Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013
Controle van nitrietoxidatie met stikstofmonoxide in OLAND-toepassingen
Robin Jordaens Promotoren:
Prof. dr. ir. Nico Boon Prof. dr. ir. Siegfried Vlaeminck
Tutoren:
Dr. ir. Haydée Declippeleir Ir. Emilie Courtens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Milieutechnologie
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013
Controle van nitrietoxidatie met stikstofmonoxide in OLAND-toepassingen
Robin Jordaens Promotoren:
Prof. dr. ir. Nico Boon Prof. dr. ir. Siegfried Vlaeminck
Tutoren:
Dr. ir. Haydée Declippeleir Ir. Emilie Courtens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Milieutechnologie
De auteur en promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze scriptie.
The author and the promoters give permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.
Gent, 7 juni 2013
De auteur,
Robin Jordaens
De promotoren,
Prof. dr. ir. N. Boon
Prof. dr. ir. S. Vlaeminck
Woord vooraf Beste lezer, Dit werk is de kers op de spreekwoordelijke taart van vijf jaar studeren in zowel Antwerpen als Gent. De afgelegde weg om tot dit punt te komen kende hoogtes en laagtes en zou onmogelijk geweest zijn zonder de steun en hulp van anderen. Daarom wil ik hier graag alle mensen bedanken die ervoor gezorgd hebben dat ik eerst en vooral tot hier ben kunnen geraken en ook zij die me gedurende deze masterproef steeds gesteund en geholpen hebben. In de eerste plaats bedank ik dan ook mijn ouders om me de kans te geven de afgelopen vijf jaar te verwezenlijken. Zonder die kans zou er namelijk van een masterproef nooit sprake geweest zijn. Ze hebben me ook steeds gesteund en deden koste wat kost altijd de moeite om te begrijpen waarmee ik dagelijks op de universiteit bezig was. Deze onnavolgbare interesse stimuleerde me dan ook enorm, zowel tijdens de studies als tijdens mijn masterproef. Het feit dat familie en vrienden soms op de hoogte waren van de vooruitgang binnen mijn studies en thesis nog voor ik hen het zelf had verteld, bestempelde dan ook de enorme fierheid die ze over mij hadden en aan iedereen duidelijk maakten. Specifiek voor deze masterproef wil ik Prof. Nico Boon bedanken, en LabMET in het algemeen, om een fantastische werkomgeving ter beschikking te stellen waar iedereen altijd alles kan vragen. Als beginnende student in augustus overtrof dit alle verwachtingen omdat je toch een stap in het onbekende doet. Dit was echter nooit het geval op deze vakgroep omdat je je vanaf dag één letterlijk deel voelde uitmaken van de ‘LabMET’ familie. Het tot stand brengen van dit werk zou absoluut niet gelukt zijn zonder het enthousiasme van mijn twee tutoren Haydée en Emilie. Met een waanzinnige kennis binnen het onderzoeksdomein kon ik ten allen tijde bij hen terecht voor eender welke vraag. Wanneer er echter toch een kleine twijfel of vraag rees waar Haydée of Emilie het antwoord niet op wisten, was er nog Siegfried. Met zijn onuitputtelijke kennis over alles wat met stikstof te maken heeft, kon je niets bedenken waar hij je niet mee kon helpen. Zelfs toen Haydée vertrok naar Washington DC, kon 6000 km oceaan er niet voor zorgen dat ik het moest stellen met een tutor minder. Haydée stond gewoon wat vroeger op om om 06:00 uur lokale tijd mijn meest prangende vragen te beantwoorden en de toekomstplannen te overleggen. Emilie zorgde er dan weer voor elke dag klaar te staan met een lach, een leuke babbel en zulk enthousiasme voor elk resultaat, groot of klein, waardoor de stimulans en concentratie ten allen I
tijde hoog bleven om nog beter te presteren. Als ik verhalen hoor van mede-studenten is zulke relatie met je tutoren toch niet steeds vanzelfsprekend en wil ik ze dus echt wel bedanken voor de professionele, maar ook leuke en ontspannen samenwerking dit afgelopen jaar. Ook wil ik alle andere mensen op LabMET bedanken om me met alles in en rond het labo te helpen waaronder in het bijzonder Greet om steeds de IC draaiende te houden zelfs wanneer de IC zelf er anders over wou beslissen. Finally I have to thank Joeri, Marta, Gio en Sandra to accept me as youngster in their group, because such a relationship outside the university to relax, talk, drink or sport, really created the nicest work environment I could imagine. Especially Joeri and Marta who also helped a lot in the lab even when they really didn’t had to help me. Joeri even stayed one day until the concierge unintentionally locked us up in the microscopy room because it was after 20:00 h, while he actually had other plans. Tenslotte bedank ik ook nog de bedrijven Aquafin, DANIS en Avecom die me de nodige biomassa verschaften om dit onderzoek te kunnen uitvoeren en alle andere mensen die ik misschien niet uitdrukkelijk heb vermeld hierboven.
II
Samenvatting OLAND of ‘oxygen-limited autotrophic nitrification/denitrification’ is een proces voor het verwijderen van ammonium uit stikstofrijk afvalwater dat tot stand komt door de samenwerking van aërobe ammoniumoxideerders (AerAOB) en anammoxbacteriën (AnAOB). Door deze perfecte coöperatie van deze twee soorten micro-organismen biedt het OLAND-proces heel wat economische en ecologische voordelen ten opzichte van conventionele actief slib systemen. Hierdoor is het aantal toepassingen van het proces voor het behandelen van afvalwater wereldwijd aan het toenemen. Het ideale scenario is echter om op termijn OLAND rechtstreeks te kunnen toepassen op de hoofdstroom van een afvalwaterzuiveringsinstallatie, daar waar OLAND momenteel vooral zijstroomtoepassingen kent. Door de hoofdstroomtoepassing kunnen de economische voordelen van het OLAND-proces namelijk nog meer benadrukt worden. Dit is echter niet zo vanzelfsprekend omdat de parameters en randvoorwaarden in een hoofdstroomtoepassing niet optimaal zijn voor het proces, terwijl al deze externe parameters in een zijstroom wel gecontroleerd kunnen worden. Eén van de grote problemen waarmee OLAND te maken kan krijgen is dat de nitriet oxiderende bacteriën (NOB) niet voldoende onderdrukt worden. Deze micro-organismen komen namelijk naast de eerder vernoemde AerAOB en AnAOB ook in de microbiële samenleving voor. Deze zullen echter in competitie treden met AerAOB voor zuurstof en met AnAOB voor nitriet, welke beide bacteriegroepen als substraat gebruiken. NOB zullen echter nitriet omvormen tot nitraat en dit nitraat wordt verder niet meer omgezet in het OLAND-proces. Door al deze factoren wordt het dus duidelijk dat NOB de efficiëntie van het gehele proces sterk zullen doen dalen. De inhibitie mogelijkheden voor NOB zijn echter allen van die aard dat ze niet eenvoudigweg in hoofdstroom kunnen toegepast worden zoals deze in de zijstroom wel gecontroleerd kunnen worden. Deze inhibitiemethoden vereisen namelijk een hoge temperatuur en hoge stikstofgehaltes. Een mogelijkheid ligt echter in het inhiberen van NOB door middel van stikstofmonoxide (NO). Er zijn namelijk reeds studies die uitwijzen dat Nitrobacter (bepaalde specie NOB) geïnhibeerd worden door NO. In deze thesis werd het effect van NO op de activiteit van nitrificerende types biomassa gekwantificeerd. Elke gebruikte biomassa had een verschillende verhouding Nitrobacter ten opzichte van Nitrospira welke varieerde van 0,01 tot 69 (logaritmisch verschil tussen Nitrobacter en Nitrospira gebaseerd op 16S qPCR resultaten). In batchtesten met bellenbeluchting, gebruik makend van een NO dosering van 1,43 g NO L-1 d-1 (100 ppmv NO), werd de biomassa met het meest aantal III
Nitrobacter voor 24% geïnhibeerd. Bij de andere soorten biomassa werd er een sterke correlatie vastgesteld tussen de affiniteitsconstante van nitriet en het percentage inhibitie. De resultaten varieerden namelijk van 0% tot 60-80% inhibitie met KS waarden van respectievelijk 0,72 tot 0,06 mg N-NO2- L-1. Deze studie bewees bijgevolg dat nitrificerende gemeenschappen sterk geïnhibeerd kunnen worden door NO. Deze resultaten werden bevestigd door een ander experiment waarbij een membraangebaseerde beluchting werd toegepast om het contact tussen NO en de biomassa te vergroten. Bij deze test werd er zelfs een inhibitie van 67% waargenomen bij de biomassa die eerder 0% inhibitie vertoonde. Dit wees op de aanwezigheid van een bepaalde drempelwaarde die overschreden moet worden alvorens inhibitie kan plaatsvinden, gegeven dat de andere types biomassa wel een inhibitie ondervonden in dezelfde grootte-orde als met de bellenbeluchting Door de duidelijke inhibitiepercentages van NOB door NO die in dit werk bekomen werden en het gegeven dat verscheidene aanwezige micro-organismen in het OLAND-proces NO zullen produceren bij stresscondities werd tenslotte ook beoordeeld of de reeds lange tijd gekende inhibitiemethoden voor NOB al dan niet rechtstreeks konden verklaard worden door terugkoppeling naar inhibitie door NO. Zo konden er sterke hypotheses gevormd worden rond de link tussen NOB uitwassing bij lage zuurstofconcentraties en NOB inhibitie door NO geproduceerd door AerAOB bij lage zuurstofgehaltes.
IV
Abstract OLAND stands for ‘oxygen-limited autotrophic nitrification/denitrification’
and is a process to
remove ammonium from high-strength nitrogen wastewaters by using a combination of aerobic ammonium oxidizers (AerAOB) and anammox bacteria (AnAOB). The perfect cooperation of these two species of micro-organisms, the OLAND-process has great economic and ecological benefits over conventional active sludge systems. Due to this facts the number of applications for the treatment of aqueous streams is significantly increasing. A mainstream application of the OLAND-process in wastewater treatment plants would be the ideal scenario. Nowadays OLAND is mostly used in sidestream treatments because here, all the external parameters can be controlled for an optimal process with highest efficiency possible. Nevertheless OLAND mainstream application would magnify the economic benefits even more, the influent conditions are not optimal. One of the most stringent problems that affect the efficiency of the OLAND-process is the presence of nitrite oxidising bacteria (NOB) in the microbial community. These NOB will compete with the AerAOB for oxygen and with the AnAOB for the substrate nitrite. NOB will consume nitrite and form nitrate which will not be converted any further. These facts lead to a convenient efficiency loss of the OLAND-process when NOB are present in the system. NOB can be inhibited by several methods, but these methods include high temperature, high nitrogen concentrations and low oxygen levels. But all these conditions are suboptimal in the mainstream of a waste water treatment and cannot be controlled in such a way that they can inhibit NOB. One possibility however is to suppress the activity of NOB by using nitric oxide (NO). Recent studies suggested that Nitrobacter species indeed are reversibly inhibited by NO. But on the other hand Nitrospira is proven to be the most common NOB specie in waste water treatment applications. This masterthesis quantified the effect of NO on the activity of nitrifying sludge types with different Nitrospira/Nitrobacter ratios (ratio of 0.01-69, based on 16S qPCR). In an oxic bubbling column, a dosage of 1.43 g NO L-1 d-1 (100 ppmv NO) inhibited the Nitrobacter dominated sludge with 24%. For the other types of sludge, the inhibition was strongly correlated with the affinity constant for nitrite (Ks) ranging from 0% to 30-50% and 60-80% inhibition of the nitrite oxidation for Ks of 0.72, 0.36 and 0.06 mg NO2--N L-1, respectively. This study showed that nitrifying communities with high affinity for nitrite can be strongly inhibited by NO. The degree of inhibition could be confirmed in a set-up with NO dosage through an artificial alginate-based biofilm, ensuring a more direct contact between NO and the microorganisms. In this experiment an inhibition percentage of 67% was obtained for the V
biomass which had 0% of inhibition in the other test. This gave the impression of the presence of a certain threshold concentration of NO which the bacteria must feel before they get inhibited. Given the distinct inhibition percentages of NOB using NO in this study and also knowing that other micro-organisms present in the biomass will produce NO under stress conditions, it was also investigated whether NO is the actual inhibitor and not the other external parameters which were thought to be the inhibitory factor.
VI
Inhoudsopgave Woord vooraf ........................................................................................................................................... I Samenvatting.......................................................................................................................................... III Abstract ................................................................................................................................................... V Inhoudsopgave ...................................................................................................................................... VII Lijst met gebruikte afkortingen .............................................................................................................. XI Lijst met Figuren ................................................................................................................................... XIII Lijst met Tabellen ................................................................................................................................. XVI
Deel 1: Literatuurstudie ................................................................................................................ 1 1. Stikstofproblematiek ....................................................................................................................... 1 2. Conventionele stikstofverwijdering uit afvalwater ......................................................................... 3 3. Het OLAND-proces........................................................................................................................... 4 3.1. OLAND hoofdstroom- vs. zijstroomtoepassing ........................................................................ 4 3.1.1. OLAND zijstroom ............................................................................................................... 5 3.1.2. OLAND hoofdstroom ......................................................................................................... 5 3.2. De microbiële gemeenschap .................................................................................................... 6 3.2.1. Aerobe ammoniumoxiderende bacteriën (AerAOB) ......................................................... 6 3.2.2. Anoxische ammoniumoxiderende bacteriën (AnAOB) ..................................................... 7 3.2.3. De theoretisch ideale samenwerking van AerAOB en AnAOB .......................................... 8 3.2.4. De spelbrekers in de praktijk ............................................................................................. 9 3.2.4.1. Nitrietoxiderende bacteriën (NOB) .......................................................................... 10 3.2.4.2. Denitrificerende bacteriën (DNB)............................................................................. 11 3.2.5. Samenvatting kinetische parameters protagonisten ...................................................... 12 3.2.6. De voordelen van het OLAND-proces ............................................................................. 13 4. NOB inhibitie ................................................................................................................................. 13 VII
4.1. Gekende methoden ................................................................................................................ 13 4.1.1. Opgeloste zuurstofconcentratie...................................................................................... 13 4.1.2. Slibretentie tijd in combinatie met temperatuursregeling ............................................. 14 4.1.3. Vrij ammoniak en vrij salpeterigzuur .............................................................................. 14 4.1.4. Zoutgehalte ..................................................................................................................... 15 4.2. NOB inhibitie door NO............................................................................................................ 15 4.2.1. Karakteristieken NO ........................................................................................................ 15 4.2.2. NO als tussenproduct in microbiële omzettingsreacties ................................................ 16 4.2.3. NO als inhibitor voor NOB-activiteit ................................................................................ 16 5. Doelstelling .................................................................................................................................... 17
Deel 2: Materiaal en methoden .................................................................................................. 18 1. MABR-reactor ................................................................................................................................ 18 2. NO-batchtesten ............................................................................................................................. 19 2.1. Batchtesten met wasflessen................................................................................................... 19 2.2. Batchtesten met artificiële biofilmmembranen ..................................................................... 21 2.2.1. Bereiding artificiële biofilm ............................................................................................. 21 2.2.2. NO-Batchtesten ............................................................................................................... 22 3. KS-bepalingen ................................................................................................................................ 23 4. qPCR-analyse voor de bepaling van de ratio Nitrobacter/Nitrospira............................................ 24 5. Analyse van de partikelgrootte distributie .................................................................................... 25 6. Fluorescentiemicroscopie na kleuring met DAF-2 DA ................................................................... 25 7. Analytische methoden................................................................................................................... 26 7.1. Ammonium ............................................................................................................................. 26 7.1.1. Teststrip .......................................................................................................................... 26 7.1.2. Colorimetrisch ................................................................................................................. 26 7.2. Nitriet ..................................................................................................................................... 26 6.2.1. Teststrip .......................................................................................................................... 26 VIII
7.2.2. Ionenchromatografisch ................................................................................................... 26 7.2.3. Spectrofotometrisch: Montgomery ................................................................................ 27 7.3. Nitraat .................................................................................................................................... 27 7.4. Zuurtegraad ............................................................................................................................ 27 7.5. Opgeloste zuurstof ................................................................................................................. 27 7.6. Zwevende stof: TSS en VSS ..................................................................................................... 27
Deel 3: Resultaten ...................................................................................................................... 28 1. Batchtesten met wasflessen ......................................................................................................... 28 1.1. Controle van de opstelling voor batchtesten met bellenbeluchting...................................... 28 1.2. NO-visualisatie in de cellen .................................................................................................... 29 1.3. Inhibitietesten ........................................................................................................................ 31 2. Continue nitrificerende MABR ...................................................................................................... 34 3. Batchtesten met artificiële biofilm ................................................................................................ 35 4. Intrinsieke parameters van de types nitrificerende biomassa ...................................................... 38 4.1. Bepaling KS nitriet ................................................................................................................... 38 4.2. Ratio Nitrospira/Nitrobacter .................................................................................................. 40 4.3. Partikelgrootte distributie ...................................................................................................... 42
Deel 4: Discussie......................................................................................................................... 44 1.
NOB inhibitie door NO............................................................................................................... 44 1.1. NOB inhibitie door middel van bellenbeluchting met NO...................................................... 44 1.1.1. Experimentele optimalisatie ........................................................................................... 44 1.1.2. Visualisatie NO opname door middel van fluorescentiemicroscopie ............................. 45 1.1.3. Inhibitie door NO ............................................................................................................. 46 1.2. NOB inhibitie door middel van membraanbeluchting met NO .............................................. 47 1.2.1. MABR evaluatie ............................................................................................................... 47 1.2.2. Artificiële biofilm op alginaatbasis .................................................................................. 47 IX
1.2.3. Inhibitie door NO ............................................................................................................. 48 1.3. Vergelijking NO contactmechanismen ................................................................................... 49 2. Vergelijking intrinsieke parameters met literatuur ....................................................................... 50 2.1. Ks waarden nitrietconsumptie NOB........................................................................................ 50 2.2. Ratio Nitrobacter/Nitrospira in praktijk gebonden biomassa ................................................ 51 2.3. Partikelgrootte distributies van praktijk gebonden biomassa ............................................... 52 3. Correlaties biomassakenmerken met inhibitiepercentage ........................................................... 52 4. NO-inhibitie aan de basis van gekende inhibitiemechanismen .................................................... 55 4.1. Zuurstoflimitatie ..................................................................................................................... 55 4.2. Vrij ammoniak en vrij salpeterigzuur ..................................................................................... 56 5. Toepasbaarheid NO-inhibitie in OLAND hoofdstroom .................................................................. 57 6. Algemene besluiten ....................................................................................................................... 58 7. Toekomstig onderzoek .................................................................................................................. 59
Deel 5: Referenties ..................................................................................................................... 60
X
Lijst met gebruikte afkortingen AD
Anaerobe vergisting (Anaerobic digestion)
AerAOB
Aerobe ammoniumoxiderende bacteriën
AMO
Ammoniak monooxygenase
Anammox
Anoxische ammoniumoxidatie
AnAOB
Anaerobe ammoniumoxiderende bacteriën
AS
Actief slib
BOD
Biologische zuurstofvraag (Biological oxygen demand)
CAS
Conventioneel actief slib systeem
COD
Chemische zuurstofvraag (Chemical oxygen demand)
DAF-2 DA
4,5-diaminofluoresceïne diacetaat
DNB
Denitrificerende bacteriën
DO
Opgelost zuurstof (Dissolved oxygen)
Eel
Elektrische energie
ETC
Elektronen transferketen (Electron transfer chain)
Eth
Thermische energie
FA
Vrij ammoniak (Free ammonia)
FNA
Vrij salpeterigzuur (Free nitrous acid)
HAO
Hydroxylamine oxidoreductase
HRT
Hydraulische retentietijd
Hzo
Hydrazine oxidoreductase
Hzs
Hydrazine synthase
IC
Ionenchromatografie
IE
Inwonersequivalent
KO2
Affiniteitsconstante voor zuurstof
KS
Affiniteitsconstante voor substraat S
MABR
Membraan geaereerde biofilm reactor
NAR
Nitraat reductase
NIR
Nitriet reductase
NOB
Nitrietoxiderende bacteriën
NOR
Nitriet oxidoreductase
NOS
Stikstofmonoxide synthase
Nxr
Nitriet oxidoreductase (meer algemene notatie dan NOR) XI
OLAND
Oxygen-limited autotrophic nitrification/denitrification
OUR
Oxygen uptake rate
qPCR
Kwantitatieve polymerase ketting-reactie (quantitative polymerase chain reaction)
RBC
Rotating biological contactor
RWZI
Rioolwaterzuiveringsinstallatie
[S]
Substraatconcentratie
SALLS
Small Angle Laser Light Scattering
SBR
Sequentiële batchreactor
SRT
Slibretentie tijd
TSS
Zwevend stofgehalte (total suspended solids)
Vmax
Maximale reactiesnelheid
VSS
Vluchtig onopgelost stofgehalte (volatile suspended solids)
WKK
Warmtekrachtkoppeling
XII
Lijst met Figuren Figuur 1.1: Microbiële anorganische stikstofcyclus (Richardson and Watmough, 1999) ....................... 1 Figuur 1.2: Processchema van een CAS-systeem met een pre-denitrificatie actief slibsysteem voor de behandeling van huishoudelijk afvalwater met slibbehandeling in de vorm van anaerobe vergisting. ................................................................................................................... 3 Figuur 1.3: Processchema van een CAS-systeem voor zuivering van huishoudelijk afvalwater met implementatie van OLAND in de zijstroom. Door daarenboven gebruik te maken van een verbeterde hoogbelaste primaire actief slib (AS) stap leidt dit systeem tot een daling van de totale energieconsumptie met 50% ten opzichte van een conventioneel systeem (De Clippeleir, 2012). ........................................................................................................................ 5 Figuur 1.4: Processchema van een CAS-systeem voor zuivering van huishoudelijk afvalwater met implementatie van OLAND in de hoofdstroom. Door daarenboven gebruik te maken van een verbeterde hoogbelaste primaire actief slib (AS) stap leidt dit systeem tot een daling van de totale energieconsumptie met 119% ten opzichte van een conventioneel systeem (De Clippeleir, 2012) ................................................................................................................... 6 Figuur 1.5: Theoretische gebalanceerde omzetting ammonium naar stikstofgas in een biofilm of granule gebruikmakend van het OLAND proces (De Clippeleir, 2012). ..................................... 9 Figuur 1.6: Ongebalanceerde, volledige stoichiometrie van het OLAND proces in aanwezigheid van alle drie de protagonisten (De Clippeleir, 2012) ........................................................................ 9 Figuur 1.7: Model van ETCs (Electron Transfer Chains) in verschillende NOB. A) Bacteriën van het genus Nitrobacter (fylum Proteobacteria). B) Bacteriën van het genus Nitrospira (fylum Nitrospirae) (Simon and Klotz, 2013). ...................................................................................... 11 Figuur 2.1: Belvorming op een silicone tube in de een stroomcel geaereerd onder een druk van 1,4 bar. De accolade duidt de silicone tubing aan. ........................................................................ 18 Figuur 2.2: Opstelling van de MABR met: 1) influentvaten; 2) influent- en effluentpomp; 3) recirculatiepomp; 4) recirculatievaten; 5) magnetische roerders; 6) reactor bestaande uit 3 stroomcellen; 7) gasdebietmeters......................................................................................... 19 Figuur 2.3: Testopstelling voor batchtest met actieve NO-toevoeging door bellenbeluchting. ........... 20 Figuur 2.4: Artificiële biofilm gevormd door een alginaat/biomassa-oplossing te fixeren rond een silicone tube ............................................................................................................................. 22 Figuur 2.5: Opstelling van de batchtesten met artificiële biofilm en membraan geaereerde gastoevoer met: 1) luchtpomp voor externe aeratie in de cellen ; 2) debietmeters om de XIII
inkomende gassen te controleren ; 3) vier identieke open cellen, elke cel met twee membranen en een beluchtingssteen ; 4) debietmeters geplaatst achter de cellen om drukopbouw te induceren over de membranen. ..................................................................... 22 Figuur 2.6: Opstelling KS bepalingen met: 1) influent met nitriet; 2) influentpomp; 3) Recipiënt met gebufferde biomassa; 4) Magnetische roerder met roervlo; 5) Luchtpomp voor beluchting ................................................................................................................................. 23 Figuur 3.1: Opvolging zuurstofconcentratie in een wasfles met 100 mL gebufferde biomassa (zonder substraat) voorzien van 0,5 L min-1 gecomprimeerde lucht en 0,75 L min-1 N2 door middel van een beluchtingsteentje. ......................................................................................... 29 Figuur 3.2: Foto's van fluorescentiemicroscopie gebruikmakend van de filter set Zeiss 38 na incubatie met DAF-2 DA. Linkse panelen: controle waarbij geen NO werd toegevoegd; rechtse panelen: biomassa na 10 minuten geflusht te zijn met NO. De waargenomen fluorescentie is toe te wijten aan de excitatie van DAF-2 triazol, gevormd na intracellulaire reactie van DAF-2 DA met NO. Voorts zijn anorganische verbindingen verantwoordelijk voor de zeer felle, sterk afgelijnde fluorescenties. .................................................................. 30 Figuur 3.3: Controle van de lineariteit van de metingen tijdens de wasfles batchtesten voor de verschillende behandelingen en types biomassa. Elke curve had een lineaire fitting met een R² ≥ 0,99. ............................................................................................................................ 31 Figuur 3.4: Absolute snelheden van nitrietconsumptie door verschillende types biomassa, telkens voor de behandeling met N2 (zwart) en de behandeling met NO (grijs) per test. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de absolute snelheden. De test met ABIL aangeduid met zwarte ster werd uitgevoerd met verse biomassa. (n=3) ...................... 32 Figuur 3.5: Relatieve snelheden van nitrietconsumptie door verschillende types biomassa, telkens voor de behandeling met N2 (zwart) en de behandeling met NO (grijs) per test. De waarden zijn relatief ten opzichte van de referentiewasfles met N2-behandeling. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de relatieve snelheden die getoond worden en zijn de verwerkte standaarddeviaties op de snelheden zelf. (n=3) ....................... 33 Figuur 3.6: MABR performantie voor nitrietconsumptie. In deze figuur worden enkele selectieve waarden weergegeven van de nitrietconsumptie per dag. Elk van de cellen werd geïnoculeerd met ABIL en pH en DO werden ten allen tijde optimaal gehouden en waren respectievelijk ca. 7,5 en >8,0 mg O2 L-1. .................................................................................. 34 Figuur 3.7: Absolute snelheden van nitrietconsumptie door verschillende types biomassa die ingekapseld werden in een artificiële biofilm op basis van alginaat. Elke cel werd extern belucht zodat overal steeds een overmaat aan DO kon worden gemeten en voorts werd elke cel met respectievelijk niets, N2, 100 ppmv NO en 50 ppmv NO behandeld door XIV
gastroughput via de membranen. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de absolute snelheden. (n=1) ................................................................................................... 36 Figuur 3.8: Relatieve snelheden van nitrietconsumptie door verschillende soorten biomassa die ingekapseld werden in een artificiële biofilm op basis van alginaat. Elke cel werd extern belucht zodat overal steeds een overmaat aan DO kon worden gemeten en voorts werd elke cel met respectievelijk niets, N2, 100 ppmv NO en 50 ppmv NO behandeld door gasthroughput via de membranen. De waarden zijn relatief ten opzichte van de referentiewasfles met N2-behandeling. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de relatieve snelheden die getoond worden en zijn de verwerkte standaarddeviaties op de snelheden zelf. (n=1) ...................................................................... 37 Figuur 3.9: Theoretische Michaelis-Menten curve en vergelijking met hypothetische waarden voor reactiesnelheid en substraatconcentratie. Vmax staat voor de maximale reactiesnelheid, [S] voor de substraatconcentratie en KS voor de intrinsieke constante voor de beschouwde reactiekinetiek. ......................................................................................................................... 39 Figuur 3.10: Nitrietconcentraties over tijd tijdens de KS bepalingstesten. Door middel van een constante voeding aan de halve maximale nitriet consumptiesnelheid van de betreffende biomassa werd uiteindelijk een fluctuatie rond een constante nitrietconcentratie vastgesteld. Deze concentratie is bijgevolg de KS waarde voor nitrietconsumptie voor de betreffende biomassa. ............................................................................................................. 40 Figuur 3.11: Aantal 16S rRNA kopieën voor respectievelijk Nitrobacter en Nitrospira bepaald via qPCR en dit per biomassa. De resultaten zijn op basis van VSS gehalte, welke afkomstig is van de batchtesten met wasflessen (Tabel 3.1). De waarden zijn bekomen aan de hand van een qPCR analyse gebruik makend van SYBR® Green chemistry. Het protocol is voor elk staal in triplicaat uitgevoerd waarvan vervolgens het gemiddelde is genomen. De weergegeven foutenvlaggen zijn bijgevolg de standaarddeviatie op dit gemiddelde. ............ 41 Figuur 3.12: Partikelgrootte distributies voor de vier gebruikte types biomassa weergegeven in de legende. De analyse werd uitgevoerd met een Mavern Mastersizer S en door middel van de theorie van Mie en/of Fraunhofer werd de output van de 64 aanwezige detectoren voor de verstrooide laserstraal omgezet tot de gegeven distributies waarbij de partikelgroottes (µm) worden uitgezet ten opzichte van het volumepercentage in het staal. ......................................................................................................................................... 42
XV
Lijst met Tabellen Tabel 1.1: Vergelijking van de energieconsumptie van OLAND in de zijstroom en hoofdstroom met een CAS-systeem (met nitrificatie/denitrificatie). De implementaties van OLAND houden rekening met een verbeterde primaire bezinker in een tweestapsproces zoals weergegeven in Figuur 1.3 en Figuur 1.4 (De Clippeleir, 2012). ................................................ 4 Tabel 1.2: Samenvatting van typische affiniteitswaarden en de verdubbelingstijd van AerAOB, AnAOB, NOB en DNB toepasselijk voor waterzuivering en gebaseerd op een modelstudie (Lackner, Terada et al., 2008) ................................................................................................... 12 Tabel 1.3: Inhibitie concentraties van vrij ammoniak en vrij salpeterig zuur op AerAOB en NOB (Anthonisen, Loehr et al., 1976) ............................................................................................... 15 Tabel 2.1: Samenvatting van de gebruikte parameters in de batchtesten met wasflessen. ................ 21 Tabel 2.2: Gebruikte parameters per biomassa tijdens de KS bepalingen. .......................................... 24 Tabel 3.1: Gemiddelde VSS-gehalten voor de gebruikte biomassa’s in de verschillende wasfles batchtesten............................................................................................................................... 28 Tabel 3.2: KS waarden voor nitriet consumptie van de verscheidene biomassa's. Deze waarden zijn bekomen door het gemiddelde te berekenen waarrond de nitrietconcentratie uiteindelijk fluctueert bij de bepalingstesten (Figuur 10). De standaarddeviaties zijn steeds de fout op dit berekende gemiddelde. ...................................................................................................... 40 Tabel 3.3: Het verschil tussen het logaritme van het aantal kopieën voor Nitrobacter en het aantal kopieën voor Nitrospira per biomassa. De resultaten zijn bijgevolg gebaseerd op Figuur 3.11, alsook de gegeven standaarddeviaties ........................................................................... 41 Tabel 3.4: Door de software van Malvern Mastersizer S berekende diameters voor de vier gegeven biomassa's. Alle gegevens worden uitgedrukt in µm. D[1,0], D[2,1], D[3,2] en D[4,3] zijn respectievelijk de omtrek-, oppervlakte-, volume-, en massagebaseerde diameters. ............ 43 Tabel 4.1: Samenvatting van de resultaten (Deel 3) van dit onderzoek. Voor uitleg over het bekomen van deze resultaten en extra info hierover wordt verwezen naar Deel 3 bij de desbetreffende sectie............................................................................................................... 53
XVI
1. Deel 1: Literatuurstudie 1. Stikstofproblematiek Stikstof komt in vele chemische vormen voor in de verschillende milieucompartimenten. De benaming ‘stikstof’ doet in eerste instantie denken aan N2, welke in gasvorm voor 78% deel uitmaakt van onze atmosfeer. Andere mogelijke chemische vormen zijn ammonium (NH4+), nitriet (NO2‐), nitraat (NO3-), stikstofmonoxide (NO), distikstofmonoxide (N2O), hydroxylamine (NH2OH), organische stikstof, etc. en hierbij variëren de oxidatiegetallen van -3 tot +5 (Richardson and Watmough, 1999; Martinez-Espinosa, Cole et al., 2011). De gereduceerde vormen van stikstof zijn strikt noodzakelijk voor de vorming van proteïnen en aminozuren en in die zin onmisbaar voor het mogelijk maken van leven op aarde. Sommige andere stikstofvormen zijn op hun beurt dan weer schadelijk voor het milieu op verschillende manieren. Enerzijds is er bijvoorbeeld N2O welke een potentieel broeikasgas is, anderzijds zijn er reactieve componenten die eutrofiëring bespoedigen en mogelijke giftige concentraties kunnen aannemen in bepaalde milieucompartimenten zoals NH4+, NO2- NO3-. Door middel van allerlei enzymatische reacties die plaats vinden in allerhande microbiële gemeenschappen zijn al deze stikstofcomponenten met elkaar verbonden in de zogenaamde bacteriële anorganische stikstofcyclus.
1. 2. 3. 4. 5.
Nitritatie (aerobe ammoniumoxiderende bacteriën) Nitratatie (nitrietoxiderende bacteriën) Denitrificatie (denitrificerende bacteriën) Fixatie (N-fixerende bacteriën) Anammox (anoxische ammoniumoxiderende bacteriën)
Figuur 1.1: Microbiële anorganische stikstofcyclus (Richardson and Watmough, 1999)
1
Deel 1
Literatuur
Deze cyclus met de mogelijke omzettingspaden wordt weergegeven in Figuur 1.1 waar er een overzichtelijk beeld geschetst wordt van alle mogelijke metabolische reacties en de daarvoor verantwoordelijke bacteriegroepen (Richardson and Watmough, 1999). De voorgestelde stikstofcyclus was tot de twintigste eeuw steeds in evenwicht vanwege de gelijke snelheden van microbiële
denitrificatie
en
stikstoffixatie.
Echter,
door
de
exponentieel
toenemende
wereldbevolking worden er steeds meer antropogene, reactieve stikstofcomponenten gecreëerd door onder meer landbouwprocessen (Haber-Bosch proces), verbranding van fossiele brandstoffen en de aanwending van ammoniak (NH3) in de chemische industrie. In 2010 was 45% van de jaarlijkse globale productie van gefixeerde stikstof van antropogene aard wat neerkwam op 187 Tg extra toegevoegde reactieve stikstof aan het milieu (Galloway, Townsend et al., 2008). De gevolgen van dergelijk verstoorde balans zijn zeer ernstig en waar te nemen in alle mogelijke milieucompartimenten. Zo is N2O een broeikasgas met 310 kg CO2-equivalenten en zorgen de reactieve stikstofvormen voor de productie van aerosolen en troposferische ozon (IPCC, 2007). Het onderwerp van deze thesis situeert zich echter meer in het watercompartiment van het milieu en ook hier zorgt de toename van antropogene stikstof voor verscheidene nefaste effecten. Het algemene en rechtstreekse effect van een overvloed aan stikstofcomponenten in een aquatisch milieu is eutrofiëring (Galloway, Aber et al., 2003). Eutrofiëring zorgt voor de overheersing van één soort organisme, meestal onder de vorm van een algenbloei (fytoplankton), waardoor de biodiversiteit in een ecosysteem drastisch daalt. Bij een hoge concentratie NH4+ moet vooral rekening gehouden worden met het chemisch evenwicht tussen NH4+ en NH3. Bij verhoogde pH en temperaturen zal dit evenwicht naar NH3 neigen en daar schuilt het grote gevaar gezien ammoniak reeds toxisch is bij lage concentraties, 0,4 mg NH3-N L-1 voor vissen en 0,2 mg NH3-N L-1 voor aquatische macro-organismen (Barnes and Bliss, 1983; Randall and Tsui, 2002). Voorts zullen nitrificeerders, welk NH3 als substraat gebruiken, door hun activiteit zuurstof verbruiken (4,57 mg O2 mg-1 N) en hierdoor mogelijks een zuurstoftekort creëren voor andere organismen en op hun beurt het ecologisch systeem uit evenwicht brengen. Tenslotte kan NO2- ook toxisch worden voor de mens vanaf een bepaalde concentratie indien dit bijvoorbeeld in drinkwater zit. Dergelijk gecontamineerd water kan aanleiding geven tot methemoglobinemie, een ziekte die zuurstofopname door het bloed negatief beïnvloedt. Vooral kinderen tussen nul en drie jaar zijn hiervoor zeer gevoelig en de ziekte is in deze leeftijdsklasse beter bekend als ‘blue baby syndrome’. Er gelden dan ook maximumconcentraties voor nitriet en nitraat in drinkwater, namelijk 10 mg NO3--N L-1 en 1 mg NO2-N L-1 (EPA, 2000).
2
Deel 1
Literatuur
2. Conventionele stikstofverwijdering uit afvalwater Conventioneel en sinds lange tijd wordt stikstof in de praktijk verwijderd door een tweestapsproces dat bestaat uit autotrofe nitrificatie en heterotrofe denitrificatie. Dergelijk conventioneel actief slib (CAS) systeem maakt gebruik van een aerobe tank voor de nitrificatie en een anoxische tank voor de denitrificatie (Khin and Annachhatre, 2004). Wat de extra inputs van dergelijk systeem betreft, dient enerzijds voldoende geaereerd te worden om volledige nitrificatie te stimuleren en anderzijds moet er een koolstofbron (bv. methanol) worden toegevoegd in de anoxische tank indien de COD/Nverhouding van het influent onder 4 à 5 daalt (Mateju, Cizinska et al., 1992). In Figuur 1.2 wordt een waterzuiveringssysteem
voorgesteld
van
een
pre-denitrificatie
opstelling
met
anaerobe
slibverwerking. In dergelijke opstelling staat de anoxische tank, waar denitrificatie plaats vindt, voor het aerobe bekken. Het is de meest gebruikelijke opstelling omdat in dergelijk systeem de koolstof in het influent rechtstreeks gebruikt kan worden in het denitrificatieproces. Een waterzuiveringsinstallatie als deze produceert grote hoeveelheden slib, welke verder in het proces verwerkt wordt door middel van anaerobe vergisting (anaerobic digestion, AD). De anaerobe vergister zal zorgen voor slibstabilisatie en vormt daarbij methaan (CH4) en (CO2). Het CH4, of ook wel biogas genoemd, zal vervolgens verbrand worden om elektriciteit en warmte te produceren via warmtekrachtkoppeling (Parkin and Owen, 1986). Het digestaat wordt vervolgens gerecirculeerd naar de hoofdstroom van de waterzuivering. Dit digestaat bevat echter hoge stikstofgehaltes (6001000 mg NH4+-N L-1) en lage COD concentraties (630-2000 mg COD L-1) door de afbraak van organische stikstof tot NH4+ (Siegrist, 1996). Om de denitrificatie in de hoofdstroom optimaal te kunnen laten verlopen, zal bijgevolg een externe koolstofbron onder de vorm van bv. methanol toegevoegd dienen te worden zoals eerder vermeld. Hierdoor zal de netto energierecuperatie die bekomen wordt in de vergistingsstap minimaal zijn in dit CAS-systeem, zo kan slechts 44% van de 96 Wh IE-1 d-1 die in een gemiddeld CAS-systeem wordt verbruikt, worden gerecupereerd als elektrische energie (De Clippeleir, 2012).
Figuur 1.2: Processchema van een CAS-systeem met een pre-denitrificatie actief slibsysteem voor de behandeling van huishoudelijk afvalwater met slibbehandeling in de vorm van anaerobe vergisting.
3
Deel 1
Literatuur
3. Het OLAND-proces OLAND of ‘oxygen-limited autotrophic nitrification/denitrification’ is een alternatief proces voor stikstofbehandeling in afvalwater. Aeratie en toevoeging van een externe koolstofbron in een CASsysteem kunnen grote kosten met zich meebrengen. OLAND overkomt het merendeel van deze kosten door gebruik te maken van de zeer efficiënte samenwerking tussen verschillende soorten bacteriën. Reeds in 1977 werd door Broda theoretisch aangetoond dat het voor bacteriën thermodynamisch en energetisch interessant is om NH4+ eerder anoxisch te gaan oxideren (Broda, 1977). Het proces op zich werd wel pas in 1995 geobserveerd en gepatenteerd (Mulder, Vandegraaf et al., 1995) en men noemde deze bacteriële omzetting anammox, wat een afkorting is van anaerobe ammoniumoxidatie. In het OLAND-proces zullen deze anammox bacteriën nauw samenwerken met de aerobe ammoniumoxiderende bacteriën (AerAOB). Deze laatstgenoemden zullen het NH4+ in het influent slechts partieel nitrificeren en vervolgens gebruiken de anammox het resterende NH4+ samen met de gevormde NO2- om als eindproduct stikstofgas te bekomen (Kuai and Verstraete, 1998). Dit alles vindt plaats onder gelimiteerde zuurstof concentraties en bovendien is het anammox proces autotroof.
3.1. OLAND hoofdstroom- vs. zijstroomtoepassing Het OLAND-proces kan in een CAS-systeem worden ingepast enerzijds in de zijstroom, anderzijds rechtstreeks in de hoofdstroom. Het grote verschil ligt erin dat de externe parameters en procesomstandigheden in de zijstroom beter gecontroleerd kunnen worden, daar waar de hoofdstroom mogelijks niet optimaal is op vlak van randvoorwaarden voor het OLAND-proces. Anderzijds kan, bij optimalisatie van het proces, in hoofdstroom een nog hogere energierecuperatie worden bekomen (Tabel 1.1) (De Clippeleir, 2012). Tabel 1.1: Vergelijking van de energieconsumptie van OLAND in de zijstroom en hoofdstroom met een CAS-systeem (met nitrificatie/denitrificatie). De implementaties van OLAND houden rekening met een verbeterde primaire bezinker in een tweestapsproces zoals weergegeven in Figuur 1.3 en Figuur 1.4 (De Clippeleir, 2012).
Proces
Energieconsumptie
Besparing t.o.v. CAS
(kWh kg-1 N)
(Wh IE-1 d-1)
CAS
2,30
53,4
0%
CAS met OLAND in zijstroom
1,15
26,7
50%
CAS met OLAND in hoofdstroom
-0,44
-10,1
119%
4
Deel 1
Literatuur
3.1.1. OLAND zijstroom Toepassing van het OLAND-proces in de zijstroom van een CAS-systeem houdt in dat het overtollige stikstof in het digestaat van de vergister kan worden verwijderd bij lage COD concentraties. De slibproductie ligt voor het OLAND-proces tevens veel lager wat de slibverwerkingskost van de zijstroom ook doet dalen. Indien echter de hoofdstroom onaangepast blijft, zal er in een secundaire stap nog steeds veel COD verwijderd dienen te worden onder aerobe omstandigheden. Hierdoor wordt de netto energierecuperatie van deze toepassing nihil. Dit kan echter verholpen worden door een verbeterde primaire bezinker te implementeren waardoor reeds 60-75% van de COD van het influent hier wordt verwijderd en rechtsreeks wordt doorgestuurd naar de anaerobe vergister. Deze aanpassing zorgt ervoor dat de energiebehoefte van het proces met 50% gereduceerd kan worden (Siegrist, Salzgeber et al., 2008; De Clippeleir, 2012).
Figuur 1.3: Processchema van een CAS-systeem voor zuivering van huishoudelijk afvalwater met implementatie van OLAND in de zijstroom. Door daarenboven gebruik te maken van een verbeterde hoogbelaste primaire actief slib (AS) stap leidt dit systeem tot een daling van de totale energieconsumptie met 50% ten opzichte van een conventioneel systeem (De Clippeleir, 2012).
3.1.2. OLAND hoofdstroom Indien er in een CAS-systeem gebruik wordt gemaakt van een verbeterde, hoogbelaste primaire stap waarbij bovendien zeer lage slib- en hydraulische retentietijden worden toegepast (SRT = 0,5 d; HRT = 15-30 min) kan reeds 60-75% COD van het influent worden geïncorporeerd in de biomassa. Een gemiddeld influent afkomstig van huishoudelijk afvalwater heeft een COD/N verhouding van 12-15 bij het binnenkomen van de waterzuivering. Na deze primaire stap daalt deze verhouding echter tot minder dan 5, wat te laag is voor conventionele nitrificatie/denitrificatie, maar optimaal wordt beschouwd voor OLAND (De Clippeleir, 2012). In dergelijke opstelling zou een hoofdstroom toepassing van OLAND een zeer interessant alternatief vormen in het ZeroWasteWater-concept waarbij er vanuit wordt gegaan dat afvalwater een energie- en nutriëntenbron is waarbij de chemische energie van het influent zoveel mogelijk tracht omgezet te worden in nuttige energie 5
Deel 1
Literatuur
(Verstraete and Vlaeminck, 2011). Een dergelijk systeem met een hoofdstroom toepassing van OLAND en een anaerobe slibverwerking wordt weergegeven in Figuur 1.4. Dergelijke opstelling is in de praktijk echter nog niet voor de hand liggend vanwege een lage stikstofconcentratie, een lage temperatuur en een hoge COD concentratie van het influent voor de OLAND reactor. Deze drie parameters zijn immers suboptimaal en kunnen de efficiëntie van het theoretische OLAND proces sterk doen dalen doordat ze een invloed hebben op de wijze waarop de microbiële protagonisten zich ten opzichte van elkaar gaan verhouden (De Clippeleir, 2012).
Figuur 1.4: Processchema van een CAS-systeem voor zuivering van huishoudelijk afvalwater met implementatie van OLAND in de hoofdstroom. Door daarenboven gebruik te maken van een verbeterde hoogbelaste primaire actief slib (AS) stap leidt dit systeem tot een daling van de totale energieconsumptie met 119% ten opzichte van een conventioneel systeem (De Clippeleir, 2012)
3.2. De microbiële gemeenschap Het OLAND-proces steunt, zoals reeds vermeld, op de samenwerking tussen de aerobe en anoxische ammoniumoxideerders. Er zijn echter nog twee andere bacteriegroepen aanwezig die de capaciteit hebben om de efficiëntie van het volledige proces negatief te beïnvloeden, namelijk nitrietoxiderende bacteriën (NOB) en denitrificerende bacteriën (DNB). 3.2.1. Aerobe ammoniumoxiderende bacteriën (AerAOB) AerAOB zijn verantwoordelijk voor de partiële nitritatie in het OLAND-proces waarbij het inkomend NH4+ gedeeltelijk wordt omgezet in NO2-. Hierbij dient al direct opgemerkt te worden dat, in tegenstelling wat de naam van de bacteriegroep doet vermoeden, NH3 in plaats van NH4+ het substraat is dat geoxideerd wordt door deze bacteriën (Suzuki, Dular et al., 1974). AerAOB zijn Gramnegatieve bacteriën behorend tot de genera Nitrosospira, Nitrosomonas en Nitrosococcus waarbij de Nitosococcus tot de γ-Proteobacteriën behoren en de twee andere genera deel uitmaken van de βProteobacteriën (Koops and Pommerening-Roser, 2001). Nitritatie bestaat uit twee deelreacties waarbij NH2OH het tussenproduct is (Kowalchuk and Stephen, 2001). 6
Deel 1
Literatuur 𝑁𝐻3 + 𝑂2 + 2 𝐻 + + 2 𝑒 − 𝑁𝐻2 𝑂𝐻 + 𝐻2 𝑂 0,5 𝑂2 + 2 𝐻 + + 2 𝑒 −
𝐴𝑀𝑂
→
𝑁𝐻2 𝑂𝐻 + 𝐻2 𝑂
(1)
→
𝑁𝑂2− + 5 𝐻 + + 4 𝑒 −
(2)
→
𝐻2 𝑂
(3)
𝐻𝐴𝑂
------------------------------------------------------------------------------𝑁𝐻3 + 1,5 𝑂2 → 𝑁𝑂2− + 𝐻 + + 𝐻2 𝑂
(4)
De eerste reactie wordt gekatalyseerd door het membraangebonden enzym ammoniak monooxygenase (AMO). Het gevormde NH2OH zal vervolgens worden omgezet tot NO2- door de werking van hydroxylamine oxidoreductase (HAO). Bij deze tweede reactie zullen de gevormde elektronen compenseren voor de gebruikte elektronen in de eerste reactie. De twee resterende elektronen nemen op hun beurt deel aan een elektron transfer reactie waarbij het terminale oxidase de elektronenbalans vervolledigt. De uiteindelijke gebalanceerde reactie (4) toont aan dat er bij de oxidatie van elk NH3 molecule er één proton gevormd wordt. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de omgeving waarin de reacties plaatsvinden goed gebufferd moeten zijn om geen significante pHdaling te verkrijgen. AMO heeft een zeer brede specificiteit waardoor verscheidene andere alifatische, aromatische en gehalogeneerde moleculen kunnen gecoöxideerd worden. Daarenboven blijkt de eerste oxidatie stap van vele recalcitrante koolwaterstoffen de limiterende stap te zijn, waardoor AerAOB in het algemeen ook veelvuldig voorkomen in bioremediatie en biofilter processen om deze reacties te faciliteren (Hooper, Vannelli et al., 1997). 3.2.2. Anoxische ammoniumoxiderende bacteriën (AnAOB) AnAOB is een groep van bacteriën die NH4+ oxideren onder anoxische omstandigheden. Al deze micro-organismen behoren tot het fylum van de Planctomycetes (Strous, Fuerst et al., 1999), waartoe onder andere volgende genera behoren: Brocadia (Kartal, Rattray et al., 2007), Kuenenia (Schmid, Walsh et al., 2003), Scalindua (Kuypers, Sliekers et al., 2003), Anammoxoglobus (Kartal, Rattray et al., 2007) en Jettenia (Quan, Rhee et al., 2008). Lange tijd werd verondersteld dat NH2OH en hydrazine (N2H4) de belangrijke intermediairen waren bij de totale oxidatie, maar uit recente onderzoeken van onder meer Kartal en Strous (Strous, Pelletier et al., 2006; Kartal, Rattray et al., 2007) blijkt het belang van NO en N2H4 in de reacties. Zowel de verscheidene deelreacties (5 tem 7) als de uiteindelijke reactievergelijking (8) worden hieronder weergegeven. Reacties 5 tot en met 7 worden mogelijk gemaakt door respectievelijk nitrietreductase (NIR), hydrazine synthase (Hzs) en hydrazine oxidoreductase (Hzo).
7
Deel 1
Literatuur 𝑁𝑂2− + 2 𝐻 + + 1 𝑒 − 𝑁𝐻4+ + 𝑁𝑂 + 2 𝐻 + + 3 𝑒 − 𝑁2 𝐻4
𝑁𝐼𝑅
→
𝐻𝑧𝑠
→
𝐻𝑧𝑜
→
𝑁𝑂 + 𝐻2 𝑂
(5)
𝑁2 𝐻4 + 𝐻2 𝑂
(6)
𝑁2 + 4 𝐻 + + 4 𝑒 −
(7)
--------------------------------------------------------------------------𝑁𝑂2− + 𝑁𝐻4+ → 𝑁2 + 𝐻2 𝑂
(8)
Nitrietreductases die NO als reactieproduct hebben kunnen enerzijds bestaan uit een cytochroom cd1, een NirS met een ongewoon cytochroom d1 op hun actieve site, of anderzijds zijn het koperafhankelijke enzymen, NirK, dewelke één of twee koper centra bevatten (Pearson, Page et al., 2003). Hydrazine synthase (Hzs), welke reactie 6 katalyseert, is een enzym uit de groep van stikstofmonoxide reductasen. Hzs activiteit wordt toegeschreven aan een heterotrimetrisch complex (HzsABC) waarvan reeds aangetoond is dat twee van de drie proteïnen diheem cytochromen c zijn (Kartal, Maalcke et al., 2011). Het derde enzym dat tenslotte betrokken is bij reactie 7 is hydrazine oxidoreductase (Hzo). Hzo is één van de vele octaheem cytochroom c complexen die eerst algemeen als Hao enzymen werden aangeduid, maar na verder genoom onderzoek bij Candidatus K. stuttgartiensis bleek enkel het 16e enzym effectief hydrazine te oxideren (Kartal, Maalcke et al., 2011). 3.2.3. De theoretisch ideale samenwerking van AerAOB en AnAOB OLAND is dergelijk efficiënt proces voor stikstofverwijdering vanwege de eerder vernoemde samenwerking tussen de AerAOB en de AnAOB. Indien we bij de opgesomde reacties van deze microorganismen (vergelijking 4 en 8) ook het anabolisme of celgroei in acht nemen, komen we tot volgende stoichiometrie van het OLAND-proces (Vlaeminck, 2009): 𝑁𝐻4+ + 0,792 𝑂2 + 0,08 𝐻𝐶𝑂3− → 0,435 𝑁2 + 0,111 𝑁𝑂3− + 1,029 𝐻+ + 0,052 𝐶𝐻1,4 𝑂0,4 𝑁0,2 +0,028 𝐶𝐻2 𝑂0,5 𝑁0,15 + 1,460 𝐻2 𝑂
(9)
De eerste biomassaterm in vergelijking 9 is deze van de aerobe bacteriën en de tweede term staat voor de biomassa van de anoxische bacteriën. Voorts kunnen we uit deze reactievergelijking afleiden dat de maximale omzettingsratio van het proces 89% bedraagt, vanwege de 11% NO3- dat gevormd wordt door de AnAOB. Dit kan weliswaar opgetrokken worden naar een theoretische 100% verwijdering, zoals een conventionele nitrificatie/denitrificatie kan bereiken, indien het OLAND proces in de zijstroom van een waterzuiveringsinstallatie wordt toegepast. Zo zal het overblijvende NO3- in het effluent van de OLAND reactor door recirculatie toch verwijderd worden in de anoxische tank door middel van het BOD in het influent (Vlaeminck, 2009). 8
Deel 1
Literatuur
Figuur 1.5: Theoretische gebalanceerde omzetting ammonium naar stikstofgas in een biofilm of granule gebruikmakend van het OLAND proces (De Clippeleir, 2012).
De coöperatie van beide AOB is mogelijk door de juxtapositie van beide soorten in bijvoorbeeld een biofilm. De AerAOB zullen steeds nauw in contact staan met het zuurstofrijk afvalwater om zo het NH4+ te kunnen omzetten in NO2-. De AnAOB zullen zich daarentegen bevinden daar waar het zuurstof reeds is opgebruikt door de naburige AerAOB. Dit is weergegeven in Figuur 1.5, waar de theoretische omzetting met zijn reactieproducten wordt weergegeven bij een ideaal OLAND proces. 3.2.4. De spelbrekers in de praktijk De theoretische stoichiometrie met bijbehorend omzettingspercentage van 89% dat in de vorige paragraaf wordt voorgesteld is echter niet wat in de praktijk wordt geobserveerd. Dit wordt verklaard door de aanwezigheid van nog twee andere soorten micro-organismen, namelijk nitrietoxiderende bacteriën (NOB) en denitrificerende bacteriën (DNB). Deze twee groepen zullen met de AerAOB en AnAOB concurreren voor substraten, tussenproducten en plaats waardoor de efficiëntie van het proces drastisch kan dalen. In Figuur 1.6 is wordt dit reeds een eerste maal getoond en in de twee volgende paragrafen zal nader worden ingegaan op de parameters en mechanismen die hiervoor verantwoordelijk zijn.
Figuur 1.6: Ongebalanceerde, volledige stoichiometrie van het OLAND proces in aanwezigheid van alle drie de protagonisten (De Clippeleir, 2012)
9
Deel 1
Literatuur
3.2.4.1. Nitrietoxiderende bacteriën (NOB) Nitrietoxiderende bacteriën zorgen voor nitratatie waarbij NO2- wordt omgezet in NO3-onder aerobe omstandigheden. NOB zijn, net als AerAOB, Gram-negatieve bacteriën waarvan sommigen ook tot het fylum der Proteobacteriën behoren, weliswaar verdeeld over meer en andere subklassen. De vier verschillende NOB zijn Nitrobacter (α-subklasse der Proteobacteriën), Nitrococcus (γ-subklasse der Proteobacteriën), Nitrospina (δ-subklasse der Proteobacteriën) en Nitrospira welke behoort tot Nitrospirae, waaruit blijkt dat Nitrospira dus tot een ander fylum behoort dan de andere protagonisten (Koops and Pommerening-Roser, 2001). Nadat er jaren gedacht werd dat Nitrobacter de dominante NOB was in waterzuiveringsinstallaties, is enkele jaren voor de eeuwwisseling pas ontdekt dat dit eigenlijk Nitrospira is (Daims, Nielsen et al., 2000; Siripong and Rittmann, 2007). De oxidatie van NO2- naar NO3- gebeurt in één stap, maar er wordt wel nog gebruik gemaakt van een finaal oxidase om de elektronen naar zuurstof over te brengen en zo de elektronenbalans te vervolledigen. 𝑁𝑂2− + 𝐻2 𝑂 0,5 𝑂2 + 2 𝐻 + + 2 𝑒 −
𝑁𝑥𝑟
→
𝑁𝑂3− + 2 𝐻 + + 2 𝑒 −
(10)
→
𝐻2 𝑂
(11)
---------------------------------------------------------------------------𝑁𝑂2− + 0,5 𝑂2 → 𝑁𝑂3−
(12)
Reactie 10 wordt gekatalyseerd door het nitriet oxidoreductase (Nxr) enzym. In eerdere of meer specifieke onderzoeken wordt dit reductase enzym ook geregeld aangeduid als Nor. Recente onderzoeken met verscheidene NOB genera hebben echter aan het licht gebracht dat er zich toch verschillen voordoen in de exacte werking van de nitrietoxidatie waardoor de algemenere benaming Nxr voortaan gebruikt wordt om het geheel aan mogelijke enzymen in NOB aan te duiden. In Figuur 1.7 worden de exacte reacties weergegeven die betrokken zijn bij de nitrietoxidatie. Figuur 1.7A toont het mechanisme voor Nitrobacter species, Figuur 1.7B doet dit voor een specie uit het fylum Nitrospirae (Candidatus Nitrospira defluviii). In Nitrobacter wordt NO2- geoxideerd door een membraangebonden Nxr complex welke bestaat uit vier subeenheden (NxrABCI). Het NxrAB systeem bevindt zich aan de cytoplasmatische zijde van het membraan en bevat molybdeen en ijzer. NxrI is een membraangebonden diheem cytochroom b en NxrC is een diheem cytochroom c welke dient als elektrondonor voor het terminale oxidase. Gezien de omzetting van NO2- naar NO3- in het cytoplasma gebeurt, dienen deze twee stoffen getransporteerd te worden over het membraan. Hiervoor worden specifieke transporters verantwoordelijk geacht van het type NarK (Simon and Klotz, 2013).
10
Deel 1
Literatuur
Figuur 1.7: Model van ETCs (Electron Transfer Chains) in verschillende NOB. A) Bacteriën van het genus Nitrobacter (fylum Proteobacteria). B) Bacteriën van het genus Nitrospira (fylum Nitrospirae) (Simon and Klotz, 2013).
Bij het fylum van Nitrospirae is het waarschijnlijk dat het NxrAB complex zich aan de buitenzijde van het cytoplasmamembraan bevindt. Voorts is het hier nog wel niet volledig duidelijk hoe het elektronentransport verloopt in dit systeem. Het zuurstofreducerend enzym is bij Nitrospirae hoogstwaarschijnlijk oxidase van het type cytochroom bd en ook de aanwezigheid van cytochromen b en c is niet uitgesloten (Simon and Klotz, 2013). De reden dat NOB nu zo inefficiënt en strikt te vermijden zijn in het OLAND-proces berust op het feit dat zij in competitie treden met zowel AerAOB als AnAOB. Nitratatie is namelijk een aeroob proces en het is dan ook vanzelfsprekend dat NOB gaan concurreren voor de aanwezige zuurstof in het systeem. Overigens treedt er competitie op tussen NOB en AnAOB voor het substraat NO2-. Indien NOB het nitriet gebruikt in plaats van de AnAOB wordt nitraat geproduceerd, welk vervolgens niet meer als stikstofsubstraat door de AOB gebruikt kan worden en dit dus een efficiëntieverlies vormt voor het gehele proces (Third, Sliekers et al., 2001). 3.2.4.2. Denitrificerende bacteriën (DNB) Als laatste van de vier protagonisten die stikstofcomponenten omzetten in de context van waterzuivering, zijn er nog de denitrificerende bacteriën. Deze groep vertegenwoordigt normaal de 11
Deel 1
Literatuur
tweede stap in de conventionele nitrificatie/denitrificatie. Hun werkingsprincipe is minder specifiek dan deze van de vorige vermelde groepen omdat zij hun energie ook uit aerobe respiratie kunnen halen en slechts nitraat en/of nitriet gaan reduceren bij zeer lage zuurstof gehalten. De denitrificatie die de omzetting van nitraat naar stikstofgas inhoudt, volgt volgende biochemische pathway (Zumft, 1997): 𝑁𝑂3− →
𝑁𝐴𝑅
𝑁𝑂2− →
𝑁𝑖𝑅
𝑁𝑂 →
𝑁𝑂𝑅
𝑁2 𝑂 →
𝑁𝑂𝑆
𝑁2
(13)
Hieruit blijkt het gebruik van opeenvolgende enzymen, respectievelijk nitraat reductase, nitriet reductase, stikstofmonoxide reductase en distikstofoxide reductase. Deze reacties kunnen plaatsvinden door de oxidatie van organisch materiaal. Hierdoor kunnen zij mogelijk competitief optreden tegen AnAOB. Zij gaan deze competitie wel slechts winnen indien de COD/N verhouding voldoende hoog is (COD/N>>2) omdat zij onder deze omstandigheden veel sneller groeien dan AnAOB (Lackner, Terada et al., 2008). 3.2.5. Samenvatting kinetische parameters protagonisten Uit vorige paragrafen is reeds gebleken dat heel wat van de besproken micro-organismen dezelfde substraten delen. Hierdoor is het van belang om de affiniteiten van de verschillende bacteriën voor de betreffende nitrietcomponenten te weten. In Tabel 1.2 worden deze samengevat, alsook wordt de verdubbelingstijd hierbij vermeld. Deze parameters zijn belangrijk om inhibitiemethoden, welke verder nog besproken worden, op te kunnen baseren. Tabel 1.2: Samenvatting van typische affiniteitswaarden en de verdubbelingstijd van AerAOB, AnAOB, NOB en DNB toepasselijk voor waterzuivering en gebaseerd op een modelstudie (Lackner, Terada et al., 2008)
Parameter
Eenheid
AerAOB
NOB
DNB
AnAOB
KS zuurstof
mg O2 L-1
0,6
2,2
0,2
-
KS ammonium
mg N L-1
2,4
-
-
0,07
KS nitriet
mg N L-1
-
5,5
0,3
0,05
KS nitraat
mg N L-1
-
-
0,3
-
d
0,34
0,48
0,12
8,7
Verdubbelingstijd
Het dient echter aangehaald te worden dat Tabel 1.2 een mogelijke set van affiniteitswaarden geeft, maar dat deze erg kunnen variëren. Kinetische variaties hangen immers af van verscheidene randvoorwaarden zoals temperatuur, vlokgrootte, microbiële gemeenschap, competitie en/of inhibitie binnen deze microbiële gemeenschap, reactortype, enzoverder (Lackner and Smets, 2012). 12
Deel 1
Literatuur
Omwille van het ontbreken van een consensus aangaande kinetische parameters gebruiken verschillende onderzoeken simpelweg een bepaald bereik van waarden in plaats van één enkele waarde. Voor onder andere de KS voor nitriet van NOB vinden we een range van 0,2 – 6,0 mg N-NO2 L-1 (Lackner and Smets, 2012). Voor deze specifieke affiniteitsparameter, die verder in dit werk nog van groot belang is, werd er wel reeds een verschil tussen Nitrobacter en Nitrospira waargenomen onder identieke omstandigheden (Blackburne, Vadivelu et al., 2007). Het resultaat van dit onderzoek wijst op een hogere affiniteit voor NO2- van Nitrospira in vergelijking tot Nitrobacter en dat Nitrospira dus meer zal domineren onder condities met lage NO2- concentraties. 3.2.6. De voordelen van het OLAND-proces Het algemene voordeel is reeds aangehaald en betreft de nauwe samenwerking tussen AerAOB en AnAOB. Doordat er een partiële nitritatie wordt toegepast wordt de aeratie beperkt en bespaart het zuurstof-gelimiteerde OLAND-proces 62,5% op aeratiekosten (Verstraete and Philips, 1998). Voorts dient er geen externe koolstofbron, zoals methanol, worden toegevoegd vanwege het autotrofe karakter van de deelnemende protagonisten. Hiermee gepaard gaand, beoogt het OLAND-proces een 100% reductie in CO2 productie. Door de lage groei van AnAOB zal er ook een sterk verminderde slibproductie zijn ten opzichte van de normale stikstofverwijdering, waardoor de slibverwerkingskost tot 90% verminderd wordt (Mulder, 2003). Dit alles samengevat komt neer op een totale kostenbesparing van 30 à 40% (Fux and Siegrist, 2004).
4. NOB inhibitie De noodzaak om NOB te onderdrukken en op die wijze het OLAND-proces te optimaliseren is reeds uitvoerig aangetoond. Er zijn de afgelopen decennia verscheidene technieken aangetoond om dit te bewerkstelligen. Het probleem is echter, wat ook zal blijken uit volgende paragrafen, dat deze technieken telkens afhankelijk zijn van heel wat voorwaarden en omstandigheden waaraan niet steeds voldaan kan zijn voor een conventionele waterzuiveringsinstallatie. Om OLAND bijgevolg toe te passen in de hoofdstroom van dergelijke bestaande waterzuiveringsinstallatie, is het van groot belang om de NOB inhibitie beter te begrijpen.
4.1. Gekende methoden 4.1.1. Opgeloste zuurstofconcentratie Uit Tabel 1 kan er worden afgeleid dat de affiniteit voor zuurstof bij NOB (KS = 2,2 mg O2 L-1) lager is dan bij AerAOB (KS = 0,6 mg O2 L-1). Hierdoor zullen de AOB een competitief voordeel hebben indien er een lage concentratie aan opgeloste zuurstof (DO of dissolved oxygen) wordt toegepast in de
13
Deel 1
Literatuur
reactor. Het is aangetoond dat bij een zuurstofconcentratie lager dan 1,0 – 1,5 mg O2 L-1 de ammoniumoxidatie nog steeds zal plaatsvinden terwijl de nitratatie wordt geïnhibeerd (Peng and Zhu, 2006). De toepasbaarheid van dergelijke inhibitie hangt niet zozeer af van het influent maar wel van de gebruikte reactor, zo zal de controle van zuurstof eerder makkelijk zijn bij bijvoorbeeld sequentiële batch reactoren (SBR), terwijl andere configuraties zich er minder toe lenen. 4.1.2. Slibretentie tijd in combinatie met temperatuursregeling NOB groeien tweemaal trager dan aerobe ammoniumoxideerders indien temperaturen tussen 30 en 40°C worden toegepast (Hellinga, Schellen et al., 1998). Indien bij deze omstandigheden gewerkt kan worden, is het mogelijk om op basis van groeisnelheid de microbiële gemeenschap te regelen via de slibretentie tijd (SRT). Bij een SRT van 1 – 1,5 dagen is immers aangetoond dat NOB selectief uit het systeem kunnen uitgespoeld worden (Sun, Nacher et al., 2010). De toepasbaarheid van deze methode op een rioolwaterzuiveringsinstallatie is echter nihil vanwege het feit dat een conventionele waterzuiveringsinstallatie in een gematigd klimaat werkzaam is bij 10 – 15°C. Een ander gegeven betreffende temperatuur is dat de mogelijkheid bestaat om ingekapselde biomassa te onderwerpen aan een hitteshock van 60°C gedurende 20 minuten en zo de nitratatie volledig te onderdrukken. AerAOB waren in dit onderzoek zelfs in staat om hitte shocken van 90°C gedurende een uur te overleven. Dit lijkt economisch alleszins niet echt haalbaar en ook is er geen resultaat van de reactie van AnAOB bij deze methode (Isaka, Sumino et al., 2008). 4.1.3. Vrij ammoniak en vrij salpeterigzuur De twee niet-geïoniseerde vormen van NH4+ en NO2-, namelijk vrij ammoniak (NH3) en salpeterig zuur (HNO2), hebben beide een inhiberend effect op zowel AerAOB als NOB. De sensitiviteit van deze twee soorten protagonisten is echter verschillend. Aanvankelijk dienen er formules gebruikt te worden om deze twee stikstofvormen te kunnen berekenen, gegeven dat bij conventionele NH4 en NO2- analyses zowel de geïoniseerde als niet-geïoniseerde vormen tezamen gemeten worden. Deze formules worden gegeven in vergelijkingen 14 en 15, waarin FA en FNA staan voor de afkortingen van de Engelstalige benamingen, respectievelijk free ammonia en free nitrous acid (Anthonisen, Loehr et al., 1976). Zoals opgemerkt kan worden, zijn FA en FNA beide afhankelijk van temperatuur en pH.
𝐹𝐴 =
(𝑁𝐻4+ +𝑁𝐻3 ).10𝑝𝐻
(14)
2300 𝑒 273+𝑇 +10𝑝𝐻 2300
𝐹𝑁𝐴 =
(𝑁𝑂2− +𝐻𝑁𝑂2 ).𝑒 273+𝑇 2300 𝑒 273+𝑇 +10𝑝𝐻
(15)
14
Deel 1
Literatuur
De verscheidene sensitiviteiten, weergegeven in Tabel 1.3, laten vermoeden dat door de regeling van beide vrije stikstofcomponenten NOB geïnhibeerd kunnen worden. Echter dient opgemerkt te worden dat de inhibitie slechts tijdelijk zal zijn aangezien NOB een zeer hoog adaptatievermogen hebben en na enige tijd zelfs kunnen bij FA-concentraties van 22 mg N L-1 (Anthonisen, Loehr et al., 1976; Turk and Mavinic, 1989). Tabel 1.3: Inhibitie concentraties van vrij ammoniak en vrij salpeterig zuur op AerAOB en NOB (Anthonisen, Loehr et al., 1976)
AerAOB
NOB
NH3 (mg N L-1)
8 – 120
0,08 – 0,82
HNO2 (mg N L-1)
0,2 – 2,8
0,06 – 0,83
Ten slotte dient, aan de hand van de gegeven vergelijkingen en inhibitieconcentraties, opgemerkt te worden dat NOB inhibitie door middel van FA slechts plaats zal vinden bij relatief hoge temperatuur en pH. Hierdoor is dit, net als bij de methoden van vorige paragraaf, minder toepasbaar in een standaard waterzuiveringsinstallatie. 4.1.4. Zoutgehalte Een laatste gekende inhibitiefactor is het zoutgehalte in de omgeving van de microbiële gemeenschap. Meer bepaald zou NaCl bij een concentratie van 10 g L-1 de activiteit van AerAOB en AnAOB toelaten, maar tegelijkertijd NOB onderdrukken (Liu, Yang et al., 2008). In latere studies in verband met partiële nitrificatie is zelfs aangetoond dat het gebruik van zeewater de oorzaak was van de inhibitie van NOB (Sun, Nacher et al., 2010). Echter werd er ook weer een hoge adaptiegraad aan deze inhibitiemethode vastgesteld, die zelfs tot 30 g NaCl L-1 kon gaan (Windey, De Bo et al., 2005). Tenslotte dient ook opgemerkt te worden dat de exacte zoutconcentratie grens tussen actieve AOB en geïnhibeerde NOB zeer moeilijk te bepalen is en afhankelijk blijkt van meerdere randfactoren (Aslan and Simsek, 2012) en dus moeilijk toe te passen is in de praktijk.
4.2. NOB inhibitie door NO 4.2.1. Karakteristieken NO Stikstofmonoxide is een component met een groot potentieel om biologische effecten te veroorzaken. Enerzijds is het een belangrijk spoorgas in de atmosfeer met een direct effect op de ozonproductie, anderzijds is NO toxisch voor heel wat organismen, waaronder bacteriën, fungi, microbiële parasieten en virussen (Zumft, 1993). Met een Henry constante van 1,9×10-3 M atm-1 in water bij standaard omstandigheden (25°C en 1 atm) is NO een zeer hydrofobe molecule, en lost het 15
Deel 1
Literatuur
dus zeer slecht op in water, maar kan het wel makkelijk over celmembranen diffunderen. De toxiciteit van NO is te wijten aan de hoge reactiviteit met eiwitten en zuurstof. In bacteriën heeft het zelfs een bewezen mutageen effect op DNA. In lage concentraties is NO echter wel actief als boodschappermolecule in vele organismen, waaronder zelfs de mens (Marletta, Tayeh et al., 1990). 4.2.2. NO als tussenproduct in microbiële omzettingsreacties NO is een gekend tussen- en/of eindproduct van sommige micro-organismen die aanwezig zijn bij het omzetten van stikstofcomponenten. NO, alsook N2O kunnen geproduceerd worden door AerAOB (Lipschultz, Zafiriou et al., 1981), NOB (Freitag and Bock, 1990) en DNB (Kluyver and Verhoeven, 1954). Bij anammox is NO wel degelijk een bewezen tussenproduct, terwijl N2O niet wordt gevormd in het AnAOB metabolisme (Kartal, Rattray et al., 2007). In het onderzoek van Kampschreur werd de emissie van beide gassen in een tweestaps nitritatie/anammox reactor aangetoond. Hierbij werd een totale N2O emissie van 2,3% van de totale stikstofbelasting vastgesteld waarvan 1,7% afkomstig van de nitritatie reactor en 0,6% van de anammox reactor. In het geval van NO emissie was dit 0,2% afkomstig van de nitritatie reactor en 0,003% van de anammox reactor (Kampschreur, Poldermans et al., 2009). Het onderzoek van Sliekers toonde dan weer een totale NO en N2O emissie van 0,1% aan in een lab-scale eenstapsreactor (Sliekers, Derwort et al., 2002). De conclusie van het eerder vernoemde onderzoek van Kampschreur was bijgevolg dat NO voornamelijk afkomstig was van het AerAOB metabolisme. AerAOB kunnen immers op twee verschillende manieren NO (en N2O) produceren, enerzijds bij de oxidatieve reactie van NH2OH naar NO2-, anderzijds hebben AerAOB ook een denitrificerend potentieel waarbij NH4+ als elektronendonor dient en waarbij NO en tenslotte N2O de eindproducten zijn (Bock, Schmidt et al., 1995). Daarenboven was reeds geweten dat AerAOB specifiek meer NO en N2O produceren onder stresscondities van lage DO gehaltes en hoge NO2concentraties (Colliver and Stephenson, 2000). Binnen deze stresscondities viel het des te meer op dat in het bijzonder de transiënte fasen rijk waren aan een emissie van beide gassen (Chandran, Stein et al., 2011). 4.2.3. NO als inhibitor voor NOB-activiteit Aangaande NOB-inhibitie door het gebruik van NO zijn al enkele onderzoeken gevoerd. Ten eerste moet duidelijk gesteld worden dat AnAOB geen effect van verhoogde NO-concentraties ondervinden omdat zij NO effectief als tussenproduct gebruiken in hun reactiemechanisme. NOB daarentegen ondervinden een bewezen inhibitie bij concentraties van 7 – 488 µg NO-N L-1 (Starkenburg, Arp et al., 2008). Hier werd immers aangetoond dat de zuurstofopname om nitriet te oxideren sterk geremd werd door toevoeging van NO aan de reactor. Eenmaal het stikstofmonoxide echter terug uit de oplossing verwijderd was, herstelde de activiteit zich bijna volledig (≥90% van de initiële snelheid). De 16
Deel 1
Literatuur
hypothese was dan ook dat NO effect had op één van de voornaamste proteïnen in het nitrietoxidatiesysteem van de NOB. Dit werd bevestigd door experimenten uit te voeren waarbij NOB, al dan niet behandeld met specifieke gekende inhibitoren, zowel in hoge als in lage DO omstandigheden werden opgevolgd. De algemene conclusie dat hieruit getrokken kon worden, was dat er een reversibele binding van NO op het cytochroom oxidase plaatsvond (Cooper, 2002) waarbij de snelheid van associatie vele malen hoger lag dan de dissociatie (Sarti, Giuffre et al., 2000). Starkenburg werkte echter wel slechts met één species, namelijk Nitrobacter winogradskyi Nb-255, en zijn conclusies gelden ook enkel voor Nitrobacter. Gezien het bewijs voor de grote aanwezigheid van Nitrospira in waterzuiveringsinstallaties bestaat er aldus een grote behoefte om de voorgestelde effecten van NO op Nitrobacter te kunnen veralgemenen naar NOB en desnoods nog andere correlaties vast te leggen die van toepassing zijn bij de verscheidene species.
5. Doelstelling Het doel van dit werk is om de inhibitie van NOB door middel van NO uit te klaren. NOB-inhibitie door NO is immers reeds bewezen voor Nitrobacter, maar niet voor Nitrospira. Gegeven dat Nitrospira het meest voorkomende NOB genus is in waterzuiveringsinstallaties, is het bijgevolg van groot belang het effect hierop volledig te begrijpen. De toepassing van OLAND in hoofdstroom waterzuiveringstoepassingen is hetgeen beoogd wordt met deze NOB inhibitie door NO. Andere inhibitieparameters zijn immers moeilijk te bekomen in een hoofdstroom en het is geweten dat de micro-organismen zelf dit NO kunnen produceren bij stress condities. Hierdoor zou een zelfonderhoudende microbiële gemeenschap kunnen bekomen worden met een maximale efficiëntie van het proces. Om het effect van NO nader te bestuderen zullen correlaties tussen inhibitie-effecten en intrinsieke kinetische parameters bepaald worden door middel van het testen van soorten slib met verschillende afkomst uit de praktijk. Uit de resultaten van de experimenten uitgevoerd in dit onderzoek zal tenslotte worden getracht reeds gekende inhibitiemethoden, zoals vernoemd in Deel 1, Sectie 4.1., te verklaren aan de hand van de NO-inhibitie en zal een besluit gevormd worden rond de toepasbaarheid van NOB inhibitie door NO in OLAND-hoofdstroomsystemen.
17
2. Deel 2: Materiaal en methoden 1. MABR-reactor De membraan geaereerde biologische reactor (MABR) bestond uit drie gelijke doorstroomcellen van 196 mL (20,2 cm lang, 5,0 cm breed en 2,1 cm hoog) waarin zich twee siliconen tubes bevinden (Figuur 2.1). Deze tubes dienen als drager voor de biofilm en bieden een groot contactoppervlak (153 cm² (L reactor)-1) voor massatransfer van NO. De gastoevoer werd ingebracht in het lumen van deze tubes en het gasdebiet door de tubes werd geregeld met debietmeters en een drukmeter aan de gasuitlaat van de reactor. Er stroomde 0,3 L min-1 gas door de tubes en dit bij een tegendruk van 1,4 bar.
Figuur 2.1: Belvorming op een silicone tube in de een stroomcel geaereerd onder een druk van 1,4 bar. De accolade duidt de silicone tubing aan.
De waterfase van de reactor (Figuur 2.2) bestond uit een medium voorzien van NO2- met een initiële concentratie van 20 mg N L-1 die mettertijd werd opgevoerd tot 50 mg N L -1 gebruikmakend van NaNO2. Verder werd ook (NH 4)2SO4 (tevens 20 - 50 mg N L-1), 12 g NaHCO3 g N-1 en KH2PO4 (70 mg P L-1) toegevoegd. Dit influent van elke cel werd in een afzonderlijk recirculatievat van 300 mL gebracht met behulp van een eerste pomp aan een snelheid van 142 mL min -1. Deze pomp was tegen dezelfde snelheid tegelijkertijd verantwoordelijk voor het terug uitpompen van effluent uit het recirculatievat. Een tweede pomp die opereerde aan 158 mL min -1 was verantwoordelijk voor het recirculeren van het medium door de drie stroomcellen. Elk recirculatievat stond op een magnetische roerder waardoor de waterfase homogeen kon worden gehouden met een 18
Deel 2
Materiaal en methoden
roervlo. De hydraulische retentietijd (HRT) van de volledige reactor was 3,2 uur. De nitrificerende biomassa (ABIL, Avecom) werd in de cellen gebracht door 300 mL biomassa in de recirculatievaten te brengen en vervolgens enkel de pomp, die verantwoordelijk was voor de circulatie van de recirculatievaten door de stroomcellen, te laten werken. Na enige tijd kon dan worden opgemerkt dat de biomassa weerhouden werd in de cellen. Vanaf dan werd de influentpomp ook aangezet.
Figuur 2.2: Opstelling van de MABR met: 1) influentvaten; 2) influent- en effluentpomp; 3) recirculatiepomp; 4) recirculatievaten; 5) magnetische roerders; 6) reactor bestaande uit 3 stroomcellen; 7) gasdebietmeters
2. NO-batchtesten 2.1. Batchtesten met wasflessen Het effect van NO op de NOB activiteit werd bepaald, gebruik makend van drie wasflessen. Hierdoor konden er drie simultane testen worden uitgevoerd, de NO-behandeling zelf en twee controles met respectievelijk lucht en N2. De opstelling van één enkele wasfles wordt weergegeven in Figuur 2.3.. De gastoevoer werd geregeld door debietmeters te plaatsen op elke gastoevoer. Hierdoor kon de hoeveelheid van elk gas geregeld worden als ook de verhouding tussen lucht en respectievelijk NO en N2 die per wasfles werd toegediend. In elke wasfles werd 0,5 L min-1 lucht toegevoegd met daarbij, in wasfles 2 en 3, respectievelijk nog 0,75 L min-1 NO en N2. Voor de input van NO werd gebruik gemaakt van een gasfles met 100 ppmv NO. Doordat er gekozen werd voor een mengsel van lucht 19
Deel 2 en respectievelijk NO en N2, werden mogelijke
Materiaal en methoden anoxische
effecten op de nitrietoxidatie
geminimaliseerd. Nadat in één van de wasflessen een korte test met opvolging van het DO gehalte werd uitgevoerd, is er gekozen voor een verhouding tussen lucht en NO/N2 van 2/3. Om kleinere gasbellen te verkrijgen werd de wasfles gemodificeerd door het aanbrengen van een beluchtingsteentje. Een goede menging werd verzekerd door het gebruik van een roervlo (2,5 cm lang en diameter 0,5 cm) in de wasfles. De gehele opstelling stond in een temperatuur gecontroleerde kamer op 20°C.
Figuur 2.3: Testopstelling voor batchtest met actieve NO-toevoeging door bellenbeluchting.
In deze opstelling werden vervolgens vier verschillende types biomassa getest, namelijk ABIL (ammonium binding inoculum liquid, een nitrificerende mengcultuur verkregen bij Avecom), OLANDbiomassa (afkomstig van een rotating biological contactor of RBC op 15°C), actief slib (rechtstreeks bekomen uit het aeroob bekken van een rioolwaterzuiveringsinstallatie, Aquafin te Oudenaarde) en DANIS slib (nitrificerend slib uit een mestverwerkingsproces van het bedrijf DANIS). In Tabel 2.1 worden de parameters weergegeven die gebruikt werden in de verschillende testen. Elke biomassa werd geactiveerd alvorens de batchtesten uit te voeren. Deze activatie bestond uit het stelselmatig opvoeren van de nitrietconcentratie die werd toegevoegd, terwijl de biomassa belucht en gemengd werd. De concentratie N-NO2- waarmee begonnen werd, hing af van de eigenschappen en afkomst van de desbetreffende biomassa. In Tabel 2.1 wordt er hierover ook meer informatie gevonden, namelijk de concentratie N-NO2- waarmee begonnen werd en deze die gevoed werd aan de biomassa op het einde van de activatie. De buffer (pH 7,5) was samengesteld uit KH2PO4 en K2HPO4. De NO2--concentraties werden bereikt door gebruik te maken van NaNO 2. Tijdens de testen werden 2 mL stalen genomen die gefilterd werden over een 0,45 µm filter. In deze stalen werd vervolgens de NO2--concentratie gemeten door middel van ionenchromatografie (IC) of de 20
Deel 2
Materiaal en methoden
spectrofotometrische Montgomery methode, waardoor voor elke wasfles in elke test een snelheid van nitrietconsumptie bepaald kon worden. Alle testen werden in drievoud uitgevoerd. DO en pH werden voor en na de batchtest in elke wasfles gemeten om veranderingen waar te nemen en externe inhibitieparameters te kunnen uitsluiten. Tabel 2.1: Samenvatting van de gebruikte parameters in de batchtesten met wasflessen.
ABIL (Industrieel)
OLAND (RBC)
Actief Slib (RWZI)
DANIS (Mestverwerking)
0,100
0,100
0,100
0,100
100 – 150
10 – 30
10 - 30
10 - 20
150
30
30
20
2000
500
1000
1000
Duur batchtest (uur)
2
4
2
2
Analysemethode
IC
Montgomery
IC
Montgomery
Volume biomassa (L) N-NO2- concentraties: Activatie (mg N-NO2- L-1) N-NO2 concentraties: Batchtest (mg N-NO2- L-1) Buffer (pH 7,5) (mg P L-1)
2.2. Batchtesten met artificiële biofilmmembranen Deze batchtesten gebruiken de membraan gebaseerde aeratie voorgesteld in de MABR, maar dan in een batchopstelling. De silicone tubes werden voorzien van een artificiële biofilm (Figuur 2.4) om een snelle en gecontroleerde fixatie van biomassa rond de tubes te verkrijgen. 2.2.1. Bereiding artificiële biofilm De artificiële biofilm werd gevormd door 100 mL ABIL te mengen met 1,5 g natriumalginaat (alginaatoplossing van 1,5%). Na homogenisatie werden de op maat geknipte silicone tubes in het biomassa-alginaat mengsel ondergedompeld.
Eens er een volledige en gelijke film aan het
membraan hing, werden de tubes in een 0,5 M calciumchloride (CaCl2) oplossing gebracht. De CaCl2oplossing stond op een magnetische roerder zodat de membranen voor 1,5 uur konden fixeren onder goed gemengde omstandigheden om een optimaal contact te bekomen tussen alginaat en CaCl2-oplossing.
21
Deel 2
Materiaal en methoden
Figuur 2.4: Artificiële biofilm gevormd door een alginaat/biomassa-oplossing te fixeren rond een silicone tube
2.2.2. NO-Batchtesten De tubes met artificiële biofilm werden per twee in een cel geplaatst (Figuur 2.5). De gastoevoer werd ingebracht in het lumen van deze tubes en
het gasdebiet door de tubes werd geregeld met
debietmeters voor en achter de cellen te plaatsen en een drukmeter aan de gasuitlaat van de cel. Er stroomde 0,5 L min-1 gas door de tubes en dit bij een tegendruk van 1,2 bar. Er werd gebruik gemaakt van lucht, NO (100ppmv), N2 en een mengsel van NO (100ppmv) met N2 in respectievelijk één van de vier cellen. Het mengsel werd bekomen door voor de cel een input van 0,25 L min-1 NO en 0,25 L min-1 N2 samen te brengen zodat er ook in deze cel nog steeds 0,5 L min-1 gas in het lumen van de tubes werd gebracht. Elke cel werd belucht door een beluchtingsteentje om het medium verzadigd te houden op vlak van DO en zo alle mogelijke anoxische effecten uit te sluiten.
4)
3)
1)
2)
Figuur 2.5: Opstelling van de batchtesten met artificiële biofilm en membraan geaereerde gastoevoer met: 1) luchtpomp voor externe aeratie in de cellen ; 2) debietmeters om de inkomende gassen te controleren ; 3) vier identieke open cellen, elke cel met twee membranen en een beluchtingssteen ; 4) debietmeters geplaatst achter de cellen om drukopbouw te induceren over de membranen.
22
Deel 2
Materiaal en methoden
In elke cel werd 300 mL medium gebracht. Dit was steeds een gebufferd medium van 30 mg N-NO2L-1 aangemaakt door 0,74 g NaNO2, 0,03 g KH2PO4, 0,16 g K2HPO4 en 0,3 g NaHCO3 te mengen in een 5 L recipiënt. Het medium werd gebufferd op een pH van 7,5. Tijdens de test werd telkens 2 mL staal genomen dat gefilterd werd over een 0,45 µm filter. Ook werd de DO en pH opgevolgd bij elke staalname.
3. KS-bepalingen Deze testen waren gebaseerd op de eerder bekomen resultaten van de batchtesten in wasflessen. Aan de hand daarvan was de maximale snelheid van elke biomassa reeds bepaald en kon er door gebruik te maken van een pomp met een gekend debiet aan constante snelheid gevoed worden, welke gelijk was aan de helft van de maximale consumptiesnelheid van nitriet voor de betreffende biomassa. Hierdoor zal de gebruikte biomassa exact even snel nitriet verbruiken als dat er wordt gevoed en wordt een constante evenwichtswaarde bereikt die gelijk is aan de KS. De gebruikte pomp werkte aan een debiet van 0,1 L uur-1 en het gebruikte biomassa volume was 2 L. De biomassa werd reeds gebufferd op pH 7,5 met een P-buffer waarvan de concentratie net als bij de batchtesten verschilde per biomassa. De test werd ongeveer 3 à 4 uren gelopen (afhankelijk van de biomassa) en tijdens de testen werd om de 20 minuten staal genomen. Deze stalen werden vervolgens geanalyseerd door de IC voor nitrietconcentratie. Figuur 2.6 is een schematische weergave van de gebruikte opstelling.
Figuur 2.6: Opstelling KS bepalingen met: 1) influent met nitriet; 2) influentpomp; 3) Recipiënt met gebufferde biomassa; 4) Magnetische roerder met roervlo; 5) Luchtpomp voor beluchting
23
Deel 2
Materiaal en methoden
In Tabel 2.2 worden de parameters weergegeven per biomassa. Voor de N-NO2- concentratie te bekomen werd gebruik gemaakt van NaNO2 en voor de buffer werd KH2PO4 en K2HPO4 gebruikt. Het dient opgemerkt te worden dat de snelheden waarvan vertrokken werd, gebaseerd waren op resultaten van de eerdere testen en dus ook afhankelijk waren van de concentratie en VSS van de biomassa die gebruikt werd in die respectievelijk test. Het zijn dus geen intrinsieke waarden van de biomassa. Tabel 2.2: Gebruikte parameters per biomassa tijdens de KS-bepalingen
Pompdebiet (L uur-1) Volume (L) ½ maximale snelheid (mg N L-1 uur-1) Concentratie influent (mg N-NO2- L-1) concentratie buffer (mg P L-1) Duur test (uur)
ABIL (Industrieel)
OLAND (RBC)
Actief slib (RWZI)
DANIS (Mestverwerking)
0,1
0,1
0,1
0,1
2
2
2
2
17,18
0,68
2,06
1,06
171,8
6,8
20,6
10,6
2000
500
1000
1000
3,5
3,0
4,0
2,5
4. qPCR-analyse voor de bepaling van de ratio Nitrobacter/Nitrospira Voor de DNA extractie en kwantitatieve PCR (qPCR) werden van elke biomassa stalen genomen met gekend VSS gehalte. Van deze stalen werd 0,2 mL gecentrifugeerd en de bekomen pellets werden direct en rechtstreeks gebruikt voor DNA extractie. DNA werd geëxtraheerd met een DNeasy mini kit (Qiagen, CA, USA) volgens de fabrieksinstructies. De kwaliteit en kwantiteit van het DNA werd geverifieerd met een NanoDrop Lite Spectrofotometer (Therme Fisher, MA, USA). De bekomen concentraties aan NOB werden, in triplicaat, gekwantificeerd gebruik makende van SYBR® Green chemistry qPCR, welke specifiek werkte op het Nitrobacter 16S rRNA gen (Graham, Knapp et al., 2007) en het Nitrospira 16S rRNA gen (Kindaichi, Kawano et al., 2006). Een standaardreeks, met verdunningen van het beoogde plasmide DNA met de specifieke genen, werd gebruikt om een standaardcurve te bekomen. Het medium voor elke reactie bestond uit volgende finale concentraties: 1X iQ Supermix (Bio-rad, CA, USA), 200 nM van elke primer, en 1uL DNA template. Primer specificaties en de afwezigheid van primer dimeer formaties werden geverifieerd via een smelt curve analyse voor elke qPCR analyse.
24
Deel 2
Materiaal en methoden
5. Analyse van de partikelgrootte distributie Voor de analyse van de partikelgrootte distributies van de gebruikte types biomassa gedurende dit onderzoek werd gebruik gemaakt van een Malvern Mastersizer S. Dit apparaat maakt gebruik van het Small Angle Laser Light Scattering (SALLS) principe om partikelgrootte distributies van emulsies, suspensies, poeders en aerosolen te meten. Een 2 mW He-Ne rode Laser (633 nm golflengte) met 18 mm straaldiameter, gecollimeerd tot een enkele transverse modus wordt gebruikt als de lichtbron. Op maat gemaakte semiconductor detectoren zijn in staat het verstrooide licht op te vangen. Voorts is er ook gecenterde ring die in staat is het doorkomende licht te detecteren om zo de obscuratie van de meting te bepalen. Het apparaat maakt gebruik van de theorie van Mie of Frauenhof om het verstrooiingspatroon te kunnen interpreteren. Op deze wijze kunnen partikels gemeten worden in de range van 0,05 µm tot 3,5 mm. Voor emulsies en suspensies, waar in dit onderzoek mee gewerkt werd, werden de stalen verdund met gedestilleerd water in een kolf buiten het apparaat. Via een aangebrachte verbinding met het apparaat werd het verdunde staal vervolgens gecirculeerd door de lens van de Malvern Mastersizer S. De software van het apparaat ontvangt vervolgens elke 2 ms een signaal van meting. De gebruikte verdunning is afhankelijk van het gebruikte staal. De obscuratie moet namelijk tussen 10% en 30% blijven (een waarde die constant te raadplegen is op het scherm van het apparaat) om relevante resultaten te bekomen. Aan de hand hiervan wordt dus besloten om meer of minder te verdunnen.
6. Fluorescentiemicroscopie na kleuring met DAF-2 DA Voor elke biomassa werden twee stalen van 30 mL genomen. Aan elk staal werd vervolgens 1 mL Krebs-Ringer-fosfaat buffer (KRP) toegevoegd met 10 µM 4,5-diaminofluoresceïne diacetaat (DAF-2 DA). De KRP buffer bestond uit 120 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 0,54 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 11 mM glucose, en 15,9 mM natriumfosfaat (pH 7,2). De biomassastalen werden vervolgens voor één uur geïncubeerd bij 37°C zodat DAF-2 DA doorheen de celmembranen kon diffunderen waarna het zich in de cellen zal omvormen tot het fluorescerende DAF-2 indien het reageert met NO. Tenslotte werd er per biomassa één staal gedurende 10 minuten doorborreld met NO, terwijl het andere deze behandeling niet onderging ter referentie. Alle stalen werden door middel van fluorescentiemicroscopie geanalyseerd. Hiervoor werd gebruik gemaakt van filterset Zeiss 38 met lichtstraal splitter FT495 en een afstelling van excitatie en emissie golflengtes van respectievelijk BP 470/40 en BP 525/50. Voor alle stalen werd een vergroting van x400 gebruikt en werd de sluitersnelheid gevarieerd tussen 1000x1000 µs en 1000x500 µs zodoende een goed zichtbaar resultaat te verkrijgen. Voor elke biomassa werd echter wel steeds een gelijke afstelling gebruikt teneinde een vergelijking te kunnen maken met het referentiestaal. 25
Deel 2
Materiaal en methoden
7. Analytische methoden 7.1. Ammonium 7.1.1. Teststrip Een indicatie van het ammoniumgehalte werd gemeten met behulp van teststrips voor ammonium (Merck), met een meetbereik tussen 10 en 400 mg NH4+ L-1 of 7,8-310 mg N L-1. 7.1.2. Colorimetrisch Deze methode voor de bepaling van het ammoniumgehalte is gebaseerd op NBN T 91-251: Wateranalysemethoden: Bepaling van ammoniakale stikstof. Rechtstreekse fotometrische methode met Nessler reagens, 1977. In een eerste stap worden interfererende elementen, zoals mangaan en ijzer, gecapteerd door KNa-tartraat (KNaC4H4O6.4H2O). Vervolgens wordt het Nessler reagens toegevoegd. Deze alkalische oplossing met HgI42--ionen vormen met ammonium een geel gekleurd complex. De intensiteit van de gele kleur is recht evenredig met de concentratie aan ammonium in het staal. De gebruikte spectrofotometer was een Biochrom WPA Lightwave II (Biochrom Ltd, Cambridge, UK). Er werd gemeten bij een golflengte van 425 nm en bij een meetbereik van 0 tot 5 mg NH4+-N L-1. Sommige organische alifatische of aromatische componenten zoals amines, chlooramines, hydrazines, aldehyden, … kunnen voor interferenties zorgen.
7.2. Nitriet 6.2.1. Teststrip Een indicatie van het nitrietgehalte werd gemeten met behulp van teststrips voor nitriet (Merck), met een meetbereik tussen 2 en 80 mg NO2- L-1 of 0,61-24 mg N L-1. 7.2.2. Ionenchromatografisch De exacte concentratie van nitriet werd bepaald via een ionenchromatograaf (IC). De gebruikte IC was een 761 Compact IC (Metrohm) met een anionenkolom (Metrosep A Supp 5-150) beschermd door een voorafgaande guard kolom (Metrosep A Supp 4/5 Guard). De detectie gebeurt via een geleidbaarheidsmeting. De oppervlakte onder de nitrietpiek is proportioneel met de nitrietconcentratie in het staal. Het meetbereik bedroeg 0,05-100 mg NO2- L-1, wat overeenkomt met 0,015-30 mg N L-1. Gekleurde oplossingen en oplossingen met ijzer en aluminium (aantasting kolom) werden vermeden omwille van interferenties.
26
Deel 2
Materiaal en methoden
7.2.3. Spectrofotometrisch: Montgomery De nitrietbepaling is gebaseerd op de Montgomery reactie. Hierbij wordt gebruik gemaakt van 2 reagentia. Reagent A werd verkregen door oplossen van 27,2 g KHSO4 en 3,46 g sulfanilzuur in 1 liter gedestilleerd
water.
Reagent
B
werd
verkregen
door
oplossen
van
0,4
g
N(1-naphtyl)ethyleendiaminehydrochloride in 1 liter gedestilleerd water. In een 96-well plaat werd 200 µl verdunning en 50 µl reagent A toegevoegd. Dit werd 15 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na incubatie werd 50 µl reagent B toegevoegd, en werd de well plaat 30 minuten geïncubeerd in een donkere omgeving. De absorbantie werd gemeten bij 540 nm. Een callibratiecurve werd opgesteld met een stockoplossing van 100 mg N/L. Hiervoor werd 0,0493 g NaNO2 opgelost in 100 ml gedestilleerd water. Een standaardreeks werd opgesteld van 0,0001 mg N/L tot 1 mg N/L.
7.3. Nitraat Nitraat werd bepaald met een IC, zoals nitriet. Het meetbereik bedroeg 0,05-100 mg NO3− L-1 of 0,011-23 mg N L-1.
7.4. Zuurtegraad De pH werd potentiometrisch bepaald door middel van een draagbare, digitale pH meter (C532 van CONSORT). Kalibratie gebeurde met standaardbufferoplossingen van pH 7 en 10.
7.5. Opgeloste zuurstof Het gehalte aan opgeloste zuurstof (dissolved oxygen, DO) werd gemeten met een draagbare, digitale zuurstofmeter (HACH HQ30d) waarbij het DO-gehalte uitgedrukt werd in mg O2 L-1.
7.6. Zwevende stof: TSS en VSS Het totaal gehalte aan stoffen in suspensie (TSS) werd bepaald door een gekend volume staal 10 minuten te centrifugeren bij 11840 g. Het supernatans werd gedecanteerd, het residu werd overgebracht in een porseleinen kroesje en gedurende 24 uren gedroogd bij 105°C. Het gewicht van de overblijvende stof is het TSS gehalte. Vervolgens werd het kroesje gedurende twee uur in een moffeloven verast bij 600°C. Het gewichtsverschil tussen voor en na verassen, is een maat voor het gehalte aan vervluchtigbare stoffen in suspensie (VSS).
27
3. Deel 3: Resultaten 1. Batchtesten met wasflessen Ondanks dat NO een slechte oplosbaarheid heeft in water (Henry-coëfficiënt van 0,0019 M atm-1) werd er getracht om met deze batchtesten reeds een eerste indicatie te verkrijgen over de inhibitie van NOB-activiteit bij verschillende soorten biomassa. Om het contact tussen de biomassa en NO te maximaliseren werd in deze testen een zo groot mogelijke biomassa concentratie gebruikt, verkregen door een concentratiestap indien mogelijk (Tabel 3.1). Tabel 3.1: Gemiddelde VSS-gehalten voor de gebruikte types biomassa in de verschillende wasfles batchtesten.
Gemiddelde VSS gehalte (g VSS L-1)
ABIL (industrieel)
OLAND (RBC)
DANIS (Mestverwerking)
Actief slib (RWZI)
6,44 ± 0,68
12,94 ± 3,42
2,00 ± 0,26
7,02 ± 0,66
In Tabel 3.1 kan waargenomen worden dat er een degelijk verschil was tussen de verschillende types biomassa op basis van VSS-gehalte. Dit was namelijk afhankelijk van de verhouding tussen biomassa en buffer, de bezinkbaarheid van het slib, de partikelgrootte en dergelijke meer. De grotere foutenmarge bij de OLAND biomassa was te wijten aan het feit dat deze biomassa visueel reeds grote verschillen vertoonde in vlokvorming en vlokgrootte waardoor een exact gelijke verdeling over de wasflessen bemoeilijkt werd.
1.1. Controle van de opstelling voor batchtesten met bellenbeluchting NO (100 ppmv) werd in contact gebracht met de biomassa door een bellenbeluchting. Als referentie werd er gebruik gemaakt van een tweede wasfles waaraan N2 gas werd toegevoegd. Aan beide wasflessen werd ook een hoeveelheid lucht toegevoegd om het DO-gehalte voldoende hoog te houden en het effect van anoxische condities te vermijden. Voorafgaand aan de inhibitietesten werd er een indicatieve test uitgevoerd waarin de DO opgevolgd werd bij een toediening van 0,5 L min-1 gecomprimeerde lucht en 0,75 L min-1 N2. Deze verhouding van 2:3 bleek een DO gehalte van 4 g L-1 te leveren, wat hoog genoeg is om anoxische effecten uit te sluiten (Figuur 3.1).
28
Resultaten
Zuurstofconcentratie (mg O2 L-1 )
Deel 3
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tijd (uur)
Figuur 3.1: Opvolging zuurstofconcentratie in een wasfles met 100 mL gebufferde biomassa (zonder substraat) voorzien van 0,5 L min-1 gecomprimeerde lucht en 0,75 L min-1 N2 door middel van een beluchtingsteentje.
De sprong in zuurstofconcentratie rond 0,2 uur was te wijten aan een kleine verandering in het toegediend debiet. Het valt echter op te merken dat het DO-gehalte zich na enige tijd terug stabiliseert naar het gewenste niveau.
1.2. NO-visualisatie in de cellen Met het celpermeabele 4,5-Diaminofluorescein diacetaat (DAF-2 DA) kan stikstofmonoxide in vivo gevisualiseerd worden aan de hand van fluorescentiemicroscopie. DAF-2 DA zal na incubatie in de cel worden omgezet tot DAF-2. In de weinige literaire werken die hierover te vinden zijn, wordt deze techniek echter gebruikt om NO productie te meten in cellen, waarbij DAF-2 in respectievelijke cellulaire ruimten direct zal binden met het geproduceerde NO om zo het fluorescerende DAF-2 triazol te vormen. In dit werk werd er getracht deze theorie toe te passen op cellen waar er NO opname plaats zou vinden in plaats van NO productie. Hierdoor kan gesteld worden dat deze test in dit onderzoek eerder de functie heeft om de methode te testen die NO opname in vivo zou kunnen visualiseren. De resultaten worden weergegeven in Figuur 3.2. Voor de vier gebruikte types biomassa worden telkens twee figuren getoond waarbij de linkse figuur de controle is zonder NO flushing en de rechtse figuur 10 minuten geflusht werd met 100 ppmv NO. Uit de figuren kan een indicatie worden afgeleid van een hogere fluorescentie na toediening van NO aan de geïncubeerde cellen (Figuur 3.2: Actief slib (RWZI)). Doch is dit resultaat zeker nog niet als eenduidig te beschouwen vanwege de zichtbare ruis op alle figuren veroorzaakt door achtergrondfluorescentie en de zichtbaar felle anorganische fluorescenties (Figuur 3.2:
OLAND slib). Extra inspanningen in dit
onderzoeksdomein zouden de eerste indicatie van deze testen kunnen bevestigen na verdere optimalisatie van het gebruikte protocol.
29
Deel 3
Resultaten
ABIL
25 µm
25 µm
25 µm
25 µm
25 µm
25 µm
OLAND slib
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
25 µm
25 µm
Figuur 3.2: Foto's van fluorescentiemicroscopie gebruikmakend van de filter set Zeiss 38 na incubatie met DAF-2 DA. Linkse panelen: controle waarbij geen NO werd toegevoegd; rechtse panelen: biomassa na 10 minuten geflusht te zijn met NO. De waargenomen fluorescentie is toe te wijten aan de excitatie van DAF-2 triazol, gevormd na intracellulaire reactie van DAF-2 DA met NO. Voorts zijn anorganische verbindingen verantwoordelijk voor de zeer felle, sterk afgelijnde fluorescenties.
30
Deel 3
Resultaten
1.3. Inhibitietesten Om een eerste inzicht te verkrijgen omtrent de inhibitie van NOB door NO, werden er in totaal vier verschillende soorten biomassa getest, namelijk ABIL (nitrificerende bacteriële mengcultuur verkregen bij Avecom), OLAND-biomassa (afkomstig van een rotating biological contactor of RBC op 15°C), actief slib (rechtstreeks bekomen uit het aeroob bekken van een waterzuiveringsinstallatie, Aquafin te Oudenaarde) en DANIS slib (nitrificerend slib uit een mestverwerkingsproces van het bedrijf DANIS). Elke biomassa werd getest door gebruik te maken van twee wasflessen, elk met een toediening van een ander gas, respectievelijk een mengsel van NO en lucht en een mengsel van N2 en lucht. Tijdens elke test werden stalen genomen om de concentratie NO2- te bepalen in functie van de tijd (Figuur 3.3). 16 14
mg NO2-N (g VSS)-1
12 10
ABIL
8
ACTIEF SLIB
6
NO-behandeling
4
N2-behandeling
2 0 0
0,5
1
1,5
2
Tijd (uur) 12
mg NO2-N (g VSS)-1
10 8 DANIS
6
OLAND RBC
4
NO behandeling
2
N2 behandeling
0 0
0,5
1
1,5
2
Tijd (uur) Figuur 3.3: Controle van de lineariteit van de metingen tijdens de wasfles batchtesten voor de verschillende behandelingen en types biomassa. Elke curve had een lineaire fitting met een R² ≥ 0,99.
Uit Figuur 3.3 blijkt dat de nitrietverwijdering tijdens de testen lineair was en dat er dus geen substraatlimitatie was. Hierdoor kunnen de verwijderingssnelheden per test berekend worden door 31
Deel 3
Resultaten
de helling van de curve te berekenen indien de concentratie wordt uitgezet tegenover de tijd. Tijdens de testen werden ook de concentraties nitraat gemeten. Deze resultaten toonden aan dat de stikstofbalans gedurende de testen steeds in evenwicht was en deze voor 90% gesloten kon worden. Vanwege de hogere betrouwbaarheid van de nitrietmetingen werd echter geopteerd om verdere berekeningen te baseren op de nitrietgehaltes. Per biomassa werden er drie testen uitgevoerd om de gebruikte methode en bekomen resultaten te kunnen verifiëren. Per test werd er in een wasfles, met 100 mL gebufferde biomassa, een bepaalde concentratie nitriet toegevoegd welke afhankelijk was van de activiteit van de biomassa (Tabel 2.1). Per test werd er gewerkt met twee gelijke wasflessen waarvan er één belucht werd met een mengsel van lucht en NO (100 ppmv), terwijl de andere als referentie belucht werd met een mengsel van lucht en N2. De resultaten van beide wasflessen werden telkens ten opzichte van elkaar vergeleken om een indruk te krijgen van de inhibitie per test door middel van toediening van NO (Figuur 3.4). 1)
2)
ABIL
30
mg N-NO2 (g VSS)-1 d-1
mg N-NO2 (g VSS)-1 d-1
400 300 200 100 0
TEST 1
3)
TEST 2
20
10
0
TEST 3
TEST 1
4)
DANIS slib
TEST 2
TEST 3
Actief slib (RWZI) 80
mg N-NO2 (g VSS)-1 d-1
50
mg N-NO2 (g VSS)-1 d-1
OLAND slib
40 30 20 10 0
TEST 1
TEST 2
TEST 3
60 40 20 0
TEST 1
TEST 2
TEST 3
Figuur 3.4: Absolute snelheden van nitrietconsumptie door verschillende types biomassa, telkens voor de behandeling met N2 (zwart) en de behandeling met NO (grijs) per test. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de absolute snelheden. De test met ABIL aangeduid met zwarte ster werd uitgevoerd met verse biomassa. (n=3)
32
Deel 3
Resultaten
Uit Figuur 3.4 kan er besloten worden dat er door middel van NO-toediening inhibitie optrad bij de omzetting van nitriet naar nitraat bij bepaalde types biomassa. Uit deze figuur conclusies trekken of vergelijkingen maken tussen testen en de types biomassa onderling is echter moeilijk vanwege de ongelijkheid in activiteit, VSS-gehalte en andere variabele parameters. Omdat de wasfles met N2behandeling in elke test als referentie geldt voor nitrietconsumptie, kan er weliswaar gewerkt worden met relatieve snelheden waarbij telkens de verhouding van snelheden wordt genomen ten opzichte van deze referentiewasfles. Dit wordt getoond in Figuur 3.5. Door middel van deze weergave kan ook eenvoudig een bepaald inhibitiepercentage worden afgeleid per test. 1)
2)
ABIL
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
OLAND slib
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 TEST 1
3)
TEST 2
TEST 3
TEST 1
4)
DANIS slib
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
TEST 2
TEST 3
Actief slib (RWZI)
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 TEST 1
TEST 2
TEST 3
TEST 1
TEST 2
TEST 3
Figuur 3.5: Relatieve snelheden van nitrietconsumptie door verschillende types biomassa, telkens voor de behandeling met N2 (zwart) en de behandeling met NO (grijs) per test. De waarden zijn relatief ten opzichte van de referentiewasfles met N2-behandeling. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de relatieve snelheden die getoond worden en zijn de verwerkte standaarddeviaties op de snelheden zelf. (n=3)
De inhibitie die kan worden waargenomen in Figuur 3.5 is duidelijk niet gelijk voor alle types biomassa (van 24% voor ABIL tot 61% voor DANIS slib) of zelfs onbestaande indien er gekeken wordt naar Figuur 3.5.4 waar de resultaten van actief slib worden weergegeven (0% inhibitie). De inhibitie zal met andere woorden afhankelijk zijn van intrinsieke parameters van de biomassa, rekening houdend met het feit dat externe parameters en/of andere inhibitiefactoren (DO, pH, temperatuur) steeds gelijk en optimaal zijn gehouden tijdens alle verschillende testen. 33
Deel 3
Resultaten
2. Continue nitrificerende MABR Door middel van een continue membraangeaereerde biofilmreactor (MABR) werd er getracht om het effect van NO op de activiteit van NOB te testen bij een verhoogd contact tussen het slecht oplosbare NO en de biomassa. Door de relatief lage oplosbaarheid van NO in waterige media was het contact tussen NO en de nitrificerende biomassa in de wasflestesten wellicht suboptimaal. Doch werden hier al enkele opmerkelijke resultaten bekomen. Om de slechte oplosbaarheid te overkomen en aldus het effect van NO op NOB, dat werd geanalyseerd in de wasflestesten, te bevestigen of zelfs te versterken, werd geopteerd voor membraanaeratie. Er werd gebruik gemaakt van een reactor met drie parallelle stroomcellen om simultaan drie verschillende behandelingen (lucht, N2 en NO) te kunnen testen. Hiervoor bestond de opstelling uit drie influentvaten, waaruit het influent naar de recirculatievaten van de respectievelijke cellen werd gepompt, terwijl een tweede pomp zorgde voor een continue recirculatie van het medium in de recirculatiecellen doorheen de cellen. In elke cel werden twee siliconetubes gespannen, welke permeabel is voor de gebruikte gassen. Indien de biomassa bijgevolg op de tubing groeit als een biofilm, wordt het contact tussen NO en de NOB bevorderd. Omdat dergelijke biofilm traag opgroeit en de NOB daarenboven een geleidelijke activatie ondergaan wat nitrietconsumptie betreft, werd een stabilisatieperiode in acht genomen (Figuur 3.6) zodoende de performantie van elke cel kon opgevolgd worden. 200
mg N-NO2 L-1 d-1
150 CEL 1
100
CEL 2 CEL 3
50
0 0
10
20
30 Tijd (dagen)
40
50
60
Figuur 3.6: MABR performantie voor nitrietconsumptie. In deze figuur worden enkele selectieve waarden weergegeven van de nitrietconsumptie per dag. Elk van de cellen werd geïnoculeerd met ABIL en pH en DO werden ten allen tijde optimaal gehouden en waren respectievelijk ca. 7,5 en >8,0 mg O2 L-1.
Uit figuur 3.6 kan worden afgeleid dat de biomassa in de drie cellen de eerste dagen snel activeert tot een waarde van ca. 100 mg N-NO2- L-1 d-1. Daarna stijgt de nitrietconsumptie nog iets verder tot 34
Deel 3
Resultaten
ca. 130 mg N-NO2- L-1 d-1 in cellen 1 en 3. Cel 2 daarentegen heeft over het algemeen een lagere activiteit, maar blijft wel stabieler over de tijd. Voorts kan er worden opgemerkt dat er wel een fluctuatie optreedt in de snelheden binnen één enkele cel. Tenslotte moet worden bestempeld dat de snelheden op basis van liter zijn en niet op basis van VSS. Hierdoor kan er dus ook geen eenduidige vergelijking worden gemaakt tussen de cellen onderling omdat er variatie kan zitten op de hoeveelheid biomassa per cel. Na de stabilisatieperiode van ongeveer twee maanden werden enkele storingen aan de reactor opgemerkt. Om deze te kunnen oplossen, diende de reactorcellen kort geopend te worden. Hierbij viel echter op dat er na dergelijk lange periode nog steeds geen aangroei viel waar te nemen op de silicone tubings. De waargenomen verwijderingssnelheid van nitriet was bijgevolg toe te wijten aan de losse biomassa die in de cellen zelf werd weerhouden. Gegeven dat het bevorderde contact door middel van een biofilm van NOB op een membraan de grote drijfveer was van deze experimentele set-up werd dan ook besloten om niet verder te gaan met dit experiment in dergelijke opstelling.
3. Batchtesten met artificiële biofilm Om de waargenomen problemen van de MABR-opstelling te overkomen, werd naar een oplossing gezocht waarbij het verbeterde contact tussen NO en NOB nog steeds centraal stond. Omdat de biomassa echter geen drijvende factor ondervond om zich te hechten aan de silicone tubings, moest er een experimentele set-up worden gevonden waarbij de biomassa artificieel gefixeerd kon worden rondom de membranen. Deze oplossing werd gevonden door de biomassa te mengen met 1,5% natriumalginaat, waarna het biomassa-alginaat mengsel in een medium van 0,5 M CaCl2 rond de tubings kon worden gefixeerd. De werking van biomassafixatie door het gebruik van alginaat werd al eerder aangetoond onder de vorm van granules zonder dat deze negatieve effecten vertoonde op de activiteit van de biomassa. De membranen met de gefixeerde biomassa werd telkens in een open cel van 300 mL geplaatst waarna de cel zelf extern geaereerd werd om een verzadigde DO concentratie te behouden en geen zuurstoflimitatie te bekomen. Elke cel werd vervolgens door de membranen gevoed met een ander gas(mengsel). Zo werden vier verschillende behandelingen bekomen, namelijk N2, 100 ppmv NO, 50 ppmv NO en een cel waar er enkel extern geaereerd werd maar geen extra gasbehandeling werd toegepast. Gegeven dat het VSS gehalte in de cellen nauwelijks kon worden opgedreven omdat er slechts gewerkt werd met twee dunne biofilmmembranen per cel, werden de testen voor langere tijd gelopen dan de wasflestesten om toch een noemenswaardige verwijderingssnelheid te kunnen meten in de cellen. In Figuur 3.7 worden voor drie verschillende types biomassa de consumptiesnelheden van nitriet weergegeven, telkens voor de desbetreffende gasbehandeling. In deze testen werden slechts drie types biomassa getest, in tegenstelling tot de 35
Deel 3
Resultaten
hierboven vernoemde testen waar er telkens ook een experiment met het DANIS slib werd uitgevoerd. De reden hiervoor is dat deze experimenten op het einde van het onderzoek werden uitgevoerd en niet alle benodigde middelen nog voor handen waren binnen de gegeven tijdslimiet. 1) mg N-NO2 (gVSS)-1 d-1
ABIL 300 250 200 150 100 50 0 Zonder gasbehandeling
2)
N2
100 ppmv NO
50 ppmv NO
100 ppmv NO
50 ppmv NO
mg N-NO2 (gVSS)-1 d-1
OLAND slib 400 300 200 100 0 Zonder gasbehandeling
3)
N2
mg N-NO2 (gVSS)-1 d-1
Actief slib (RWZI) 35 30 25 20 15 10 5 0 Zonder gasbehandeling
N2
100 ppmv NO
50 ppmv NO
Figuur 3.7: Absolute snelheden van nitrietconsumptie door verschillende types biomassa die ingekapseld werden in een artificiële biofilm op basis van alginaat. Elke cel werd extern belucht zodat overal steeds een overmaat aan DO kon worden gemeten en voorts werd elke cel met respectievelijk niets, N 2, 100 ppmv NO en 50 ppmv NO behandeld door gastroughput via de membranen. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de absolute snelheden. (n=1)
Uit Figuur 3.7 kan, net als bij de batchtesten met wasflessen, worden afgeleid dat er een inhibitie van NOB optreedt, geïnduceerd door de toevoeging van NO. Deze inhibities zijn echter niet gelijk voor alle types biomassa en ook verschillen de absolute snelheden onderling tussen de gebruikte soorten 36
Deel 3
Resultaten
slib. De behandeling met 50 ppmv NO geeft geen eenduidig resultaat als we de verschillende testen met elkaar vergelijken. Enkel bij ABIL valt er een lichte inhibitie op bij de 50 ppmv NO-behandeling die zich lineair lijkt te verhouden tot de inhibitie met 100 ppmv NO en de referentiewasfles met N2behandeling. 1)
ABIL
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 N2
100 ppmv NO
2)
50 ppmv NO
OLAND slib
2,5 2 1,5 1 0,5 0 N2
3)
100 ppmv NO
50 ppmv NO
Actief slib (RWZI)
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 N2
100 ppmv NO
50 ppmv NO
Figuur 3.8: Relatieve snelheden van nitrietconsumptie door verschillende soorten biomassa die ingekapseld werden in een artificiële biofilm op basis van alginaat. Elke cel werd extern belucht zodat overal steeds een overmaat aan DO kon worden gemeten en voorts werd elke cel met respectievelijk niets, N 2, 100 ppmv NO en 50 ppmv NO behandeld door gasthroughput via de membranen. De waarden zijn relatief ten opzichte van de referentiewasfles met N2-behandeling. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer op de relatieve snelheden die getoond worden en zijn de verwerkte standaarddeviaties op de snelheden zelf. (n=1)
Om de testen eenvoudiger met elkaar te kunnen vergelijken, worden in Figuur 3.8 de resultaten weergegeven
relatief
ten
opzichte
van
de
referentiewasfles
met
N2-behandeling.
De
inhibitiepercentages voor de 100 ppmv NO-behandeling variëren van 20% voor ABIL tot 67% voor 37
Deel 3
Resultaten
actief slib van de waterzuiveringsinstallatie. Vooral dit laatste is opmerkelijk gezien dit slib in wasflestesten geen inhibitie vertoonde bij NO-toediening en een mogelijk effect van de wijze waarop NO in contact komt met de biomassa hier wordt aangetoond. Wat de 50 ppmv behandeling betreft is het moeilijk om sluitende conclusies te trekken. Bij ABIL wordt er een inhibitie waargenomen van 12% wat ongeveer lineair is met de 20% inhibitie van 100 ppmv NO. Daar er geen inhibitie valt waar te nemen bij de twee andere soorten slib, en er bij het OLAND-slib zelfs een hogere consumptiesnelheid valt waar te nemen dan bij de referentiecel, kan wel worden geopperd dat er voor elk slib een bepaalde drempelwaarde bestaat waarbij er al dan niet inhibitie optreedt. Het aantal geteste biomassa’s en gebruikte concentraties NO is echter veel te weinig om hierover verder uit te wijden in dit onderzoek.
4. Intrinsieke parameters van de types nitrificerende biomassa Om een vergelijking te kunnen maken tussen de verschillende types biomassa op vlak van inhibitie van nitrietconsumptie, dienen er nog enkele andere intrinsieke kenmerken bepaald te worden van de gebruikte soorten slib. Door middel van deze extra gegevens kunnen mogelijke correlaties tussen de verschillende eigenschappen onderzocht en met de literatuur vergeleken worden, alsook is er de mogelijkheid om met de resultaten van dit onderzoek eerder gemaakte hypotheses in het domein van NOB inhibitiefactoren te verklaren en/of te weerleggen met de theorie van NOB inhibitie door NO.
4.1. Bepaling KS nitriet Een eerste intrinsieke parameter die getest werd, was de affiniteit van een biomassa voor de opname van nitriet. Deze kan worden bepaald aan de hand van de KS waarde voor nitriet te berekenen per biomassa. De KS waarde is omgekeerd evenredig aan de affiniteit, waardoor dus gesteld kan worden dat een lagere KS waarde een hogere affiniteit voor het substraat, in dit geval nitriet, inhoudt. De KS waarde wordt conventioneel bekomen door de Michaelis-Mentenvergelijking te fitten, waarbij substraatconcentratie wordt uitgezet tegenover de reactiesnelheid (Figuur 3.9 en Figuur 3.10). Deze curve is echter zeer moeilijk te bekomen vanwege de steile helling in de lage range van substraatconcentraties, mede doordat er gewerkt wordt met verschillende soorten biomassa en er per biomassa ook verschillen optreden in VSS concentraties en absolute consumptiesnelheden, waarvoor er per batchtest met een ander substraatconcentratie moet gecorrigeerd worden. Echter zullen er steeds kleine fouten in de resultaten sluipen bij elke vorm van behandeling en analyse. Deze fouten zijn echter nefast bij het fitten van dergelijk steile curve.
38
Deel 3
Resultaten
𝑉 = 𝑉𝑚𝑎𝑥
[𝑆] 𝐾𝑆 + [𝑆]
KS
Figuur 3.9: Theoretische Michaelis-Menten curve en vergelijking met hypothetische waarden voor reactiesnelheid en substraatconcentratie. Vmax staat voor de maximale reactiesnelheid, [S] voor de substraatconcentratie en K S voor de intrinsieke constante voor de beschouwde reactiekinetiek.
Hierdoor werd er gewerkt volgens een omgekeerde redenering van de Michaelis-Menten theorie. De halve maximale nitriet consumptiesnelheid kon bekomen worden uit de eerder uitgevoerde batchtesten met wasflessen. Indien er continu nitriet gevoed wordt aan de biomassa aan deze halve maximale snelheid zal de biomassa in een soort van evenwicht geraken. Ze zullen namelijk net evenveel verbruiken als dat er continu wordt bijgespiked. De genomen stalen doorheen de test zullen dan ook rond één evenwichtswaarde schommelen wat nitrietconcentratie betreft. Deze constante nitrietconcentratie wordt volgens de theorie dan ook beschouwd als de KS waarde voor nitrietconsumptie voor de betreffende biomassa. De resultaten van deze testen worden weergegeven in Figuur 3.10, de effectieve KS waarden staan samengevat in Tabel 3.2. Uit Figuur 3.10 blijkt allereerst de correctheid van de gebruikte methode. Telkens werd de achterliggende theorie bevestigd en begonnen de nitrietconcentraties na stabilisatie te fluctueren rond één constante waarde. Dit werd bovendien extra bevestigd door enkele experimenten waarbij de halve maximale consumptiesnelheid werd onderschat of overschat, hierbij ging de nitrietconcentratie na enige tijd respectievelijk naar nul of bleef ze stijgen. Uit Tabel 3.2 valt de hoge affiniteit van DANIS slib voor nitriet af te leiden, terwijl ABIL duidelijk de laagste affiniteit heeft.
39
Deel 3
Resultaten
2)
ABIL
OLAND slib
2
0,8
1,5
0,6
mg N-NO2 L-1
mg N-NO2 L-1
1)
1 0,5
0,4 0,2
0
0 0
2
4
0
1
Tijd (uur)
3
4
3
4
Tijd (uur)
4)
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
0,08
4
0,06
3
mg N-NO2 L-1
mg N-NO2 L-1
3)
2
0,04 0,02
2 1 0
0 0
2
0
4
1
2 Tijd (uur)
Tijd (uur)
Figuur 3.10: Nitrietconcentraties over tijd tijdens de KS bepalingstesten. Door middel van een constante voeding aan de halve maximale nitriet consumptiesnelheid van de betreffende biomassa werd uiteindelijk een fluctuatie rond een constante nitrietconcentratie vastgesteld. Deze concentratie is bijgevolg de K S waarde voor nitrietconsumptie voor de betreffende biomassa.
Tabel 3.2: KS waarden voor nitriet consumptie van de verscheidene types biomassa. Deze waarden zijn bekomen door het gemiddelde te berekenen waarrond de nitrietconcentratie uiteindelijk fluctueert bij de bepalingstesten (Figuur 3.10). De standaarddeviaties zijn steeds de fout op dit berekende gemiddelde.
KS nitriet (mg N-NO2- L-1)
ABIL
OLAND slib
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
1,50 ± 0,09
0,36 ± 0,02
0,059 ± 0,007
0,7 ± 0,1
4.2. Ratio Nitrospira/Nitrobacter Een tweede intrinsieke parameter van de gebruikte types biomassa die bepaald werd, was de verhouding Nitrobacter ten opzichte van Nitrospira. Dit werd bekomen door van elke gebruikt slib tijdens de batchtesten met wasflessen een extra biomassastaal te nemen en hierop een DNA extractie en kwantitatieve PCR (qPCR) uit te voeren. De uiteindelijke concentraties NOB werden bekomen door SYBR® Green chemistry qPCR toe te passen op de biomassastalen, welke specifiek gericht was op het determineren van respectievelijk het Nitrobacter 16S rRNA gen en het Nitrospira 16S rRNA gen. De uiteindelijke resultaten van de qPCR werden tenslotte gecorrigeerd voor het VSS 40
Deel 3
Resultaten
gehalte om uiteindelijke waarden te verkrijgen waarbij het aantal 16S kopieën per g VSS worden getoond (Figuur 3.11). 1,E+09 1,E+08
16S kopieën (g VSS)-1
1,E+07 1,E+06 1,E+05
Nitrobacter
1,E+04
Nitrospira
1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E+00 ABIL
OLAND slib
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
Figuur 3.11: Aantal 16S rRNA kopieën voor respectievelijk Nitrobacter en Nitrospira bepaald via qPCR en dit per biomassa. De resultaten zijn op basis van VSS gehalte, welke afkomstig is van de batchtesten met wasflessen (Tabel 3.1). De waarden zijn bekomen aan de hand van een qPCR analyse gebruik makend van SYBR® Green chemistry. Het protocol is voor elk staal in triplicaat uitgevoerd waarvan vervolgens het gemiddelde is genomen. De weergegeven foutenvlaggen zijn bijgevolg de standaarddeviatie op dit gemiddelde.
Om in het verdere vervolg van dit werk met effectieve en eenduidige waarden te kunnen werken omtrent de ratio Nitrobacter/Nitrospira werd het logaritmische verschil (∆log) berekend tussen beide soorten NOB per biomassa. Deze resultaten worden samengevat in Tabel 3.3. Tabel 3.3: Het verschil tussen het logaritme van het aantal kopieën voor Nitrobacter en het aantal kopieën voor Nitrospira per biomassa. De resultaten zijn bijgevolg gebaseerd op Figuur 3.11, alsook de gegeven standaarddeviaties.
∆log(Nitrobacter/Nitrospira)
ABIL
OLAND slib
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
1,8 ± 0,4
-1,91 ± 0,02
-1,16 ± 0,04
0,4 ± 0,2
Uit Figuur 3.11 en Tabel 3.3 kan worden afgeleid dat de gekozen types biomassa een grote verscheidenheid hebben in termen van totale NOB-gehalten alsook in verhouding Nitrobacter ten opzichte van Nitrospira. De totale NOB waarden variëren van (2,9 ± 0,1).105 16S kopieën (g VSS)-1 voor ABIL tot (1,03 ± 0,04).108 16S kopieën (g VSS)-1 voor OLAND slib. ABIL vertoont verder ook het grootste relatieve gehalte aan Nitrobacter terwijl OLAND slib het meeste Nitrospira bevat relatief ten opzichte van het totaal aantal NOB in het betreffende slib. Deze verschillen in Nitrobacter en Nitrospira tussen de verschillende soorten biomassa, weergegeven als ∆log in Tabel 3.3, kunnen van groot belang zijn voor de mogelijke correlaties en conclusies van dit werk omdat in dit
41
Deel 3
Resultaten
onderzoeksdomein momenteel enkel hypotheses rond Nitrobacter gemaakt zijn, en dit terwijl Nitrospira de meest voorkomende NOB is in waterzuiveringen.
4.3. Partikelgrootte distributie Een laatste parameter die werd bepaald om de types biomassa onderling te vergelijken was de partikelgrootte distributie. Door dergelijke distributies te bepalen, konden ook verschillende statistische diameterwaarden bekomen worden, welke van belang kunnen zijn voor conclusies rondom de eerder bepaalde KS-waarden. Deze KS-waarden kunnen immers mogelijk gecorreleerd worden aan diffusielimitaties van substraat, welke dan weer gelinkt kan zijn aan grotere partikels of vlokken. Om bijgevolg zeker te zijn van de intrinsiekheid van de affiniteiten van de NOB voor nitriet werd deze analyse uitgevoerd. De analyse werd uitgevoerd door een Malvern Mastersizer S welke gebruik maakt van het Small Angle Laser Light Scattering (SALLS) principe. Voor alle vier de soorten
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
ABIL OLAND slib Actief slib (RWZI) DANIS slib
0,06 0,09 0,15 0,23 0,36 0,58 0,91 1,44 2,28 3,60 5,69 9,00 14,22 22,49 35,56 56,23 88,91 140,58 222,28 351,46 555,71 878,68
Volume %
biomassa is deze distributie weergegeven in Figuur 3.12.
Partikelgrootte (µm) Figuur 3.12: Partikelgrootte distributies voor de vier gebruikte types biomassa weergegeven in de legende. De analyse werd uitgevoerd met een Mavern Mastersizer S en door middel van de theorie van Mie en/of Fraunhofer werd de output van de 64 aanwezige detectoren voor de verstrooide laserstraal omgezet tot de gegeven distributies waarbij de partikelgroottes (µm) worden uitgezet ten opzichte van het volumepercentage in het staal.
De resultaten uit Figuur 3.12 vertonen een normale distributie voor elke biomassa wat alvast de correctheid en bruikbaarheid van de methode en de resultaten bevestigd. Visueel blijkt ook reeds dat OLAND slib gemiddeld grotere partikels bevat, terwijl ABIL duidelijk een distributie heeft met kleinere partikels. Deze distributie is echter gebaseerd op gemeten partikelgroottes door middel van laserverstrooiing en is bijgevolg afhankelijk van de positie waarin de gegeven partikels op dat ogenblik de lens passeren. De computersoftware van het gebruikte apparaat is echter in staat om door de vele partikelmetingen van één enkel staal de gemiddelde omtrek-, oppervlakte-, volume-, en massagebaseerde diameters te berekenen welke als eenduidig getal eenvoudiger verder te gebruiken zijn dan een distributie. Deze verschillende diameters voor de vier types biomassa worden gegeven in Tabel 3.4. 42
Deel 3
Resultaten
Tabel 3.4: Door de software van Malvern Mastersizer S berekende diameters voor de vier gegeven soorten biomassa. Alle gegevens worden uitgedrukt in µm. D[1,0], D[2,1], D[3,2] en D[4,3] zijn respectievelijk de omtrek-, oppervlakte-, volume-, en massagebaseerde diameters.
ABIL
OLAND slib
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
D [4,3] (µm)
15,89
122,40
32,66
80,90
D [3,2] (µm)
2,43
53,64
14,53
22,72
D [2,1] (µm)
0,39
6,84
3,90
0,78
D [1,0] (µm)
0,22
1,52
1,56
0,25
De nummer-gewogen diameters, D[1,0], zullen voornamelijk de kleinere partikels benadrukken in de meting, terwijl de massa-gewogen diameters, D[4,3], de grotere partikels zullen benadrukken in de distributiemeting. De oppervlakte-gewogen en volume-gewogen diameters, respectievelijk D[2,1] en D[3,2] liggen hier logischerwijs tussen. D[1,0] kan worden beschouwd als de normale verwachte gemiddelde diameter waarbij alle gemeten diameters worden gedeeld door het aantal gemeten deeltjes. Het stelt dan ook de gemiddelde diameter voor van de partikeldistributies weergegeven in Figuur 3.12 zonder rekening te houden met de al dan niet scheve verdeling van de distributie. D[3,2] is nog een veel gepubliceerde diameter en wordt ook wel de Sauter-diameter genoemd en is dus de ratio tussen het volume en de oppervlakte van de deeltjes.
43
4. Deel 4: Discussie 1. NOB inhibitie door NO In eerder uitgevoerde onderzoeken werd reeds een inhibitie van NO op de activiteit van NOB bewezen. In Starkenburg (2008) werden er significante effecten waargenomen op de nitrietomzetting door NOB bij concentraties van 7 – 488 µg NO-N L-1. Dit, en andere onderzoeken, werden echter enkel specifiek uitgevoerd op Nitrobacter species terwijl in waterzuiveringsinstallaties vooral Nitrospira de overwegende NOB species zijn. Aangezien dit onderzoek zich focust op waterzuiveringstechnologie, bevond zich hier aldus een groot hiaat in de literatuur en diende er experimentele duidelijkheid geschept te worden rond het effect van NO op relevante nitrietoxiderende microbiële gemeenschappen. In de volgende paragrafen wordt de verwevenheid van de eerder getoonde resultaten geleidelijk aangetoond om een conclusie te kunnen vormen rond NOB inhibitie door NO en de afhankelijkheid van intrinsieke eigenschappen van een biomassa. Dit werd getest door gebruik te maken van twee verschillende contactmechanismen om NO in contact te brengen met het nitrificerende slib.
1.1. NOB inhibitie door middel van bellenbeluchting met NO 1.1.1. Experimentele optimalisatie Door middel van een eenvoudige bellenbeluchting in een beperkt volume biomassa werd er getracht een eerste indicatie te krijgen van mogelijke inhibitie van NOB door NO. Ondanks dat dit experiment louter indicatief bedoeld was, werd er toch enige aandacht besteed aan de experimentele opstelling omdat NO enkele eigenschappen heeft die in acht genomen moeten worden. Eerst en vooral heeft NO, met een Henry constante van 1,9×10-3 M atm-1 in water en bij standaard omstandigheden (25°C en 1 atm), een zeer hydrofoob karakter. Voorts is NO een zeer reactieve molecule die snel zal reageren met zuurstof om NOx moleculen te vormen. Doch moest er voor de werking van de nitrificerende biomassa ook voldoende zuurstof aanwezig zijn om hier geen limitatie te krijgen en een inhibitorisch effect te creëren die niet aan de toevoeging van NO is te wijten. Er werd bijgevolg gebruik gemaakt van enerzijds een toevoer gecomprimeerde lucht en anderzijds een toevoer van 100 ppmv NO, welke vlak voor de wasfles met biomassa werden samengevoegd. Om er zeker van te zijn dat de biomassa effectief gevoed werd met NO en niet met de reactieve NOx producten, werd eenmalig voor het experiment één gasstaal genomen rechtstreeks uit de toevoer van de gasfles (100
44
Deel 4
Discussie
ppmv NO) en één gasstaal nadat de mix van lucht en NO de opstelling had doorlopen zonder de aanwezigheid van biomassa. De verblijftijd van het gasmengsel in de opstelling was echter slechts 0,1 minuut bij de gekozen gasdebieten en de NO-meting van de gasstalen bevestigden dan ook dat dit te kort was voor de toegediende NO om een significante aantal reactieproducten te vormen. De gekozen ratio lucht ten opzichte van NO zorgde voor een DO gehalte van 4 mg L-1. Dit is een waarde die hoog genoeg geacht wordt om de NOB activiteit optimaal te stimuleren bij een maximale OUR (oxygen uptake rate) (Blackburne, Yuan et al., 2008). Alle parameters gekozen bij het toedienen van de verschillende gassen waren bijgevolg zo gekozen om de nitrietconsumptie door NOB te stimuleren waardoor de al dan niet waargenomen inhibitie van NOB enkel te wijten is aan de toevoer van NO. 1.1.2. Visualisatie NO opname door middel van fluorescentiemicroscopie Omdat NO slecht oplosbaar is in waterige media, kan er in deze testen dus geen eenduidige concentratie NO worden bepaald die de biomassa zou gevoeld hebben. De NO-verblijftijd in de wasflessen is immers niet voldoende om te bepalen met hoeveel NO de NOB exact in contact zijn gekomen. Om toch een bevestiging te hebben van NO-opname door desbetreffende cellen, werd geopteerd om fluorescentiemicroscopie toe te passen op de gebruikte types biomassa nadat deze werden geïncubeerd met DAF-2 DA en vervolgens geflusht werden met de NO gebruikt in de wasflestesten. DAF-2 DA is namelijk een celpermeabele, fluorescerende probe die intracellulair met NO zal reageren, en dit reeds bij concentraties van 3 nM NO (Kojima, Hirotani et al., 2001). De onderzoeken die reeds naar intracellulaire bio-imaging van NO zijn uitgevoerd zijn echter allen gericht op NO productie in de bacteriën. Deze NO productie zou gestimuleerd worden door stresscondities waarin de bacteriën vertoeven (Hierop wordt in sectie 4 van dit hoofdstuk nader ingegaan). Het protocol gebruikt in dit werk is aldus een eigen interpretatie van eerdere onderzoeken die gericht waren op NO productie om zo de NO opname door de cellen te visualiseren die extern werd toegediend door middel van bellenbeluchting. De resultaten weergegeven in Figuur 3.2 zijn niet van die aard dat er een eenduidige conclusie kan worden getrokken. Bij de referentiefoto van elke biomassa, waar er dus geen externe toevoeging van NO was, werd er ook steeds fluorescentie waargenomen. Het woord ‘extern’ in vorige zin kan echter van groot belang zijn. Alle soorten biomassa werden echter geactiveerd bij 20°C en hadden steeds substraat voor handen bij optimale condities. De mogelijkheid bestaat dus dat de biomassa tijdens de incubatie, die doorging bij 37°C en zonder substraat, NO geproduceerd heeft. Deze beperkte NO-productie kon, wegens de lage detectielimiet van de fluorescentie met DAF-2, reeds voldoende zijn om de ruis te induceren die op Figuur 3.2 (links) telkens is waar te nemen. Voor dit onderzoek is het dus niet mogelijk om reeds een kwantitatief besluit te vormen rond de hoeveelheid NO opname in de wasflestesten. Doch heeft DAF-2 het potentieel om NO opname, in plaats van NO productie, te visualiseren en dient 45
Deel 4
Discussie
fluorescentiemicroscopie de nodige aandacht te krijgen in dit onderzoek. Zo kan op een kwantitatieve en visuele manier bewezen worden dat extern toegevoegde NO, door bellenbeluchting, toch voldoende in contact komt met de daarvoor bedoelde micro-organismen om een effect te zien. 1.1.3. Inhibitie door NO De nitriet consumptiesnelheden die in Figuur 3.4 en Figuur 3.5 worden weergegeven voor de vier gebruikte types biomassa blijken wel degelijk negatief beïnvloed door de toediening van NO. Er is echter wel een groot verschil tussen de soorten biomassa onderling. Gegeven dat externe parameters constant werden gehouden doorheen de testen en tussen de testen onderling (temperatuur, pH, DO, ppmv NO, buffer, biomassavoorbereiding) dienen de waargenomen verschillen gewijd te worden aan intrinsieke verschillen tussen de types biomassa onderling. Een mogelijke hypothese omtrent NO als inhibitor die sinds de jaren ’90 wordt aangehaald in meerdere onderzoeken op moleculair niveau is dat NO in competitie zou treden met O2 voor binding op de heemstructuren in cytochroomcomplexen (Cooper, 2003). Doordat NO bindt aan deze structuren, kan er geen O2 meer binden. De binding zou wel reversibel van aard zijn maar de snelheden waarmee NO de binding breekt zijn vele malen lager dan de snelheden waarmee de binding wordt gevormd, respectievelijk 0,01 M-1 s-1 ten opzichte van 108 M-1 s-1 voor de binding van NO op een ijzerheem. Hierdoor verhoogt het dus rechtsreeks de KO2 van het complex. Deze theorie en het effect van NO op cytochroomcomplexen is echter wel afhankelijk van de soort van heemcomplex. Zo is er een bewezen verschil in inhibitorisch effect tussen koper- en ijzerhemen. NO zal namelijk veel sneller binden aan koper, doch is over deze binding veel minder gekend tot op heden dan over de binding met ijzerhemen. Ten slotte dient opgemerkt te worden dat NO een veel effectievere inhibitor is dan verklaard kan worden door enkel de competitie met O2 voor de binding op een ijzerheem. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat O2, in tegenstelling tot NO, niet geneigd is te binden met koper en NO als inhibitor dus voordeel kan halen uit bindingen met koper die in de cytochromen slechts 5 Å verwijderd zijn van de het ijzerheem. Deze bevoorrechte plaats zou NO een voordeel geven ten opzichte van O2 in hun onderlinge competitie (Torres, Darley-Usmar et al., 1995). Deze theorie kan van groot belang zijn om verder in dit werk de verschillende soorten biomassa met elkaar te kunnen vergelijken aangezien Nitrobacter en Nitrospira werken volgens een ander reactiemechanisme en met andere cytochromen. Een verschil in ratio Nitrobacter/Nitrospira tussen de gebruikte types biomassa zou dus een eerste verklaring kunnen zijn voor een verschil in inhibitie.
46
Deel 4
Discussie
1.2. NOB inhibitie door middel van membraanbeluchting met NO 1.2.1. MABR evaluatie Omdat reeds interessante resultaten bekomen werden bij de batchtesten met een bellenbeluchting van een slecht oplosbaar gas, werd er gezocht naar een experimentele opstelling waarbij NO gecontroleerd in beter contact gebracht zou kunnen worden met de biomassa en zo mogelijks ook een idee gevormd zou kunnen worden over de concentratie NO die de NOB effectief voelde. De oplossing hiervoor werd gevonden in het gebruik van permeabele membranen in een MABR waarbij de nitrificerende biomassa als een biofilm op de membranen groeit en de gassen door het membraan gevoed kunnen worden aan de reactor. Hierdoor zouden de toegediende gassen onvermijdelijk via de biomassa moeten passeren en zou de berekende hoeveelheid en concentratie aan toegediend gas ook effectief de belasting zijn voor de biomassa. Na een opstart- en stabilisatieperiode van twee maanden liep de reactor echter enkele problemen op waardoor hij voor het eerst sinds de opstart geopend diende te worden. Hierbij werd jammerlijk duidelijk dat er geen enkele biomassa aangroei was aan de membranen maar dat de biomassa los in de cel aanwezig was. Doordat dit niet geheel duidelijk kon opgevolgd worden buiten de reactor viel dit pas op te merken na dergelijk lange periode. Ondanks dat een biofilm steeds een lange opstart periode nodig heeft, zijn er toch twee mogelijke verklaringen die beide aan de basis kunnen liggen dat er geen aangroei was. Enerzijds werd als inoculum gekozen voor ABIL. Deze biomassa wordt industrieel geproduceerd en daar wordt deze gegroeid op calciumcarbonaatkorrel. Het is een biomassa die bijgevolg zeer snel bezinkt en geen enkele intrinsieke behoefte heeft om uit zichzelf een biofilm te gaan vorm. Anderzijds was er ook geen externe drijfveer waarom de biomassa alsnog tot een biofilm gedwongen zou worden omdat er op de membranen een constante druk stond en de biomassa als het ware van de tubing weggeduwd zou worden. Daarenboven werd er geopteerd voor een lage recirculatie waardoor er een minimale schuifspanning op de groeiende biofilm zou worden uitgeoefend, maar daardoor was er ook een te lage uitwassing van gesuspendeerd materiaal. Artificiële biofilm membranen op basis van alginaat konden hier een oplossing voor bieden, welke in de volgende paragraaf besproken worden. 1.2.2. Artificiële biofilm op alginaatbasis Om alsnog inhibitietesten te kunnen uitvoeren waarbij de NO-belasting exact gekend zou zijn, moest er worden afgestapt van het MABR-concept. De oplossing lag erin de biomassa te fixeren rondom de membranen zodat er een artificiële biofilm gevormd werd. Deze fixatie werd mogelijk door de biomassa te mengen met alginaat (1,5%) en dit mengsel, rond de silicone membranen, onder te dompelen in een CaCl2 medium. Reeds in 1987 werd het gebruik van alginaat voor fixatie van 47
Deel 4
Discussie
nitrificerende biomassa bewezen te werken (Lewandowski, Bakke et al., 1987). Dit echter wel steeds in de vorm van alginaat granules die vervolgens gebruikt werden in fluidized bed reactoren. In de jaren hierop volgend werden heel wat onderzoeken uitgevoerd naar hoe de kinetische parameters of reactiemechanismen
al
dan
niet
zouden
veranderen
bij
het
gebruik
van
dergelijke
immobilisatietechnieken. Omdat er een grote variatie is in gebruikte biomassa, randvoorwaarden, en dergelijke meer per test is het onmogelijk om een eenduidig kwantitatief antwoord te vinden op deze vraag. Wel zijn er twee algemene bemerkingen, enerzijds veranderen kinetische parameters niet significant ten opzichte van wanneer de biomassa gewoon (niet geïmmobiliseerd) gebruikt wordt, anderzijds moet wel rekening gehouden met de diffusie van substraten in de alginaatgranules of –membranen (Hill and Khan, 2008). Om bijgevolg waardevolle resultaten te verkrijgen bij experimenten waarbij de concentratie van een substraat in een medium wordt opgevolgd, dient er in acht genomen te worden dat het substraat dus eerst moet diffunderen in de alginaatmatrix en moet dus een stabilisatieperiode ingerekend worden. Dit kan praktisch gezien door een eerste staal niet in de berekeningen mee te nemen of door de tijdspanne tussen de twee eerste stalen zo groot te nemen dat de diffusiefase verwaarloosbaar klein wordt. Ook kunnen er gradiënten ontstaan van deze substraten of van bijvoorbeeld zuurstof doorheen de alginaatmatrix, waardoor de microorganismen verschillende effecten kunnen hebben naargelang waar ze zich in de matrix bevinden (Hill and Khan, 2008). In de praktijk heeft alginaat-immobilisatie, of geïmmobiliseerde nitrificerende biomassa in het algemeen, heel wat voordelen ten opzichte van gesuspendeerde ‘losse’ biomassa. Voorbeelden hiervan zijn hogere reactiesnelheden, lagere groeisnelheden, hogere cel concentraties, geen nood aan scheiding van verschillende cellen en de eliminatie van de mogelijkheid tot uitwassing van de biomassa. Anderzijds dient wel de bijkomende kost van de inkapseling in acht genomen te worden (van Ginkel, Tramper et al., 1983; Wijffels and Tramper, 1995; Aravinthan, Takizawa et al., 1998; Cao, Zhao et al., 2002; Yang, Cao et al., 2002). 1.2.3. Inhibitie door NO De inhibitietesten met de artificiële membranen tonen interessante resultaten (Figuur 3.7 en Figuur 3.8). Om de effecten van substraatdiffusie in de biofilms te kunnen verwaarlozen en een goed meetbare consumptiesnelheid te verkrijgen bij dergelijk lage VSS-gehaltes, werden de testen overnacht gelopen (ca. 20 uur). De verschillen die waar te nemen zijn tussen de verschillende types biomassa dienen, net als bij de batchtesten met wasflessen, verklaard te worden aan de hand van intrinsieke kenmerken omdat externe parameters steeds gelijk waren. De resultaten vertonen twee interessante gegevens, enerzijds ondervindt elke geteste biomassa een inhibitie geïnduceerd door 100 ppmv NO, anderzijds is er de behandeling met 50 ppmv NO die bij ABIL een lichte inhibitie 48
Deel 4
Discussie
induceert (13%) terwijl dit effect bij de andere twee soorten biomassa niet gezien kan worden. Voor de verklaring van de NOB inhibitie door NO wordt verwezen naar eerdere paragrafen in dit werk (Deel 1 sectie 4.2. en Deel 4 sectie 1.1.3.). Een bijkomend gegeven in deze test is wel de extra behandeling met 50 ppmv NO die gebruikt werd. Met deze behandeling werd getracht om de concentratieafhankelijkheid van de inhibitie te bepalen. Het gaat echter wel louter om een indicatie omdat er slechts met twee verschillende concentraties gewerkt werd, een echte correlatieanalyse is bijgevolg niet mogelijk. Uit Figuur 3.7 en Figuur 3.8 blijkt dat er een groot verschil is tussen de inhibitie-effecten van 50 ppmv NO ten opzichte van 100 ppmv NO, maar ook dat de types biomassa onderling verschillen in reactie op de 50 ppmv NO-behandeling. Uit het eerste feit kan worden geconcludeerd dat er voor inhibitie door een NO een bepaalde drempelwaarde bestaat. Deze drempelwaarde hangt onder andere af van de affiniteit voor NO dat de NOB in de betreffende biomassa bezitten alsook van andere intrinsieke parameters. Er kan bijgevolg besloten worden dat er wel degelijk een concentratieafhankelijkheid bestaat en dat deze niet lineair is maar dat de NOB een bepaalde minimale NO-concentratie moeten voelen vooraleer zij hier effect van gaan ondervinden. Deze minimumconcentratie hangt dan ook weer af van de gebruikte biomassa, wat wel te verwachten was na de eerder besproken inhibitie-effecten bij 100 ppmv NO.
1.3. Vergelijking NO contactmechanismen Het valt op te merken dat er, ondanks de verklaring van intrinsieke biomassaparameters die verder in dit werk nog volgt, ook een verschil is tussen de twee soorten batchtesten op vlak van inhibitiepercentages. Dit verschil is het grootst bij de resultaten van het actief slib afkomstig van de full-scale waterzuiveringsinstallatie waar er bij de wasflestesten geen inhibitie viel waar te nemen terwijl er bij de membraantesten een inhibitie van 67% werd bekomen. Bij de twee andere soorten slib, ABIL en OLAND, zijn de inhibitie-effecten echter van dezelfde grootte-orde bij beide experimenten. Hieruit blijkt de afhankelijkheid van het contactmechanisme bij de toediening van NO, maar deze afhankelijkheid is wel niet eenduidig voor alle soorten biomassa, of beter NOB. De verklaring hiervoor ligt waarschijnlijk in het verschil tussen toegediende concentratie NO en de concentratie NO die effectief de NOB bereikt. Naargelang hoe een vlokvorming tot stand komt in een biomassa of hoe de specifieke NOB in de vlokken of partikels geordend zijn, zullen zij minder in contact staan met concentraties NO in het medium (Zie verder, Deel 4, sectie 2.3. en sectie 3). Daarenboven moet de NO, maar ook de substraten zoals NO2- kunnen diffunderen in de vlokken en partikels. Door een verschillende ordening van micro-organismen zal ook deze diffusiesnelheid verschillen tussen de gebruikte types biomassa. Ten slotte dient nog opgemerkt te worden dat er een zeker affiniteit voor NO moet zijn welke afhankelijk is van de verschillende cytochroomcomplexen (Cooper, 2003) (Deel 4, sectie 1.1.3.). Deze verschillen zoals eerder vermeld ook per biomassa, met 49
Deel 4
Discussie
name door het verschil in ratio Nitrobacter/Nitrospira. Er is dus een verwevenheid van een viertal verschillende intrinsieke factoren die de opname van NO gaan beïnvloeden, en waarop het contactmechanisme al dan niet een invloed heeft. Om hierover kwantitatieve conclusies te trekken is haast onmogelijk omdat er voor correlatieanalyses veel meer gegevens nodig zijn voor elke parameter, namelijk meer soorten biomassa met verschillende ratio’s Nitrobacter/Nitrospira, vlokvorming, partikelgrootte, NO-affiniteit, enzoverder. Het besluit dat uit deze twee experimenten getrokken kan worden, is dat het van groot belang is om de inhibitor, hier dus NO, op een zo goed mogelijke wijze tot bij de te inhiberen organismen, hier NOB, te brengen. Enkel hierdoor zal de drempelwaarde voor NO-inhibitie overschreden kunnen worden omdat door de vele extra parameters het toegediende NO zeker niet gelijk is aan de NO concentratie die gevoeld wordt door de NOB. Voor sommige types biomassa blijkt aldus dat een conventionele bellenbeluchting met NO voldoende is, terwijl voor andere types biomassa dit ruim onvoldoende blijkt door de ordening van micro-organismen in het slib en de invloed van andere kinetische parameters.
2. Vergelijking intrinsieke parameters met literatuur Om verklaringen te vinden voor het verschil tussen de gebruikte types biomassa aangaande de inhibitie door NO, werden enkele intrinsieke parameters bepaald in dit onderzoek. Om de conclusies die hierover gemaakt zullen worden algemeen geldend te maken, wordt in deze paragraaf nagegaan of de bekomen waarden steeds van dezelfde grootte-orde zijn als dat gevonden kan worden in reeds gepubliceerde werken.
2.1. Ks waarden nitrietconsumptie NOB Een kinetische parameter die in dit werk werd bepaald, is de KS waarde van elke biomassa. Een KS waarde is een indicatie voor de affiniteit voor een bepaald substraat. Logischerwijs was het substraat hier nitriet omdat de activiteit, en dus affiniteit, van NOB bepaald werd. De KS waarde is de halfsaturatie constante van de organismen voor het betreffende substraat en is bijgevolg omgekeerd evenredig met de affiniteit, met andere woorden, hoe hoger de KS waarde hoe lager de affiniteit. KS waarden variëren echter erg naargelang gebruikte biomassa en er is dan ook geen eenduidige waarde te vinden in wetenschappelijke literatuur. Kinetische variaties hangen immers af van verscheidene randvoorwaarden zoals temperatuur, vlokgrootte, microbiële gemeenschap, competitie en/of inhibitie binnen deze microbiële gemeenschap, reactortype, enzoverder (Lackner and Smets, 2012). Er wordt wel geregeld gesproken van een bepaalde spreiding voor KS waarden van NOB. Deze range gaat van 0,2 mg N-NO2- L
-1
tot 6,0 mg N-NO2- L-1. Echter zijn ook op deze range
uitzonderingen te vinden welke vooral variëren op vlak van de ondergrens van 0,2 mg N-NO2- L -1. De waarden bekomen in dit werk, liggen op uitzondering van de KS waarde van het DANIS slib allemaal in 50
Deel 4
Discussie
de bovengenoemde range. DANIS slib zou echter een lagere KS waarde hebben dan algemeen terug te vinden in de literatuur. Enerzijds kan dit eenvoudig verklaard worden aan de hand van de uitzonderingen die in de lage range bestaan door een invloed die alle randvoorwaarden kunnen hebben op de KS waarde (Lackner and Smets, 2012). De afkomst van het DANIS slib kan hier bijgevolg een grote rol spelen. DANIS slib is van oorsprong een biomassa die gebruikt wordt voor mestverwerking. Mestverwerking heeft natuurlijk hele andere influentparameters (zeer hoge stikstof concentraties) dan een conventionele waterzuivering waardoor de microbiële gemeenschap in dergelijke biomassa zich ook volledig zal aangepast hebben. Voorts wordt de correctheid van de KS waarde van het DANIS slib ondersteund door de geïmplementeerde methode ter bepaling van de KS, die hier gebruikt werd. Deze methode blijkt immers, na de bevestiging van de theoretische achtergrond (Deel 2, sectie 3), KS waarden te geven die voor drie van de vier types biomassa perfect stroken met wat in de literatuur gevonden kan worden.
2.2. Ratio Nitrobacter/Nitrospira in praktijk gebonden biomassa De ratio Nitrobacter/Nitrospira die terug te vinden is in allerhande nitrificerende soorten slib hangt voornamelijk af van de oorsprong van de betreffende biomassa. Dit is zeer logisch, gegeven dat een microbiële gemeenschap zich (snel) zal aanpassen aan de omstandigheden. Elke specie heeft zijn optimale parameters waarbij het andere micro-organismen zal kunnen uitgroeien. Deze voordelen in competitie hebben alles te maken met affiniteit voor de gemeenschappelijke substraten, hier zuurstof en nitriet. Nitrobacter en Nitrospira verschillen hier in en hebben dus eigenlijk elk een aparte strategie om hun groei te optimaliseren. Voor deze strategieën wordt steeds verwezen naar K/r-strategie. Deze strategieën gelden niet enkel voor micro-organismen maar zijn er ook zeker op toepasbaar. Een K-strateeg zal vooral bij lage substraatconcentraties te vinden zijn waarbij het zeer zorgvuldig omspringt met de gegeven substraatconcentraties en dus zeer gericht en efficiënt is op de draagkracht van de nakomelingen in tegenstelling tot het aantal nakomelingen. Een r-strateeg is bijgevolg net het omgekeerde. Deze zal vooral gericht zijn op het aantal nakomelingen dat hij produceert, eerder dan op de kwaliteit van deze nakomelingen. Hierdoor vertoeft dergelijke strateeg vooral bij hoge substraatconcentraties om zich zo snel mogelijk te kunnen vermenigvuldigen generatie op generatie. Dit gegeven kan worden opgemerkt, aan de hand van affiniteiten en voorkomen in gekende processen met gekende influenten, dat Nitrobacter een r-strateeg is en Nitrospira een K-strateeg (Kim and Kim, 2006). Met deze theoretische achtergrond en door verschillende onderzoeken is het bijgevolg geweten dat Nitrospira de dominerende specie is in waterzuiveringsinstallaties vanwege de lage concentratie stikstof in het influent (Daims, Nielsen et al., 2000; Siripong and Rittmann, 2007). De resultaten die voortkomen uit de qPCR analyse in dit onderzoek (Deel 3, Figuur 3.11) bevestigen dit alles. De twee soorten biomassa die uit 51
Deel 4
Discussie
waterzuiveringsprocessen komen, actief slib van een volle-schaal RWZI en het OLAND slib, hebben beide een hogere concentratie Nitrospira ten opzichte van Nitrobacter. ABIL, welke industrieel (in het bedrijf Avecom) geproduceerd wordt bij hoge stikstofconcentraties, en DANIS slib, welk afkomstig is uit een mestverwerkingsbedrijf dat standaard zeer hoge concentraties aan stikstof verwerkt, vertonen beide een hogere concentratie Nitrobacter.
2.3. Partikelgrootte distributies van praktijk gebonden biomassa Partikelgroottes en de distributie daarvan zijn zeer specifiek voor elke biomassa. Hierdoor is het onmogelijk om effectieve waarden te vinden in de literatuur over de specifiek gebruikte types biomassa, het is zelfs zo dat er reeds een verschil kan zijn tussen twee identieke volle-schaal waterzuiveringsinstallaties die zich op een andere locatie bevinden. Wel kan via een logische beredenering de achterliggende verklaring van de verkregen resultaten in Figuur 3.12 en Tabel 3.4 gevonden worden. ABIL wordt bijvoorbeeld industrieel gekweekt op korrels van calciumcarbonaat. Hierdoor wordt een zeer losse biomassa verkregen met kleine, losse partikels die geen enkele drijfveer hebben om vlokken of biofilms te vormen. Omwille hiervan heeft deze biomassa de kleinste gemiddelde partikelgrootte van alle geteste soorten biomassa. De vlokvorming van een bepaald soort slib hangt overigens af van verschillende factoren zoals aantal en compositie van de extracellulaire polymeer substanties (EPS), kationen, microbiële gemeenschap en activiteit, en alle mogelijke interacties tussen deze parameters. De details over welke parameter de vlokstabiliteit al dan niet beïnvloed is dan ook niet volledig uitgeklaard (Wilén, Jin et al., 2003). De grotere partikels in het actief slib (RWZI) zijn het gevolg van de vlokvorming die algemeen voorkomt in volle-schaal waterzuiveringsinstallaties. Dat OLAND de grootste partikeldistributie heeft, kan het gevolg zijn van de oorsprong van deze biomassa. De gebruikte OLAND biomassa is immers afkomstig van een labscale rotating biological contactor waar de biomassa dus als een biofilm voorkomt.
3. Correlaties biomassakenmerken met inhibitiepercentage Om nu een vergelijking te kunnen maken tussen de inhibitiepercentages per biomassa bij de twee geteste contactmechanismen dienen alle intrinsieke parameters mee in acht genomen te worden. In Tabel 4.1 wordt een samenvatting gegeven van alle berekende parameters per biomassa. De vergelijking die enkel handelt over het verschil tussen de twee experimenten (bellenbeluchting of membraanbeluchting) kan terug gevonden worden in Deel 4, sectie 1.3. Verder in deze paragraaf wordt, indien niet nader verklaard, steeds het inhibitiepercentage bedoeld van de testen met membraanbeluchting. In deze testen was het contact tussen NO en de biomassa immers optimaler, wat het verschil verklaart bij de inhibitiepercentages van het slib afkomstig van de RWZI (Deel 4, sectie 1.3.). Enkel voor DANIS slib wordt er wel steeds verwezen naar de inhibitie bij bellenbeluchting 52
Deel 4
Discussie
wegens het ontbreken van gegevens van het andere experiment voor deze biomassa. Ook dient opgemerkt te worden dat de verder besproken correlaties gebaseerd zijn op eigen hypotheses van de waarden in Tabel 4.1 en gesteund door de theoretische literatuur. Vier gegevens per variabele zijn immers veel te weinig om effectief statistische correlatieanalyses op uit te voeren. Tabel 4.1: Samenvatting van de resultaten (Deel 3) van dit onderzoek. Voor uitleg over het bekomen van deze resultaten en extra info hierover wordt verwezen naar Deel 3 bij de desbetreffende secties.
Inhibitie bellenbeluchting (%) Inhibitie membraanbeluchting (%) KS nitriet (mg N-NO2- L-1) Delta log (Nitrobacter/Nitrospira) Sauter-diameter (µm)
ABIL
OLAND slib
DANIS slib
Actief slib (RWZI)
24 ± 6
39 ± 12
63 ± 12
0±0
20
44
N.A.
67
1,50 ± 0,09
0,36 ± 0,02
0,059 ± 0,007
0,7 ± 0,1
1,8 ± 0,4
-1,91 ± 0,02
-1,16 ± 0,04
0,4 ± 0,2
2,43
53,64
14,53
22,72
Een eerste correlatie die gevonden kan worden is deze tussen de KS waarden en de ratio Nitrobacter/Nitrospira. In Deel 4, sectie 2.2. werd namelijk al het verschil uitgelegd tussen K- en rstrategen en hoe Nitrobacter en Nitrospira zich hierin gedragen. Dit wordt in de resultaten bevestigd, zo valt een hoge KS waarde op indien er meer Nitrobacter aanwezig zijn in de biomassa. Dit is volledig in lijn met de theorie van de r-strateeg welke geen hoge affiniteit vertoont voor het substraat maar vooral gericht is op een groot aantal nakomelingen bij een hoge substraat concentratie. ABIL met het hoogst aantal Nitrobacter ten opzichte van Nitrospira heeft dan ook de laagste affiniteit, of anders gezegd de hoogste KS-waarde. Omdat de KS-waarde van een biomassa, zoals reeds enkele malen vermeld, sterk afhangt van heel wat andere factoren zoals temperatuur, vlokgrootte, microbiële gemeenschap, competitie en/of inhibitie binnen deze microbiële gemeenschap, reactortype, enzoverder (Lackner and Smets, 2012) werd er getracht enkele van deze parameters mee in beschouwing te nemen om hun invloed hiervan te kunnen visualiseren. Zoals in de alinea hierboven vermeld werd, is er een duidelijke correlatie tussen microbiële gemeenschap en de affiniteit. Een correlatie met de partikelgrootte is echter minder eenduidig en zo lijkt het dus dat de partikelgrootte, hierboven weergegeven volgens de Sauter diameter (gemiddelde diameter op volume-basis, D[3,2]), geen directe invloed heeft op de KS waarde. Door de grote afhankelijkheid van de microbiële gemeenschap kan er echter wel een vergelijking worden gemaakt tussen types biomassa met ongeveer dezelfde gemeenschap omdat het 53
Deel 4
Discussie
effect van de Sauter-diameter niet zal opwegen ten opzichte van het aantal Nitrobacter/Nitrospira. In dit geval zou dat dus een vergelijking zijn tussen OLAND- en DANIS-slib. Hierbij valt op dat bij een kleinere Sauter-diameter, een lager KS-waarde gevonden wordt (DANIS slib). Enerzijds is dit logisch omdat de substraten zich sneller tot in de partikels kunnen werken via diffusie en dus eigenlijk meer beschikbaar zijn. Anderzijds levert een vergelijking tussen slechts twee biomassa’s geen sluitend bewijs. Het testen van verscheidene gelijke microbiële gemeenschappen maar met bijvoorbeeld een verschillende vlokvorming zou hier een oplossing bieden, maar voor dit werk kan niet eenduidig gezegd worden dat de Sauter-diameter een rechtstreeks effect heeft op de intrinsieke KS-waarde van een biomassa. Tenslotte is er nog de belangrijke correlatie tussen intrinsieke parameters en het percentage inhibitie die meer inzicht kan verschaffen over hoe er een verschil kan optreden tussen de types biomassa bij de inhibitietesten. We gaan deze correlatie bespreken aan de hand van KS-waarden omdat de ratio Nitrobacter/Nitrospira hieraan rechtstreeks verbonden is en dat de Sauter-diameter hier geen effect op heeft. Een zeer opvallend resultaat is dat bij een hogere affiniteit er ook een hoger inhibitiepercentage valt op te merken. Hiervoor dient echter wel eerst een drempelwaarde overschreden te worden van de concentratie aan inhibitor. Als hiermee rekening gehouden wordt, valt immers op dat bij het experiment met de bellenbeluchting er geen drempelwaarde overschreden werd voor het actief slib (Deel 4, sectie 1.1.3.) maar dat er bij de andere drie soorten biomassa duidelijk meer inhibitie optreedt indien ze een lagere KS waarden hebben. Eens de drempelwaarde van NO is overschreden om inhibitie te induceren bij het actief slib van de RWZI (door middel van het experiment met membraanbeluchting) ondervindt ook deze biomassa een hoge inhibitie, nl. 67 %. Deze waarde ligt echter niet tussen de inhibitiewaarden van ABIL en OLAND slib, waar de KS zich wel tussen de KS waarden van deze twee types biomassa bevindt. In dit experiment is de correlatie bijgevolg niet zo eenduidig en kan het bijvoorbeeld zijn dat het contactmechanisme enige invloed heeft. Zo is een mogelijke verklaring dat de affiniteit belangrijkere invloed heeft als de inhibitor moeilijker tot bij de biomassa geraakt (bellenbeluchting) dan dat de inhibitor zich in een verzadigde hoeveelheid tussen de micro-organismen bevindt (membraanbeluchting). Om deze hypotheses statistisch te kunnen bevestigen dienen studies te worden uitgevoerd die slechts op één enkele correlatie gericht zijn waardoor er meer verschillende gegevens per variabele getest kunnen worden terwijl de andere variabelen constant gehouden worden.
54
Deel 4
Discussie
4. NO-inhibitie aan de basis van gekende inhibitiemechanismen Een zeer belangrijke en opmerkelijke hypothese die voortvloeit uit de resultaten van dit werk gecombineerd met de achterliggende theorie van gekende inhibitiemethoden voor NOB, is dat deze inhibitiemethoden allen gecorreleerd zouden kunnen worden aan de inhibitie door NO. Zo is het geweten dat NO wordt geproduceerd, al dan niet als tussenproduct, door alle microbiële protagonisten in nitrificerend slib (Kluyver and Verhoeven, 1954; Lipschultz, Zafiriou et al., 1981; Freitag and Bock, 1990; Kartal, Rattray et al., 2007). Door het gegeven dat NO productie van AOB sterk gestimuleerd wordt door stresscondities (Colliver and Stephenson, 2000) is het bijgevolg mogelijk dat de NOB inhibitie onder bepaalde omstandigheden terug te linken is aan inhibitie door NO.
4.1. Zuurstoflimitatie Een algemeen aanvaarde theorie die verklaart waarom AOB de competitie winnen van NOB bij lage DO concentraties, is dat deze laatste een lagere affiniteit hebben voor zuurstof (KO2, NOB = 2,2 mg NNO2- L-1, KO2,AerAOB = 0,6 mg N-NO2- L-1) (Lackner, Terada et al., 2008). Hierdoor zal bij een weloverwogen HRT bij een lage DO-setpoint de NOB worden uitgespoeld uit het systeem terwijl AerAOB deze uitwassing kunnen overleven door hun snelle groei. Het is echter ook geweten dat bij lage DO concentraties en hoge nitrietconcentraties AerAOB beduidend meer NO en N2O produceren (Colliver and Stephenson, 2000). Binnen deze stresscondities viel het des te meer op dat in het bijzonder de transiënte fasen rijk waren aan een emissie van beide gassen (Chandran, Stein et al., 2011). Een tweede gegeven dat eerder in dit werk al meermaals is aangehaald, is de afhankelijkheid van substraataffiniteit voor allerhande parameters. Eén van deze parameters was de aanwezigheid van inhibitoren en de competitie met andere actoren in de microbiële gemeenschap (Lackner and Smets, 2012). Hierdoor is het dus zeer plausibel aan te nemen dat de lagere affiniteit voor zuurstof van NOB gecorreleerd is aan de hogere NO productie van AerAOB. Een bijkomend argument is dat meestal een fluctuerende zuurstoftoediening wordt toegepast in plaats van een continue lage zuurstoftoediening. Deze keuze komt voort uit de conclusie van meerdere onderzoeken waarin geopteerd wordt dat fluctuerende zuurstoftoediening betere resultaten van NOB-uitwassing geeft dan de continue lage DO vanwege het aanpassingsvermogen van NOB aan stresscondities (Dotro, Jefferson et al., 2011). Deze afwisselende aeratie is echter ook de ultieme stressconditie om NO productie van AerAOB te stimuleren waardoor het dus niet ondenkbaar is dat NO-inhibitie mee aan de oorzaak ligt van de lag-fase die geïnduceerd wordt bij NOB bij dit aeratieregime. Die lag-fase is immers de algemeen aanvaarde verklaring voor de trage respons van NOB op veranderende zuurstofconcentraties (Jardin and Hennerkes, 2012). In een eerdere sectie (Deel 4, sectie 1.1.3.) werd 55
Deel 4
Discussie
reeds aangehaald dat de NO-inhibitie te wijten is aan een reversibele binding van NO aan cytochroomcomplexen van NOB maar dat deze reversibele reactie veel trager verloopt dan de eerste binding (Cooper, 2003), waardoor de lag-fase van NOB, bij fluctuerende aeratie met een lage DO setpoint, dus verklaard wordt door de NO-inhibitie.
4.2. Vrij ammoniak en vrij salpeterigzuur De twee niet-geïoniseerde vormen van ammonium en nitriet, namelijk vrij ammoniak (NH3) en salpeterig zuur (HNO2), hebben beide een inhiberend effect op zowel AerAOB als NOB. De sensitiviteit van deze twee soorten protagonisten is echter verschillend zoals weergegeven in Tabel 1.3. Uit deze tabel blijkt dat door een juiste keuze van concentraties van beide stoffen NOB geïnhibeerd worden terwijl AerAOB hier geen effect van ondervinden. Voor de berekening van FA (free ammonia) en FNA (free nitrous acid) worden twee formules gebruikt (Deel 1, sectie 4.1.3.) blijkt de grote afhankelijkheid van temperatuur en pH (Anthonisen, Loehr et al., 1976). De temperatuur heeft bijgevolg reeds een onrechtstreeks effect op de eigenlijke inhibitie omdat er ook geen inhibitie van FA en FNA plaatsvindt als de temperatuur laag is. Uit een recente studie blijkt echter dat de jarenlange veronderstelling van NOB inhibitie door FA en FNA niet volledig correct is, maar dat de inhibitie zelfs rechtstreeks afhankelijk is van temperatuur (Kim, Guo et al., 2008). Dit onderzoek toont namelijk resultaten waarbij er gevarieerd wordt met FA concentraties alsook met temperaturen. Hieruit blijkt dat bij zeer hoge FA concentraties, maar tegelijkertijd lage temperaturen er geen inhibitie viel waar te nemen. Bij het andere uiterste, lage FA concentraties maar hoge temperaturen, bleek er wel NOB-inhibitie plaats te vinden. Alle andere combinaties werden ook getest en bevestigden de temperatuursafhankelijkheid, eerder dan de FAafhankelijkheid. Temperatuur speelt bijgevolg een zeer belangrijke rol in meerdere NOB inhibitiemogelijkheden en “Temperatuursgebonden inhibitie” zou dan ook een betere titel kunnen zijn voor deze paragraaf. Zo is er nog een mogelijkheid tot NOB-inhibitie die enkel en alleen door temperatuur wordt geïnduceerd, namelijk het toedienen van een hitteshock (ca. 60°C) aan de micro-organismen. NOB worden bij dergelijke hitte shocken van ongeveer 20 minuten onderdrukt, terwijl AerAOB zelfs in staat waren om hitte shocken van 90°C gedurende een uur te overleven. Er is echter geen resultaat van de reactie van AnAOB bij deze methode (Isaka, Sumino et al., 2008). Er is echter tot op heden niet de mogelijkheid om deze temperatuursgebonden
inhibities te
koppelen aan NO-inhibitie om de eenvoudige reden dat de huidige literatuur geen informatie bevat over de temperatuursafhankelijkheid van NO productie in een microbiële gemeenschap. Omwille van het feit dat NO voornamelijk geproduceerd wordt onder stresscondities en dat de hoofdoorzaak van 56
Deel 4
Discussie
deze NO-productie te vinden is enzymreacties waarbij NirK (nitriet reductase) een grote rol speelt, zou het niet verwonderlijk zijn dat NO productie zal stijgen bij een stijgende temperatuur. Vanwege het feit dat de verklaring van alle eerder vernoemde inhibities door toedoen van hoge temperaturen niet steeds voor handen is of nog onduidelijkheden bevat, kan het zeer nuttig zijn een toekomstig onderzoek te wijden aan de relatie van temperatuur en NO productie.
5. Toepasbaarheid NO-inhibitie in OLAND hoofdstroom NOB-inhibitie door middel van NO voor hoofdstroom OLAND toepassingen is zeker veelbelovend. Ten eerste zijn er heel wat externe factoren die als nadelig worden aanzien voor toepassing van OLAND in de hoofdstroom, die eigenlijk ook voordelig zijn om inhibitie door middel van NO in de hand te werken. Voorbeelden hiervan zijn de lage stikstofconcentratie in het influent en de lage temperatuur. Beide factoren zullen K-strategen stimuleren waaronder de Nitrospira species vallen (Deel 4, sectie 2.2.). Nitrospira zullen, K-strateeg zijnde, steeds een hogere affiniteit hebben voor nitriet dan Nitrobacter, welke r-strateeg zijn. Door deze hogere affiniteit zal Nitrospira meer vatbaar zijn voor de inhibitie geïnduceerd door NO (Deel 4, sectie 3.). De lage DO die zou worden toegepast om OLAND in de hoofdstroom te stimuleren, kan eveneens worden teruggekoppeld aan NO-inhibitie zoals beschreven in deel 4, sectie 4.1. Deze hypothese dient te worden bevestigd en verder onderzocht zodat het zuurstofgehalte kan gestuurd worden om effectief de NO productie door AerAOB te stimuleren, eerder dan gewoon een vast DO-gehalte te benaderen. Dit is een systeemafstelling die zeker onderzocht moet worden om een optimaal evenwicht te vinden tussen enerzijds NOB inhibitie en anderzijds geen overmatige NO productie die uit het systeem ontsnapt. Dit laatste is niet onbelangrijk omdat NO als reactieve molecule ozondepletie en zure regen teweeg brengt en onrechtstreeks ook een gevaarlijk broeikaspotentieel heeft. Het aeratie regime met het meeste potentieel voor inhibitie door middel van NO is volgens de voorlopige hypothese de alternerende beluchting. De hieruit voortkomende lag-fase van NOB kan immers zijn oorsprong vinden in de binding van NO op de cytochroomcomplexen (Deel 4, sectie 4.1.). Niet onbelangrijk voor de praktische toepassing zijn de resultaten van de batchtesten met bellenbeluchting. Hieruit blijkt dat ondanks de slechte oplosbaarheid van NO in waterige media er toch een opmerkelijk resultaat wordt bekomen op vlak van inhibitie. Daarenboven zal de NO door diverse micro-organismen in-situ worden geproduceerd waardoor het contact tussen NO en biomassa veel hoger zal liggen. De NO concentratie dient wel een bepaalde drempelwaarde te overschrijden alvorens effect te hebben en dit zal dan ook moeten worden nagegaan in de praktijk omdat dit afhangt van de fysische kenmerken van de reactor, intrinsieke parameters van de biomassa, menging, enzoverder. 57
Deel 4
Discussie
NOB inhibitie door middel van NO heeft dus veel potentieel maar er dienen ook nog heel wat onzekerheden te worden weggewerkt en hypotheses te worden bevestigd. Wel is het een zeker feit dat het perfect past in het plaatje van het ZeroWasteWater-concept omdat men het proces gaat sturen door de micro-organismen zelf in een bepaald evenwicht te sturen en de inhibitie op deze wijze te induceren zonder dat er extra chemicaliën of energie aan het systeem dient te worden toegevoegd (Verstraete and Vlaeminck, 2011). Zo zou een mogelijk einddoel zijn dat AerAOB NO produceren en deze NO gebruikt wordt om NOB te inhiberen. Een grote leegte in dit onderzoeksdomein is echter wel het gebrek aan kennis over wat de rol van temperatuur in dit verhaal is (Deel 4, sectie 4.2.). Tenslotte dient opgemerkt te worden dat er bij het ontwikkelen van dit concept een duidelijke duurzaamheidsafweging dient gemaakt te worden waarbij door het implementeren van energiepositieve waterzuivering de uitstoot van schadelijke stoffen kan toenemen.
6. Algemene besluiten In deze paragraaf worden kort en bondig de belangrijkste besluiten van dit onderzoek opgesomd. Ondanks de slechte oplosbaarheid van NO in waterige media blijkt het contact met nitrificerende biomassa via eenvoudige bellenbeluchting toch voldoende om inhibitie van NOB te induceren. Zo werden inhibities waargenomen tussen 0% en 63% afhankelijk van de biomassa. De hypothese rond de drempelwaarde van NO om inhibitie van NOB te induceren werd bevestigd door de twee uitgevoerde experimenten, met een verschillend contactmechanisme, met elkaar te vergelijken. Zo kon voor de biomassa met 0% inhibitie bij de bellenbeluchting, een inhibitie van 67% worden waargenomen bij membraanbeluchting. Overigens bleek dat de types biomassa die bij de bellenbeluchting reeds inhibitie vertoonden, ook bij de membraanbeluchting een inhibitie van dezelfde grootte-orde ondervonden. De affiniteit voor nitriet van de verschillende soorten biomassa correleerde met de hoeveelheid inhibitie die werd waargenomen. Hoe hoger de affiniteit, hoe meer de desbetreffende biomassa werd geïnhibeerd. Zo ondervond een biomassa met een KS van 1,50 mg N-NO2- L-1 een inhibitie van 20% , terwijl een andere biomassa met een KS van 0,059 mg N-NO2- L-1 een inhibitie van 63% vertoonde. Doordat er ook een positieve correlatie kon gevonden worden tussen KS waarden en hoeveelheid Nitrospira in een biomassa, kon bijgevolg ook worden besloten dat Nitrospira meer geïnhibeerd werden dan Nitrobacter. In dit onderzoek zijn ook enkele nieuwe methoden en/of analyses toegepast met wisselend succes. De artificiële biofilm membranen op basis van alginaat bleken zeer efficiënt om biomassa te fixeren
58
Deel 4
Discussie
als een biofilm zonder een invloed uit te oefenen op de testen of de intrinsieke parameters van de biomassa. De visualisatie van NO opname door middel van DAF-2 en fluorescentiemicroscopie bleek potentieel te hebben maar dient zeker geoptimaliseerd te worden voor verdere onderzoeken. Tenslotte bleek de KS bepaling gebruikt in dit werk een zeer eenvoudige en handige methode. De resultaten hiervan waren immers zeer consistent en in lijn met waarden uit de literatuur. NOB inhibitie door middel van NO kan mogelijk gerelateerd worden aan reeds gekende inhibitiemethoden zonder dat men zich hiervan in het verleden bewust van was. Zo is de koppeling van NO aan de NOB inhibitie door het toepassen van een lage alternerende DO zeer goed beargumenteerd en kan dit na bevestiging zeker gebruikt worden om de verschillende microorganismen in een OLAND systeem elkaar te laten sturen door een optimaal evenwicht te creëren waarbij de tussenproducten van de ene microbiële protagonist, de andere ongewenste protagonist gaan inhiberen.
7. Toekomstig onderzoek Hier worden nog enkele suggesties gegeven voor mogelijk toekomstig onderzoek in dit onderzoeksdomein:
Het effect van temperatuur op NO-productie door micro-organismen is tot op dit moment nog nauwelijks tot niet onderzocht. Deze leemte in de literatuur opvullen zou een groter inzicht kunnen verschaffen over de rol van NO in gekende NOB inhibitiemethoden omdat temperatuur bij deze gekende methoden bijna steeds van groot belang is.
De NO concentratieafhankelijkheid van de NOB-inhibitie werd in dit werk reeds kort aangehaald. Er kon echter enkel een conclusie getrokken worden over het bestaan van een drempelwaarde maar een kwantitatieve correlatie ontbreekt nog.
De hypothese rond de betrokkenheid van NO bij het toepassen van een lage DO, welke een reeds gekende NOB-inhibitie is, dient bevestigd te worden. Een onderzoek dat de NO productie bij lage NO test, alsook hoe deze NO zich vervolgens in het systeem gedraagt en hoe dat de reversibele binding op de cytochroomcomplexen van NOB al dan niet de waargenomen lag-fase induceert zou een zeer grote vooruitgang betekenen voor de toepasbaarheid van NOB inhibitie door NO in hoofdstroom OLAND toepassingen.
59
5. Deel 5: Referenties
Anthonisen, A. C., R. C. Loehr, et al. (1976). "Inhibition of nitrification by ammonia and nitous acid." Journal Water Pollution Control Federation 48(5): 835-852. Aravinthan, V., S. Takizawa, et al. (1998). "Factors affecting nitrogen removal from domestic wastewater using immobilized bacteria." Water Science and Technology 38(1): 193-201. Aslan, S. and E. Simsek (2012). "Influence of salinity on partial nitrification in a submerged biofilter." Bioresource Technology 118: 24-29. Barnes, D. and P. J. Bliss (1983). Biological Control of Nitrogen in Wastewater Treatment. London, New York: E.& F.N. Spon. Blackburne, R., V. M. Vadivelu, et al. (2007). "Kinetic characterisation of an enriched Nitrospira culture with comparison to Nitrobacter." Water Research 41(14): 3033-3042. Blackburne, R., Z. Yuan, et al. (2008). "Partial nitrification to nitrite using low dissolved oxygen concentration as the main selection factor." Biodegradation 19(2): 303-312. Bock, E., I. Schmidt, et al. (1995). "Nitrogen loss caused by denitrifying Nitrosomonas cells using ammonium or hydrogen as electron donors and nitrite as electron acceptor." Archives of Microbiology 163(1): 16-20. Broda, E. (1977). "Two kinds of lithotrophs missing in nature." Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 17(6): 491-493. Cao, G.-m., Q.-x. Zhao, et al. (2002). "Characterization of nitrifying and denitrifying bacteria coimmobilized in PVA and kinetics model of biological nitrogen removal by coimmobilized cells." Enzyme and Microbial Technology 30(1): 49-55. Chandran, K., L. Y. Stein, et al. (2011). "Nitrous oxide production by lithotrophic ammonia-oxidizing bacteria and implications for engineered nitrogen-removal systems." Biochemical Society Transactions 39: 1832-1837. Colliver, B. B. and T. Stephenson (2000). "Production of nitrogen oxide and dinitrogen oxide by autotrophic nitrifiers." Biotechnology Advances 18(3): 219-232. Cooper, C. E. (2002). "Nitric oxide and cytochrome oxidase: substrate, inhibitor or effector?" Trends in Biochemical Sciences 27(1): 33-39. Cooper, C. E. (2003). "Competitive, reversible, physiological? Inhibition of mitochondrial cytochrome oxidase by nitric oxide." IUBMB Life 55(10-11): 591-597. Daims, H., P. H. Nielsen, et al. (2000). "Novel Nitrospira-like bacteria as dominant nitrite-oxidizers in biofilms from wastewater treatment plants: diversity and in situ physiology." Water Science and Technology 41(4-5): 85-90. De Clippeleir, H. (2012). Microbial resource management of OLAND focused on sustainability: 217. Dotro, G., B. Jefferson, et al. (2011). "A review of the impact and potential of intermittent aeration on continuous flow nitrifying activated sludge." Environmental Technology 32(15): 1685-1697.
60
Deel 5
Referenties
EPA, U. (2000). Wastewater technology fact sheet: trickling filter nitrification. [Washington, D.C.] :, United States Environmental Protection Agency, Office of Water. Freitag, A. and E. Bock (1990). "Energy-conservation in Nitrobacter." Fems Microbiology Letters 66(13): 157-162. Fux, C. and H. Siegrist (2004). "Nitrogen removal from sludge digester liquids by nitrification/denitrification or partial nitritation/anammox: environmental and economical considerations." Water Science and Technology 50(10): 19-26. Galloway, J. N., J. D. Aber, et al. (2003). "The nitrogen cascade." Bioscience 53(4): 341-356. Galloway, J. N., A. R. Townsend, et al. (2008). "Transformation of the Nitrogen Cycle: Recent Trends, Questions, and Potential Solutions." Science 320(5878). Graham, D. W., C. W. Knapp, et al. (2007). "Experimental demonstration of chaotic instability in biological nitrification." Isme J 1(5): 385-393. Hellinga, C., A. Schellen, et al. (1998). "The SHARON process: An innovative method for nitrogen removal from ammonium-rich waste water." Water Science and Technology 37(9): 135-142. Hill, C. B. and E. Khan (2008). "A comparative study of immobilized nitrifying and co-immobilized nitrifying and denitrifying bacteria for ammonia removal from sludge digester supernatant." Water Air and Soil Pollution 195(1-4): 23-33. Hooper, A. B., T. Vannelli, et al. (1997). "Enzymology of the oxidation of ammonia to nitrite by bacteria." Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 71(1-2): 59-67. IPCC (2007). Climate Change 2007 - The Physical Science Basis: Working Group I Contribution to the Fourth Assessment Report of the IPCC, Cambridge University Press. Isaka, K., T. Sumino, et al. (2008). "Novel nitritation process using heat-shocked nitrifying bacteria entrapped in gel carriers." Process Biochemistry 43(3): 265-270. Jardin, N. and J. Hennerkes (2012). "Full-scale experience with the deammonification process to treat high strength sludge water -- a case study." Water Sci Technol 65(3): 447-455. Kampschreur, M. J., R. Poldermans, et al. (2009). "Emission of nitrous oxide and nitric oxide from a full-scale single-stage nitritation-anammox reactor." Water Science and Technology 60(12): 3211-3217. Kartal, B., W. J. Maalcke, et al. (2011). "Molecular mechanism of anaerobic ammonium oxidation." Nature 479(7371): 127-U159. Kartal, B., J. Rattray, et al. (2007). "Candidatus "Anammoxoglobus propionicus" a new propionate oxidizing species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria." Systematic and Applied Microbiology 30(1): 39-49. Khin, T. and A. P. Annachhatre (2004). "Novel microbial nitrogen removal processes." Biotechnology Advances 22(7): 519-532. Kim, D.-J. and S.-H. Kim (2006). "Effect of nitrite concentration on the distribution and competition of nitrite-oxidizing bacteria in nitratation reactor systems and their kinetic characteristics." Water Research 40(5): 887-894. Kim, J.-H., X. Guo, et al. (2008). "Comparison study of the effects of temperature and free ammonia concentration on nitrification and nitrite accumulation." Process Biochemistry 43(2): 154160.
61
Deel 5
Referenties
Kindaichi, T., Y. Kawano, et al. (2006). "Population dynamics and in situ kinetics of nitrifying bacteria in autotrophic nitrifying biofilms as determined by real-time quantitative pCR." Biotechnology and Bioengineering 94(6): 1111-1121. Kluyver, A. J. and W. Verhoeven (1954). "Studies on true dissimilatory nitrate reduction." Antonie van Leeuwenhoek 20(1): 241-262. Kojima, H., M. Hirotani, et al. (2001). "Bioimaging of Nitric Oxide with Fluorescent Indicators Based on the Rhodamine Chromophore." Analytical Chemistry 73(9): 1967-1973. Koops, H. P. and A. Pommerening-Roser (2001). "Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria emphasizing cultured species." Fems Microbiology Ecology 37(1): 1-9. Kowalchuk, G. A. and J. R. Stephen (2001). "Ammonia-oxidizing bacteria: A model for molecular microbial ecology." Annual Review of Microbiology 55: 485-529. Kuai, L. P. and W. Verstraete (1998). "Ammonium removal by the oxygen-limited autotrophic nitrification-denitrification system." Applied and Environmental Microbiology 64(11): 45004506. Kuypers, M. M. M., A. O. Sliekers, et al. (2003). "Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea." Nature 422(6932): 608-611. Lackner, S. and B. F. Smets (2012). "Effect of the kinetics of ammonium and nitrite oxidation on nitritation success or failure for different biofilm reactor geometries." Biochemical Engineering Journal 69(0): 123-129. Lackner, S., A. Terada, et al. (2008). "Heterotrophic activity compromises autotrophic nitrogen removal in membrane-aerated biofilms: Results of a modeling study." Water Research 42(45): 1102-1112. Lewandowski, Z., R. Bakke, et al. (1987). "Nitrification and autotrophic denitrification in calcium alginate beads." Water Science and Technology 19(1-2): 175-182. Lipschultz, F., O. C. Zafiriou, et al. (1981). "Production of NO and N2O by soil nitrifying bacteria." Nature 294(5842): 641-643. Liu, S. T., F. L. Yang, et al. (2008). "Assessment of the positive effect of salinity on the nitrogen removal performance and microbial composition during the start-up of CANON process." Applied Microbiology and Biotechnology 80(2): 339-348. Marletta, M. A., M. A. Tayeh, et al. (1990). "Unraveling the biological significance of nitric oxide." Biofactors 2(4): 219-225. Martinez-Espinosa, R. M., J. A. Cole, et al. (2011). "Enzymology and ecology of the nitrogen cycle." Biochem Soc Trans 39(1): 175-178. Mateju, V., S. Cizinska, et al. (1992). "Biological water denitrification - a review." Enzyme and Microbial Technology 14(3): 170-183. Mulder, A. (2003). "The quest for sustainable nitrogen removal technologies." Water Science and Technology 48(1): 67-75. Mulder, A., A. A. Vandegraaf, et al. (1995). "Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized-bed reavtor." Fems Microbiology Ecology 16(3): 177-183. Parkin, G. and W. Owen (1986). "Fundamentals of Anaerobic Digestion of Wastewater Sludges." Journal of Environmental Engineering 112(5): 867-920. Pearson, I. V., M. D. Page, et al. (2003). "A mutant of Paracoccus denitrificans with disrupted genes coding for cytochrome c550 and pseudoazurin establishes these two proteins as the in vivo electron donors to cytochrome cd1 nitrite reductase." J Bacteriol 185(21): 6308-6315. 62
Deel 5
Referenties
Peng, Y. Z. and G. B. Zhu (2006). "Biological nitrogen removal with nitrification and denitrification via nitrite pathway." Applied Microbiology and Biotechnology 73(1): 15-26. Quan, Z. X., S. K. Rhee, et al. (2008). "Diversity of ammonium-oxidizing bacteria in a granular sludge anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) reactor." Environmental Microbiology 10(11): 3130-3139. Randall, D. J. and T. K. Tsui (2002). "Ammonia toxicity in fish." Mar Pollut Bull 45(1-12): 17-23. Richardson, D. J. and N. J. Watmough (1999). "Inorganic nitrogen metabolism in bacteria." Current Opinion in Chemical Biology 3(2): 207-219. Sarti, P., A. Giuffre, et al. (2000). "Nitric oxide and cytochrome c oxidase: mechanisms of inhibition and NO degradation." Biochem Biophys Res Commun 274(1): 183-187. Schmid, M., K. Walsh, et al. (2003). "Candidatus "Scalindua brodae", sp nov., Candidatus "Scalindua wagneri", sp nov., two new species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria." Systematic and Applied Microbiology 26(4): 529-538. Siegrist, H. (1996). "Nitrogen removal from digester supernatant - comparison of chemical and biological methods." Water Science and Technology 34(1–2): 399-406. Siegrist, H., D. Salzgeber, et al. (2008). "Anammox brings WWTP closer to energy autarky due to increased biogas production and reduced aeration energy for N-removal." Water Sci Technol 57(3): 383-388. Simon, J. and M. G. Klotz (2013). "Diversity and evolution of bioenergetic systems involved in microbial nitrogen compound transformations." Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics 1827(2): 114-135. Siripong, S. and B. E. Rittmann (2007). "Diversity study of nitrifying bacteria in full-scale municipal wastewater treatment plants." Water Research 41(5): 1110-1120. Sliekers, A. O., N. Derwort, et al. (2002). "Completely autotrophic nitrogen removal over nitrite in one single reactor." Water Research 36(10): 2475-2482. Starkenburg, S. R., D. J. Arp, et al. (2008). "Expression of a putative nitrite reductase and the reversible inhibition of nitrite-dependent respiration by nitric oxide in Nitrobacter winogradskyi Nb-255." Environmental Microbiology 10(11): 3036-3042. Strous, M., J. A. Fuerst, et al. (1999). "Missing lithotroph identified as new planctomycete." Nature 400(6743): 446-449. Strous, M., E. Pelletier, et al. (2006). "Deciphering the evolution and metabolism of an anammox bacterium from a community genome." Nature 440(7085): 790-794. Sun, S. P., C. P. I. Nacher, et al. (2010). "Effective Biological Nitrogen Removal Treatment Processes for Domestic Wastewaters with Low C/N Ratios: A Review." Environmental Engineering Science 27(2): 111-126. Suzuki, I., U. Dular, et al. (1974). "Ammonia or ammonium ion as substrate for oxidation by Nitrosomonas-Europaea cells and etracts." Journal of Bacteriology 120(1): 556-558. Third, K. A., A. O. Sliekers, et al. (2001). "The CANON system (completely autotrophic nitrogenremoval over nitrite) under ammonium limitation: Interaction and competition between three groups of bacteria." Systematic and Applied Microbiology 24(4): 588-596. Torres, J., V. Darley-Usmar, et al. (1995). "Inhibition of cytochrome c oxidase in turnover by nitric oxide: mechanism and implications for control of respiration." Biochem J 312(Pt 1): 169-173. Turk, O. and D. S. Mavinic (1989). "Maintaining nitrite build-up in a system acclimated to free ammonia." Water Research 23(11): 1383-1388. 63
Deel 5
Referenties
van Ginkel, C. G., J. Tramper, et al. (1983). "Characterization of Nitrosomonas europaea immobilized in calcium alginate." Enzyme and Microbial Technology 5(4): 297-303. Verstraete, W. and S. Philips (1998). Nitrification-denitrification processes and technologies in new contexts. Amsterdam, Elsevier Science Bv. Verstraete, W. and S. E. Vlaeminck (2011). "ZeroWasteWater: short-cycling of wastewater resources for sustainable cities of the future." International Journal of Sustainable Development & World Ecology 18(3): 253-264. Vlaeminck, S. (2009). Biofilm and granule applications for one-stage autotrophic nitrogen removal Department of Biochemical and microbial technology, University of Ghent: 134. Wijffels, R. H. and J. Tramper (1995). "Nitrification by immobilized cells." Enzyme and Microbial Technology 17(6): 482-492. Wilén, B.-M., B. Jin, et al. (2003). "Impacts of structural characteristics on activated sludge floc stability." Water Research 37(15): 3632-3645. Windey, K., I. De Bo, et al. (2005). "Oxygen-limited autotrophic nitrification-denitrification (OLAND) in a rotating biological contactor treating high-salinity wastewater." Water Research 39(18): 4512-4520. Yang, P. Y., K. Cao, et al. (2002). "Entrapped mixed microbial cell process for combined secondary and tertiary wastewater treatment." Water Environ Res 74(3): 226-234. Zumft, W. (1993). "The biological role of nitric oxide in bacteria." Archives of Microbiology 160(4): 253-264. Zumft, W. G. (1997). "Cell biology and molecular basis of denitrification." Microbiology and Molecular Biology Reviews 61(4): 533-+.
64
