban a legegyszerűbb és legelterjedtebb módja a csontszövet vérzéseinek megállítására a csontviasz alkalmazása volt. A csontviaszt méhviaszból (70%) állítják elő, melyhez vazelint adnak (30%) [91]. Használatakor a csontviaszt lágyítás után a csontfelszínre kenik, mely eltömíti az ereket. Annak ellenére, hogy használata nagyon könnyű, gazdaságos és a hatása azonnal bekövetkezik, a méhviasznak számos hátrányos tulajdonsága is van:

31

•

gátolja az új csont képződését, mely kritikus lehet a csont gyógyulási folyamatában,

•

használata növeli a csontinfekciók kialakulásának esélyét,

•

idegen test reakciót, fibrózis- és granulómaképződést válthat ki [91].

Ezen hátrányos tulajdonságok elhárítására fejlesztették ki az Ostene®-t. Az Ostene® egy vízoldékony keverék, mely pontosan úgy néz ki és viselkedik, mint a méhviasz. Összetételét tekintve az Ostene® vízoldékony alkilén-oxid-kopolimerek (etilén-oxid és propilén-oxid származékok) steril keveréke. A szervezetben nem metabolizálódik, változatlan formában eliminálódik [92].

2.6. Egyéb, helyi alkalmazású terápiás rendszerek A terápiás rendszerek alkalmazása számos előnnyel bír, nem csak a farmakon terápiás hányadát képesek megnövelni, hanem lehetővé teszik olyan farmakonok alkalmazását is, melyek konvencionális formában nem lennének adagolhatók toxicitásuk, mellékhatásaik vagy rövid biológiai felezési idejük miatt. A terápiás rendszer olyan hatóanyagtartalmú készítmény, mely folyamatosan előre meghatározott sebességgel és időn át képes leadni a hatóanyagot a szisztémás keringésbe vagy a meghatározott célszervbe. A terápiás rendszereket csoportosíthatjuk alkalmazásuk szerint, így vannak infúziós, implantációs, orális, transzdermális, okuláris és uterin rendszerek. Az implantációs, oculáris és uterin rendszerek esetén főként a lokális hatásnak van nagy jelentősége. Az implantációs rendszerek ortopédiában használatos példáival a 2.4. fejezetben foglalkoztam. A szemészeti terápiás rendszerek közül a glaukóma kezelésére jelenleg a pilokarpin tartalmú Ocusert® terápiás rendszert alkalmazzák. Ez 7 napon át tudja a hatóanyagot megfelelő koncentrációban biztosítani. A vízben rosszul oldódó hatóanyagok esetén kiválóan alkalmazható a NODS (New Ophtalmic Delivery System). A szemészeti készítmények közül legújabbak a kontaklencsék, amelyben a hidrogélben lévő víz helyettesíthető farmakon vizes oldatával.

32

A intrauterin terápiás rendszerek helyettesíteni tudják az orális fogamzásgátlók alkalmazását. Ezek „T”-alakú felépítésűek, melynek üreges szárában elhelyezhető a hatóanyagraktár, mely szilikonolajban diszpergálva tartalmazza a farmakont. Ezen rendszereket alkalmazva a szervezet hormonterhelése elenyésző az orális alkalmazáshoz képest. Ozmózissal szabályozott terápiás rendszerek esetében a hatóanyagleadást az ozmózis jelenségével lehet szabályozni. Ez a forma alkalmazható implantátum formájában is. A rendszer két részből áll: ozmotikus anyagot tartalmazó részből külső oldalán szemipermeábilis hártyával és egy gyógyszerraktárból. A rendszer a külső környezetből vizet szív, az ozmotikus anyag feloldódik, a keletkezett nyomás hatására a belső kamrában található hatóanyag kiáramlik [93, 94].

2.7. A hatóanyagok kvantitatív meghatározásának ismert módszerei Az antibiotikum tartalmú hordozórendszerek in vitro és in vivo vizsgálatánál is nagyon fontos a kioldódott hatóanyag pontos mennyiségének meghatározása. Az in vitro antibiotikus aktivitásmérés az egyik lehetőség az előállított hordozórendszerek vizsgálatára. Az antibiotikumok hatóértékét úgy állapítjuk meg, hogy azt a gátló hatást hasonlítjuk össze, melyet a vizsgálandó antibiotikum és a referenciaanyag ismert koncentrációi az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmusok szaporodására kifejtenek. Az értékmérést vagy diffúziós módszerrel vagy turbidimetriás módszerrel lehet meghatározni.

A

mikroorganizmussal

diffúziós beoltott

módszer táptalajra

során helyezzük

meghatározott a

mennyiségű

Gyógyszerkönyv

által

meghatározott oldószerek felhasználásával készült antibiotikum-oldatot, majd a kialakult gátlási zónát vizsgáljuk. A turbidimetriás módszer esetén a referencia-anyag valamint a meghatározandó anyag oldatából három különböző koncentrációt vizsgálunk. A különböző koncentrációjú oldatokhoz a beoltott táptalajból adunk meghatározott mennyiséget. Az antibiotikumok meghatározására különféle analitikai módszerek alkalmasak, melyek közül a legelterjedtebbek a vékonyréteg kromatográfia, fluoreszcens

33

polarizációs immunoassay- és radioimmunoassay vizsgálatok, kapilláris elektroforézis, folyadékkromatográfia különféle detektálási módszerekkel (UV, tömegspektrométer stb.) [95, 96]. Az antibiotikumok mennyiségének meghatározására az egyik legelterjedtebb mérési módszer a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC). A kromatográfiás eljárások célja a többkomponensű gáz, gőz vagy folyadékelegyek összetevőinek elválasztása. Az elválasztandó komponensek egy állófázis (oszlop) és egy azon meghatározott irányban áramló mozgófázis (eluens) között oszlanak meg. A mozgófázisban a komponensek eltérő sebességgel vándorolnak, így egymástól elválnak. Az állófázis után detektor segítségével valamilyen fizikai vagy kémiai tulajdonságuk alapján mérik a komponenseket. Az oszlopról eluálódó anyagok által a detektorban keltett jel intenzitását az idő függvényében ábrázolva kapják a kromatogramot, amely lehetővé teszi az elválasztott anyagok minőségi és mennyiségi meghatározását. A folyadékkromatográfiában a mozgófázis folyadék, amely a minta komponenseivel kölcsönhatásba lép. Ez a kölcsönhatás az elválasztás alapja. Az elúció lehet izokratikus, amikor az eluens összetétele állandó az elválasztás során, és lehet gradiens, amikor az eluens összetétele egy megadott program szerint változik. A kromatográfiás technikák esetén alkalmazott detektorok a következők: • Törésmutató detektor: az eluens és az oldott anyagot tartalmazó eluens közötti törésmutató különbséget jelzi. Érzékenysége 10-3 – 10-5 M. • Spektrofotometriás

detektor:

UV-VIS

hullámhossztartományban

mért

fényelnyelés alapján működik. Érzékenysége: fotometria: 10-3 – 10-6 M, LC-UV: 10-4 – 10-8 M. • Fluoreszcens detektor: A fluoreszkáló anyagok meghatározására alkalmas UVVIS tartományban. Érzékenység 10-3 – 10-6 M. • Fényszórás mérésén alapuló detektor. Érzékenység 1-2 ng. • Radioaktivitás mérésen alapuló detektor. Érzékenység 10-7 – 10-10 M. • Elektrokémiai

detektor:

vezetőképesség,

potenciometria,

amperometria,

polarográfia mérésén alapuló eljárás. Érzékenysége: 10-3 – 10-7 M. • Dielektromos állandó mérésén alapuló detektor. Érzékenysége: 10-4 – 10-6 M. • Tömegspektrometriás detektor: (ionforrások: ESI, APCI, APPI) Érzékenysége: pmol, fmol.

34

VCM analitikai meghatározására az irodalomban számos módszert találhatunk: nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia [96-106], kapillár elektroforézis [107], tömegspektrometria [95, 109]. Baranowska

és

munkatársai

egy érzékeny

és

gyors

fordított

fázisú

nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert dolgoztak ki diódasoros és fluoreszcens detektálással, 11 hatóanyag (köztük a VCM) meghatározására humán vizeletből. A hatóanyagok meghatározása 20 perc alatt kivitelezhető volt [108]. Direkt szérum injektálással Kitahashi és munkatársai határozták meg VCM koncentrációját. Vizsgálataikhoz micelláris elektrokinetikus kapilláris elektroforézist alkalmaztak. Kutatásaik során a VCM migrációs ideje 7 perc volt. Az általuk fejlesztett módszer előnye, hogy a klinikai gyakorlatban hasznosítható a direkt szérum injektálás miatt [107]. Egy gyors, egyszerű és robosztus HPLC módszert fejlesztettek ki Luksa és munkatársai a bioekvivalencia vizsgálatokhoz. A plazma mintákból a hatóanyagot fehérjekicsapást követően, folyadék-folyadék extrakcióval nyerték ki. A fejlesztett és validált kromatográfiás rendszer izokratikus elúció után UV detektálással határozták meg a VCM-t (a retenciós idő 5 perc) [97]. Farin és munkatársai egy új HPLC módszert írtak le UV detektálással, amely alkalmas

szövet

és

plazmaminták

szilárd

fázisú

extrakciót

követő

VCM

koncentrációjának monitorozására. A biológiai mintákat gradiens elúcióval mérték, a retenciós idő 25 perc volt [99]. Diana és munkatársai a VCM szennyezéseinek kimutatására és kvantitatív meghatározására fejlesztettek HPLC módszert tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS). Munkájuk során vizsgálták a VCM fragmentációját és az ismert származékokat, valamint 6 különböző kereskedelmi forgalomban kapható mintát tanulmányoztak [95]. A GEN analitikai meghatározására az irodalomban számos módszert találhatunk: nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia különböző detektálási módokkal [110-118], immunoassay-k [119], kapillár elektroforézis [120-124], tömegspektrometria [125].

35

Yusuf és munkatársai egyszerűsített HPLC módszert használtak a GEN komponensek meghatározására plazmamintából. Méréseik során a retenciós idő 33 perc volt, az áramlási sebesség pedig 2,5 ml/perc. Ezzel a rendszerrel 50 µl-nyi minta analízise vált lehetővé nagy pontossággal [112]. Megoulas és kutatócsoportja kifejlesztett egy folyadékkromatográfiás módszert ELSD detektorral (evaporative light scattering detector) GEN meghatározására különböző gyógyszerformákból (injekció, csepp, krém). Csak a krémek esetében volt szükség mintaelőkészítésre (folyadék-folyadék extrakció) [110]. Egy gyors (retenciós idő 10 perc) és egyszerű HPLC módszert (ELSD detektálással) fejlesztett a gentamicin-szulfát kvantitatív meghatározására Clarot és munkacsoportja. Vizsgálataikat tömegspektometriás mérésekkel is alátámasztották, melyek szerint szennyezők nem választódnak el a gentamicintől [111]. Manyanga és munkatársai olyan folyadékkromatográfiás módszert fejlesztettek tovább GEN meghatározására, mely az Európai Gyógyszerkönyvben is megtalálható. A módszer reprodukálhatónak, lineárisnak és robosztusnak bizonyult [113, 114]. A CPFX analitikai meghatározására nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiát [126-131], kapilláris elektroforézist [132, 133], tömegspektrometriát [134-137] alkalmaznak. Mivel kísérletes munkám során olyan módszert használtam a CPFX kvantitatív meghatározására, mely az irodalomban már megtalálható, ezért a CPFX analitikai meghatározásának irodalmi hátterével részletesen nem foglalkozom.

2.8. Analitikai módszerek validálásának irányelvei Az analitikai módszerek validálása során a következő paraméterek vizsgálatát írják elő a nemzetközi irányelvek [138-140]: • Szelektivitás (Selectivity). Egy módszer szelektivitása arra vonatkozik, hogy a módszer milyen mértékben képes az adott alkotó meghatározására egyéb zavaró alkotók jelenlétében. További kiegészítő információt kaphatunk csúcstisztaság vizsgálattal. • Rendszeralkalmassági vizsgálatok. Az analitikai rendszer reprodukálhatóságának ellenőrzésére szolgáló vizsgálatok sorozata, amely kiterjed a módszer zavartűrőképességének és robosztusságának meghatározására. Ezen vizsgálatok során

36

változatjuk az áramlási sebességet, a mozgófázis szerves anyag tartalmát, a kolonna hőmérsékletét valamint a meghatározás hullámhosszát. • Torzítatlanság (Accuracy). Azt mutatja meg, hogy a mérés eredménye mennyire van közel a valódi értékhez. Az átlag eltérése a valódi értéktől a mérés pontosságául szolgál. • Pontosság (Precision). A vizsgáló eljárás/módszer pontossága a homogén mintából

vett,

meghatározott

számú

független

mérési

eredmény

megegyezésének mértéke, amelyet a szórás %–val fejeznek ki [141]. A pontosságot ismételhető és reprodukálható körülmények között, ill. azonos helyen, de változó körülmények között kell vizsgálni. o Napon belüli és napok közötti megbízhatóság. A napok közötti megbízhatóság meghatározása 6 egymást követő napon QC mintákkal (alacsony, közepes és magas koncentráció) történik, pontossággal és torzítatlansággal jellemzik. A napon belüli megbízhatóságot három különböző koncentráció szinten (alacsony, közepes és magas) határozzák meg és a napok közötti megbízhatósághoz hasonlóan pontosság és torzítatlanság adatokkal írják le. • Linearitás (Standard curve) / mérési tartomány. A vizsgáló eljárásnak az a képessége, hogy az analitikai jel egyenesen arányos a mintában lévő vizsgálandó anyag mennyiségével. A kalibrációs görbe linearitása azt fejezi ki, hogy a kalibrációs görbe az ún. lineáris tartományban adott megbízhatósággal egyenesnek tekinthető. A méréstartományt lefedő koncentrációjú minták elemzésével határozzák meg. A mérési tartományt az alkotókat különböző koncentrációban tartalmazó minták elemzésekor a válaszjel meghatározásával állapítják meg az adott feladatnál kielégítő pontossággal és precizitással. A korrelációs koefficiens r = 0,995 feletti érték fogadható el. • Meghatározási határ (Limit of Quantification, LOQ). Az analitikai mérőgörbe legalsó értékelhető pontja (nem extrapolálható), ahol a jel/zaj arány 10:1. Megadott pontossággal és precizitással kell megadni. A kalibrációs görbe fejlesztésekor az LOQ névleges koncentrációtól való eltérése 20%. • Kimutatási határ (Limit of Detection). Az anyagnak azt a legkisebb koncentrációját jelenti, amely még kimutatható a mintában az adott kísérleti

37

körülmények között. Számszerűleg azt a koncentrációt jelenti, ahol a jel:zaj arány minimálisan 3:1. • Stabilitás (Stability). A stabilitásvizsgálat a mérésre előkészített minta kémiai és biológiai stabilitásának (pl. párolgás, hidrolízis, rohadás) meghatározását jelenti. Segítségével a mérés időbeni korlátai határozhatók meg, azaz egy olyan időintervallum, amelyen belül az előkészített minták elemzési folyamatát be kell (lehet) fejezni.

2.9. Implantátumok hatóanyagleadásának vizsgálata Az implantátumok hatóanyagleadásának vizsgálatára az irodalomban fellelhető mind in vitro, mind in vivo körülmények között végzett kutatás is. Az in vitro tanulmányok magukba foglalják a kioldódási vizsgálatokat, valamint a mikrobiológiai vizsgálatokat is. A kioldódási vizsgálatokhoz leggyakrabban foszfátpuffert alkalmaznak kioldóközegként [59, 60]. Ezek a vizsgálatok a hatóanyagleadást csak napokig követik nyomon. A mikrobiológiai vizsgálatok során a hatóanyagot tartalmazó implantátumot vagy hordozórendszert általában táptaptalajra helyezték, és a körülötte kialakuló gátlási udvar nagyságát olvasták le. Az in vivo vizsgálatok során állatmodellen figyelik a készítmények hatékonyságát. Az in vivo vizsgálatok során a beültetett implantátum hatékonyságát radiológiai vagy szövettani erdeményekkel támasztják alá. A hatóanyag vérszintje szintén monitorozható [42, 68, 83].

38

3. Célkitűzések A periprotetikus infekciókat (a protézist körülvevő területek gyulladását), melyek az ortopéd sebészeti gyakorlatban nagy jelentőséggel bírnak, elsősorban Staphylococcus aureus és Staphylococcus epidermidis törzsek okozzák. Ezen fertőzések gyakran csontveszteséghez, osteolysishez vezetnek. A gyógyszer-formulálásnál alapvető követelmény, hogy olyan gyógyszerhordozó rendszert állítsunk elő, amely képes a hatóanyagot a hatás helyére szállítani és ott biztosítani a megfelelő koncentrációt folyamatosan. A klinikai gyakorlatban jelenleg nem érhető el olyan biodegradábilis, antibiotikumot tartalmazó rendszer, amely autológ vagy homológ csontgraftokhoz keverhető vagy köthető. A kutatások egy olyan hordozórendszer tervezésére és vizsgálatára irányultak, amely alkalmas antibiotikumok lokális felszabadítására csontműtét során a szervezetbe (intraartikuláris, intramedulláris, intraosszeális) juttatva. Olyan specifikus hordozó rendszerek előállítása volt a feladat, amelyek tehát alkalmasak a csonthiányok pótlása során felhasznált csontgraftok antibiotikumokkal történő bevonására. Ezáltal folyamatosan biztosítani tudják – akár néhány héten keresztül – az alkalmazás helyén a hatékony koncentrációt. Az antibiotikum csontból történő kontrollált kiáramlása jelentősen lecsökkentheti a revíziós műtétek (protézisek cseréje) során kialakuló szeptikus következményeket. Munkám során célul tűztem ki: 1. antibiotikum

tartalmú

hatóanyagleadó-rendszerek

előállítását,

melyek

alkalmasak csontgraftok bevonására, csontőrleményhez való keverésére, így biztosítani tudják a csont környezetében a megfelelő antimikróbás koncentrációt, 2. a

hatóanyagleadás

vizsgálatát,

valamint

a

különböző

segédanyagok

hatóanyagleadás sebességét befolyásoló hatásának tanulmányozását, 3. a hatóanyagleadás nyomon követésére alkalmas analitikai módszerek fejlesztését és validálását, 4. az előállított gélek és hordozórendszerek fiziko-kémiai tulajdonságainak, valamint hatóanyagleadásának vizsgálatát, 5. in vitro-in vivo összefüggések vizsgálatát, 6. alkalmazhatóság és in vivo viselkedés tanulmányozását.

39

4. Kísérleti anyagok és módszerek 4.1. Felhasznált anyagok 4.1.1. Modell hatóanyagok Az antibiotikum tartalmú gyógyszerhordozók előállításához a preformulációs vizsgálatokhoz, valamint a további vizsgálatokhoz modell hatóanyagnak a vancomycint (Vancomycini hydrochloridum, Ph. Hg. VIII.) választottam. A már kifejlesztett hordozórendszerekbe gentamicint (Gentamicini sulfas, Ph. Hg. VIII.), ciprofloxacint (Ciprofloxacini hydrochloridum, Ph. Hg. VIII.) és oxytetracyclint (Oxytetracyclini hydrochloridum, Ph. Hg. VIII.) is inkorporáltam. A felhasznált hatóanyagok fizikaikémiai paramétereit a 4. táblázat tartalmazza.

4. táblázat A vizsgálatokhoz felhasznált hatóanyagok fizikai-kémiai paraméterei Hatóanyag Paraméter

vancomycin gentamicin ciprofloxacin oxytetracyclin

Molekulatömeg

1449,2540

477,5954

331,3415

460,4340

Olvadáspont (°C)

133 - 135,6

105

255 - 257

183

2,25 ×10-1

1,26 ×101

1,35

8,10 ×10-1

-3,1

-3,1

2,3

-1,

Előrejelzett vízoldékonyság (mg/ml) lopP/hidrofobicitás

4.1.2. Segédanyagok A gélek előállításához a következő segédanyagokat használtam: •

Carbopol® 934P, 940, 971P, 980, 974 PNF (Carbomera, Ph. Hg.VIII.; Noveon Ltd, Cleveland, USA)

A

Carbopol®

polimerek

olyan

akrilsav

származékok,

melyekhez

keresztkötésekkel poli(alkenil-éterek) vagy divinil-glikol kapcsolódnak. Könnyen vesznek fel vizet, hidratálódnak és duzzadnak. Vizes diszperzióijának pH-ja 2,5-3,0

40

között van, ezt semlegesítve viszkozitásnövelő gélképzőként használatosak. A Carbopol®-ok

különböző

típusai

vannak

forgalomban,

melyek

között

a

keresztkötések száma, az előállítási körülmények tesznek különbséget. A különböző típusok felhasználási területei eltérőek. A Carbopol® 934 P-ben allil-szukrózzal létesülnek a keresztkötések, a polimerizáció benzolban történik. A Carbopol® 971 P és 974 P-ben a keresztkötéseket allil-penta-erythrollal képezik, a polimerizációt etilacetátban végzik. Ez utóbbi kettő között a keresztkötések számában van különbség. •

Poli(vinil-alkohol) (PVA) (Poly(alcohol vinylicus) Ph. Hg. VIII.; Hungaropharma Zrt., Magyarország)

A poli(vinil-alkoholt) vinil-acetát polimerzációjával állítják elő úgy, hogy a keletkezett poli(vinil-acetátot) katalitikus mennyiségű lúg vagy ásványi sav jelenlétében részlegesen vagy csaknem teljesen hidrolizálják. Átlagos relatív molekulatömege 20000-150000, viszkozitása 3-70 mPas, észterszáma (mely a hidrolízis fokát jellemzi) legfeljebb 280. •

metil-cellulóz (Methylcellulosum, Ph. Hg. VIII.; Hungaropharma Zrt., Magyarország)

A metilcellulóz részben O-metilezett cellulóz. Fehér, sárgásfehér vagy szürkésfehér por, illetve szemcsék. Forró vízben, acetonban, etanolban, éterben és toluolban gyakorlatilag nem oldódik. Hideg vízben kolloid oldatot képezve oldódik. •

hidroxietil-cellulóz

(Hydroxyaethylcellulosum,

Ph.

Hg.

VIII.;

Hungaropharma Zrt., Magyarország) A hidroxietilcellulóz részlegesen O-2-(hidroxietilezett) cellulóz. Fehér, sárgásfehér vagy szürkésfehér por, illetve szemcsék. Forró és hideg vízben kolloid oldatot képez. Acetonban, alkoholban és toluolban gyakorlatilag nem oldódik.

41

A hordozórendszerek előállítására a következő segédanyagokat használtam: •

Cera alba (Ph. Hg. VIII.; Hungaropharma Zrt., Magyarország)

A fehér viaszt sárga méhviaszból, színtelenítéssel állítják elő. Fehér vagy sárgásfehér darabokból vagy lemezkékből áll. Vízben gyakorlatilag nem oldódik, forró alkoholban részben oldódik, zsíros olajokban és illóolajokban teljesen feloldódik. Cseppenéspontja 61-66 °C, észterszáma 70-80, savszáma 17,0-24,0, szappanszáma 87-104. •

Vaselinum album (Ph. Hg. VIII.; Hungaropharma Zrt., Magyarország)

Kőolajból nyert, félszilárd szénhidrogének tisztított és elszíntelenített vagy csaknem elszíntelenített elegye. Áttetsző, lágy, kenőcsállományú anyag. Vízben gyakorlatilag nem oldódik, diklór-metánban oldódik, alkoholban és glicerinben gyakorlatilag nem oldódik. Cseppenéspontja 35 és 75 °C között van. • A

Precirol® ATO 5 (Gattefossé SA, Saint-Priest, Franciaország) Precirol®

ATO

5,

gliceril-palmitosztearát,

melyet

glicerin

palmitosztearnisavval való észteresítésével állítanak elő. Palmitosztearinsav mono-, di- és trigliceridjeinek keveréke, melyben a diészter frakció dominál. Olvadáspontja 56 °C. HLB értéke 2. •

Gelucire® 50/13 (Gattefossé SA, Saint-Priest, Franciaország)

A Gelucire® 50/13 amfifil tulajdonságú, félszilárd anyag. Olvadáspontja 50 °C, HLB értéke 13. Hidroxil-száma 36-56. Előállítása PEG 1500-ból és hidrogénezett pálmaolajból történik. Összetétele: -

20% mono-, di- és trigliceridek

-

72% PEG 1500 mono- és di- zsírsav észterei

-

8% szabad PEG 1500.

42

•

Gelucire® 44/14 (Gattefossé SA, Saint-Priest, Franciaország)

A Gelucire® 44/14 amfifil tulajdonságú, félszilárd anyag. Olvadáspontja 44 °C, HLB értéke 14. Hidroxil-száma 36-56. Előállítása PEG 1500-ból és hidrogénezett pálmaolajból történik. Összetétele: -

20% mono-, di- és trigliceridek

-

72% PEG 1500 mono- és di- zsírsav észterei

-

8% szabad PEG 1500.

Gelucire®-ok

A

a

gyógyszertechnológiában

régóta

használatosak,

oldékonyságnövelő segédanyagként, illetve módosított hatóanyagleadású rendszerek formulálásakor.

4.1.3. Vegyszerek, oldószerek Az analitikai meghatározásokhoz használt HPLC tisztaságú vegyszereket (metanol,

acetonitril,

ammónium-acetát)

a

Sigma-Aldrich

Kft-től

(Budapest,

Magyarország) vásároltuk. A vizsgálatokhoz felhasznált vizet a Millipor Direct-Q® 3 UV (Millipore, Molsheim, Németország) víztisztító berendezés alkalmazásával állítottam elő.

4.2. Módszerek 4.2.1. Gélek előállítása A Carbopol®-t tartalmazó gélek előállításakor a Carbopol®-t desztillált vízzel leöntöttük és 24 órán át 10 °C alatti hőmérsékleten tartottuk. Másnap 1,2 %-os nátriumhidroxid oldattal semlegesítettük, melynek következtében gélképző származék keletkezett. A metil-cellulózt, illetve hidroxietil-cellulózt forró vízben eloszlattuk és a folyadékot 24 órán át 10 °C alatti hőmérsékleten tartottuk. A gélek összetételét az 5. és 6. táblázat mutatja.

43

A VCM tartalmú gélek hatóanyagtartalma 50 mg/g gél, a GEN tartalmú gélek hatóanyagtartalma 40 mg/g gél.

5. táblázat Az előállított VCM-tartalmú gélek összetétele

Összetétel neve

A gélképző típusa

Koncentráció (%)

A

Carbopol® 934 P

10

B

Carbopol® 971 P

10

C

Carbopol® 980

10

D

Carbopol® 974 PNF

10

E

Hydroxyaethylcellulosum

10

6. táblázat Az előállított GEN-tartalmú gélek összetétele

Összetétel neve

A gélképző típusa

Koncentráció (%)

A

Carbopol® 940

3

B

Methylcellulosum

10

C

poli(vinil-alkohol)

14

D

Carbopol® 980

3

E

Carbopol® 980

5

F

Carbopol® 980

10

4.2.2. Hordozók előállítása A

lipofil

segédanyagok

keverékét

60-70

°C-on

megolvasztottam.

A

megolvasztott keverékkel a hatóanyagot szuszpendáltam (4 mg/tabletta illetve 5 mg/g

44

pálcika), majd folyamatos keverés mellett pálcika vagy tabletta formába öntve hagytam megdermedni. Az így készült hordozók különböző formáit a 14. ábra szemlélteti.

A

B

C

14. ábra Az előállított pálcika (A), illetve tabletta (B, C) formájú hordozórendszerek

45

4.2.3. Fizikai vizsgálatok 4.2.3.1. Olvadáspont meghatározása Az olvadáspontok meghatározására Exstar 6000 DSC (Seiko Instruments Inc., Austin, TX, USA) készüléket használtam. A pásztázó differenciálkalorimetria (Differential Scanning Calorimetry; DSC) olyan módszer, amellyel adott anyag (vagy keverék) hevítés (vagy hűtés) folyamán lezajló energiaváltozásait követhetjük, továbbá meghatározhatjuk entalpia- és fajhőváltozásait, valamint azokat a hőmérsékleteket, amelyeken ezek a változások végbemennek. A módszert annak a hőmérsékletre vonatkoztatott

hőáramlás-különbségnek

a

hőmérséklet

függvényében

történő

meghatározására használjuk, amely a vizsgálati minta és az összehasonlító cella között mutatkozik az elnyelt vagy felszabadult hő következtében [146].

4.2.3.2. Cseppenéspont meghatározása Mintáim cseppenéspontját Ubbelohde-készülékkel határoztam meg. A műszer alsó sapkájába beolvasztva a mintát hozzáerősítettem a készülék hőmérőt tartalmazó részéhez. Légköpenyben melegítve a mintát megfigyelhető volt a lecseppenés hőmérséklete [142].

4.2.3.3. Nyomószilárdság meghatározása Az előállított minták nyomószilárdságát Erweka-féle szilárdság vizsgáló készüléken mértem 25 °C-on, kúpokhoz hasonlóan. A 20 percig előtemperált korong alakú hordozórendszert egyenként a készülék nyomófelületei közé állítottam. A kiindulási alapterhelés 600 g volt, melyet percenként 200 g-mal tovább növeltem. A minta szétnyomódása pillanatában alkalmazott összterhelés a minta nyomószilárdsága g-ban kifejezve [93, 142].

46

4.2.3.4. Nedvesedési peremszög Az előállított minták nedvesedési peremszögét Sigma KSV 7010 készülékkel mértem (KSV Instruments, Helsinki, Finnország). A mérés során egyensúlyi helyzetben lévő Wilhelmy-lemezt lógattam a folyadék fölé. A folyadékot a műszer lassan megemelte, majd mikor a lemez egy bizonyos mélységig merült benne, a készülék a folyadékot lassan leengedte. A lemezre ható erők változásából a felületi feszültség számítható.

4.2.4. In vitro hatóanyagleadás vizsgálata

A gélek hatóanyagleadását 100 ml kioldóközegben, pH=7,5 foszfát pufferben vizsgáltam (15. ábra). A vizsgálati hőmérséklet 37 °C volt, a lefedett kioldótartályokat klímaszekrényben (Heraeus Instruments Typ. 6030, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany) tartottam.

Vizsgált minta (2 g) Kioldóközeg

15. ábra Gélek hatóanyagleadásának vizsgálata

47

A hordozórendszerek hatóanyagleadásának vizsgálatához szükséges volt új módszer kidolgozására a hosszú hatóanyagleadás nyomonkövetése miatt. A fiziológiás körülmények szimulálása érdekében a kioldóközeg fiziológiás sóoldat volt. A vizsgálatot

37

°C

hőmérsékleten

végeztem,

a

lefedett

kioldótartályokat

klímaszekrényben (Heraeus Instruments Typ. 6030, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany) elhelyezve. A vizsgálat során nem alkalmaztam keverést. Az előállított, antibiotikum tartalmú mintákból (polimerek, viaszkeverékek) a hatóanyag-leadást fiziológiás sóoldatban 4 héten keresztül követtem nyomon. 24 óra elteltével a sóoldatot friss oldatra cseréltem (16. ábra).

mintaoldat

2. nap

1. nap

24 órás kioldódás fiziológiás sóoldatban

24 órás kioldódás fiziológiás sóoldatban

16. ábra A hordozórendszerek hatóanyagleadás vizsgálatának sematikus ábrája

48

4.2.4.1. Hatóanyagok kvantitatív meghatározása 4.2.4.1.1. Standard és a kalibrációhoz szükséges oldatok előállítása

A különböző koncentrációjú VCM, GEN és CPFX standard oldatokat (100 µg/ml) a hatóanyag fiziológiás sóoldatban való oldásával készítettem, majd 4 oC-on tároltam. A kalibrációs egyeneshez elkészített oldatok VCM, illetve GEN koncentrációja 1-100 µg/ml, CPFX esetében pedig 10-1000 ng/ml. A kalibrációhoz készített oldatok esetén az oldószer szintén fiziológiás sóoldat volt. Az így készült oldatokat használtam fel a kalibrációs görbe felvételéhez. A napok közötti megbízhatóság és pontosság vizsgálatához minőségellenőrző mintákat (QC) készítettem. A készítés során a hatóanyagokat fiziológiás sóoldatban oldottam fel. A QC minták koncentrációja VCM esetében 4, 30 és 60 µg/ml, GEN estében 5, 20 és 80 µg/ml volt. Aripriprazol (ARI, 17. ábra) belső standardet (Bst) készítettem a CPFX méréséhez. A készítés során 0,0010 g ARI-t 10 ml metanolban oldottam, majd ebből fiziológiás sóoldattal ötszörös hígítást készítettem.

17. ábra Az aripriprazol (ARI) szerkezeti képlete

4.2.4.1.2. Vancomycin analitikai meghatározása A

VCM

meghatározását

Agilent

1100

típusú

nagyhatékonyságú

folyadékkromatográffal (Agilent Technologies Inc. Palo Alto, CA, USA) végeztem. A készülék egy bináris pumpából, beépített gázmentesítőből, automata mintaadagolóból, kolonna termosztátból és diódasoros detektorból áll. Vizsgálataimhoz Zorbax Rx-C-18 (2,1x150 mm, 5 µm) analitikai kolonnát használtam (Agilent, Waldbronn, Germany).

49

Az injektált mintatérfogat 20 µl volt, az áramlási sebesség 0,3 ml/perc. A kolonna hőmérséklete 30 °C. Az izokratikus elválasztás során a mozgófázis összetétele a következő volt: metanol:víz:ammónium-acetát puffer (0,02 M, pH=9 cc. ammóniával beállítva)= 25:70:5 v/v/v. A kromatogramok felvétele 230 nm-en történt [104]. A hatóanyagtartalom meghatározására külső standard módszert alkalmaztam. A mérési adatok értékelését ChemStation Rev. A.10.02 (Agilent Tecnologies) szoftverrel végeztem, a statisztikai értékeléshez Table Curve 2D Version 5.01 (Systat Software INC., Chicago, USA) szoftvert használtam.

4.2.4.1.3. Gentamicin analitikai meghatározása A

GEN

meghatározását

HP

1050

típusú

nagyhatékonyságú

folyadékkromatográffal (Agilent Technologies Inc. Palo Alto, CA, USA) végeztem. A készülék egy bináris pumpából, beépített gázmentesítőből, automata mintaadagolóból, kolonna termosztátból és diódasoros detektorból áll. Vizsgálataimhoz Zorbax Rx-C-18 (2,1x150 mm, 5 µm) analitikai kolonnát használtam (Agilent, Waldbronn, Germany). Az injektált mintatérfogat 20 µl volt, az áramlási sebesség 0,3 ml/perc. A kolonna hőmérséklete 30 °C. Az izokratikus elválasztás során a mozgófázis összetétele a következő volt: metanol:víz:ammónium-acetát puffer (0,02 M, pH=9 cc. ammóniával beállítva)= 35:60:5 v/v/v. A kromatogramok felvétele 280 nm-en történt [116]. A hatóanyagtartalom meghatározására külső standard módszert alkalmaztam. A mérési adatok értékelését ChemStation Rev. A.10.02 (Agilent Tecnologies) szoftverrel végeztem, a statisztikai értékeléshez Table Curve 2D Version 5.01 (Systat Software INC., Chicago, USA) szoftvert használtam.

4.2.4.1.4. Ciprofloxacin analitikai meghatározása A hatóanyagtartalom meghatározására belső standard módszert alkalmaztam. A belső standard ARI volt, melyet 20 ng/ml (20 µl) koncentrációban adtam a minták 500 µl-nyi mennyiségéhez.

50

A CPFX meghatározását egy Agilent 1100 típusú nagyhatékonyságú folyadékkromatográffal kapcsolt tömegspektrométerrel (Agilent 1100 Series LC/MSD SL, Agilent Technologies Inc., CA, Santa Clara, USA) végeztem. A készülék egy bináris pumpából, beépített gázmentesítőből, automata mintaadagolóból, kolonna termosztátból, diódasoros detektorból és tömegspektrométerből áll. Vizsgálataim során Supelco Discovery C8 (150 mm×4,6 mm, 5 µm) (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Magyarország) analitikai kolonnát használtam. A CPFX és ARI elválasztására gradiens módszert alkalmaztam 2 oldószer keverésével: az „A” ág acetonitrilt, a „B” ág pedig 0,02 M ammónium-acetát oldat hangyasavval pH 2,5-re beállított elegyét tartalmazta. Az injektált mintatérfogat 20 µl volt, az áramlási sebesség 0,5 ml/perc. A kolonna hőmérséklete 30 °C. A gradiens program a 7. táblázatban látható.

7. táblázat A CPFX meghatározása során alkalmazott gradiens program

Idő (perc)

A%

B%

0-8

80

20

8-8,2

40

60

8,2-17

40

60

17-23

80

20

A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elúciót követően a CPFX meghatározása elektrospray ionforrással (ESI) működő tömegspektrométerrel (MSD SL, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) történt. A tömegspektrométert pozitív ionmódban, két különböző monitorozási módszerrel (scanning-SCAN és selected ion monitoring-SIM) végeztem. A SCAN módban a tömeg/töltés (m/z) tartomány 200-500 Da volt, míg SIM-módban az m/z érték CPFX és ARI esetén 332,1 és 448,1 Da volt (MHCPFX, MHARI). Porlasztó- és szárító gázként nitrogén gázt használtam. A tömegspektrometriás paraméterek a mérés során a következők voltak: a gáz áramlási sebessége 13 l/perc; porlasztó gáz nyomása 60 psi; szárító gáz hőmérséklete 350 °C; a kapilláris feszültség 4,0 kV; a fragmentor feszültség 70 V.

51

A mérési adatok értékelése ChemStation Rev. A.10.02 (Agilent Tecnologies) szoftverrel történt [143].

4.2.4.1.5. Oxytetracyclin meghatározása Az OTC meghatározására az USP-ben megtalálható spektrofotometriás módszert alkalmaztam. A méréseket Hitachi U-3501 (Hitachi, Tokió, Japán) készüléken végeztem, a meghatározási hullámhossz 273 nm volt [144].

4.2.4.2. Az alkalmazott analitikai módszerek validálása A VCM és GEN tartalmú rendszerek hatóanyagleadásának nyomonkövetésére fejlesztett módszerek validálását elvégeztem az ICH irányelveknek megfelelően [138140]. A CPFX analitikai meghatározására irodalomban leírt, validált módszert használtam [143]. A VCM és GEN meghatározására kifejlesztett módszerek validálási folyamatai során a következő teljesítményjellemzőket vizsgáltam: •

Szelektivitás (Selectivity). Meghatározásaim során 6 párhuzamos mérés során fiziológiás sóoldatot injektáltam, majd az így kapott kromatogramokat hasonlítottam össze [145]. Csúcstisztasági vizsgálatokat is végeztem.

•

Rendszeralkalmassági vizsgálatok. A kromatogramokban fellelhető változásokat úgy vizsgáltam, hogy egyszerre csak egy paramétert változtattam [146]. A retenciós időben, kapacitás faktorban valamint a szimmetria faktorban fellépő változásokat figyeltem. A kapacitás faktor értékét a következő egyenlet (1) alapján számítottam ki:

k'=

tR − tM tM

k’= kapacitásfaktor,

52

(1)

tR= retenciós idő, melyet az alapvonalon, az injektálási pont és a komponens

csúcsmaximumából

az

alapvonalra

bocsátott

merőleges között mérünk. tM= holtidő: az az idő/távolság, amelyet az alapvonalon, az injektálási

pont

és

a

vissza

nem

tartott

komponens

csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk.

A szimmetria faktor értékeket a következő egyenlet (2) alapján számítottam ki:

As =

w0,05 2d

(2)

As= szimmetria faktor, w

0,05=

a csúcsmagasság huszadánál mért csúcsszélesség (18.

ábra), d= a csúcsmaximumból az alapvonalra bocsátott merőleges és a csúcs felszálló ága között, a magasság huszadánál mért távolság [147].

18. ábra Egy csúcs szimmetria faktorának számításánál (Ph. Hg.) alkalmazott HPLC kromatogram paraméterei [147]

53

•

Szelektivitás (Selectivity) / specificitás: Meghatározásaim során 6 párhuzamos mérés

során

fiziológiás

sóoldatot

injektáltam,

majd

az

így

kapott

kromatogramokat hasonlítottam össze [148]. További kiegészítő információt kaphattam csúcstisztaság vizsgálattal. •

Pontosság (Precision).  Napon belüli és napok közötti megbízhatóság és torzítatlanság: A napok közötti megbízhatóság meghatározása 6 egymást követő napon QC mintákkal (alacsony, közepes és magas koncentráció) történt. A napon belüli megbízhatóságot három különböző koncentráció szinten (alacsony, közepes és magas) határoztam meg és a napok közötti megbízhatósághoz hasonlóan, pontosság és torzítatlanság adatokkal jellemeztem.

•

Linearitás (Standard curve) / mérési tartomány. A kalibrációs tartományt átfogó, 6 különböző koncentrációjú minta mérési eredményére egyenest illesztettem. Az egyenes egyenletét valamint r2 értékékeit meghatároztam.

•

Meghatározási határ (Limit of Quantification, LOQ). Meghatároztam az analitikai mérőgörbe legalsó értékelhető pontját, ahol a jel:zaj arány 10:1.

•

Kimutatási határ (Limit of Detection). Meghatároztam a kidolgozott analitikai módszerek kimutatási határát.

•

Stabilitás (Stability). Vizsgálatokat 48 órán keresztül szobahőmérsékleten végeztem. A folyamat során vizsgált mintákból származó kromatogrammok csúcs alatti területeit hasonlítottam össze.

54

4.2.7. Egyéb vizsgálatok 4.2.7.1. Mikrobiológiai vizsgálatok A VCM tartalmú gyógyszerhordozó rendszer (4 mg VCM/hordozó) in vivo vizsgálatát megelőzték az in vitro mikrobiológiai laborvizsgálatok. A vizsgálatok során a gátlási udvar kialakulásának megfigyelése volt az egyik cél. Ennek meghatározását kétféle módon végeztük el. A „direkt gátlási udvar” módszer folyamán az antibiotikum tartalmú viaszkorongot ráhelyeztük Staphylococcus tenyészetre majd a kialakuló gátlási zóna nagyságát követtük nyomon. A „korongdiffúziós módszer” alkalmazása során a viaszkorongot fiziológiás sóoldatba helyeztük (10 ml 0,9%-os NaCl oldat), és minden egyes korong oldatából 5µl-et cseppentettünk szűrőpapírkorongra, amit előzőleg a tenyészet közepébe helyeztünk. Mivel minden korong oldata eltérő antibiotikum koncentrációt tartalmaz (ami a korongból felszabadul), ezért különböző méretű gátlási udvar volt megfigyelhető. A minimális inhibitor koncentráció (MIC) meghatározását szintén kétféle módszerrel végeztük. Az első módszer során 10 ml fiziológiás sóoldatba vagy foszfát pufferbe 1 viaszkorongot helyezünk. Ezután 100 µl-t cseppentünk a rendszerbe az adott dúsított baktérium szuszpenzióból. A 0. percben kiveszünk 5 µl-t a rendszerből, és szélesztjük Müller-Hinton (300 g/l marhahús kivonat, 17,5 g/l pepton, 1,5 g/l glükóz, 17 g/l agar, pH 7,3) táptalajon. Ezután a baktériumokat együtt inkubáljuk a vancomycines oldattal 36 °C-on, 24 óra elteltével újból kiveszünk 5 µl-t és újabb kioltást végzünk. A 0. percben kioltott mintához viszonyítva regisztráljuk a telepszám-csökkenést. Ezzel a módszerrel megkereshetjük azt az optimális AB koncentrációt, ami kezdettől fogva gátolta a baktériumok növekedését. A MIC meghatározására használt másik módszer során változó csíraszámú baktériumot helyezünk az antibiotikum tartalmú korong oldatába. Meghatároztuk az egyes baktérium populációra ható antibiotikum MIC értékeket.

55

4.2.7.2. Állatkísérletek Az előállított vancomycin tartalmú gyógyszerhordozó rendszerrel dúsított csontgraftok alkalmazhatóságát, hatékonyságát és antimikróbás hatását vizsgáltuk nyúl MRSA osteomyelitis modellben. Állatkísérleteinket az OECD „Good Laboratory Practice” irányelvei, illetve a magyar állategészségügyi hatóság előírásai és engedélye alapján végeztük a Miskolci Állatkórházban. A vizsgálatok elvégzése előtt az előállított VCM tartalmú hordozórendszereket gamma-sugárral sterileztük. Kísérleteinkben a vancomycines gyógyszerhordozó rendszert a nyulakból kivett natív spongiosus csonthoz keverten alkalmaztuk 2:1 arányban. A kísérletekhez 40 felnőtt új-zélandi nyulat használtunk, átlagos testtömegük 3.940 kg (± 0.26) volt. A nyulakat három csoportba osztottuk. A negatív kontrollcsoportban (I. csoport– 8 nyúl) nem indukáltunk osteomyelitist, csupán 5 mm-es lyukat fúrtunk a tibia proximalis metaphysisébe elülső feltárásból. Ezt a csonton ejtett üreget VCM tartalmú hordozórendszerrel töltöttük ki. Ennél a csoportnál az általunk használt hordozórendszer biodegradábilitását, a befogadó csontágy szöveti reakcióját, a csont újdonképződést nem-infekt környezetben kívántuk vizsgálni. 24 nyúlban osteomyelitist idéztünk elő a jobb oldali proximalis tibia metaphysisben. Azon nyulakat, amelyekben nem fejlődött ki sem radiológiailag, sem klinikailag osteomyelitis (5 állat), kizártuk a kísérletből. Egy állat elhullott interkurrens pneumoniában, amelyet szintén kizártunk. Az így megmaradt 18 nyulat két csoportba randomizáltuk. Az egyik csoportban 14 állatnál (II. csoport) az osteomyelitises góc sebészi debridementje után autológ spongiosa és VCM tartalmú hordozórendszer keverékével töltöttük ki az üreget. Négy nyúlnál (III. csoport) a sebészi kezelést csupán ASP-vel való kitöltéssel egészítettük ki. A II. és III. csoportban 1 cm-es csontblokkot távolítottunk el a velőüreg szélesebb feltárása céljából és 0,1 ml 109 CFU/ml (=Colony Forming Unit – csíraszám/ml) koncentrációjú MRSA-szuszpenziót fecskendeztünk be. A sebészi beavatkozást követően az állatokat megfigyeltük és klinikailag vizsgáltuk az osteomyelitis tüneteit keresve: testtömeg mérés mérleggel, fvs szám meghatározás automata készülékkel, Az osteomyelitis létrehozását célzó műtét után három héttel a II. és III. csoportban második műtét következett, amelyet radiológiai vizsgálat előzött meg az osteomyelitis igazolása céljából. A bal oldali tibia azonos helyéről autológ spongiosa-t nyertünk. A jobb oldali tibián az osteomyelitises góc feltárását követően

56

bakteriológiai és szövettani mintát vettünk. A kitisztított üreget a II. csoportban ASP és DDSV keverékével, a III. csoportban csak ASP-vel töltöttük ki. Azon nyulak, amelyek sem klinikailag, sem mikrobiológiailag, sem szövettanilag nem mutattak osteomyelitist, ezen a ponton kiestek a vizsgálatból. A második beavatkozást követően is monitoroztuk a nyulakat a gyulladásos paraméterek (fehérvérsejt-szám, testtömeg) tekintetében [149].

57

5. Eredmények 5.1. A hordozórendszerek in vitro fizikai vizsgálatai A 8. táblázat az előállított viaszos hordozórendszerek fizikai vizsgálatainak (olvadáspont, cseppenés-pont, nyomószilárdság és nedvesedési peremszög) eredményeit mutatja. A vizsgálatokat a 4.2.3. fejezetben leírt módon végeztük, vizsgálatonként 5 párhuzamos mérést végezve.

8. táblázat Az előállított hordozórendszerek fizikai vizsgálatainak eredményei

Fizikai vizsgálatok

Összetételek Cera alba: Vaselinum

Nyomó- Nedvesedési szilárdság peremszög (g) (θ θadv)

Olvadáspont (°C)

Cseppenéspont (°C)

64,2

71,6

4000

72,0

61,9

64,6

3266

65,0

60,0

66,0

>6400

48,5

58,5

67,6

>6400

60,0

album (95:5) Cera alba: Vaselinum album (90:10) Cera alba: Precirol® (50:50) Cera alba: Precirol®: Vaselinum album (45:45:10)

A Cera alba: Precirol® (50:50) összetétel DSC görbéje a 19. ábrán látható.

58

8000

140

6000 120 4000 100

0 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

80 9000

-2000 60

-4000 -6000

Hőmérséklet (C)

DSC (uW)

2000

40

-8000 20 -10000 -12000

Idő (0,1 sec)

DSC (uW)

0

Hőmérséklet (ºC)

19. ábra Cera alba: Precirol® (50:50) összetétel DSC görbéje

5.2. Vizsgált rendszerek hatóanyagleadásának meghatározása A VCM és GEN fiziológiás sóoldatból történő meghatározására HPLC-UV módszereket fejlesztettem és validáltam [138]. A validálási folyamatok során vizsgáltam a specificitást és szelektivitást, a kalibráció linearitását, meghatároztam a detektálhatóság és a mennyiségi meghatározás határát, a napok közötti és napon belüli megbízhatóságot, a rendszeralkalmasságot valamint a minták rövidtávú stabilitását. A CPFX esetében validált HPLC-MS módszert alkalmaztam.

59

5.2.1. Vancomycin analitikai meghatározása A VCM tartalmú hordozórendszerek kioldódási vizsgálatai során nyert minták hatóanyagtartalmának analitikai meghatározására HPLC módszert fejlesztettem és validáltam. A 20. ábra VCM standard oldat (100 µg/ml, oldószer: fiziológiás sóoldat) kromatogramját mutatja. A VCM retenciós ideje a 4.2.4.2. fejezetben leírt kromatográfás körülmények mellett 3,0349 ± 0,0059 perc (n=25).

mAU 350 300 250 200 150 100 50 0 0

1

2

3

4

5

6

7

20. ábra VCM standard oldat HPLC kromatogramja

A HPLC módszer kifejlesztése után a rendszert ICH irányelveknek megfelelően validáltam [138]. A validálási folyamat elején vizsgáltam a módszer szelektívitását. Az injektált fiziológiás sóoldat kromatogramjaiban a VCM retenciós idejénél csúcs nem volt látható. A 21. ábra a VCM standard oldat (100 µg/ml) csúcstisztasági kromatogramját mutatja. Az ábrán látható, hogy a VCM retenciós idejénél nincs zavaró komponens, tehát a kromatogramon látható csúcs a VCM csúcsa.

60

perc

|

| '

'

'

'

'

990

1000

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

2,50

2,75

3,00

3,25

3,50

3,75

4,00

4,25

perc

21. ábra VCM standard oldat csúcstisztasági kromatogramja

A módszer linearitásának vizsgálatakor a kalibrációs sor eredményei alapján meghatároztam a kalibrációs egyenes egyenletét: y = 77,602 x + 204,5186. Az r2 értéke 0,9994, amely megfelel az előírásoknak. A linearitás statisztikai elemzésének adatait a 9. táblázat foglalja össze. A kromatográfiás módszer LOD értéke a validálás során 0,2 µg/ml, az LOQ 0,6 µg/ml-nek adódott. A napon belüli- és napok közötti pontosság és megbízhatóság méréséhez a 4.2.4.1. fejezetben leírt módon készült QC mintákat használtam. A napon belüli vizsgálatokhoz a QC mintákból 5-5 párhuzamos mintát készítettem és határoztam meg ugyanazon a napon. A napok közötti vizsgálatok során hat független napon új QC mintákat készítettem (naponként 3-3 párhuzamost) és vizsgáltam. A napon belüli és napok közötti pontosság és megbízhatósági értékeket a 10. táblázat mutatja. A számításokat a 4.2.4.2. fejezetben leírtak alapján végeztem.

61

9. táblázat VCM meghatározására fejlesztett módszer linearitásának statisztikai elemzése

Koncentráció

1-100 µg/ml

r2

0,9994

FLack-of-fit

23,5670

p Lack-of-fit *

0,004655

a ± sa **

77,6002 ± 0,8810

b ± sb**

204,5186 ± 40,2813

Reziduálisok szórása

71,9298

* Szignifikancia-szint: 95 % ** s = szórás

A

kromatográfiás

rendszer

rendszeralkalmassági

vizsgálata

során

a

kromatográfiás paramétereket változtattam. A három koncentrációszinten végzett injektálások után kapott csúcs alatti területeket, a retenciós időket, kapacitásfaktort és szimmetria faktorokat hasonlítottam össze (11. táblázat). A kapott csúcs alatti területek RSD értéke 2% alatt volt. A rövidtávú stabilitási vizsgálatok elvégzéséhez a standard oldatokat 48 órán át szobahőmérsékleten tartottam és ellenőriztem. A standard oldatból 48 óra alatt vett minták csúcs alatti területének változása RSD<1% volt.

62

10. táblázat A VCM meghatározásához alkalmazott HPLC módszer megbízhatósági vizsgálatának eredményei

Napon belüli (n=25/koncentráció) Nominális

Mért

koncentráció koncentráció (µg/ml )

4 µg/ml

30 µg/ml

60 µg/ml

(µg/ml) ± S.D.

4,0564 ± 0,0315 30,4089 ± 0,2200 61,0740 ± 0,6120

Pontosság

Megbízhatóság

R. S. D.

(%)

0,787

101,410

0,733

101,363

1,018

101,790

63

Napok közötti (n=54/koncentráció) Mért koncentráció (µg/ml) ± S. D.

4,0530 ± 0,0630 30,4560 ± 0,4660 61,5910 ± 0,2760

Pontosság

Megbízhatóság

R. S. D.

(%)

1,575

101,330

1,553

101,520

0,461

102,650

11. táblázat A VCM meghatározásához alkalmazott HPLC módszer robosztussági vizsgálatának eredményei (csúcs alatti terület RSD<2%)

Kiindulási értékek

Áramlási sebesség 0,2 0,4 ml/min

Metanoltartalom

ml/min

-1%

+1%

Hőmérséklet

Detektálási hullámhossz

-5 ºC

+5 ºC

- 5nm

+5 nm

Retenciós idő (perc) 3 µg/ml

3,044

4,709

2,351

3,488

2,723

3,238

2,937

3,113

3,120

10 µg/ml

3,057

4,719

2,359

3,508

2,708

3,239

2,942

3,120

3,132

50 µg/ml

3,098

4,782

2,381

3,561

2,718

3,259

2,957

3,153

3,167

Szimmetria faktor 3 µg/ml

1,220

1,397

1,283

1,372

1,251

1,281

1,312

1,315

1,390

10 µg/ml

1,309

1,445

1,414

1,459

1,218

1,320

1,354

1,384

1,352

50 µg/ml

1,251

1,367

1,271

1,409

1,210

1,283

1,228

1,273

1,200

Kapacitás faktor (k’) 3 µg/ml

1,831

3,271

1,132

2,163

1,470

1,937

1,664

1,824

1,830

10 µg/ml

1,773

3,281

1,139

2,186

1,456

1,938

1,669

1,829

1,841

50 µg/ml

1,810

3,337

1,159

2,230

1,465

1,956

1,682

1,860

1,872

64

5.2.2. Gentamicin analitikai meghatározása A GEN tartalmú hordozórendszerek kioldódási vizsgálatai során nyert minták hatóanyagtartalmának analitikai meghatározására HPLC módszert fejlesztettem és validáltam. A 22. ábra GEN standard oldat (100 µg/ml, oldószer: fiziológiás sóoldat) kromatogramját mutatja. A GEN retenciós ideje a 4.2.4.1. fejezetben leírt kromatográfiás körülmények mellett 4,4949 ± 0,0339 perc (n=25).

mAU 120 100 80 60 40 20 0 -20 1

2

3

4

5

6

7

22. ábra GEN standard oldat HPLC kromatogramja

A HPLC módszer kifejlesztése után a rendszert validáltam. A validálási folyamat elején vizsgáltam a módszer szelektívitását GEN-re. Az injektált fiziológiás sóoldat kromatogramjaiban a GEN retenciós idejénél csúcs nem volt látható. A 23. ábra a GEN standard oldat (100 µg/ml) csúcstisztasági kromatogramját mutatja. Az ábrán látható, hogy a GEN retenciós ideje alatt nincs zavaró komponens a csúcs alatt ábrázolva, tehát a kromatogramon látható csúcs tisztán a GEN csúcsa. A 4.2.4.1. fejezetben leírtak alapján kalibrációs sort készítettem egymást követő 6 napon. A módszer linearitásának vizsgálatakor meghatároztam a kalibrációs egyenes egyenletét, mely a következő: y = 49,6498 x + 22,7302. Az r2 értéke 0,99908, amely érték megfelel az előírásoknak. A linearitás statisztikai elemzésének adatait a

65

perc

12. táblázat foglalja össze. A módszer LOD értéke 0,1658 µg/ml, az LOQ pedig 1,0 µg/ml.

12. táblázat GEN meghatározására fejlesztett módszer linearitásának statisztikai elemzése

Koncentráció

1-100 µg/ml

r2

0,99908

FLack-of-fit

26,3602

p Lack-of-fit *

0,0000854

a ± sa **

49,6498 ± 8,2306

b ± sb**

22,7302 ±0,1578

Reziduálisok szórása

10,9999

* Szignifikancia-szint: 95 % ** s =szórás

A napon belüli és napok közötti pontosság és megbízhatóság méréséhez a 4.2.4.1. fejezetben leírt módon készült QC mintákkal végeztem. A napon belüli vizsgálatokhoz a QC mintákból 5-5 párhuzamos mintát készítettem és mértem le ugyanazon a napon. A napok közötti vizsgálatok során hat független napon új QC mintákat készítettem (naponként 3-3 párhuzamost) és vizsgáltam. A napon belüli és napok közötti pontosság és megbízhatósági értékeket a 13. táblázat mutatja. A számításokat a 4.2.4.2. fejezetben leírtak alapján végeztem. A

kromatográfiás

rendszer

rendszeralkalmassági

vizsgálata

során

a

kromatográfiás paramétereket változtattam. A három koncentrációszinten végzett injektálások után kapott csúcs alatti területeket, a retenciós időket, kapacitásfaktort és szimmetria faktorokat hasonlítottam össze. A kapott csúcs alatti területek RSD értéke 2% alatt volt. Az eredményeket a 14. táblázatban foglaltam össze.

66

| |

| |

990

1000

- - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - -

4,1

4,2

4,3

4,4

4,5

4,6

4,7

4,8

4,9

min 23. ábra GEN standard oldat csúcstisztasági kromatogramja

A rövid távú stabilitási vizsgálatok elvégzéséhez a standard oldatokat 48 órán át szobahőmérsékleten tartottam és folyamatosan ellenőriztem. A standard oldatból 48 óra alatt vett minták csúcs alatti területének változása RSD<1% volt.

13. táblázat A GEN meghatározásához alkalmazott HPLC módszer megbízhatósági vizsgálatának eredményei Napon belüli (n=25/koncentráció) Nominális

Mért

koncentráció koncentráció (µg/ml)

(µg/ml) ± S.D.

4,9606 ± 5 µg/ml

0,0933 20,4590 ± 20 µg/ml

0,1975 79,3246 ± 80 µg/ml

1,5954

Pontosság

Megbízhatóság

R. S. D.

(%)

1,8660

99,212

Napok közötti (n=54/koncentráció) Mért koncentráció (µg/ml) ± S. D.

Pontosság

Megbízhatóság

R. S. D.

(%)

1,9580

101,220

1,0110

101,255

1,5486

98,276

5,0610 ± 0,0979

0,9875

102,295

1,9943

99,156

67

20,2451 ± 0,2022 78,6213 ± 1,2389

14. táblázat A GEN meghatározásához alkalmazott HPLC módszer robosztussági vizsgálatának eredményei (csúcs alatti terület RSD<2%)

Kiindulási értékek

Áramlási

Metanol-

sebesség

tartalom

0,27

0,33

ml/min

ml/min

-1%

+1%

Hőmérséklet

-5 ºC

Detektálási hullámhossz

+5 ºC

- 5 nm

+5 nm

Retenciós idő (perc) 5 µg/ml

4,449

4,817

3,930

4,809

4,152 4,628 4,405

4,602

4,762

20 µg/ml

4,451

4,828

3,936

4,916

4,155 4,693 4,415

4,605

4,712

80 µg/ml

4,479

4,849

3,940

5,036

4,189 4,740 4,440

4,762

4,652

Szimmetria faktor 5 µg/ml

0,918

0,856

0,847

0,835

0,827 0,913 0,899

0,911

0,876

20 µg/ml

1,036

0,874

0,868

0,889

0,903 1,019 0,990

1,028

1,021

80 µg/ml

0,984

0,933

0,942

0,906

0,942 0,995 1,044

1,005

1,026

Kapacitás faktor (k’) 5 µg/ml

3,096

3,369

2,565

3,361

2,138 3,198 2,996

2,478

3,321

20 µg/ml

3,039

3,379

2,570

3,459

2,769 3,257 3,005

3,177

3,274

80 µg/ml

3,063

3,398

2,574

3,568

2,799 3,299 3,027

3,319

3,220

68

5.2.3. Ciprofloxacin analitikai meghatározása A CPFX tartalmú

minták

kioldódási

vizsgálata során

nyert

minták

hatóanyagtartalmát HPLC-MS módszerrel határoztam meg. A 24. ábrán a CPFX (961,54 ng/ml) és a vizsgálatokhoz belső standardként (Bst) alkalmazott ARI (769,230 ng/ml) LC/MS kromatogramjai láthatók. A CPFX retenciós ideje 15,7057 ± 0,0158 perc (n=25), az ARI retenciós ideje 7,033 ± 0,0627 perc (n=25) volt. A CPFX kalibrációs egyenes egyenlete y = 336,41 x-22,102, az r2 értéke 0,9997, amely magasabb az előírt minimális értéknél. A módszer LOD és LOQ értéke CPFX-ra vonatkoztatva 0,4 ng/ml valamint 4,0 ng/ml [143].

Intenzitás 50000

CPFX 40000

30000

20000

ARI 10000

0 2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

24. ábra CPFX és ARI (BSt) LC/MS kromatogramjai

69

20

22.5 perc

5.3. Hatóanyagleadó rendszerek kioldódásprofiljainak vizsgálata 5.3.1. Gélek kioldódási tulajdonságainak vizsgálata Az előkísérletes munka során VCM és GEN tartalmú géleket állítottam elő a 4.2.1. fejezetben leírtak szerint. A 25. ábra a VCM tartalmú gélek membrándiffúziós vizsgálata során nyert kioldódási profilt mutatja. A vizsgálatokat a 4.2.4. fejezetben leírt módon végeztem, mintánként 5 párhuzamos méréssel. A hatóanyagleadás a hidroxietil-cellulóz tartalmú készítmény esetén a leggyorsabb, a 8 órás vizsgálat végére közel 90%, így ez az összetétel a nyújtott hatóanyagleadás elérésére nem bizonyult alkalmasnak. A Carbopol® 980 tartalmú minták hatóanyagleadása közel lineáris, a 8. óra elteltével 30%. A kioldódási görbe linearitása és a kioldódott hatóanyag mennyisége miatt a nyújtott hatóanyagleadás elérésére ez az összetétel alkalmasnak tűnik. A Carbopol® 934 P, 971 P és a 974 PNF tartalmú készítmények hatóanyagleadása kevésbé egyenletes, a 8. óra elteltével a hatóanyag 40-70%-át adják le. 100 90

Kioldódott VCM (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1

2

3

4 Idő (óra)

Carbopol 934 P Carbopol 980 Hydroxyaethylcellulosum

5

6

7

8

Carbopol 971 P Carbopol 974 PNF

25. ábra Az előállított VCM tartalmú gélek membrándiffúziós vizsgálata során nyert kioldódási görbék (± SD, n=5)

70

A 4.2.1. fejezet szerint leírt módon előállított GEN tartalmú gélek membrándiffúziós vizsgálata során nyert kioldódási profilt a 26. ábra mutatja. A vizsgálatokat a 4.2.4. fejezetben leírt módon végeztem, mintánként 5 párhuzamos mérést folytatva. A leggyorsabb kioldódást a metil-cellulózzal készített gél esetén tapasztaltam, a hatóanyag 100%-a felszabadult a vizsgálat első órájában, tehát a hatóanyagleadás túl gyors. A PVA-val, Carbopol® 940, Carbopol® 980 tartalmú gélek esetében a hatóanyagleadás elnyújtottabb. A PVA tartalmú készítményből vizsgálat 4 órája alatt a hatóanyag 40 %-a szabadul fel. A metil-cellulóz tartalmú összetételtől eltekintve, az előállított gélek hatóanyaleadása közel egyenletes.

100

Kioldódott GEN (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Idő (óra) Carbopol 940

Methylcellulosum

PVA

Carbopol 980 3 %

Carbopol 980 5 %

Carbopol 980 10%

26. ábra Az előállított GEN tartalmú gélek membrándiffúziós vizsgálata során nyert kioldódási görbék (± SD, n=5)

71

5.3.2. Hordozórendszerek hatóanyagleadó-képességének vizsgálata A 4.2.2. fejezetben leírtak szerint előállított VCM, GEN és CPFX tartalmú hordozórendszerek hatóanyagleadását a 4.2.4. fejezet szerinti kioldódás-vizsgálati módszerrel vizsgáltam. A 27. ábra VCM tartalmú rendszerek 28 napos hatóanyagleadási profilját mutatja. A hatóanyagleadás mind a négy összetétel esetén lineárisnak tekinthető. A kioldódási görbék pontjaira illesztett egyenesek egyenletét és r2 értékeket a 15. táblázat tartalmazza. A hatóanyag legnagyobb mennyiségét a Cera alba: Vaselinum album (95:5) összetételű minta adta le (28 nap alatt közel 60%). A legkevesebb hatóanyagot a Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) összetétel szabadította fel, 28 nap alatt 15%-ot. A 28. ábra mutatja a hordozórendszerekből hetente átlagosan felszabaduló hatóanyagmennyiséget.

100 90 Kioldódott VCM %

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Idő (nap) Cera alba:Vaselinum album (95:5) Cera alba: Vaselinum album (90:10) Cera alba:Precirol (50:50) Cera alba:Precirol:Vaselinum album (45:45:10) Lineáris (Cera alba:Vaselinum album (95:5)) Lineáris (Cera alba:Precirol (50:50)) Lineáris (Cera alba: Vaselinum album (90:10)) Lineáris (Cera alba:Precirol:Vaselinum album (45:45:10))

27. ábra A VCM tartalmú minták hatóanyagleadása az idő függvényében (± SD, n=5)

72

15. táblázat A VCM tartalmú hordozórendszer hatóanyagleadási vizsgálatai során nyert görbékre illesztett egyenesek adatai

Összetétel

Egyenes egyenlete

r2

Cera alba:Vaselinum album (95:5)

y = 1,628 x + 13,5280

0,9511

Cera alba:Vaselinum album (90:10)

y = 0,9831 x + 1,9963

0,9654

Cera alba:Precirol® (50:50)

y = 0,3566 x + 16,359

0,8035

Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10)

y = 0,4292 x + 4,8660

0,9882

Cera alba: Vaselinum album (95:5)

Felszabadult VCM (%)

30

Cera alba:Vaselinum album (90:10) 25

Cera alba:Precirol (50:50) Cera alba:Precirol:Vaselinum album (45:45:10)

20

15

10

5

0 1. hét

2. hét

3. hét

4.hét

Idő (hét)

28. ábra A VCM tartalmú hordozórendszerekből hetente átlagosan felszabadult hatóanyagmennyiség

73

A 29. ábra GEN tartalmú rendszerek kioldódási vizsgálatai során nyert hatóanyagleadási profilt mutatja. Összetételenként 5-5 párhuzamos mérést végeztem. A kioldódási görbék pontjaira illesztett egyenesek egyenletét és r2 értékeket a 16. táblázat tartalmazza. Ahogy a 29. ábra is mutatja, a Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) összetétel esetén a vizsgálat 4. napjára a hatóanyag 100%-a felszabadult. A hatóanyagleadás sebessége a Cera alba:Vaselinum album (90:10) és Cera alba:Precirol® (50:50) összetétel esetén a vizsgálat 4. napjától kezdődően nem változott. Ezen összetételek esetén a hatóanyag 50%-a szabadul fel. Az Cera alba:Vaselinum album (95:5) összetétel hatóanyagleadása a 14 nap alatt 10% alatt maradt.

100 90 Kioldódott GEN %

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

Idő (nap) Cera Cera Cera Cera

alba: Vaselinum album (95:5) alba: Vaselinum album (90:10) alba: Precirol (50:50) alba: Precirol: Vaselinum album (45:45:10)

29. ábra A GEN tartalmú minták hatóanyagleadása az idő függvényében (± SD, n=5)

74

16. táblázat A GEN tartalmú hordozórendszer hatóanyagleadási vizsgálatai során nyert görbékre illesztett egyenesek adatai

Összetétel

Egyenes egyenlete

r2

Cera alba:Vaselinum album (95:5)

y = 0,051 x + 3,5266

0,3356

Cera alba:Vaselinum album (90:10)

y = 2,3702 x + 25,471

0,4822

Cera alba:Precirol® (50:50)

y = 2,4775 x + 26,451

0,4985

Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10)

y = 2,3291 x + 23,105

0,7892

A CPFX tartalmú minták 14 napos hatóanyagleadását a 30. ábra mutatja. Minden összetétel esetén 5 párhuzamos mérést végeztem. A kioldódási görbék pontjaira illesztett egyenesek egyenletét és r2 értékeket a 17. táblázat tartalmazza. A 28. ábrán jól látható, hogy a két hetes hatóanyagleadási vizsgálat során egyik összetétel esetében sem szabadul fel a hatóanyag több mint 1%-a. A legegyenletesebb hatóanyagleadást és a legnagyobb mértékű hatóanyagleadást a Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) összetétel esetén tapasztaltam. A legkevesebbet pedig a Cera alba:Vaselinum album (90:10) összetétel adta le.

75

Kioldódott CPFX %

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Idő (nap) Cera alba: Vaselinum album (95:5) Cera alba: Vaselinum album (90:10) Cera alba: Precirol (50:50) Cera alba: Precirol: Vaselinum album (45:45:10) Lineáris (Cera alba: Precirol (50:50)) Lineáris (Cera alba: Vaselinum album (90:10)) Lineáris (Cera alba: Vaselinum album (95:5)) Lineáris (Cera alba: Vaselinum album (95:5))

30. ábra A CPFX tartalmú minták hatóanyagleadása az idő függvényében (± SD, n=5)

17. táblázat A VCM tartalmú hordozórendszer hatóanyagleadási vizsgálatai során nyert görbékre illesztett egyenesek adatai Összetétel

Egyenes egyenlete

r2

Cera alba:Vaselinum album (95:5)

y = 0,0444x - 0,0143

0,9188

Cera alba:Vaselinum album (90:10)

y = 0,0214x + 0,1471

0,7967

Cera alba:Precirol® (50:50)

y = 0,0498x + 0,0957

0,8838

Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10)

y = 0,0607x + 0,1757

0,9510

76

Az OTC tartalmú minták 28 napos hatóanyagleadását a 31. ábra mutatja. Minden összetétel esetén 5 párhuzamos mérést végeztem. A kioldódási görbék pontjaira illesztett egyenesek egyenletét és r2 értékeket a 18. táblázat tartalmazza. A 30. ábrán jól látható, hogy a négyhetes hatóanyagleadási vizsgálat során a hatóanyagleadás mértéke az alkalmazott segédanyag hatására jelentősen változott. A legegyenletesebb hatóanyagleadást a Cera alba:Precirol®:Gelucire® (50:25:25) összetétel esetén tapasztaltam. A Cera alba:Gelucire® 50/13 (75:25) összetétel esetében volt a legnagyobb a hatóanyagleadás mértéke, azonban a görbére illesztett egyenes korrelációs együtthatója itt a legalacsonyabb. A legkevesebb hatóanyagot a Cera alba:Vaselinum album (75:25) összetétel adta le.

100 90

Kioldódott OTC (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Idő (nap) Cera alba:Precirol:Gelucire 50/13 50:25:25 Cera alba:Gelucire 50/13 75:25 Cera alba:Vaselinum album 75:25 Lineáris (Cera alba:Vaselinum album 75:25) Lineáris (Cera alba:Precirol:Gelucire 50/13 50:25:25) Lineáris (Cera alba:Gelucire 50/13 75:25)

31. ábra Az OTC tartalmú minták hatóanyagleadása az idő függvényében (± SD, n=5)

77

18. táblázat Az OTC tartalmú hordozórendszer hatóanyagleadási vizsgálatai során nyert görbékre illesztett egyenesek adatai

Összetétel

Egyenes egyenlete

r2

Cera alba:Vaselinum album (75:25)

y = 1,8926 x – 2,7314

0,9911

Cera alba:Gelucire® 50/13 (75:25)

y = 2,8311 x + 8,5755

0,9785

Cera alba:Precirol®:Gelucire® 50/13

y = 2,7908 x + 5,7633

0,9915

(50:25:25)

5.4. Hordozórendszerek mikrobiológiai vizsgálatai A 4.2.7. fejezetben leírtak alapján elvégeztük a viaszhordozók mikrobiológiai vizsgálatát, mely során az antimikróbás hatékonyság bizonyítása volt a célunk. A 32., 33. és 34. ábra a vizsgálatok során készített képeket mutatja. A 32. ábra a direkt gátlási udvar vizsgálatai során készült. A táptalaj közepén a viaszhordozó rendszer látható, a körülötte kialakuló gátlási zónával.

32. ábra Gátlási udvar vizsgálata („direkt” módszer)

78

A 33. ábra a korongdiffúziós módszerrel való antimikróbás hatékonyság vizsgálata során mutatja a táptalaj közepén lévő szűrőpapírt és körülötte kialakuló gátlási udvart.

33. ábra Korongdiffúziós módszer

Az „együtt inkubálás” módszerével előállított baktériumtelepeket a 34. ábra mutatja. Az első ábra a vizsgálat megkezdődése után 2 nappal készült felvétel, a második kép pedig a 3. napon készült. Jól látható a baktériumszám csökkenése.

34. ábra „Együtt inkubálás”

79

5.5. Hordozórendszerek in vivo állatkísérletes vizsgálatai A 19. táblázat a vizsgálatokban résztvevő új-zélandi nyulak testtömeg- és fehérvérsejt-szám változásait mutatja. A II. csoportban a 21. napon végzett műtétet követően a 6. hétre a kísérleti állatok visszanyerték eredeti testtömegüket, a fehérvérsejt szám kissé emelkedett maradt, de szignifikánsan alacsonyabbnak mutatkozott a III. csoportban mérthez képest. A bakteriális tenyésztések rendre negatív eredményt mutattak, ami bizonyítja az infekció kontrollt.

19. táblázat Az in vivo vizsgálatok során megfigyelt fehérvérsejt-szám és testtömeg-változások

Fehérvérsejt-szám

Testtömeg

II. csoport

III. csoport

II. csoport

III. csoport

(G/L) ± S.D.

(G/L) ± S.D.

(kg) ± S.D.

(kg) ± S.D.

0. nap

8,90 ± 2,04

8,68 ± 2,05

3,91 ± 0,31

3,90 ± 0,18

21. nap

13,52 ± 2,14

13,93 ± 2,18

3,49 ± 0,26

3,45 ± 0,19

42. nap

10,00 ± 2,73

13,30 ± 1,99

3,85 ± 0,31

3,45 ± 0,10

Hat héttel a műtétet követően a kísérleti állatok szövettani, laboratóriumi és radiológiai vizsgálatok szerint a vancomycines gyógyszerhordozó rendszer kifejtette hatását, a csontosodást nem gátolta és az osteomyelitis meggyógyult. Az újonnan kifejlesztett vancomycines csontgraft technológia nyulakban biodegradábilisnak bizonyult, MRSA-val okozott osteomyelitis esetében hatékony lokális antibiotikus hatást tudott kifejteni. Az I. csoportban végzett szövettani vizsgálatok enyhe xanthogranulomatosus gyulladás képét mutatták macrophagok jelenlétében, melyek lassan lebontják a VCM tartalmú hordozórendszert (35. ábra). A csont újraképződést nem gátolta a hordozórendszer jelenléte (36. ábra). A VCM jelenléte irodalmi adatok alapján nem befolyásolja a csontképződést.

80

35. ábra Fagocitáló óriássejt, benne a VCM tartalmú gyógyszerhordozó rendszer (1000-szeres nagyítás)

36. ábra Fibrotikus neostroma habos cytoplasmájú lipophag sejtekkel (1000-szeres nagyítás): a gyógyulási folyamatot és a csontújraképződést demonstrálja (II. csoport, 42. posztoperatív nap)

81

6. Megbeszélés 6.1. Analitikai vizsgálatok Új HPLC-UV módszert dolgoztam ki és validáltam 1-100 µg/ml koncentráció tartományban VCM és GEN meghatározására, kioldódási vizsgálatok kvantitatív értékelésére. Új kromatográfiás módszerek kidolgozására azért volt szükség, mivel az irodalomban nem található olyan analitikai rendszer, amely alkalmas hosszú távú in vitro hatóanyagleadás nyomonkövetésére is fiziológiás sóoldat kioldóközegben. A kidolgozott

rendszerek

szelektivitása

megfelelőnek

bizonyult,

mivel

a

kromatogrammokon nem jelentek meg a vizsgált anyagokkal interferáló csúcsok. Az LOD érték VCM esetén 0,2 µg/ml-nek, GEN esetén pedig 0,1658 µg/ml-nek adódott. A LOQ érték VCM meghatározása esetén 0,6 µg/ml, GEN esetén pedig 1,0 µg/ml volt. A vizsgált koncentrációtartományban a koncentráció-csúcs alatti terület arány lineáris (az r2 értéke VCM esetén 0,9988, GEN esetén 0,99908). A vizsgált validálási paraméterek megfelelnek a nemzetközi előírásoknak. A validálás eredményei is alátámasztották a fejlesztett kromatográfiás módszerek alkalmasságát az általam vizsgált minták hatóanyagtartalmának meghatározására. CPFX meghatározására validált bioanalitikai módszert alkalmaztam. A kromatográfiás

rendszer

a

kioldódásvizsgálatok

során

nyert

minták

hatóanyagtartalmának meghatározására is alkalmasnak bizonyult.

6.2 Fizikai-kémiai vizsgálatok eredményei A hatóanyagleadási vizsgálatok előtt az előállított viaszos hordozórendszerek fizikai paramétereit vizsgáltam. A 8. táblázat foglalja össze ezen eredményeket. A DSC vizsgálatok során azt tapasztaltam, hogy a Cera alba:Precirol® (50:50) és Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) összetételű minták olvadáspontja alacsonyabb, mint a másik két összetételé (Cera alba:Vaselinum album (95:5) és Cera alba:Vaselinum album (90:10)). Az alacsonyabb olvadáspontú összetételekben található Precirol® hatására a rendszerek olvadáspontja lecsökken.

82

A legalacsonyabb cseppenésponttal a Cera alba:Precirol® (50:50) összetétel rendelkezett, míg a legmagasabbal az Cera alba:Vaselinum album (95:5). A nyomószilárdság értékek a Cera alba:Precirol® (50:50) és Cera alba:Precirol®: Vaselinum album (45:45:10) összetétel esetén voltak a legmagasabbak (>6400 g), tehát az alkalmazott segédanyag a rendszer szilárdságát is befolyásolta. A nedvesedési peremszög értéke szintén a Cera alba:Precirol® (50:50) és Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) összetétel esetén alacsonyabbak, mint az Cera alba:Vaselinum album (95:5) és Cera alba:Vaselinum album (90:10) összetételeké. A fizikai vizsgálatok alapján arra következtetésre jutottam, hogy az alkalmazott segédanyagok a hordozók fizikai paramétereit befolyásolják. A Precirol® (olvadáspontja 56 °C) felhasználása az olvadás-, cseppenéspontot és a nedvesedési peremszöget csökkentette, a nyomószilárdságot növelte. Ezen paraméterek változásának nagy jelentősége van a felhasználhatóság szempontjából is.

6.3. Kioldódási vizsgálatok Az

irodalmi

áttekintésben

is

említettem,

hogy

a

hatóanyagleadás

nyomonkövetésére új módszer kifejlesztésére volt szükség, mivel az irodalomban eddig nem volt fellelhető olyan kioldódásvizsgáló módszer, mely során a hatóanyagleadást több héten keresztül vizsgálták. A módszer kidolgozása során célom volt, hogy a fiziológiás

körülményeket

a

lehető

legjobban

megközelítsem.

Éppen

ezért

kioldóközegnek fiziológiás sóoldatot választottam, a kioldóközeget pedig a vizsgálat alatt 37 °C-ra temperáltam. A vizsgálat során a közeget nem kevertettem, így szimulálva a csont és környezetének szűkös vérellátását. A vizsgálati módszer egyszerűen kivitelezhetőnek bizonyult, költségkímélő, a fejlesztett analitikai módszerek pedig lehetővé teszik belőlük nyert mintákból a hatóanyag gyors és pontos meghatározását.

83

6.3.1. Gélek kioldódási eredményei A gélek kioldódási vizsgálatainak eredményeit a 24. és a 25. ábra mutatja be. A VCM tartalmú gélek esetében a hatóanyagleadás a hidroxietil-cellulóz tartalmú készítmény esetén a leggyorsabb, a 8 órás vizsgálat végére közel 90%. A Carbopol® 980 tartalmú minták hatóanyagleadása közel lineáris, a 8. óra elteltével a hatóanyag 30%-a szabadul fel. A Carbopol® 934 P, 971 P és a 974 PNF tartalmú készítmények hatóanyagleadása kevésbé egyenletes, a 8. óra elteltével a hatóanyag 40-70%-át adják le. Ezen eredmények alapján a nyújtott hatónyagleadás elérésére VCM hatóanyag esetén a Carbopol® 980 segédanyag használata bizonyult alkalmasnak. A Carbopol® segédanyagok esetében tapasztalható különbséget a segédanyagok szerkezetében fellelhető különbségek (keresztkötések száma és előállítási körülmények) okozzák. A GEN tartalmú géleknél a metil-cellulóz bizonyult a legkevésbé megfelelő összetételnek a nyújtott hatóanyagleadás szempontjából, hiszen a vizsgálat első órájában felszabadult belőle a hatóanyag 100%-a. A PVA-val, Carbopol® 940, Carbopol® 980 tartalmú gélek elnyújtottabb hatóanyagleadást eredményeztek. Ezen összetételek lineáris hatóanyagleadást mutattak, a szórás értékek alacsonyak voltak. Megállapítható, hogy a gélrendszerek összetételét mindenképpen az alkalmazott hatóanyag tulajdonságainak figyelembevételével szükséges optimálni.

6.3.2. Hordozórendszerek kioldódási eredményei A kifejlesztett kioldódási vizsgálati módszert alkalmazva vizsgáltam a VCM, GEN, CPFX és OTC tartalmú hordozórendszerek hatóanyagleadását. A kísérletek eredményeiből nyert kioldódási görbéket, valamint az illesztett egyeneseket a 27., 28., 29., 30. és 31. ábra, a 15., 16., 17. és 18. táblázat mutatja. A

VCM

tartalmú

hordozórendszerek

közül

a

legnagyobb

mértékű

hatóanyagleadást a Cera alba:Vaselinum album (95:5) összetételnél tapasztaltam. Ezt követte a Cera alba:Precirol® (50:50) összetétel és a Cera alba:Vaselinum album (90:10) összetétel, a legkisebb hatóanyagleadást pedig a Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) összetétel mutatta. A GEN tartalmú hordozók közül a Cera alba:Precirol®:

84

Vaselinum album (45:45:10) összetételből a hatóanyag gyorsan, a vizsgálat 4. napjára teljes mennyiségében felszabadult. A hatóanyagleadás sebessége a Cera alba: Vaselinum album (90:10) és Cera alba:Precirol® (50:50) összetételnél a vizsgálat 4 napjától kezdőden nem változott. Ezen összetételekből a hatóanyag 50%-a szabadul fel, a Cera alba:Vaselinum album (95:5) összetétel hatóanyagleadása a 14 nap után 10% alatt maradt. A CPFX tartalmú rendszerek vizsgálata során a legalacsonyabb mértékű hatóanyagleadással a két hét után a Cera alba:Vaselinum album (90:10) összetétel rendelkezik. A kioldódott hatóanyag mennyisége függ a hatóanyag tulajdonságaitól. Így a VCM esetén a hatóanyag 60%-a felszabadult a négyhetes vizsgálat alatt, míg a CPFXnál a legnagyobb hatóanyagleadás is csak 1% volt a két hetes vizsgálat során. Különbségek láthatók az eltérő összetételeknél nyert kioldódási görbék linearitásában, valamint a mért felszabadult hatóanyag mennyiség szórásában is. A VCM tartalmú rendszereknél a legnagyobb szórást a Cera alba:Precirol® (50:50) és a Cera alba:Vaselinum album (95:5) összetételeknél tapasztaltam, míg a Cera alba:Vaselinum album (90:10) és a Cera alba: Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) kombinációnál a szórás kicsi volt. A GEN tartalmú rendszerek vizsgálatakor a szórások értéke alacsony volt, a kioldódási görbe pontjaira illesztett egyenesek r2 értékek alacsonyak, a kioldódás nem lineáris. CPFX rendszereknél a szórás értékek alacsonyak, az r2 értékek pedig linearitásra utalnak. Az OTC tartalmú formulációk hatóanyagleadását bemutató ábra mutatja a különböző

segédanyagok

hatását

a

kioldódott

hatóanyag

mennyiségére.

A

hatóanyagleadás sebességét az alkalmazott segédanyagok (Precirol®, Gelucire® 50/13) megnövelték, ezen összetételek estében a hatóanyagleadás a 4. hét végére 30%-kal nagyobb volt. Így ezen vizsgálatok is alátámasztották a felhasznált segédanyagok hatóanyagleadást moduláló hatását. A hordozórendszerből történő hatóanyagleadás mind a hordozórendszertől (összetétel, porozitás, nedvesedés), mind a hatóanyag sajátosságaitól nagymértékben (oldékonyság, molekulatömeg) függ. Így ezen paraméterek módosítása változást okoz a kioldódási profilban (idő, sebesség, leadott hatóanyag mennyisége). A fizikai vizsgálatok valamint az in vitro kioldódási vizsgálatok alapján a legmegfelelőbb összetétel kiválasztása lehetséges. Ezek alapján a legmegfelelőbbnek

85

VCM esetén Cera alba:Precirol®:Vaselinum album (45:45:10) és Cera alba:Precirol® (50:50) összetételek, GEN hatóanyagú rendszereknél a Cera alba:Vaselinum album (90:10) és a Cera alba:Precirol® (50:50) összetételek, CPFX mintánál pedig a Cera alba: Precirol®: Vaselinum album (45:45:10) és a Cera alba: Precirol® (50:50) összetételek bizonyultak, mind az olvadás-, cseppenéspont, nedvesedési peremszög értékek, mind a hatóanyagleadás tekintetében. A gélek alkalmazása csontműtétek során nehézkesebb, mint a kifejlesztett hordozórendszereké. Nehézséget jelent a csont felszínére való felvitele, mely a műtéti körülmények között, ex tempore nem kivitelezhető. Ugyanakkor a fejlesztett hordozórendszerek mérete és alakja igény szerint változtatható, így lehetővé válik, hogy a megfelelő méretű és alakú hordozórendszert az alkalmazott csonthoz keverjék. A hordozórendszerek másik felhasználási módja lehet a csontgraftok bevonása akár ex tempore, akár előzőleg.

6.4. Mikrobiológiai vizsgálatok eredményei Az in vitro hatóanyagleadás-vizsgálatok és fizikai vizsgálatok után az előállított korong alakú antibiotikum tartalmú hordozórendszereket in vitro mikrobiológiai vizsgálatok során értékeltük. A vizsgálatok során a kialakuló gátlási zóna nagyságát figyeltük meg. A vizsgálatok során a hordozórendszerek hatékonynak bizonyultak mindhárom vizsgálati módszer alkalmazása esetén. A direkt módszer esetén a táptalajra helyezett antibiotikum tartalmú gyógyszerhordozó-rendszer körül gátlási udvar alakult ki, melynek nagyságából következtethetünk a rendszer hatékonyságára. A kialakult gátlási zóna nagysága egy hét elteltével sem csökken. Ugyanakkor a táptalaj kiszáradása miatt a módszer nem alkalmas a hatóanyagleadás több héten keresztül történő megfigyelésre. A korongdiffúziós módszer alkalmazása során a táptalajt minden esetben frissre cseréltük, így a kiszáradást elkerültük. Az „együtt inkubálás” módszerével tudtuk a legjobban modellezni a hordozórendszerek antimikróbás aktivitását. Egy hét volt szükséges ahhoz, hogy a korong kifejtse a hatását. Felmerül, hogy az alkalmazást követően párhuzamosan szükséges lehet parenterálisan antibiotikum adása is.

86

6.5. In vivo vizsgálatok eredményei

Egy olyan biodegradábilis, antibiotikumot tartalmazó gyógyszerhordozó rendszer, amely autológ vagy homológ csontgraftokhoz keverhető vagy köthető, széles körben alkalmazható lenne a klinikai gyakorlatban. Egy ilyen gyógyszerhordozó rendszer alkalmazható lenne cement nélküli és csontcementes revíziós műtétek során is. Az állatkísérleteink során bizonyítást nyert, hogy az általunk korábban létrehozott viaszrendszer képes a csontgraftokkal együtt megfelelni a fenti igényeknek. Alkalmazhatóságát felhasználható.

tekintve

A

egyszerű,

vancomycin

műtéti

tartalmú

körülmények hordozórendszer

között

könnyen

elkeverhető

a

csontőrleménnyel és így azonnal beültethetővé válik. Csontgraftként alkalmazható natív csont, fagyasztott vagy mertiolátban kezelt csont, vagy akár liofilizált csontkészítmény. Lehetséges a csontgraftok impregnálása, fizikai bevonása is, de ehhez laboratóriumi körülmények szükségesek. Kísérleteink igazolták, hogy az antibiotikumot tartalmazó gyógyszerhordozó rendszer alkalmas a Staphylococcus okozta osteomyelitis lokális kezelésére, a csontgraft beépülését nem gátolja, a gyulladásos folyamatok regresszióját idézi elő. Mivel nem toxikus, úgy fejti ki baktericid hatását, hogy a gazdaszervezetet nem károsítja. A műtét utáni 21. napon a III. csoportban lévő kísérleti állatok testtömege alacsony maradt, míg a fehérvérsejt-szám emelkedett volt. A bakteriológiai tenyésztések mind a 21., mind a 42. napon pozitívak voltak ebben a csoportban. A II. csoportban a 21. napon végzett műtétet követően a 6. hétre a kísérleti állatok visszanyerték eredeti testtömegüket, a fehérvérsejt-szám kissé emelkedett maradt, de szignifikánsan alacsonyabbnak mutatkozott a III. csoportban mérthez képest. A bakteriális tenyésztések rendre negatív eredményt mutattak, ami bizonyítja az infekció kontrollt. A két csoportot összehasonlítva nem állítható, hogy a II. csoportban lévő nyulak teljesen meggyógyultak, de tünetmentesek voltak, az észlelt paraméterek alapján megfelelő állapotban voltak, míg a III. csoportban lévő állatok súlyos betegnek voltak mondhatók. A

kísérleti

állatok

I.

csoportjában

bizonyítást

nyert

a

hordozórendszer

biodegradábilitása, a szöveti reakció elhanyagolható volt, új csontképződés volt megfigyelhető.

87

7. Következtetések Doktori fejlesztettem

munkám ortopédiai

során

antibiotikum

célra.

Ezen

tartalmú

rendszereket

új

hordozórendszereket

hatóanyagleadásuk,

fizikai

paramétereik, valamint in vivo állatkísérletben mutatott hatékonyságuk szerint vizsgáltam. A megfelelő antibiotikus kezelés feltétele, hogy helyes indikáció alapján, a legalkalmasabb antibiotikummal, kellő adagban, megfelelő ideig végezzük. Az antibiotikum rezisztencia terjedése különösen jelentős a hosszú ideig kórházban fekvő betegeknél. Revíziós műtéteknél elsősorban a Staphylococcus aureus és Staphylococcus epidermidis törzsek okoznak leggyakrabban periprotetikus infekciót, de számolni kell sok esetben ún. multirezisztens kórokozókkal is. A kioldódási vizsgálatok során nyert minták hatóanyagtartalmának (VCM, GEN) meghatározására kidolgozott folyadékkromatográfiás módszerek a validálási eredmények alapján alkalmasak a VCM és GEN tartalmú hordozórendszerek hatóanyagleadásának nyomonkövetésére. Ezen módszerek az irodalomban fellelhető eljárásokkal szemben gyorsak és robosztusak. Az LOQ értékek megfelelőek a felszabaduló hatóanyag mennyiségének reprodukálható, megbízható meghatározására. A CPFX tartalmú hatóanyagleadásának nyomonkövetésére az alkalmazott validált módszer megfelelőnek bizonyult. Az OTC meghatározására gyógyszerkönyvi (USP) módszert alkalmaztam. A mátrix rendszerből történő hatóanyagleadás mind a hordozórendszertől (összetétel, porozitás, nedvesedés), mind a hatóanyag sajátosságaitól nagymértékben (oldékonyság, molekulatömeg) függ. Ezen paraméterek módosítása változást okoz a kioldódási profilban (idő, sebesség, leadott hatóanyag mennyisége). Így elmondható, hogy az alkalmazott hatóanyagnak megfelelően a készítmények (mind a gélek, mind a hordozórendszerek) összetételét optimálni szükséges. Újonnan kifejlesztett vancomycin tartalmú gyógyszerhordozó rendszerünk nyulakban biodegradábilisnak bizonyult és nem gátolta a csont újdonképződést. Nyulakban MRSA-val okozott osteomyelitis esetében hatékony lokális antibiotikus hatást tudott kifejteni a rendszer. További vizsgálatok szükségesek a lehetséges ortopéd sebészeti, illetve a humán alkalmazás tekintetében.

88

Az értekezés új tudományos eredményei •

Munkám során új hatóanyagleadó rendszerek formulálási és vizsgálati módszereit fejlesztettem ki ortopédiai alkalmazás számára. Az előkísérletek során gélrendszereket állítottam elő. A további fejlesztés során hidrofób hordozórendszereket

állítottam

elő.

Modellhatóanyagként

vancomycint

alkalmaztam. A későbbi kísérletek során a hordozórendszerekbe gentamicint, ciprofloxacint és oxytetracyclint is inkorporáltam.

•

In vitro vizsgálati módszert dolgoztam ki (fiziológiás sóoldat kioldóközegben) a műtött csont környezetében több héten keresztül végbemenő hatóanyagleadás tanulmányozására.

•

Az alkalmazott antibiotikumok (vancomycin, gentamicin) kioldóközegben való meghatározására alkalmas analitikai módszert fejlesztettem ki és validáltam.

•

A hatóanyagleadás vizsgálati módszere alkalmasnak bizonyult a különböző segédanyagok

hatóanyagleadás

sebességét

szabályozó

hatásának

tanulmányozására. A segédanyagok arányainak változtatásával több hetes hatóanyagleadás volt biztosítható. •

A hosszú hatóanyagleadást és a hordozók in vitro és in vivo viselkedését in vitro mikrobiológiai és in vivo állatkísérletes vizsgálatokkal igazoltuk. Az alkalmazott hordozórendszerek biodegradábilisnek mutatkoztak hat héttel az alkalmazást követően.

89

Az eredmények gyakorlati alkalmazhatósága •

Olyan új hordozórendszerek kerültek kifejlesztésre, amelyek alkalmasak különböző

antibiotikumok

hosszan

elnyújtott,

több

héten

keresztüli

hatóanyagleadására. Ezzel lehetőség nyílik revíziós műtéteknél profilaktikus felhasználásukra, illetve szeptikus betegek esetében terápiás alkalmazásukra. A vizsgált hidrofób hordozórendszerek alkalmasak lehetnek humán készítmények fejlesztésére is, melyhez klinikai vizsgálatok még szükségesek. Az eddigi in vivo vizsgálatok eredményei alátámasztották az in vitro eredményeket. A kifejlesztett rendszerek hatékonynak és biodegradábilisnek bizonyultak.

•

A fenti eredmények megelőzik az esetleges reoperáció kockázatát, így a betegek gyorsabb gyógyulásának az esélyét növelik, a rövidebb és hatékonyabb orvosi beavatkozással.

•

A fejlesztett gyors, egyszerű analitikai módszerek alkalmasak a felhasznált antibiotikumok

kvantitatív

meghatározására.

Humán

vizsgálatok

során

alkalmasak lehetnek a hatóanyag szervezetbeni eloszlásának nyomonkövetésére megfelelően fejlesztett mintaelőkészítéssel. A kifejlesztett analitikai módszerek más kioldódási vizsgálatok esetén is alkalmazhatók gyógyszertechnológiai fejlesztés során.

90

8. Összefoglalás Csontpótlás során a lokálisan ható antibiotikumok előnyösek a kórokozók elleni (ortopédiában leggyakoribbak a Staphylococcus aureus és Staphylococcus epidermidis törzsek) küzdelemben, akár osteomyelitises üregek kitöltésekor, akár fertőzött endoprotézisek revíziója során. A nemzetközi szakirodalom szerint, az ortopéd sebészetben a csontinfekció megelőzésére elsősorban gentamicint, ciprofloxacint, vancomycint alkalmaznak a csontcementre, illetve csontőrleményre impregnálva. Vizsgálataink célja olyan technológia kifejlesztése és tanulmányozása, amely a revíziós műtéteknél a felhasználható csontgraftok és egyéb biokompatibilis anyagok antibiotikumokkal történő bevonását, impregnálását teszi lehetővé. Az antibiotikum csonthoz történő keverése, illetve a csontfelszín bevonása speciális technológiát igényel, mert a gyógyszer kiáramlását programozottan kell megvalósítani. Doktori munkám során célul tűztem ki olyan specifikus hordozó rendszerek kifejlesztését,

amelyek

alkalmasak

a csonthiányok

pótlása során

felhasznált

csontgraftok antibiotikumokkal történő bevonására, és folyamatosan biztosítani tudják az alkalmazás helyén a hatékony koncentrációt. Az előkísérletes vizsgálatok során különböző gélképző anyagok segítségével géleket állítottunk elő, melyeknek vizsgáltuk hatóanyagleadásuk és fizikai-kémiai tulajdonságaik tekintetében. A későbbiek folyamán viaszkeverékeket állítottunk elő. Vancomycint, gentamicint, ciprofloxacint és oxytetracyclint inkorporáltunk a különböző rendszerekbe.

Ezen

vizsgálati

mintákat

fizikai

paramétereik,

valamint

hatóanyagleadásuk tekintetében vizsgáltuk in vitro körülmények között. Az in vitro kioldódási vizsgálatok értékelésére megfelelő analitikai módszereket alkalmaztunk, fejlesztettünk és validáltunk (HPLC, HPLC/MS). Az alkalmas hordozórendszerek kiválasztásához mikrobiológiai értékmérést valamint in vivo állatkísérletes vizsgálatokat végeztünk, melyek eredményei alátámasztják az in vitro vizsgálati következtetéseket. Így lehetővé válik olyan hordozórendszerek kifejlesztése, melyek alkalmasak a hatóanyag több héten keresztüli leadására megfelelő koncentrációban.

91

9. Summary INVESTIGATION OF CARRIER SYSTEMS CONTAINING ANTIBIOTICS USED IN BONE SURGERY

During bone subtitution surgeries, local drug delivery systems can be favourable againts bacteria (in orthopaedic practice the most frequents strains are Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis), in case of the treatment of either osteomyelitis or the revision surgery of infectious prothesis. According to international literature, in orthopaedic surgery principally gentamicin, ciprofloxacin and vancomycin impregnated on bone cement or allograf are principally applied for the prevention of bone infection. The aim of our studies was to develop and study a technology that enables the impregnation process of bone grafts or biocompatible materials that are used in revision surgery. The mixing of antibiotics with bone and the impregnation of bone surface requires special technology beacuse the drug release has to be strictly controlled. During my doctorial work, I set the aim to develop specific carrier systems that are able to impregnate the bone grafts during orthopaedic surgeries and can assure the effective concentration at the site of action. Gel systems were prepared in preformulation work using different gel forming agents. The gels were studied in physical and drug release aspects. Then waxy systems were prepared. Vancomycin, gentamicin, ciprofloxacin and oxytetracyclin were applied as modell drugs. These samples have been investigated in physical and drug release aspects in in vitro circumstances. For the determination of samples drawn in drug release studies, appropriate analytical methods have been developed and validated (HPLC, HPLC/MS). For the selection of proper composition microbiological investigations as well as in vivo studies have been performed. The results of these studies confirmed the results of the in vitro investigations. Thus the development of carrier systems that are releasing the active ingredient for weeks, is becoming possible.

92

10. Irodalomjegyzék 1. Vizkelety T. Az ortopédia tankönyve, Semmelweis Kiadó (2002) 2. Schlegel U, Perren SM. (2006) Surgcal aspects of infection involving osteosynthesis implants: implant design and resistance to local infection, Injury 37: S67-73 3. Adachi K, Tsuromoto T, Yonekura A, Nishimura S, Kajiyama S, Hirakata Y, Shindo H. (2007) New quantitative image analysis of staphylococcal biofilms on the surfaces of nontranslucent metallic biomaterials, J. Orthop. Sci. 12: 178-184 4. Mader JT, Landon GC, Calhoun J. (1993) Antimicrobial treatment of osteomyelitis, Clin. Orthop. 295: 87-95 5. Patzakis MJ, Mazur K, Wilkins J, Sherman R, Holtom P (1993) Septopal beads and autogenous bone grafting for bone defects in patients with chronic osteomyelitis, Clin. Orthop. Relat. Res. 295: 112-118 6. Walenkamp GH, Kleijn LL, de Leeuw M. (1998) Osteomyelitis treated with gentamycin-PMMA beads: 100 patients followed for 1–12 years, Acta Orthop. Scand. 69: 518-522 7. Chilukuri DM, Shah JC. (2005) Local delivery of vancomycin for the prophylaxis of prosthetic device-related infections, Pharm. Res. 22: 563-572 8. Winkler H, Kaudela K, Stoiber A, Menschik F. (2006) Bone grafts impregnated with antibiotics as a tool for treating infected implants in orthopedic surgery – one stage revision results, Cell Tissue Bank 7: 319-323 9. Beardmore AA, Brooks DE, Wenke JC., Thomas DB. (2005) Effectiveness of local antibiotic delivery with an osteoinductive and osteoconductive bone-graft substitute, J. Bone Joint Surg. Am. 87: 107-112 10. Cevher E, Orhan Z, Mülazimoglu L, Sensoy D, Alper M, Yildiz A, Özsoy Y.(2006) Characterization of biodegradable chitosan microspheres containing vancomycin and treatment of experimental osteoyelitis caused by ethicillin-resistant Staphylococcus aureus with prepared microsphere, Int. J. Pharm. 217: 127-135 11. Dévay Attila, Antal István: A gyógyszeres terápia biofarmáciai alapjai, Medicina Könyvkiadó Zrt, Budapest 183-232 (2009) 12. Wichelhaus TA, Kern S, Schafer V, Brade V. (1999) Rapid detection of Epidemic Stains of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, J. Clin. Microbiol. 37: 690-693 13. Ciampolini J, Harding KG. (2000) Pathophysiology ofchronic bacterial osteomyelitis. Why do antibiotics fail so often?, Postgrad. Med. J. 76: 479-483

93

14. Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Donati ME, Pirini V, Visai L, Speziale P., Montarano L.(2005) Antibiotic resistencein exopolysacchaide-forming Staphylococcus epidermidis clinical isolates from orthopaedic implant infections, Biomaterials 26: 6530-6535 15. Ádám É.: Gyógyszerészi mikrobiológia, Semmelweis Kiadó 135-139 (2001) 16. Sampedro MF, Piper KE, McDowell A, Patrick S, Mandrekar JN, RouseMS, Steckelberg JM, Patel R. (2009) Species of Proponibacterium and Propionibacterium acnes phylotypes assosiated with orthopedic implant, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64: 138-145 17. Trampuz A, Zimmerli W. (2006): New strategies for the treatment of infections associated with prostethic joints, Curr. Opin. Investig. Drugs. 6:185-190 18. Mah TF, O’Toole GA. (2001) Mechanism of biofilm resistence to antimicrobal agents, Trends microbiol. 9, 34-39 19. Ramage G, Tunney MM, Patrick S, Gorman SP,. Nixon JR. (2003) Formation of Propionibacterium acnes biofilms on orthopaedic biomaterials and their susceptibility to antimicrobials, Biomaterials 24: 3221-3227 20. Schmitz FJ, Fluit AC, Gondolf M, Beyrau R, Lindenlauf E, Verhoef J, Heinz HP, Jones ME. (1999) The prevalence of aminoglycoside resistance and corresponding resistance genes in clinical isolates of Staphylococci from 19 European hospitals, J. Antimicrob. Chemother. 43: 253-259 21. Hayashi K. (1984) Other antibiotics, Clin. Orthop. Relat. Res. 190, 109-113 22. Hanssen AD, Osmon DR. (1999): The Use of Prophylactic Antimicrobal Agents During and After Hip Arthroplasty, Clin. Orthop. Relat. Res. 369: 124-138 23. Krasko MY, Golenser J, Nyska A, Nyska M, Brin YS, Domb AJ. (2007) Gentamicin extended release from an injectable polymeric implant, J. Control. Relese 117: 90-96 24. Zimmerli W, Widmer A, Blatter M, Frei R,. Ochsner PR. (1998) Role of Rifampin for Treatment of Orthopedic Implant-Related Staphylococcal Infections, JAMA 279: 1537-1541 25. Toyoguchi T, Takahashi S, Hosoya J, Nakagawa Y, Watanabe H. (1997) Nephrotoxicity of Vancomycin and Drug Interaction Study with Cilastatin in Rabbits, Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1985-1990 26. Gyires K., Fürst Zs.: Farmakológia, Medicina Könyvkiadó Zrt., 830-831 (2007) 27. Graham AE, Speicher E, Williamson B. (1997): Analysis of gentamicin sulfate and a study of its degradation in dextrose solution, J. Pharm. Biomed. Anal. 15: 537-543

94

28. Giacometti A, Cirioni O, Ghiselli R, Goffi L, Viticchi C, Mocchegiani F, Riva A, Orlando F, Saba V, Scalise G. (2000): Mupirocin Prophylaxis against, MethicillinSusceptible, Methicillin-Resistant or Vancomycin-Intermediate Staphylococcus epidermidis Vascular-Graft Infection, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2842-2844 29. Davis SL,. McKinnon PS, Hall LM, Delgado G, Rosa W, Robert F. Wilson RF, Rybak M. (2007) Daptomycin versus Vancomycin for Complicated Skin and skin Structure Infections: Clinical and Economical Outcomes, Pharmacotherapy 27: 16001618 30. Rao N, Ziran BH, Wagener MM, Santa ER, Yu VL. (2004) Similar Hematologic Effects of Long-Term Linezolid and Vancomycin Therapy in a Prospective Observational Study of Patients with orthopaedic Infections, Clin. Infect. Dis. 38: 10581064 31. González De Valle A, Bostrom M, Brause B, Harney C, Salvati EA. (2001) Effective bactericidal activity of tobramycin and vancomycin eluted from acrylic bone cement. Acta Orthop. Scand. 72: 237-240 32. Rushton N. (1997) Applications of local antibiotic therapy, Eur. J. Surg. 578: 27-30 33. Henry SL, Galloway KP. (1995): Local antibacterial therapy for the management of orthopaedic infections: Pharmakokinetic considerations, Clin. Pharmacokinet. 29: 36-45 34. Kanellakopoulou K., Giamarellos-Bourboulis EJ. (2000) Carrier Systems for the local delivery of antibiotics in bone infections, Drugs 59: 1223-1232 35. Laki M, Hajdú M, Zahár Á, Sáska Z, Klebovich I, Szendrői M, Antal I. (2007) Csontműtéteknél alkalmazható antibiotikum-tartalmú hordozórendszerek tervezése, Acta Pharm. Hung. 77: 108-115 36. Langlais F. (2003) Can we improve the results of revision arthroplasty for infected total hip replacement? J Bone Joint Surg. 85: 637-640 37. Shi Z, Neoh KG, Kang ET, Wang W. (2006) Antibacterial and mechanical properties of bone cement impregnated with chitosan nanoparticles, Biomaterials 27: 2440-2449 38. Haddad FS, Masri BA, Campbell D, McGraw RW, Beauchap CP, Duncan CP. (2000) The Prostalac functional spacer in two-stage revision for infected knee replacements, J Bone Joint Surg. 82: 807-812 39. Adams K, Couch L, Cierny G. (1992) In vitro and in vivo evaluation of antibiotic diffusion from antibiotic-impregnated polymethylmethacrylate beds, Clin. Orthop. 278: 244-252 40. Kuercle DK, Landon GC, Musher DM. (1991) Elution of vanomycin, daptomycin and amikacin from acrylic bone cement, Clin. Orthop. 264: 302-308

95

41. Langlais F, Belot N, Ropars M, Thomazeau H, Lambotte JC, Cathalinau G. (2006) Antibiotic cement sin articular prosthesis: current orthopaedic concepts, Int. J. Antimicrob. Agents 28: 84-89 42. Mendel V, Simanowski HJ, Scholz HC, Heymann H. (2005) Therapy with gentamicin-PMMA beads, gentamicin-collagen sponge, and cefaolin for experimental osteomyelitis due to staphylococcus aureus in rats, Arch.. Orthop. Trauma Surg. 125: 363-368 43. Virto MR, Frutos P, Torrado S, Frutos G. (2003) Gentamicin release from modifed acrylic bone cements with lactose and hydroxypropylmethylcellulose, Biomaterials 24: 79-87 44. Kuechle DK, Landon GC, Musher DM, Noble PC. (1991) Elution of Vancomycin, Daptomycin and Amikacin from Acrylic Bone Cement, Clin. Orthop. Relat. Res. 264: 302-308 45. Nelson CL, Evans RP, Blaha JD, Calhoun J, Henry SL, Patzakis MJ. (1993) A Comparison of Gentamicin-Impregnated Polymethylmethacrylate Bead Implantation to Conventional Parenteral Antibiotic Therapy in Infected Total Hip and Knee Arthroplasty, Clin. Orthop. Relat. Res. 295: 96-101 46. Liu SJ, Chi PS, Lin SS, Ueng SWN, Chan EC, Chen JK. (2007) Novel solvent-free fabrication of biodegradable poly-lactic-glicolic acid (PLGA) capsules for antibiotics and rhBMP-2 delivery, Int. J. Pharm. 330: 45-53 47. Evan RP, Nelson CL. (1993) Gentamicin-impregnated Polymethylmethacrylate Beads Compared with Systemic antibioic Therapy in the Treatment of chronic Osteomyelitis, Clin. Orthop. Relat. Res. 295: 37-42 48. Bettencourt A, Calado A, Amaral J, Alfaia A, Vale FM, Monteiro J, Montemor MF, Ferreira MGS, Castro M. (2004) Surface study on acrylic bone cement, Int. J. Pharm. 278: 181-186 49.Walenkamp GHIM, Vree TB,. Van Rens TJG. (1986) Gentamicin-PMMA Beads (Pharmacokinetic and Nephrological Study), Clin. Orthop. Relat. Res. 205:171-183 50. Anagnostakos K, Wilmes P, Schmitt E, Kelm J. (2009) Elution of gentamicin and vancomycin from polymethylmethacrylate beads and hip spacers in vivo, Acta Orthop. 80: 193-197 51. Shirtliff ME, Calhoun JH, Mader JT. (2002) Experimental Osteomyelitis Treatment with Antibiotic-Impregnate Hydroxyapatite. Clin. Orthop. 401: 239-247 52. Li B, Liu X, Cao C, Dong Y, Wang Z, Ding C. (2008) Biological and antibacterial properties of plasma sprayed wollastonite coatings grafting gentamicin loaded collagen. J. Biomed. Mater. Res. 87: 84-90

96

53. Wachol-Drewek Z, Pfeiffer M, Scholl E. (1996) Comparative investigation of drug delivery of collagen implants saturated in antibiotic soluions and sponge containing gentamicin, Biomaterials 17: 1733-1738 54. Bunetel L, Segui A, Cormier M. (1990) Comparative study of gentamicin release from normal and low viscosity acrylic bone cement, Clin. Pharmacokinet. 19: 333-340 55. Böstman OM. (1991) Current concepts review adsorbable implants for the fixation of fracture. J Bone Joint Surg. 73A: 148-153 56. Xu L, Wu F, Yuan W, Jin T. (2008) Controlled-release implan system formulated using biodegradable hemostatic gauze as scaffold, Int. J. Pharm. 355: 249-258 57. Garvin K, Feschuk C. (2005) Polylactide-polyglycolide Antibiotic Implants, Clin. Orthop. Relat. Res. 437: 105-110 58. Böstman O, Hirvensalo E, Makinen J, Rokkanen P. (1977) Foreign-body reactions to fracture fixation implants of biodegradable synthetic polymers. J Bone Joint Surg. 72B: 592-596 59. Lin SS, Ueng SWN, Liu SJ, Chan EC, Chao EK, Tsai CH, Chen KT, Wei FC, Shih CH. (1999) Developent of a Biodegradable Antibiotic Delivery System, Clin. Orthop. Relat. Res. 362: 240-250 60. Calhoun JH, Mader JT. (1997) Treatment of Osteomyelitis with a Biodegradable Antbiotic Implant, Clin. Orthop. Relat. Res. 341: 206-214 61. Kawanabe K, Okada Y, Matsusue Y. (1998) Treatment of osteomyelits with antibiotic-soaked porous glass ceramic, J. Bone Joint Surg. Br. 80: 527-530 62. Schierholz JM, Steinhauser H, Rump AFE, Berkels R, Pulverer G. (1997) Controlled release from biomedical polyurethans: morphological and structural features. Biomaterials 18: 839-844 63. Chai F, Hornez JC, Blanchemain N, Neut C,. Descamps M, Hildebrand HF. (2007) Antibacterial activation of hydroxyapatite (HA) with controlled porosity by different antibiotics, Biomol. Eng. 24: 510-514 64. Joosten U, Joist A, Gosheger G, Liljenqvist U, Brandt B, von Eiffe C. (2005) Effectiveness of hydroxyapatite-vancomycin bone cement int he treatment of Staphylococcus aureus induced chronc osteomyelitis. Biomaterials 26, 5251-5258 65. Huber FX, Belyaev O, Hillmeier J, Kock HJ, Huber C, Meeder PJ, Irina Berger I. (2006) First histologicalobservations on the incorporation of a novel nanocrystalline hydroxapatite paste OSTIM in human cancellous bone, BMC Musculoskelet. Disord. 7: 50-64

97

66. Zelken J, Wanich T, Gardner M, Griffith M, Bostro M. (2007) PMMA is Superior to Hydroxypaptite for Colony Reducion in Induced Osteomyelits, Clin. Orthop. Relat. Res. 462: 190-194 67. Del Real RP, Padilla S, Vallet-Regi M. (2000) Gentamicin release from hydroxyapatite/poly(ethylmathacrylate)/poly(methylmethacrylate) composites, J. Biomed. Mater. Res. 52: 1-7 68. Padilla S, del Real RP, Vallet-Regi M. (2002) In vitro release of gentamicin from OHAp/PEMA/PMMA samples, J. Control. Release 83: 343-352 69. Stigter M, Bezemer J, de Groot K, Layrolle P. (2004) Incorporation of different antibiotics into carbonated hydroxyapatite coatings on titanium implants, rlease and antibiotic efficacy, J. Control. Release 99: 127-137 70. Wang X, You X, Huo S, Li X, Fan Y, Zhang Y, Zhang W. (2007) Studies on the GS impregnated calcium sulphate implants. J. Biomed. Eng. 24: 802-805 71. Gitelis S, Brebach GT. (2002) The treatment of chronic osteomyelitis with a biodegradable antibiotic-impregnated implant, J. Orthop. Surg. 10: 53-60 72. Rauschmann MA, Wichelhaus TA, Stirnal V, Dingeldein E, Zichner L, Schnettler R, Alt V. (2005) Nanocrystalline hydroxyapatite and calcium sulfate as biodegradable composite carrier material for local delivery of antibiotics in bone infections, Biomaterials 26: 2677-2684 73. Lin SS, Ueng SWN, Lee SS, Chan EC, Chen KT, Yang CY, Chen CY, Chan YS. (1999) In vitro elution of antibiotic-ipregnated biodegradable calcium alginate wound dressing, J. Trauma 47: 136-141 74. Ueng SWN, Lee MS, Lin SS, Chan EC, Liu SJ. (2007) Development of a Biodegradable Alginate Carrier System for antibiotics and Bone Cells, J. Orthop. Res. 25: 62-72 75. Ueng SWN, Yuan LJ, Lee N, Lin SS, Chan EC, Weng JH. (2004) In vivo study of biodegradable alginate antibiotic bead sin rabbits, J. Orthop. Res. 22, 592-599 76. Manouchehr M, Ozturk OG, Eskandari HG. (2006) Cyanoacrylate Adhesive Provides Efficient Loal Drug Delivery, Clin. Orthop. Rel. Res. 451: 242-250 77. Shermak MA, Wong L, Inoue N, Crain BJ, Im MJM, Chao EY, Manson PN. (1998) Fixation of the craiofacial skeleton with butyl-2-cianoacrylate and its effects on histotoxicity and healing, Plast. Reconstr. Surg. 102: 309-318 78. Bonutti PM, Weiker GG, Andrish JT.(1988) Isobutyl cyanoacrylate as a soft tissue adhesive, an in vtudy in the rabbit Achilles tendon, Clin. Orthop. Relat. Res. 229: 241248

98

79. Iooss P, Le Ray AM, Grimandi G, Daculsi G, Merle C. (2001) A new injectable bone substitute combing poly(ε-caprolactone) microparticles with biphasic calcium phosphate granules, Biomaterials 22: 2785-2794 80. Garvin K, Feschuk C. (2005) Polylactide-poliglycolid antibiotic Implants, Clin. Orthop. 437: 105-110 81. Buttaro MA, Gonzalez Della Vale AM, Pineiro L, Mocetti E, Morandi AA, Picaluga F. (2003) Incorporation of vancomycin-supplemented bone allografts, Acta Orthop. Scand. 74: 505-513 82. Buttaro MA, Gimenez MI, Greco G, Barcan L, Piccaluga F. (2005) High active local levels of vancomycin without nephrotoxicity released from impacted bone allografts in 20 revision hip arthroplasties, Acta Orthop. 76: 336-340 83. Buttaro MA, Pusso R, Piccaluga F. (2005) Vancomycin-supplemented impacted bone allografts in infected hip arthroplasty, J. Bone Joint Surg. 87: 314-319 84. Chen CE, Ko JY, Pan CC. (2005) Results of vancomycin-imprgenated cancellous bone grafting for infected tibial nenunion, Arch. Orthop. Trauma Surg. 125: 369-375 85. Buttaro M, Comba F, Piccaluga F. (2007) Vancomycn-supplemented Cancellous Bone Allografts in Hip Revison Surgery, Clin. Orthop. Relat. Res. 461: 74-80 86. Winkler H, Janata O, Berger C, Wein W, Georgopoulos A. (2000) In vitro release of vancomycin and tobramycin from impregnated human and bovine bone grafts, J. Antimicob. Chemother. 46: 423-428 87. Hatefi A, Amsden B. (2002) Biodegradble injectable in situ forming drug delivery systems, J. Control. Release 80: 9-28 88. Veyries ML, Couaraze G, Geiger S, Agnely F, Massias L, Kunzli B, Faurisson F, Rouveix B. (1999) Controlled release of vancomycin from Poloxamer 407 gels. Int. J. Pharm. 192:183-193 89. Vyries ML, Faurisson F, Joly-Guillou ML, Rouveix B. (2000) Conrol of Staphylococcal Adhesion to Polymethylmethacrylate and Enhancement of Susceptibility to antibiotics by Poloxamer 407, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1093-1096 90. Schonauer C, Tessitore E, Barbagallo G, Albanese V, Moraci A. (2004) The use of local agents: bone wax, gelatin, collagen, oxidized cellulose, Eur. Spine J., 13: S89-S96 91. Wolvius EB, van der Wal KGH. (2003) Bone wax as a cause of a foreign body granuloma in a cranial defect: a case report. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 32: 656–658 92. Wellisz T, Armstrong JK, Cambridge J, Fisher TC. (2006) Ostene, a new watersoluble bone hemostasis agent. J Craniofac Surg 17: 420-425

99

93. Rácz I, Selmeczi B: Gyógyszertechnológia 3., Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 619-625 (2001) 94. Sáska Z, Hajdú M, Laki M, Klebovich I, Antal I. (2008) Szemészeti hatóanyagfelszabadító rendszerek fejlesztésének lehetőségei, Acta Pharm. Hung. 78. 156-164 95. Diana J, Visky D, Hoogmartens J, Van Schepdael A, Adams E. (2006) Investigation of vancomycin and related substances by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 20: 685-693 96. Shibata N, Ishida M, Venkata Y, Prasad R, Gao W, Yoshikawa Y, Takada K. (2003) Highly sensitive quantification of vancomycin in plasma samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and oral bioavailability in rats. J. Chromatogr. B. 789: 211-218 97. Luksa J, Marusic A. (1995) rapid high-performance liquid chromatographic determination of vancomycin in human plasma, J. Chromatogr. B 667: 277-281 98. Favetta P, Guitton J, Bleyzac N, Dufresne C, Bureau J. (2001) New sensitive assay of vancomycin in human plasma using high-performance liquid chromatography and elctrochemical detection, J. Chromatogr. B 751: 377-382 99. Farin D,. Piva GA, I Gozlan I, Kites-Cohen R. (1998) A modified HPLC method for the determination of vancomycin in plama and tissues and comparison to FPIA (TDX), J. Pharm. Biomed. Anal. 18: 367-372 100. Backes DW, Aboleneen HI,. Simpson JA. (1998) Quantitation of vancomycin and its crystalline degradation product (CDP-1) in human serum by high performance liquid chromatography, J. Pharm. Biomed. Anal. 16: 1281-1287 101. Forlay-Frick P, Nagy ZB, Fekete J, Kettrup A, Gebefugi I. (2001) Reverse phase HPLC method for the determinaton of vancomycin in influenza vaccine, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 24: 497-507 102. Forlay-Frick P, Fekete J, Héberger K. (2005) Classification and replacement test of HPLC systems using principal component analysis, Anal. Chim. Acta 536: 71-81 103. Del Nozal MJ, Bernal JL, Pampliega A, Marinero P, Lopez MI, Coco R. (1996) High-perfomance liquid chromatographic determination of vancomycin in rabbit serum, vitreous and aqueous humour after intravitreal injection of the drug, J. Chromatogr. A 727: 231-238 104. Laki M, Hajdú M, Ludányi K, Zahár Á, Szendrői M, Klebovich I, Antal I. (2008) Evaluation of a new LC method for analysis of vancomycin released from an orthopaedic drug carrier system, Chromatographia. 68: 141-144 105. Rosenthal AF, Sarfati I, A’Zary E. (1986) Siplified Liquid-Chromatographic Determination of Vancomycin, Clin. Chem. 32: 1016-1019

100

106. Metz P, Kohlhepp SJ, Gilbert DN. (2002) Study of different off-line sample processing procedures and the measurement of antibiotic and antiviral levels in human serum by high-performance liquid-chromatography, J. Chromatogr. B 773: 159-166 107. Kitahashi T, Furuta I. (2001) Determination of vancomycin in human serum by micellar electrokinetic capillary chromatography with direct sample injection, Clin. Chim. Acta, 312: 221-225 108. Baranowska I, Markowski P, Baranowski J. (2006) Simultaneous determination of 11 drugs belonging to four different groups in human urine samples by reversed-phase high-performance liquid chromatography method, Anal. Chim. Acta 570: 46-58 109. Cass RT, Villa JS, Karr DE, Schmidt DE. (2001) Rapid bioanalysis of vancomycin in seru and urine by high-performance liquid chromatography tandem mass spectropetry using on-line sample extraction and parallel analytical columns, Rapid Commun. Mass Spectrom. 15: 406-412 110. Megoulas NC, Koupparis MA. (2004) Development and validation of a novel LC/ELSD method for the quantitation of gentamicin sulfate components in pharmaceuticals, J. Pharm. Biomed. Anal. 36: 73-79 111. Clarot I, Chaimbault P, Hasdenteufel F, Netter P, Nicolas A. (2004) Determination of gentamicin sulfate and related compounds by high-perforance liquid chromatography with evaporative light scattering detection, J. Chromatogr. A 1031: 281-287 112. Yusuf A, Al-Rawithi S, Raines D, Frayha H, Toonsi A, Al-Mohsen I, El-Yazigi A. (1999) Simplified High-Performance Liquid Chromatographic Method for the Determination of Gentamicin Sulfate in a Microsample of Plasma: Comparison with Fluorescence Polarization Immunoassay, Ther. Drug Monit. 21: 647-652 113. Manyanga V, Kreft K, Divjak B, Hoogmartens J, Adams E. (2008) Improved liquid chromatographic method with pulsed electrochemical detectin for the analysis of gentamicin, J. Chromatogr. A 1189: 347-354 114. Manyanga V, Grishina O, Yun Z, Hoogmartens J, Adams E. (2007) Comparison of liquid chromatographic methods with direct detection for the analysis of gentamicin, J. Pharm. Biomed. Anal. 45: 257-262 115. Arcelloni C, Comuzzi B, Vaiani R, Paroni R. (2001). Quantification of gentamicin in Mueller-Hinton agar by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B. 753: 151-156 116. Laki M, Ludányi K, Hajdú M, Zahár Á, Szendrői M, Klebovich I, Antal I. (2010) Determination of Gentamicin Released from Orthopedic Carrier System by a novel HPLC Method, J. Chromatogr. Sci., közlésre elfogadva

101

117. Doadrio AL, Sousa EMB, Doadrio JC, Perez Pariente J, Ízquierdo-Barba I, ValletReg M. (2004) Mesoporous SBA-15 HPLC evaluation for controlled gentamicin drug delivery, J. Control. Release 97: 125-132 118. Lesniak W, McLaren J, Harris WR,. Pecoraro VL, Schacht J. (2003) An isocratic separation of underivatized gentamicin components, 1H NMR assignement and protonation pattern, Carbohydr. Res. 338: 2853-2862 119. Andrews JM, Wise R. (1984) A comparison of the homogeneous enzyme immunoassay and polarization fluoroimmunoassay of gentamicin, J. Antimicrob. Chemother. 14: 509-520 120. Curiel H, Vanderaerden W, Velez H, Hoogmartens J, Van Schepdael A. (2007) Analysis of underivatized gentamicin by capillary electrophoresis with UV detection, J. Pharm. Biomed. Anal. 44: 49-56 (2007) 121. Yuan L, Wei H, Li SF. (2005) Direct determination of gentamicin components by capillary electrophoresis with potential gradient detection, Electrophoresis 26:196-201 122. Kaale E, Leonard S, Van Schapdael A, Roets E, Hoogmartens J. (2000) Capillary Electrophoreis analysis of gentamicn sulphate after pre-capillary derivatization with 1,2phtalic dicarboxaldehyde and mercaptoacetic acid, J. Chromatogr. A. 895: 67-79 123. Deubner R, Holzgrabe U. (2004) Micellarelectrokinetic capillary chromatography, high performance liquid chromatographyand nuclear magnetic resonance-three orthogonal methods for characterization of critcal drugs, J. Pharm. Biomed. Anal. 35: 459-467 124. Kühn KD, Weber C, Kreis S, Holzgrabe U. (2008) Evaluaton of the stability of gentamicin in different antibiotic carriers using a validated MEKC method, J. Pharm. Biomed. Anal. 48: 612-618 125. Preu M, Guyot D, Petz M. (1998) Development of a gas chromatography-mass spectrometry method for the analysis of aminoglycoside antibiotics using experimental design for the optimisation of the derivatisation reactions, J. Chromatogr. A. 818: 95108 126. Pellegrino RM, Segoloni F, Cagini C. (2008) Simultaneous determination of Ciprofloxacin and the active metabolite of Prulifloxacin in aqueous human humor by high-performance liquid chromatography, J. Pharm. Biomed. Anal. 47: 567-574 127. Christodoulou EA, Samanidou VF, Papadoyannis IN. (2007) Validation of an HPLC-UV method according to the European Union Decision 2002/657/EC for the simultaneous determination of 10 quinolones in chicken muscle and egg yolk, J. Chromatogr. B. 859: 246-255 128. Schneider MJ, Braden SE, Reyes-Herrera I, Donoghue DJ. (2007) Simultaneous determination of fluoroquinolones and tetracyclines in chicken muscle using HPLC with fluorescence detection, J. Chromatogr. B 846: 8-13

102

129. Tuerk J, Reinders M, Dreyer D, Kiffmeyer TK, Schmidt KG, Kuss HM. (2006) Analysis of antibiotics in urine and wipe samples from environmental and biological monitoring—Comparison of HPLC with UV-, single MS- and tandem MS-detection, J. Chromatogr. B. 831: 72-80 130. Espinosa-Mansilla A, Muñoz de la Peña A, Gómez DG, Salinas F. (2005) HPLC determination of enoxacin, ciprofloxacin, norfloxacin and ofloxacin with photoinduced fluorimetric (PIF) detection and multiemission scanning: Application to urine and serum, J. Chromatogr. B. 822: 185-193 131. Imre S, Dogaru MT, Vari CE, Muntean T, Kelemen L. (2003) Validation of an HOLC method for the determination of ciprofloxacin in human plasma, J. Pharm. Biomed. Anal. 33: 125-130 132. Bannefeld KH, Stass H, Blaschke G. (1997) Capillary electrophoresis with laserinduced fluorescence detection, an adequate for the alternative to high-performance liquid chromatography, determination of ciprofloxacin and its metabolite desethyleneciprofloxacin in human plasma, J. Chromatogr. B. 692: 453-459 133. Vargas Mamani MC, Amaya-Farfan J, Reyes FG, Fracassi da Silva JA, Rath S. (2008) Use of experimental design and effective mobility calculations to develop a method for the determination of antimicrobials by capillary electrophoresis, Talanta 76: 1006-1014 134. Tang Q, Yang T, Tan X, Luo J. (2009) Simultaneous determination of fluoroquinolone antibiotic residues in milk sample by solid-phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry., J. Agric. Food Chem. 57: 4535-4539 135. Toussant B, Bordin G, Janosi A, Rodriguez AR. (2002) Validation of a liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantification of 11 (fluoro)quinolone antibiotics in swine kidney, J. Chromatogr. A. 976: 195-206 136. Garcés A, Zerzaňová A, Kučera R, Barrón D, Barbosa J. (2006) Determination of a series of quinolones in pig plasma using solid-phase extraction and liquid chromatography coupled with mass spectrometric detection: Application to pharmacokinetic studies, J. Chromatogr. A. 1137: 22-29 137. Lolo M, Pedreira S, Fente C, Vásquez BI, Franco CM, Cepeda A. (2003) Use of the diphasic dialysis as a new extraction procedure in the determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in egg, Anal. Chim. Acta 480: 123-130 138. ICH Harmonised Tripartite Guideline- Validation of Analytical Procedures: Test and Methodology Q2 (R1) International Conference on Harmonization of Technical Requirement for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005) 139. Nováková L, Matysová L, Havliková L, Solich P. (2005) Development and validation of HPLC method for determination of indomethacin and its two degradation products in topical gel, J. Pharm. Biomed. Anal. 37: 899-905

103

140. Mendez ASL, Steppe M, Schapoval EES. (2003) Validation of HPLC and UV spectrophotometric methods for the detrmination of meropenem in pharmaceutical dosage form, J. .Pharm. Biomed. Anal. 33: 947-954 141. Al-Dgither S, Alvi SN, Hammami MM. (2006) Development and validation of an HPLC method for the determination of gatifloxacin stability in human plasma, J. Pharm. Biomed. Anal. 41: 251-255 142. Csóka G, Marton S, Budai M, Antal I, Klebovich I. A gyógyszertechnológia fizikai ellenörző vizsgálatai, Semmelweis Kiadó, Budapest (2008) 128-133 143. Pápai K, Budai M, Ludányi K, Antal I, Klebovich I. (2010) Analysis of ciprofloxacin in low- and high-fat milk by high-performance liquid chromatographymass spectrometry, Acta Chromatogr. 22: 115-129 144. United States Pharmacopoeia (2008) USP32-NF27:3181 145. Baldelli S, Murgia S, Merlini S, Zenoni S, Perico N, Remuzzi G, Cattaneo D. (2005) High-performance liquid chromatography with ultraviolet detection for therapeutic drug monitoring of everolimus, J. Chromatogr. B. 816: 99-105 146. Widomski P, Baran P, Golebiewski P, Surowiec I, Bielejewska A. (2008) Validated liquid chromatographic method for analysis of the isomers of latanoprost. Acta Chromatogr. 20: 157-164 147. Pharmacopoea Hungarica Editio VIII., 1. kötet, Medicina Könyvkiadó Rt. (2003) 148. Sara Baldelli, Stefano Murgia, Simona Merlini, Stefania Zenoni, Norberto Perico, Guiseppe Remuzzi, Dario Cattaneo (2005) High-performance liquid chromatography with ultraviolet detection for therapeutic drug monitoring of everolimus, J. Chromatogr. B. 816: 99-105 149. Zahár Á, Kocsis G, Lengyel B, Puskás G, Laki M, Hajdú M, Antal I. (2009) Hosszú hatóanyagleadású antibiotikus csontgraftok alkalmazása állatkísérletes osteomyelitis modellben, Magyar Traumatológia ·Ortopédia ·Kézsebészet ·Plasztikai Sebészet, 52. 2. 171-178

104

11. Saját publikációk jegyzéke

10.1. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények 1. M. Laki, M. Hajdú, K. Ludányi, Á. Zahár, M. Szendrői, I. Klebovich, I. Antal: Evaluation of a New LC method for the determination of Vancomycin Released from an Orthopedic Drug Carrier System Chromatographia, Supplement 68: S141-144 (2008)

2. M. Laki, K. Ludányi, M. Hajdú, Á. Zahár, M. Szendrői, I. Klebovich, I. Antal: Determination of Gentamicin Released from Orthopedic Carrier System by HPLC-UV Method Journal of Chromatographic Sciences (2010)(közlésre elfogadva)

3. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Sáska Zsófia, Klebovich Imre, Szendrői Miklós,

Antal

István:

Csontműtéteknél

alkalmazott

antibiotikum

tartalmú

hordozórendszerek tervezése Acta Pharmaceutica Hungarica 77: 108-115 (2007)

4. Zahár Ákos, Kocsis György, Lengyel Béla, Puskás Gábor, Laki Mónika, Hajdú Mária, Antal István: Hosszú hatóanyagleadású antibiotikus csontgraftok alkalmazása állatkísérletes osteomyeltis modellben Magyar Traumatológia·Ortopédia·Kézsebészet·Plasztikai Sebészet 52: 171-178 (2009)

105

10.2. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó, teljes terjedelmében megjelent összefoglalók 1. M. Laki, M. Hajdú, Á. Zahár, M. Szendrői, I. Klebovich, I. Antal: Studies on Drug Carrier Systems with Long-term Local Antibiotic Release, 6th World Meeting on Pharmaceutics,

Biopharmaceutics

and

Pharmaceutical

Technology,

Barcelona,

Spanyolország, 2008. április 7-10., P-228

2. Mónika Laki, Mária Hajdú, Ákos Zahár, Miklós Szendrői, Imre Klebovich, István Antal: Development of an antibiotic containing drug delivery system for surgical application, Pharmaceutical Journal of Slovenia, 59: 270-271 (2008)

10.3. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó előadások 1. Zahár Á., Laki M., Hajdú M., Klebovich I., Antal I., Szendrői M.: Revíziós műtétek során csonthiányok pótlására alkalmazható antibiotikum tartalmú biológiai hordozók hatóanyag-felszabadulásának vizsgálata, Magyar Ortopéd Társaság 49. Kongresszusa, Budapest, 2006. június 8-10., A0102

2. Laki Mónika: Egyenletes hatóanyagleadást biztosító vankomicin tartalmú gyógyszer-hordozórendszerek tervezése és mikrobiológiai vizsgálata, VIII. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 2007. április 12-13., 35.o.

3. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Klebovich Imre, Antal István: Programozott hatóanyagleadású antibiotikum tartalmú biológiai hordozórendszerek tervezése és vizsgálata, Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok, Budapest, 2007. április 12-13., E-VII/2.

4. Zahár Ákos, Szász Máté, Kristóf Katalin, Laki Mónika, Hajdú Mária, Antal István, Szendrői Miklós: Antibiotikummal impregnált csontgraftok biológiai értékmérése,

Magyar Ortopéd Társaság és Magyar Traumatológus Társaság 2007. évi közös Kongresszusa, Nyíregyháza, 2007. június 20-23., A0022

5. Zahár Ákos, Laki Mónika, Hajdú Mária, Antal István, Szendrői Miklós: Antibiotikus csontgraftok létrehozása, Magyar Ortopéd Társaság 50. Kongresszusa, Székesfehérvár, 2008. június 19-21., A0016

6. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Szendrői Miklós, Klebovich Imre, Antal István: Nyújtott hatóanyagleadású antibiotikum tartalmú hordozórendszerek vizsgálata, Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok, Budapest, 2009. március 30-31., EVI/4.

7. Laki Mónika: Nyújtott hatóanyagleadású antibiotikum tartalmú hordozórendszerek vizsgálata, IX. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 2009. április 23-24., 27.o., III. díj

8. Laki Mónika: Nyújtott hatóanyagleadású antibiotikum tartalmú hordozórendszerek vizsgálata, MTA Gyógyszerésztudományi Osztályközi Komplex Bizottság Ülése, Budapest, 2009. április 29.

10.4. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó poszterek 1. M. Hajdú, E. Farkas, M. Laki, Á. Zahár, M. Szendrői, I. Klebovich , I. Antal: Preparation and characterization of controlled release gel systems containing antibiotics 1st BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, 2005. szeptember 26-28., P16

2. M. Hajdú, E. Farkas, M. Laki, Á. Zahár, M. Szendrői, I. Klebovich, I. Antal: Preparation and characterization of controlled release gel systems containing antibiotics, Pharmacy: Smart molecules for therapy. Semi-centennial conference of Semmelweis University, Faculty of Pharmacy. Budapest, 2005. október 12-14., P-40

107

3. Laki Mónika, Zahár Ákos, Hajdú Mária, Klebovich Imre, Antal István: Csonthiányok pótlására alkalmazható antibiotikum tartalmú hordozók hatóanyagfelszabadulásának vizsgálata, Semmelweis Egyetem, PhD napok, Budapest 2006. április 14-15., P-I/13

4. Laki M., Hajdú M., Zahár Á., Klebovich I., Antal I.: Gyógyszertechnológiai kutatások antibiotikummal impregnált csont előállítására és vizsgálatára, XIII. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus, Budapest, 2006. május 25-27., P-59, Poszter I. díj

5. Hajdú Mária, Laki Mónika, Zahár Ákos, Szendrői Miklós, Klebovich Imre, Antal István:

Gyógyszertechnológiai

lehetőségek

antibiotikum

tartalmú

biológiai

hordozórendszerek előállítására, Gyógyszer az ezredfordulón VI., Sopron, 2006. november 9-11., P-2

6. Zahár Á., Laki M., Hajdú M., Klebovich I., Antal I., Szendrői: M.: Drug release of vancomycin impregnated bone grafts in revision surgery, 8th EFORT Congress, Firenze, Olaszország, 2007. május 12-14.,

7. Laki, M., Hajdú, M., Ludányi, K., Zahár, Á., Szendrői, M., Klebovich, I., Antal, I.: Application of Liquid Chromatography Method for the Determination of Antibiotics Released from Matrix Type Drug Delivery Systems, 7th Balaton Symposium, Siófok, 2007. szeptember 5-7., P-76

8. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Szendrői Miklós, Klebovich Imre, Antal István:

Antibiotikumot

tartalmazó

gyógyszerhordozó

rendszerek

előállítása,

Gyógyszerkutatási szimpózium, ”A molekulától a készítményig”, Szeged, 2007. november 9-10., P-18

9. M. Laki, M. Hajdú, Á. Zahár, M. Szendrői, I. Klebovich, I. Antal: Studies on Drug Carrier Systems wih Long-term Local Antibiotic Release, 6th World Meeting on

108

Pharmaceutics,

Biopharmaceutics

and

Pharmaceutical

Technology,

Barcelona,

Spanyolország, 2008. április 7-10., P-228

10. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Szendrői Miklós, Klebovich Imre, Antal István: Csonthiányok pótlására alkalmazott antibiotikum tartalmú hordozók vizsgálata, Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Továbbképző Szimpózium, Galyatető, 2008. április 2-4., P-13, Poszter I. díj

11. Mónika Laki, Mária Hajdú, Ákos Zahár, Miklós Szendrői, Imre Klebovich, István Antal: Development of an antibiotic containing drug delivery system for surgical application, 7th Central European symposium on Pharmaceutical Technology and Biodelivery Systems, Ljubjana, Szlovénia, 2008. szeptember 18-20., PO127

12. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Szendrői Miklós, Klebovich Imre, Antal István: Nyújtott hatóanyagleadású hordozórendszerek fejlesztése, Gyógyszer az ezredfordulón VI., Sopron, 2008. szeptember 25-27., P-15

13. Hajdú Mária, Budai Marianna, Laki Mónika, Klebovich Imre, Antal István: Antibiotikum tartalmú szemészeti hordozórendszerek stabilitási problémái, Gyógyszer az ezredfordulón VI., Sopron, 2008. szeptember 25-27., P-8

14. Laki Mónika, Hajdú Mária, Ludányi Krisztina, Zahár Ákos, Klebovich Imre, Antal István: Antibiotikum tartalmú hordozórendszerek hatóanyaleadásának analitikai vizsgálata, Elválasztástudományi Vándorgyűlés, Sárvár, 2008. november 5-7., P-30

15. Laki, M., Hajdú, M., Pápai, K., Zahár, Á., Szendrői, M., Klebovich, I., Antal, I.: Determination of Ciprofloxacin, Gentamicin and Vancomycin in Drug Carrier Systems, 8th Balaton Symposium, Siófok, 2009. szeptember 2-4., P-93

16. Laki Mónika, Hajdú Mária, Zahár Ákos, Szendrői Miklós, Klebovich Imre, Antal István:

Csontműtéteknél

alkalmazható

109

antibiotikum-tartalmú

hatóanyagleadó

rendszerek vizsgálata, Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIV. Budapest, 2009. november 13-15., P-59, Nívódíj

10.5. Egyéb közlemények 1. M. Laki, M. Hajdú, I. Antal, I. Klebovich: Modern pharmaceutical facilities in the formulation of rectal dosage forms European Journal of Pharmaceutical Sciences, 25 Suppl. 1: 144-146 (2005)

2. Sáska Zsófia, Hajdú Mária, Laki Mónika, Klebovich Imre, Antal István: Szemészeti hatóanyag-felszabadító rendszerek fejlesztésének lehetőségei Acta Pharmaceutica Hungarica 78: 156-164 (2008)

3. M. Hajdú, M. Budai, M. Laki, H. Pap, I. Klebovich, I. Antal: Preparation and characterization of ocular drug delivery systems containing antibiotics 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Barcelona, Spain, 2008. április 7-10., P-203

110

12. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Antal Istvánnak, hogy doktori munkámat mindvégig figyelemmel kísérte, útmutatásával és tanácsaival segítette, így lehetővé vált értekezésem elkészítése. Hálás köszönettel tartozom Dr. Hajdú Máriának, aki tudományos diákkörösként felkeltette érdeklődésemet a gyógyszertechnológia és a kutatás iránt, és doktorandusz éveim során mindvégig mellettem állt, tanácsaival segítette munkámat. Köszönöm

Prof.

Dr.

Klebovich

Imrének,

a

Semmelweis

Egyetem

Gyógyszerészeti Intézetének igazgatójának, hogy lehetőséget adott arra, hogy doktori munkámat intézetében folytassam. Hálás köszönet illeti Dr. Ludányi Krisztinát, akinek az analitikai módszerek mélyebb megismerését és megszeretését köszönhetem. Köszönöm neki publikációim elkészítése és validálási munkám során nyújtott mérhetetlen segítséget. Köszönettel tartozom Dr. Zahár Ákosnak, az ortopédiai kérdésekben nyújtott szakmai segítségéért. Köszönöm Dr. Kocsis Györgynek az állatkísérletek, Dr. Szász Máté Sándornak a mikrobiológiai vizsgálatok során nyújtott segítséget. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Pápai Katalinnak, Dr. Budai Mariannának, Dr. Dávid Ádám Zoltánnak, valamint Horváthné Gyenge Ildikónak, akik méréseim során nyújtottak nagy segítséget. Köszönetet

mondok

a

Semmelweis

Egyetem

Gyógyszerészeti

Intézet

valamennyi, munkámat segítő munkatársának. Köszönöm vőlegényemnek, családomnak és barátaimnak a rengeteg segítséget és támogatást, amit egyetemi és doktori éveim alatt nyújtottak, és amely nélkül értekezésem nem születhetett volna meg. Köszönöm Szüleimnek, hogy lehetővé tették számomra, hogy olyan hivatást válasszak magamnak, amelyhez kedvet éreztem. Köszönöm nekik, hogy munkám során mindvégig támogatást nyújtottak.

111

13. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények különlenyomatai

112