Praktikum č. 11: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců z čeledi Enterobacteriaceae (Salmonella, Edwardsiella, Yersinia, Shigella, Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter).
Cíle: 1. 2. 3.
Seznámit se s morfologií, kultivačními vlastnostmi a biochemickou aktivitou veterinárně významných rodů. Naučit se postupy bakteriologické diagnosticky salmonel, patogenních yersinií a koliinfekcí. Porozumět teoretickým principům sérotypizace salmonel.
Rod: Escherichia Escherichia coli Je to komenzál střeva teplokrevných zvířat, některé jeho kmeny jsou potenciálně patogenní. • • • • • • • • • •
Nejdůležitější infekce:
septikémie a průjmy telat průjmy sajících a odstavených selat enterotoxémie odstávčat (edémová choroba) mastitidy skotu, MMA (mastitis, metritis, agalakcie) komplex u prasnic septikámie a průjmy jehňat koliseptikémie a kolienteritídy dyzentérie králíků průjmy psů infekce drůbeže (septikémie, koligranulomatóza ) obecně také infekce sliznic urogenitálního a respiračního traktu zvířat a člověka
Faktory zvyšující vnímavost k infekci patogenními E.coli u mláďat hospodářských zvířat: ♦ nedostatečná nebo žádná kolostrální imunita (koliseptikémie) ♦ zmnožení patogenní E.coli ♦ přeplňování chovných zařízení a špatná hygiena ♦ nevyzrálá imunita a nedostatečně stabilizovaná mikroflóra střeva ♦ receptory pro adheziny ETEC během prvního týdne života (telata) ♦ přetrvání receptorů pro některé adheziny u prasat po odstavu (poodstavové průjmy) ♦ přechod na krmné dávky jiného složení (nestravitelné a neresorbovatelné živiny usnadňují množení E.coli) ♦ stres v podobě podchlazení a vytváření nových skupin zvířat DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál: obsah střeva, výkaly, parenchymatózní orgány, vzorky mléka ... Kultivační průkaz: •
kultivace vzorku na selektivně-diagnostická média s laktózou
•
pomnožování vzorku není většinou nutné
•
laktóza-pozitivní kolonie se dále identifikují
68
Biochemická identifikace se nejčastěji provádí s využitím různých komerčně vyráběných mikrotestů např. Enterotest I a II, API systém. Biochemická aktivita E.coli: laktóza +
VPT -
indol + LDC+
citrát -
ureáza - sirovodík -
ONPG +
Sérotypizace - slouží k určení antigenní struktury izolovaného kmene (O a H antigenů). Sérologické skupiny E.coli mohou být charakteristické pro určité patogenní typy. Příklad : Sérotypy izolované ze septikémií a enteritíd telat: O8; O9; O15; O20; O26; O35; O78; O86; O101; O115; O117. Sérotypy ETEC prasat: O8.H19; O9.H-; O20.H-; O45.H-; O101.H-; O138.H14; O138.H-; O139.H1; O141.H4; O147.H19; O149.H10. Určení patogenity. Patogenní kmeny E.coli se vyznačují produkcí (genetickým založením) faktorů, které umožňují jejich patogenní uplatnění v organismu hostitele. Jedná se o adherenčních antigenů a toxiny. Zcela orientačním znakem patogenních kmenů bývá hemolýza na krevním agaru. Adherenční antigeny prokazujeme aglutinací se specifickým antisérem nebo PCR. Produkce toxinů se detekuje testy na tkáňových kulturách linií Vero, CHO, Y-1, nebo se prověřuje přítomnost odpovědných genů metodou PCR. Typy patogenních kmenů E. coli: ETEC - enterotoxické kmeny E.coli produkují jeden nebo oba ze dvou toxinů: 1. termostabilní enterotoxin ST 2. termolabilní enterotoxin LT EIEC - enteroinvazivní kmeny pronikají do enterocytů (faktor invazivity) EPEC - enteropatogenní - cytotoxíny EHEC - enterohemoragické (produkce verotoxinů) Rozlišují se i další typy patogenních kmenů. Rod: Edwardsiella Edwardsiella tarda •
je prokazována ve střevě obratlovců i některých bezobratlých, ve vodě, odpadech a bahně
•
patří k běžné mikroflóře střeva plazů
•
vyvolává latentní infekce, které se mohou u ryb za určitých podmínek rozvinout v klinicky manifestní onemocnění: různé leze, abscesy (ve svalovině, játrech, ledvinách), krváceniny v různých částech těla (včetně ploutví), kožní vředy řady druhů ryb, hlavně úhořů a sumců, (EPDC - emfyzematózní hnilobná choroba sumců), mohou být postiženy i sladkovodní želvy, tuleni, lachtani, delfíni.
•
zaznamenány byly i průjmy u prasat, skotu, psů a jiných živočišných druhů včetně člověka.
69
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - změněné tkáně, výkaly a pod. Kultivační průkaz - selektivní média s laktózou Biochemické vlastnosti: laktóza -, indol +, LDC +, H2S +, MR +. Rod: Citrobacter C. freundii, C.amalonaticus, C. diversus, C. koseri, C.sedlakii, C.farmeri, C.werkmanii, C.youngae, C.braakii O patogenním významu u zvířat je zatím málo známo. Tyto bakterie patří k přirozené mikroflóře střeva. Některé kmeny mohou vyvolat průjmy, mastitidy, případně jiné sekundární infekce. DIAGNOSTIKA viz. obecné schéma diagnostika příslušníků čeledě Enterobacteriaceae Rod: Enterobacter E. cloacae, E. sakazakii, E. taylorae, E. aerogenes, E. gergoviae a další Jsou izolovány z prostředí (voda, půda, rostlinné zbytky a podobně) a střevního traktu zvířat. Mohou vyvolat i infekce hospodářských zvířat: • koně - aborty, infekce genitálního traktu vedoucí ke sterilitě, hřebci mohou být skrytými bacilonosiči. • skot - aborty, mastitidy • prasata - MMA syndrom Rod: Klebsiella Kl. pneumoniae subsp. pneumonie - fakultativní patogen, součást mikroflóry střeva, prostředí Kl. pneumoniae subsp. ozaenae Kl. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis - chronické infekce dýchadel člověka Kl. oxytoca , Kl. terrigena , Kl. planticola - prostředí Kl. pneumoniae subsp. pneumoniae - součást mikroflóry prostředí (půda, voda, rostlinné zbytky, odpady) a střeva zvířat u koní - záněty sliznic genitálií, aborty, generalizované infekce hříbat u skotu - mastitidy (akutní), generalizované infekce a enteritidy u telat u prasat - průjem selat, MMA syndrom Může vyvolat infekce i u jiných druhů zvířat - hlavně drůbeže.
70
Rod Salmonella Současná systematika:
S. enterica 1. poddruh S. enterica subsp. enterica 2. poddruh S. enterica subsp. salamae 3. poddruh S. enterica subsp. arizonae 4. poddruh S. enterica subsp. diarizonae 5. poddruh S. enterica subsp. houtenae 6. poddruh S. enterica subsp. Indica S. bongori !!! Spíše než toto systematické členění se v praxi využívá k označení salmonel názvu sérovaru (viz. Kauffmann-Whiteovo antigenní schéma). Dnes je užíváno komplexní označení, které zahrnuje název druhu, poddruhu a sérovaru; např. Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium. Takovéto komplexní taxonomické označení je poněkud těžkopádné pro rutinní použití, proto se v běžné praxi užívá jen zkrácené označení sérovaru. Jako např. Salmonella typhimurium nebo přesněji Salmonella Typhimurium nebo dokonce jen Typhimurium. Většina (více než 99%) salmonel izolovaných z člověka a zvířat patří k poddruhu I a jeho sérovary jsou označovány názvy. Sérovary poddruhů IIIa a IIIb (arizonae a diarizonae) jsou označovány pouze antigenní formulí, stejně jako sérovary poddruhů II, IV, V a VI popsané po roce 1966. Podle epizootologického, epidemiologického a klinického významu můžeme salmonely rozdělit do několika skupin: A) Sérovary primárně adaptované na člověka S.Typhi - vyvolává specifické onemocnění pro člověka břišní tyfus ( celkové horečnaté onemocnění s bakteriémií a zánětem Peyerových plaků tenkého střeva). S.Paratyphi (A,B,C) - původci paratyfu člověka. b) Sérovary primárně adaptované na určitý druh zvířete S.Dublin - působí salmonelózu skotu - gastroenteritídy a septikemická onemocnění telat, aborty krav a latentní infekce dospělého skotu S.Abortusovis, S.Abortusequi, S.Abortusbovis - vyvolávají aborty u příslušných druhů zvířat S.Pullorum - způsobuje pullorovou nákazu (bílou úplavici) kuřat a S.Gallinarum tyfus dospělé drůbeže S. Choleraesuis - enteritidy prasat, latentní infekce střeva, septikemie S.Typhisuis - chronické enteritidy selat S.Arizonae (řada sérovarů různé antigenní struktury): - O51; Z4, Z23 salmonelózy krůt, aborty ovcí, běžná mikroflóra střeva plazů. c) Sérovary, které nejsou adaptovány na jeden hostitelský druh, vyvolávají infekce zvířat a jsou přenosné na člověka nejčastěji prostřednictvím kontaminovaných potravin a vyvolávají tzv. sekundární salmonelózy. K nejčastějším z nich patří tyto sérovary :S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Agona, S. Infantis, S. Heidelberg, S. Derby a další.
71
Salmonelové infekce jsou nejčastěji zjišťovány v chovech vodní a hrabavé drůbeže, relativně méně často v chovech prasat a skotu, sporadicky u koní, psů, koček a okrasných ptáků. Zvláštní význam mají tyto infekce u plazů, kde jsou často příčinou sekundárních infekcí. Výskyt těchto infekcí ovlivňuje zoohygienická úroveň chovu, výživa a celková péče o zvířata. Ve většině případů probíhají tyto infekce u odrostlejších a dospělých zvířat inaparentně, u mláďat spíše jako infekce manifestní, ve formě enteritíd a celkových infekcí sepsí (věková rezistence). Vedle primárních zdrojů (nemocná zvířata) jsou závažným zdrojem infekce člověka kontaminované potraviny živočišného původu (zvláště vejce a vaječné výrobky), které jsou konzumovány bez řádné tepelné úpravy, dále pak kontaminované povrchové vody a prostředí. U lidí probíhají salmonelové infekce pod obrazem typickým pro alimentární toxikoinfekce: u dospělých - akutní horečnatá gastroenteritis s krátkou bakteriemií nebo lehký průběh pod klinickým obrazem akutní enteritídy. U dětí do 1-2 roků a přestárlých, jsou častější i celková septikemická onemocnění. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - rektální výtěry, výkaly, parenchymatózní orgány, potraviny, voda, krmivo. Kultivační průkaz - viz. schéma č. 1. Schématické znázornění postupu vyšetření 1. den (krmiva, potraviny, vzorky prostředí)
∂ předmnožení vzorků s nízkým počtem salmonel v pufrované peptonové vodě (inokulační poměr 1:10)
vzorek
(sekční materiál, klinický materiál)
• přímá kultivace vzorků na selektivně-diagnostické půdy (BGA, DCA, XLD, MAL ...)
÷ přímé selektivní pomnožení vzorků v některém z uvedených tekutých médií: Selenitová půda (IP 1:10), Rappaport-Vassiliadisova půda (IP 1:100), je možno použít i modifikaci polotuhého agaru dříve se užívaly i Mueller-Kauffmannův tetrathionátový bujon , Rappaportova půda inkubace 24-48 h. při 37o C, případně 42o C 2. den 3 subkultivace na selektivně-diagnostické půdy (nejlépe paralelně na dvě) ze selektivního pomnožení 3 selektivní pomnožení vzorků předmnožených v pufrované peptonové vodě 3 subkultivace podezřelých kolonií z médií po přímé kultivaci vzorku 3. až 5. den - dokončení subkultivací - izolace čistých kultur a screening biochemických vlastností na TSI, LIA a ureázovém testu - úplná biochemická identifikace (Enterotest I a II, API systém) - sérologické určení sérovaru rychlou sklíčkovou aglutinací - další vyšetření (antibiogram, fagová typizace a pod.) Příslušnost bakteriálního kmene k rodu Salmonella se stanoví na základě biochemického vyšetření a případně podle výsledků aglutinace s polyvalentním salmonelovým antisérem nebo reakce kultury s polyvalentním O1 fágem. Určení sérovaru se provede rychlou sklíčkovou aglutinací bakteriální kultury se salmonelovými antiséry:
72
Tab. č. 10: Počty sérovarů salmonel Druh /poddruh Počet sérovarů S.enterica - subsp. enterica 1 416 - „ salamae 477 - „ arizonae 94 - „ diarizonae 317 - „ houtenae 66 - „ indica 10 S.bongori 19 Celkem sérovarů 2 399
Tabulka č. 11: Kauffmann-Whiteovo antigenní schéma - výběr významných sérovarů sérologická skupina
sérovar
O-antigeny
H-antigen fáze 1 fáze 2
skupina A S. Paratyphi A
1, 2, 12
a
(l,5)
skupina B S. Abortusequi S. Paratyphi B S. Abony S. Abortusovis S. Saintpaul S. Reading S. Agona S. Typhimurium S. Lagos S. Agama S. Bredeney S. Heidelberg
4, 12 1,4,(5),12 1,4,12,27 4,12 1,4,(5),12 1,4,(5),12 1,4,12 1,4,(5),12 1,4,12 4,12 1,4,12,27 1,4,(5),12
S. Paratyphi C S. Choleraesuis S. Typhisuis S. Montevideo S. Infantis S. Bareilly
6,7 (Vi) 6,7 6,7 6,7 6,7,14 6,7,14
S. Muenchen S. Newport
6,8 6,8
S. Typhi S. Enteritidis S. Dublin S. Panama S. Gallinarum
9,12(Vi) 1,9,12 1,9,12(Vi) 1,9,12 1,9,12
b b c e,h e,h f,g,s i i i l,v r
e,n,x 1,2 e,n,x 1,6 1,2 1,5 1,2 1,5 1,6 1,7 1,2
skupina C1 c (c) c g,m(p),s r y
1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
skupina C2 d e,h
1,2 1,2
d g,m g,p l,v -
(1,7) 1,5 -
e,h e,h l,v
1,6 l,w 1,7
skupina D1
skupina E1 S. Anatum S. Meleagridis S. Give
3,10 3,10 3,10
73
Postup sérotypizace salmonel (Př. neznámá kultura bude patřit do sérotypu S. Typhimurium): ♦
aglutinace 24 hodinové kultury salmonel na MPA se smíšeným salmonelovým antisérem
(obsahuje protilátky proti hlavním O-antigenům všech sérologických skupin K-W antigenního schématu)
♦
pokud je výsledek pozitivní, podrobí se kultura sklíčkové aglutinaci se salmonelovými antiséry specifickými pro jednotlivé sérologické skupiny (naše neznámá kultura aglutinuje se
♦
rozlišení jednotlivých sérotypů v rámci sérologické skupiny B si vyžaduje určit u neznámé salmonelové kultury bičíkové antigeny, které existují u většiny sérovarů ve dvou fázích, determinovaných geny H1 a H2 (naše neznámá kultura aglutinuje s antisérem anti i)
♦ ♦
♦
♦
salmonelovým antisérem O4, proto se výběr hledaných sérotypů zúží na sérologickou skupinu B)
z tabulky č. 11 je patrné, že tento bičíkový antigen mohou ze sérologické skupiny B tvořit 3 sérotypy – Typhimurium, Lagos a Agama. Pro pochopení dalšího postupu si musíme uvědomit, že kultura salmonel při množení ve frekvenci asi 105 bude obsahovat nové buňky vybavené bičíkovým antigenem opačné (druhé, nespecifické) fáze. H-antigen tzv. fázuje a jeho expresi ovlivňuje gen vh2 , pracující jako spínač v uvedené frekvenci. Naše neznámá kultura je směsí salmonelových buněk vybavených H antigenem i a buněk vybavených H antigenem opačné fáze, kterých je mnohem méně. Proto musíme získat kulturu, u které potlačíme první určenou fázi H antigenu. Připravíme polotuhý MPA, který obohatíme o několik kapek salmonelového antiséra proti antigenu H i a tím naplníme skleněnou U trubici. Po ztuhnutí agaru do jednoho ramene U trubice naočkujeme naši neznámou kulturu a necháme do druhého dne inkubovat v termostatu při 37 oC. Protilátky budou množící se kultuře bránit v tvorbě bičíků H-i a pohybu, proto do druhého ramene U trubice se budou pohybovat pouze buňky vybavené druhou fází H antigenu. Tuto kulturu přeočkujeme na MPA a se získanou kulturou dokončíme sérotypizaci. Pokud naše kultura s potlačenou specifickou (první fází) H antigenu bude aglutinovat se salmonelovým antisérem H 2 jedná se o sérotyp S.Typhimurium.
Úkol: Proveďte sérotypizaci neznámé kultury salmonel Rod: Shigella S.dysenterie - tropy a subtropy S.boydii - Blízký Východ, Sev. Afrika
S.flexneri - celosvětově S.sonnei - celosvětově
Shigely vyvolávají u člověka dyzentérii. Infekce zvířat jsou vyjímkou, kromě primátů (ZOO), u kterých vyvolávají gastroenteritidy, někdy i aborty a pneumonie. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - rektální výtěry, výkaly, parenchymatózní orgány Kultivační vyšetření - přímá kultivace - SSA, XLD, MCA pomnožení - selenitová půda Biochemické vyšetření - Enterotest I a II Rod: Proteus P.mirabilis, P.vulgaris, P.myxofaciens, P.penneri Jedná se většinou o saprofyty střeva člověka a zvířat, podílí se na rozkladu organické hmoty v prostředí, jsou často prokazovány v různých vyšetřovaných materiálech jako
74
kontaminující mikroflóra. Některé kmeny se mohou uplatnit i jako původci průjmových infekcí dětí a mláďat, případně jiných infekcí. Jako podmíněně patogenní baktérie mohou vyvolat: • koně - endometritídy, urogenitální infekce • skot - mastitídy, endometritídy, u býků katarální infekce prepucia • • •
telata - gastroenteritídy prasata - průjmy, MMA komplex, močové infekce psi a kočky - močové infekce, otitis externa, případně jiné sekundární infekce
Při kontaminaci potravin vyvolávají hnilobný rozklad bílkovin.
Rod: Morganella M.morganii subsp. morganii M.morganii subsp. sibonii Vyskytují se ve výkalech člověka a zvířat, mohou být původcem různých sekundárních infekcí Rod: Providencia P.alcalifaciens, P.heimbachae, P.rettgeri, P.rustigianii, P.stuartii Příslušníci rodu mohou jako podmíněně patogení mikroorganismy vyvolávat průjmy mláďat, infekce močových cest. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - výkaly, výtěry, stěry, tkáně, potraviny. Kultivační vyšetření - na MPKA a selektivně-diagnostická média s laktózou. Biochemická identifikace-využití Enterotestu Ia II. Rod: Yersinia Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica,Y.ruckeri, Y.frederiksenii, Y.kristensenii, Y.rhodei, Y.intermedia, Y.aldovae, Y.mollaretii, Y.bercovieri Y. pseudotuberculosis ♦ pseudotuberkulóza hlodavců a ptáků (domácích i divokých) ♦ u jiných domácích zvířat (kůň, skot, prase, ovce, koza) jsou časté případy latentního bacilonosičství ve střevě Vyšetřovaný materiál - výkaly, střevo, orgány (změněné tkáně) Kultivační vyšetření: ℵ kultivace přímá: na MPKA a selektivně-diagnostická média s laktózou (CIN agar) ℑ chladové pomnožení: ve fosfátovém pufru při 4oC po 3 týdny
75
Y. enterocolitica Byla izolována ze střeva u celé řady domácích a volně žijících zvířat, u kterých většinou nevyvolává klinicky manifestní onemocnění. Pouze u činčil, zajíců, opic, ovcí a koz, může způsobit generalizovanou infekci nebo enteritídu. Pro člověka jsou patogenní sérovary O:3; O:5,27; O:8 a O:9. K častým bezsymptomním bacilonosičům těchto sérovarů patří prase domácí. Sekundárně mohou být těmito mikroorganismy kontaminovány potraviny, voda, zelenina a pod.. Tabulka č. 12: Diferenciace zástupců rodu Proteus a Morganella Vlastnost P.mirabilis P.vulgaris P.myxofaciens P.penneri Plazivý růst + + FAD + + + + Indol + Sirovodík + + v Želatinolýza + + v Utilizace v v + citrátu ODC + ureáza + + + +
M.morganii + + + +
Tabulka č. 13 : Diferenciační schéma laktózanegativních rodů č. Enterobacteriaceae Vlastnost VP test FAD Indol LDC H2S ureáza pohyblivost + + + Salmonella V Shigella + + + + Edwardsiella o + Yersinia +22 C + V + + + Proteus + + V + Providencia + + + Serratia + + + Hafnia (upraveno pro výuku) Vysvětlivky: V – variabilní , FAD - fenylalanindeamináza, LDC - lyzindekarboxyláza
76
