Collageenafzetting bij nieuwe celpopulaties in de dermale wondomgeving WILLIAM J. LINDBLAD, Phd
Na verwonding moeten talrijke collageenstructuren opnieuw samengesteld worden om de functie van het weefsel te herstellen. De basale membraanzone, de vasculair basale membranen en het dicht bindweefsel van de dermis zijn voorbeelden van structuren, die een aantal verschillende collageentypes bevatten en die vervangen moeten worden na beschadiging.
Bovendien wordt er een litteken afgezet aan de beschadigde zijde voor de elementen, die niet succesvol kunnen vervangen worden en om de elementen die verloren zijn in het trauma, te vervangen. Zeer zeker hebben celoverblijfselen van de verschillende compartimenten van de huid de mogelijkheid om collageen te synthetiseren en af te zetten om deze multiple structuren te hervormen. Alhoewel opeenstapelend experimenteel bewijs suggereert dat naast deze residente cellen, cellen, afkomstig uit het bloed, verantwoordelijk kunnen zijn voor de afzetting van een deel van het nieuw gevormde collageen. Studies door dit laboratorium tonen aan dat de geactiveerde monocyt een potentiële bron van collageen is in de wondomgeving. De dynamiek van het proces gegeven, veronderstelt de hypothese dat, gedurende de normale wondheling, de geactiveerde monocyt een bron is van collageen essentieel voor de snelle vorming van een voorlopige matrix en bevorderlijk voor de subsequente vorming van granulatieweefsel. Collageensynthese verschijnt ook bij uitgezette populaties van residente cellen, onder de invloed van inflammatoire cel afkomstige mediatoren, wat resulteert in een grotere accumulatie van collageen gedurende het wondherstel. Hoewel chronische inflammatie geïnitieerd is, blijven de geactiveerde monocyten in voldoende aantallen aanwezig om collageen af te zetten, wat leidt tot een pathologisch letsel. (WOUND REP REG 1998;6:186-193)
anatomie van de huid
Schade aan de dermis of, wat dat betreft, aan de meeste weefsels, houdt in een onderbreking van meerdere collageenstructuren die uiteindelijk hervormt moeten worden om te voldoen aan het functioneel herstel van het weefsel. Deze collageenstructuren omvatten het macroscopisch zichtbare interstitieel dicht bindweefsel, de microscopische dunne basale membranen en de erg dunne pericellulaire matrix. De grondsubstantie van het bindweefsel is histologisch moeilijk te onderzoeken door het hoge watergehalte (door de aanwezigheid van glycosaminoglycanen en proteoglycanen die water binden) en de moeilijk fixeerbare macromoleculen. De fibroblast is waarschijnlijk de grootste producent van verbindingen die de grondsubstantie vormen. De grondsubstantie bevindt zich in een voortdurende turnover, bij aanvoer is er steeds afbraak d.m.v. endocytotische opname en lysosomale vertering. Iedere structuur heeft een verschillende functie en de wedersamenstelling ervan is kritisch voor de heroprichting van de unieke aspecten van het weefsel. Alhoewel het duidelijk is dat grote hoeveelheden bindweefsel na beschadiging snel afgezet worden in de huid, is de cellulaire bron van het collageen niet zeker. Collageen zijn gevlochten of geweven bundels. De synthese ervan gebeurt door het aan elkaar binden van een reeks aminozuren volgens de code opgeslagen in het DNA (desoxyribonucleozuur). De boodschapper m-RNA (ribonucleozuur) zorgt voor de correcte sequentie en de T-RNA transporteert de verschillende aminozuren op hun plaats in de alfa1ketting (rechtsdraaiend) dewelke voorkomt op de ribosomen. Daarna volgt de assemblage van 3-alfa ketens (links draaiende superhelix). De moleculen rangschikken zichzelf, nl. de ene molecule overlapt een andere voor ongeveer 1/4 van zijn lengte. De ketting in de molecule en de moleculen worden bij elkaar gehouden door zwakke waterstofbindingen. Na enkele dagen vermindert de oplosbaarheid van het collageen en verbetert de sterkte van de vezels. Er zijn tenminste 13 te onderscheiden types collageen:
3
Distributie Alle samenhangende weefsels behalve hyaline kraakbeen en basaal membraan Hyaline kraakbeen en kraakbeenachtig weefsel Samenhangende weefsels, bloedvaten
4
Basaal membraan
5 6
Alle weefsels Alle weefsels
1 2
7 8 9 10 11
Functie Vorming van ondersteunende vezels van verschillende diameter Idem 1, maar kleiner Formatie van kleine vezelachtige elementen co-vezels type1 Formatie van netvormige stelling
Idem collageen type 3 Formatie van micro-fibrillaire elementen Dermale-epidermale verbindingen Verankeren van fibrillen Decemet’s membraan geproduceerd door Onbekend endotheelcellen Hyaline kraakbeen Vormt co-aggregaten met collageen type 2 Hypertrofisch kraakbeen Onbekend Hyaline kraakbeen Onbekend, mogelijks vorming covezels met type 2 collageen
12 13
Gelijkend op type 1 collageen
Onbekend, mogelijks vorming van co-aggregaten met type 1 collageen Gesynthetiseerd door bepaalde tumorcellen Onbekend
De onzekerheid van de bron van dit collageen is te wijten door de veranderde cellulaire dynamiek in de uren en dagen onmiddellijk na de verwonding. Gedurende deze periode is er een actieve beweging van cellen in de wonde, alsook van proliferatie van residente celpopulaties. Door de verandering van
een dynamische stabiele omgeving naar een snellere, worden de cellen blootgesteld aan multiple omgeving invloeden wat kan leiden tot de afzetting van genenproducten die niet geproduceerd werden in de rustige omgeving van de niet beschadigde huid. Daarom kan het repertoire van proteïne, afgezet door een cel in deze omgeving, niet het complement van proteïnen reflecteren, die geobserveerd werden in het resterende stadium. Bijkomstig, tot nu toe, was het moeilijk om celtypes te differentiëren in wonden enkel gebaseerd op morfologische criteria. De identificatie van cel oppervlakte markers, die gedetecteerd kunnen worden door antilichamen, maken het mogelijk om deze beperking te overwinnen, omdat men nu cellen kan onderscheiden die morfologisch op elkaar lijken maar eigenlijk afkomstig zijn van verschillende celorigines. Het is belangrijk te noteren dat volgend op de verwonding, de afzetting van collageen in de huid, de hoeveelheid collageen aanwezig voor de beschadiging, overtreft en resulteert in een litteken. Daarom bevat de discussie van collageensynthese gedurende de wondheling twee componenten: namelijk de cellulaire oorsprong van collageen gebruikt voor de reconstructie van normale collagene structuren van het weefsel en de oorsprong van het collageen dat een litteken wordt, een structuur niet aanwezig voorafgaande aan de verwonding. Het is aannemelijk dat verschillende celpopulaties betrokken zijn bij elk van deze componenten, alhoewel er waarschijnlijk een overlapping is in cellulaire inbreng naar elk component.
1.
COLLAGENE STRUCTUREN VAN DE NIET-BESCHADIGDE HUID De huid bevat een aantal collagene structuren die unieke karakteristieken verschaffen aan dit belangrijk barrièreweefsel.
figuur 1 Schematische voorstelling van de huid met aandacht voor de verschillende collagene structuren aanwezig in de niet beschadigde huid. Het gebied van de basale membraan zone in de cirkel is vergroot.
Figuur 1 vertoont een schematisch overzicht van de huid met aandacht voor deze structuren. De meest substantiële collagene structuur in termen van volume of massa is het bindweefsel van de dermale laag, in het bijzonder de reticulaire dermis. Deze laag bevat dicht gepakte collageenvezels die parallel lopen met de lichaamsoppervlakte. Het is deze structuur dat de mechanische kracht verleent aan de huid en het mogelijk maakt te weerstaan aan constant fysisch misbruik. Een uniek structureel component van de huid is de cutane basale membraan zone, gelokaliseerd onder de laag van basale keratinocyten (figuur 1). Deze zone bevat twee collagene structuren: een basismembraan, dat onder de keratinocyten ligt en de verankerde vezels, die het basismembraan verbindt met de verankerde plaatjes in de papillaire dermis. De handhaving van deze structuur is noodzakelijk om te voorkomen dat de epidermis gescheiden wordt van de dermis.
De basale membraan zone (BMZ) van de huid bestaat uit een groot aantal verschillende structurele macromoleculen die een ingewikkelde aanhechtingszone vormen met het dermaleepidermale grensvlak. De aanwezigheid van grote aantallen van deze macromoleculen en hun discrete intermoleculaire interacties zijn noodzakelijk voor de functionele integriteit van de basale membraan zone. Aan de epidermale zijde van de BMZ, kan men hemidesmosomen herkennen, dit zijn aanhechtende structuren die verschijnen op het basale keratinocytenlamina lucida grensvlak. De hemidesmosomen bestaan uit een intracellulaire plaat en een transmembraan component dat een link vormt en de aanhechting verzekert met de basale keratinocyten en de aangrenzende dermale-epidermale BMZ. De hemidesmosomale proteïnen (BPAG-1 en –2 en a6B4 integrine) vormen een netwerk dat reikt van het intracellulair milieu van de basale keratinocyten naar de extracellulaire ruimte en verzekeren de aanhechting van de epidermis met het onderliggende basale membraan. De kern van het cutane BMZ bestaat uit een basaal membraan dat men kan indelen in twee lagen: de bovenste is de lamina lucida, de onderste de lamina densa. In de lamina lucida zijn er duidelijk herkenbare fijne draadvormige structuren, verankerde vezels, dewelke het meest talrijk zijn onder de hemidesmosomen. Type IV collageen, laminine 1 en nidogeen zijn eveneens aanwezig als belangrijke structurele componenten van het cutane basale membraan. In het lager deel van de BMZ, kunnen de aanhechtende fibrillen goed gedetecteerd worden. Deze fibrillen reiken van de lamina densa van het basale membraan naar de papillaire dermis. Type VII collageen is de belangrijkste component van de aanhechtende fibrillen. Naast het basaal membraan dat onder de basale keratinocyten ligt, bezitten andere structuren in de huid basale membranen (figuur 1). Haarfollikels bijvoorbeeld, welke invaginaties zijn van de epidermis en die penetreren naar de dermis, bevatten basale membranen onder de epitheliale cellen. De dermale lagen van de huid zijn eveneens voorzien van bloedvaten die endotheliale cellen bevatten en die gesteund worden door basale membranen in de arteriolen en venulae (zie volgende figuur).
Derhalve zijn deze multipele collagene structuren nogal wijd verspreid in de huid, ondanks de grote massa van het aanwezige collageen in de huid, berust het in de dichte reticulaire dermale bindweefsel. De volledige hoeveelheid collageen types die aanwezig zijn in de huid weerspiegelen de diverse collagene structuren. Types I en III zijn de predominante types van collageen in de huid. Alhoewel een verscheidenheid aan hoger genummerd collageen meer recent geïdentificeerd werd in de huid, wijst het op een rijke diversiteit van de functies van deze proteïnen, in de verschillende huidstructuren. Bijvoorbeeld, het dichte bindweefsel van de dermis, dat primair samengesteld is met type I collageen, bevat substantiële aantallen van type VI collageen, dewelke een hoog vertakt draadvormig netwerk vormt rond de type I vezels. Alhoewel deze grote hoeveelheden van type VI collageen gelokaliseerd werden in de dermis, is de functie van dit netwerk nog onvatbaar. Een extensief netwerk van basale membranen in de huid, vereist type IV collageen, dewelke een open netwerk structuur produceert in de lamina densa en de lamina lucida, domeinen van het basale membranen. Basale membranen bevatten eveneens een brede reeks van niet collagene componenten, waaronder laminine, entactine, heparine sulfaat proteoglycanen en grote aantallen groeifactoren. Laminine is een structureel glucoproteïne en vervult eveneens een hechtende functie in de lamina basalis, enerzijds naar de epitheelcellen, anderzijds met betrekking tot de ankervezels. Heparine sulfaat is een proteoglycaan. Een proteoglycaan is een molecuul dat zich bevindt in de matrix van de dermis. Ze zijn opgebouwd uit glycosaminoglycanen, lineaire polysacchariden. Het eiwitgedeelte maakt 10-20% uit van het proteoglycaan. Door hun structuur kunnen ze veel water binden. Ze gaan ook verbindingen aan met vezels van de matrix, voornamelijk collagene vezels. Ze bepalen de visco-elastische eigenschappen van de
dermis. Groeifactoren regelen en controleren de cellulaire processen van fagocytose (het vernietigen van bacteriën door het in te sluiten in een vacuool van macrofaag of granulocyt en het vrijlaten van enzymen), chemotaxis (het aantrekken van eigen cellen door het produceren van chemische stoffen), mitogenese, matrixcomponentsynthese, wondcontractie en littekenremoddelering gedurende de wondheling. Onder groeifactoren verstaat men de cytokines (geproduceerd door en werkend op leukocyten), de lymfokines (geproduceerd door lymfocyten), de monokines (geproduceerd door macrofagen/monocyten) en de interleukines (geproduceerd door verschillende celtypes). Deze groeifactoren kunnen verschillende effecten hebben op verschillende cellen en weefsels en kunnen ook interageren met elkaar. Ze kunnen andere cellen beïnvloeden door endocriene (factoren vervoerd langs bloedstroom om doelcel te bereiken in ander deel van het lichaam), paracrien (factoren bereiken cellen in dezelfde omgeving dan ze geproduceerd zijn), autocrien (factoren geproduceerd en met effect op dezelfde cel) en intracriene mechanismen (factoren die niet door de cel zelf geproduceerd werden maar wel functioneren in de cel zelf). Deze structuren zijn integrale componenten van een systeem van extracellulaire mediatoren die de gedifferentieerde toestand van de cellen onderhouden. Naast deze collageentypes, bevat de huid ook type V collageen, een van de vezelvormende types collageen die vereist zijn voor de re-epithelialisatie van een wonde als de BMZ van de huid verstoord is. De alfa (VII) vezels die opgebouwd zijn uit type VII collageen, zijn de elementaire eenheden van de verankerde vezels en zijn de grootste van de gekende gewervelde collagene keten, die een moleculaire massa bezit van 320 kDa. Type VII collageen vormt aggregaties met het C eind van een niet-collageen domein, aan het ene eind van het aggregaat vastgelegd in het basaal membraan van de BMZ en het ander C-terminal domein vastgemaakt aan de aangrenzende plaat. Ook type VIII collageen is aanwezig in de huid, gelokaliseerd in de extracellulaire matrix rond de haarfollikels en de kleine bloedvaten. Het is daardoor blijkbaar dat de huid normaal ruimschoots voldoet in beide, het totaal aantal collageen aanwezig en de samenstelling van talrijke types van dit eiwit. Als zodanig moet dit weefsel multipele celtypes bevatten, die dit collageen kan produceren onder normale fysiologische condities. Een belangrijke vraag verschijnt: zijn dit dezelfde cellen die collageen produceren volgend op een beschadiging, of wordt het herstelcollageen geproduceerd door cellen aangetrokken in het wonddefect?
2.
CELLULAIR ORIGINE VAN DE EXTRACELLULAIRE MATRIX De vorming van een nieuwe extra cellulaire matrix volgend op de verwonding, heeft een gezamenlijke kracht nodig van cellen van verschillende afkomst in het weefsel, als van cellen verworven aan de kant van de beschadiging. Deze verschillende cellen beantwoorden aan het verschil van oplosbare mediatoren en de invloed van verouderde cel-ECM interacties die resulteren van de afbraak van het weefsel. Drie celtypes in de huid hebben de mogelijkheid om de volledige vervolmaking van collageentypes te synthetiseren en om de collagene structuren te hervormen die normaal in de huid aanwezig zijn. Epitheliale cellen synthetiseren type V collageen gedurende het proces van celmigratie om het “ontblootte” gebied van de dermis te bedekken. De epitheelcellen bewegen zich over vrije open oppervlakten en dit onafhankelijk van celdeling. Deze cellen komen vanuit wondrand of de resten van haarwortels, sebum en zweetkliertjes aanwezig in de huid. Indien er geen resten meer zijn, ziet men soms mesenchymale (cellen afkomstig van het mesenchym, embryonaal bindweefsel) cellen zich transformeren en deel gaan uitmaken van het epiderm. Reepithelialisatie gaat het vlugst bij wonden waarvan het basale membraan intact gebleven is. Deze cellen vereisen een voorlopige ECM met type V collageen als een component voor het tot standhouden van dit migrerend gedrag. Deze cellen hebben ook de mogelijkheid om de individuele componenten te synthetiseren in de basale membranen, waaronder fibronectine, type IV collageen en laminine, de welke allen transforming groeifactor beta produceren. Fibronectine is een structureel glycoproteïne (eiwit -koolhydraat complex) aanwezig in het bloed en in de weefselvloeistoffen.. Het eiwit component domineert en het koolhydraataandeel is vertakt. Cellen rekruteren (fibroblasten, macrofagen en endotheelcellen) en vormen een netwerk voor de afzetting van collageen. Collageen zal zich volgens dit patroon zetten. Eerst type III, nadien wordt dit vervangen door type I collageen. Fibronectine kan zich binden aan celmembranen zoals van fibroblasten, glycosaminoglycanen en collagene vezels. Fibronectine hecht zich ook aan fibrine en kan zo de adhesie van fibroblasten aan een stolsel bewerkstelligen Transforming groeifactor beta, wordt door macrofagen, BP, neutrofielen, T-lymfocyten, fibroblasten en keratinocyten geproduceerd en heeft als functie fibroblastproliferatie, chemotaxis van ontstekingscellen, collageenmetabolisme, indirecte angiogenese en acties van andere groeifactoren. Derhalve hebben de epitheelcellen de mogelijkheid om het basale membraan opnieuw samen te stellen als het nodig is na de beschadiging. Dezelfde cellen kunnen ook type VII collageen synthetiseren, dewelke de integrale proteïne is van de verankerde vezels. Daarom kan de volledige reformatie van de BMZ volgend op beschadiging, voltooid worden door de epitheliale cellaag. Neovascularisatie van een beschadigde zijde vereist proliferatie, migratie en organisatie van endotheliale cellen. Binnen enkele uren na het vrijkomen van de angiogenetische stimulus beginnen de endotheelcellen van de bestaande bloedvaten enzymen te produceren die het vasculair basaal membraan afbreken en dit alleen aan de stimulus zijde. Na 24 uur beginnen de endotheelcellen te migreren over het afgebroken basaal membraan in de richting van de angiogenetische stimulus. Achter de leidende tip van de migrerende cellen, delen zich voortslepende endotheelcellen. Kort daarna differentiëren ze zich en vormen een tubulair lumen. Uiteindelijk wordt er een vasculair netwerk gevormd. Als de bloedvaten rijpen, wordt er extracellulaire matrix componenten afgescheiden om een nieuw basaal membraan te vormen. Eens dit basaal membraan gevormd is, is de capillair voldoende rijp om een zekere
bloeddruk te weerstaan. Dit proces resulteert in nieuwe bloedvaten bekleed met endothelium met een basaal membraan op het basaal oppervlak. Bij de wedersamenstelling van de BMZ, zijn de cellen integraal bij die structuur, bekwaam om collagene componenten te synthetiseren nodig voor het stabiliseren en het beïnvloeden van de vorming van nieuwe bloedvaten. Deze cellen vertonen ook de mogelijkheid om type VIII collageen te produceren, dewelke schijnbaar vereist is voor vaatvorming, alhoewel de exacte functionering nog ongekend is. De mogelijkheid om de zachte ECM van de reticulaire dermis te vervangen kan volbracht worden door fibroblasten in de dermis. Fibroblasten worden gestimuleerd door macrofagen. Ze produceren collageen, elastine en proteoglycanen, dewelke het bindweefsel zullen reconstrueren en stimuleren de angiogenese. Ze gaan prolifereren, migreren en zetten matrixmateriaal vrij. Hierdoor veranderen ze van celfenotype, door retractie van het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat, naar perinucleaire locaties en de vorming van grote actine bundels parallel met de lengteas van de cellen. Men spreekt van een myofibroblast. Hierdoor stijgt de contractibilliteit en mobiliteit. Deze cellen zijn wijd herkend om hun mogelijkheid om collageen te produceren in vitro en worden verondersteld een prototypisch bindweefselcel te zijn. Bovendien hebben studies van collageenafzetting in vivo aangetoond dat deze cellen het synthetiseren van collageen I en III, na de beschadiging van de huid, induceren. Nochtans behalve het herplaatsen van het collageen naar de reticulaire dermis, is de beschadiging van de huid gekarakteriseerd door de afzetting van dicht collageen littekenweefsel. Identificatie van de collageenproducerende cellen in het initiële granulatieweefsel en het daarop volgend litteken, is nog steeds onopgelost na eeuwen van studies.
3.
CELLULAIR ORIGINE VAN LITTEKEN BINDWEEFSEL. De cellen verantwoordelijk voor de afzetting van collageen dat resulteert in een litteken, kunnen de residente fibroblasten zijn, die uniform geactiveerd kunnen worden door inflammatoire mediatoren, afgezet in het wondmilieu om een toenemende hoeveelheid collageen te produceren voor elke celbasis. In dit verband werden grote aantallen inflammatoire mediatoren onderzocht voor hun potentiële mogelijkheid om collageen synthese te stimuleren door fibroblasten. Eén groeifactor in het bijzonder, transforming groeifactor-beta, vertoonde de specifieke doeltreffendheid in het stimuleren van fibroblast collageen transcriptie. Behalve een stijging van collageenproductie per cel, moeten deze cellen prolifereren om te voorzien in een groter aantal collageen producerende cellen in de wonde dat de dramatische stijging in de ECM afzetting, gezien bij littekenvorming, verklaart. Opnieuw, de welgevestigde mogelijkheid van inflammatoire cel afkomstige mediatoren om celproliferatie te stimuleren, leidt tot de identificatie van factoren, bijvoorbeeld, platelet derived growth factor, die de mogelijkheid hebben om de fibroblasten proliferatie te stimuleren. Daarom is het erg aannemelijk dat vaste cellen geactiveerd worden om grotere aantallen ECM te synthetiseren gedurende het weefselherstel. Dit concept van veralgemeende fibroblastenproliferatie en matrix afzetting mag niet de complexiteit van het bindweefsel respons reflecteren. Het werd duidelijk aangetoond dat er een significante heterogeniteit was in de fibroblastpopulaties in de weefsels. Unieke fibroblastsubpopulaties die een aanzienlijke verschil in hoeveelheid van collageen afzetting per cel vertoonden, zijn gekloond van menselijke huid. Deze cellen vertonen eveneens een aanzienlijk verschil in hun antwoord op mononucleaire cel afkomstige inflammatoire mediatoren. Dus, één kan een scenario construeren in dewelke beschadiging een inflammatoire response in de huid initieert. De selectieve afzetting van inflammatoire mediatoren, activeert een subpopulatie van residente fibroblasten voor de proliferatie. Deze uitgebreide subpopulatie zet fenotypisch meer collageen af, per celbasis dan dat de subpopulaties van fibroblasten doen die normaal predomineren in de verouderde staat. Dit resulteert dan in de afzetting van grotere aantallen van collageen, dat resulteert in een litteken. Alhoewel, er blijft een andere mogelijkheid over, dewelke niet mutueel exclusief is voor deze scenario’s. Deze laatste mogelijkheid bevat de intrigerende mogelijkheid dat cellen van hematologische oorsprong die aangetrokken worden naar het beschadigd weefsel, de mogelijkheid hebben om te differentiëren in de ECM producerend cellen. Behalve vast te houden aan het theoretisch aspect, in er ook experimenteel bewijs dat dit mechanisme zou functioneren in wondherstel bij zoogdieren. De cel afkomstig uit het bloed, dat gefocust is met interesse met respect naar dit laatstgenoemde mechanisme is de monocyt/macrofaag. De macrofaag is gekend als een integraal cellulair component van het wondhelingsproces door de uitwijding van grote aantallen oplosbare mediatoren in de wondomgeving. Bovendien zijn deze cellen betrokken in de ECM biosynthese in verscheiden studies. Een eerder studie van de jaren 1950 rapporteert dat mononucleaire cellen van muizen (cellen met één kern), onderhouden in een diffusiekamer, veranderen in een fibroblast gelijkende cel in 3 dagen. Mononucleaire leukocyten afkomstig uit het bloed, werden eveneens in vivo getoond om de wonde te lokaliseren en morfologisch verschijnend als fibroblasten. Deze resultaten werden verkregen door autoradiografische analyses van huidwonden van ratten die geïnjecteerd werden met hthymidine voorafgaand de chirurgie. Deze auteurs noteerden dat de wonden fibroblastische cellen bevatten die isotopisch gelabeld werden met thymidine. Volgend op deze in vivo studies waren er verscheidene rapporten die cellen van hematologische origine in vitro onderzochten voor marker enzymen of collageenbiosynthese. Al deze studies konden de aanwezigheid aantonen van collageen biosynthetische enzymen, voornamelijk prolyl hydroxylase in cellen van hematogene oorsprong, waaronder monocyten. Nochtans kunnen deze studies niet de mogelijkheid uitsluiten dat deze enzymen aanwezig waren voor de synthese van niet-collagene proteïnen die hydroxy-L-proline zoals C1q bevatten en daarom mogen deze cellen niet bijdragen aan de collageen synthese in helende wonden.
Bewijs voor mensen, ratten en muizen verkregen in studies van dit laboratorium en andere over de laatste jaren, ondersteunt de hypothese dat monocyten/macrofagen bijdragen tot de afzetting van collageen gedurende het weefselherstel. Onze eerste studies om cellulaire bronnen van collageen gedurende de wondheling in de rat te lokaliseren, maakte gebruik van collageen typespecifiek polyclonale antilichamen. In een uitgesneden dermaal model van herstel, werd type IV collageen aangetroffen in de bloedklonter 18 tot 24 uren na de verwonding (figuur 2).
Figuur 2 Immunohistochemische kleuring van type IV collageen in het dermale wondweefsel van een rat, 24 uur na de beschadiging. Een full-thickness wonde werd geplaatst op een dorsale huid van een volwassen mannelijke rat door het gebruiken van 4-mm trephine. Het volledige wondweefsel werd verwijderd door gebruik te maken van een 6-mm trephine, en het weefsel werd in de helft verdeeld en in een vervrozen weefsel vastgezet medium en onmiddellijk ingevroren. Delen van het weefsel werden gekleurd voor type IV collageen door een indirect immunofluorescente techniek door gebruik te maken van polyclonale (is de normale immunoreactie, waarbij een meervoudige antigene werking leidt tot vorming van vele soorten immunoglobulinen, stoffen die na contact van het organisme met een antigeen worden geproduceerd en als antistoffen in het bloed en weefselvloeistoffen aanwezig zijn) antilichamen van konijnen. Gedurende deze tijd, kleurt de klonter sterk voor type IV collageen en is enkel minder gekleurd in de niet-beschadigde aangrenzende huid. Door anti-leukocyten antilichamen te gebruiken, kleuren de cellen in de klonter intens op dit moment.
De aanwezigheid van dit collageen werd gevolgd door de opeenvolgende verschijning van type V, III en I collageen gedurende de volgende 24 tot 36 uren in het weefsel defect. Deze vroegtijdige aanwezigheid van collageenbevattende cellen was geassocieerd met mononucleaire cellen in de bloedklonter, omdat de cellen die positief kleurden voor collageen, eveneens kleurden met antilichamen in leukocyten cel oppervlakte marker en de MAC-1 antigeen. We beslissen dan menselijk perifeer bloed monocyten te plaatsen in een cultuur dat prolyl hydroxylase bevat. Deze studies toonden aan dat prolyl hydroxylase activiteit in koud geïsoleerde monocyten niet detectabel was, maar de activiteit werd geïnduceerd gedurende de volgende 96 uren van een cultuur op een serumdependente wijze. Deze inductie was geïnhibeerd door cycloheximide en de prolyl hydroxylase activiteit bleek niet gerelateerd te zijn aan C1q biosynthese, omdat de C1q biosynthetische activiteit niet “cosegregate” met de cellen die hoge levels van prolyl hydroxylase activiteit bevatten. Van deze biochemische karakteristieken werd verwacht dat, als de cellen de wondrand binnengaan en blootgesteld werden aan plaatjes afkomstige mediatoren, dat ze dan collageen synthetiseerden. Studies werden eveneens uitgevoerd bij muizen door geïmplanteerde nucleopore (kernarme) membranen te gebruiken om peritoneale (met betrekking tot het buikvlies) macrofagen te verzamelen. Door metabolische labeling studies vertoonden deze cellen, wanneer ze geplaatst waren in cel culturen, de synthese van collagene proteïnen. Bovendien was vol, lengte collageen gedetecteerd door Western blot analyses. Coculturen van fibroblasten en muis peritoneale macrofagen van muizen gekleurd met een antitype I collageen antilichaam en een anti Mac-1 antilichaam, vertoonden de geschikte specificiteit zoals aanwezig in figuur 3.
Figuur 3 Dubbele immunohistochemische kleuring voor type 1 collageen (A) en Mac-1 antigeen B in coculturen van muisstaart fibroblasten en peritoneale macrofagen. De coverslips werden kort gefixeerd in aceton en geïncubeerd met rabbit IgG antimouse type 1 collageen gevolgd door goat antirabbit IgGFitC. De coverslips werden dan geïncubeerd met rat IgG anti-mac-1phycoerythrin. Vergelijking met beide figuren vertoont duidelijk dat de Mac-1positieve cellen eveneens type 1 immunoreactief proteïne bevatten zoals de aangrenzende fibroblasten doen.
Dat zijn de cellen die type I procollageen bevatten en eveneens de Mac-1 antigeen op hun cel oppervlakte afzet, hoewel fibroblastcellen type I collageen immunoreactiviteit bezitten maar niet de Mac-1 kleuring. Alhoewel dit een erg sterk bewijs is, dat muismacrofagen collageen synthetiseren, hebben we deze studies uitgebreid bij het ter plaatse volbrengen van kruisanalyses, door gebruik te maken van een anti- α1 (Ι) procollageen cRNA, onderzocht op cellen die vertoonden een macrofaag te zijn, door positief te kleuren voor anti-Mac-1 antigeen. De resultaten van deze onderzoeken bevestigen dat muismacrofagen, behalve collageenproteïne, eveneens type I procollageen mRNA bevat (figuur 4).
Daarom bij biochemische, immunologische en moleculaire benadering, hebben we aangetoond dat geactiveerde monocyten de mogelijkheid hebben om collageen type I af te zetten. Deze cellen bezitten het fenotype collageen+ /vinertin+ /CD34+ en werden beschreven als circulerende fibrocyten. De relatie van deze circulerende fibrocyten en de geactiveerde monocyten is onduidelijk omdat de auteurs van deze recente studie lange termijn culturen van perifeer bloed leucocyten nodig hadden om deze cellen te identificeren, in tegenstelling met de tijdsduur gebruikt in onze studie. Hoewel, het mogelijk is dat het bloed verschillende cellen bevat die kunnen bijdragen tot de ECM afzetting door inductie van de activiteit door transformatie/differentiatie van monocyten/macrofagen of de accumulatie en/of proliferatie van circulerende fibrocyten.
Samenvattend, de wedersamenstelling van de ECM volgend op een letsel van de huid, betrekt de deelneming van meerdere verschillende celtypes in het weefsel, alsook cellen die binnenkomen door het bloedcompartiment. Ofschoon de residente cellen, de mogelijkheid hebben om de BMZ, vasculaire basale membranen en het normale dichte bindweefsel te hervormen, doen de circulerende cellen dienst als een snel opstellend mechanisme, dat het proces doet beginnen en een stabiel collagene structuur, in de ontwikkelende voorlopige matrix en subsequent granulatieweefsel, vormt. Als de wonde tot ontwikkeling komt, kan de bijdrage van deze cellen geminimaliseerd worden, als de residente cellen gestimuleerd werden om collageen te produceren. Hoewel, onder invloed van chronische inflammatie, dat resulteert in een meer diepere invloed van monocyten, macrofagen, kunnen deze cellen significant bijdragen tot de accumulatie van collageen dat leidt tot grote littekens of zelfs pathologische letsels. Dus wordt het belangrijk om de cellulaire bron van collageen volledig te begrijpen, om kunnen te beoordelen tussen de potentiële verschillen tussen normale en abnormale wondheling.
BEDANKING De auteur wil jan Vaage, PhD, van het Roswell Parc Cancer Institute bedanken voor de waardige samenwerking. Deze samenwerking was essentieel voor het voortzetten van de verklaring van de collagene biosynthetische mogelijkheden van monocyten.
