CHEMIE POTRAVIN A CHEMICKÉ LABORATORNÍ METODY PRAKTICKÁ CVIČENÍ

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO

FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav hygieny a technologie mléka

CHEMIE POTRAVIN A CHEMICKÉ LABORATORNÍ METODY PRAKTICKÁ CVIČENÍ Prof. MVDr. Lenka Vorlová, Ph.D. MVDr. Michaela Králová, Ph.D. RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Mgr. Romana Kostrhounová, Ph.D.

Brno 2014

Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost:

„Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin“ (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287)

1

OBSAH 1 Zásady práce v laboratoři ............................................................................................................................... 4 1.1 1.2

Bezpečnost práce v laboratoři ..................................................................................................................... 4 Vedení laboratorních záznamů ................................................................................................................... 7

2 Fyzikálně-chemické parametry masa ............................................................................................................ 8 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7

Stanovení kyseliny mléčné ......................................................................................................................... 8 Stanovení pH elektrometricky .................................................................................................................. 11 Stanovení hydroxyprolinu ........................................................................................................................ 13 Stanovení histaminu v rybách ................................................................................................................... 16 Stanovení amoniaku pomocí iontově selektivní elektrody ....................................................................... 18 Stanovení amoniaku spektrofotometricky ................................................................................................ 20 Extrakce polycyklických aromatických uhlovodíků z rybí svaloviny metodou QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) ..................................................................................................... 22

3 Fyzikálně-chemické parametry masných výrobků ..................................................................................... 24 3.1 3.2 3.3

Stanovení dusitanů .................................................................................................................................... 24 Potenciometrické stanovení chloridů z popela.......................................................................................... 26 Stanovení obsahu volného tuku (ČSN ISO 1444) .................................................................................... 28

4 Fyzikálně – chemické parametry mléka ...................................................................................................... 30 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7

Stanovení pH (ČSN 57 0530) ................................................................................................................... 30 Stanovení titrační kyselosti podle Soxhlet-Henkela (rozhodčí metoda) (ČSN 57 0530) .......................... 31 Stanovení laktózy polarimetricky (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530)............................................... 32 Stanovení vápníku komplexonem (provozní metoda podle ČSN 57 0530) .............................................. 34 Stanovení chloridových iontů (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530) .................................................... 36 Stanovení bílkovin pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) .......................................................................................................................... 37 Extrakce na pevné fázi (SPE) tetracyklinových antibiotik ....................................................................... 41

5 Fyzikálně-chemické parametry mléčných výrobků .................................................................................... 43 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5

Stanovení pH (ČSN 57 0530) ................................................................................................................... 43 Stanovení titrační kyselosti podle Soxhlet-Henkela (rozhodčí metoda) (ČSN 57 0530; ČSN 57 0107) .. 44 Stanovení chloridu sodného v sýrech rozhodčí metoda (ČSN 57 0107) ................................................... 47 Extrakce tukové složky pomocí onePSE extraktoru ................................................................................. 49 Stanovení cholesterolu v mléce a mléčných výrobcích metodou HPLC .................................................. 51

6 Fyzikálně-chemické parametry vajec .......................................................................................................... 54 6.1

Stanovení cholesterolu enzymovou metodou ........................................................................................... 54

7 Fyzikálně-chemické parametry medu .......................................................................................................... 56 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6

Stanovení hydroxymethylfurfuralu podle Winklera ................................................................................. 57 Stanovení obsahu vody refraktometricky ................................................................................................. 60 Stanovení elektrické vodivosti .................................................................................................................. 62 Stanovení titrační kyselosti ....................................................................................................................... 63 Důkaz porušení medu škrobovým sirupem, škrobovým cukrem a sladovými výtažky (Fieheho reakce II) .............................................................................................................................................................. 64 Stanovení aktivity diastázy v medu enzymovou metodou ........................................................................ 65

8 Literatura ....................................................................................................................................................... 68

2

PŘEDMLUVA

Chemie potravin a chemické laboratorní metody je průřezovou disciplínou pro potravinářské vědy, svou náplní je "praeklinickou" disciplínou pro navazující předměty technologickohygienické bakalářského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin FVHE VFU Brno. Náplň praktické výuky je zaměřena na zvládnutí analytické práce v hygienicko-potravinářské laboratoři, zaměřené na osvojení si metodik fyzikálně-chemického rozboru jednotlivých komodit a dynamických dějů v nich probíhajících; správného vyhodnocení výsledků (výpočetní technika) a jejich interpretaci vzhledech k platným hygienickým limitům. Předkládaný materiál vede studenta od bezpečnosti práce, přes vypracování protokolu ze cvičení až po jednotlivé metody, prováděné na cvičeních.

3

1

ZÁSADY PRÁCE V LABORATOŘI

Nezbytnou podmínkou úspěšné práce v laboratoři je dobrá teoretická příprava posluchače. Proto je nezbytné, aby posluchači při příchodu do praktických cvičení měli prostudovány kapitoly vztahující se k experimentální práci a to jak z návodů na cvičení, tak popřípadě i z další literatury. Jedině tak je možno zvládnout, v řadě případů náročné metodiky analýzy potravin. Vzhledem k bezpečné práci v chemické laboratoři, ale i podmínkou úspěchu je pořádek a čistota v laboratoři. Použité chemické sklo se po předběžném vypláchnutí ukládá do určených košů. Papírový a tuhý odpad, zrovna tak jako rozbité sklo je nutno třídit do předem označených nádob. Je třeba udržovat v čistotě výlevky (nevyhazovat tuhý odpad), digestoře, váhové stoly a pracovní stoly. Zvláštní pozornost je třeba věnovat udržování čistoty analytických vah a předvážek. V čistotě je potřeba udržovat i přípravnu pro vzorky a další společné prostory. Po skončení práce si každý uklidí své pracovní místo a přesvědčí se, zda jsou vypnuta elektrická zařízení, případně přívod vody a plynu. Své pracovní místo předá asistentovi cvičení. Před odchodem z laboratoře si studenti umyjí pečlivě ruce. Ochranný oděv (plášť) odloží až po opuštění laboratoře.

1.1 Bezpečnost práce v laboratoři Bezpečná práce v chemické laboratoři předpokládá dodržování následujících zásad:  Vstup do laboratoře je zakázán osobám, které v ní nepracují.  Povolené je vykonávat jen přikázané práce a ty, ke kterým dal povolení odpovědný vedoucí laboratorního cvičení.  V laboratoři je třeba používat ochranný plášť (je potřeba jej obléci před vstupem do laboratoře) a podle potřeby i jiné ochranné pomůcky (brýle, štíty, rukavice).  V laboratoři se nesmí jíst, pít ani kouřit.  Chemikálie a roztoky se nesmí zkoušet ochutnáváním.  Při zkoušce čichem je třeba postupovat opatrně - přivanout si výpary rukou.  Tuhé chemikálie se nabírají jen laboratorními lžičkami, nepoužité se nevracejí do původních obalů. 4

 Označení nádob s chemikáliemi je třeba chránit před poškozením.  Žíraviny (silné kyseliny, silné zásady a koncentrovaná kyselina octová) i zředěné mohou způsobit poškození kůže, sliznic a očí. Účinek se zvyšuje s teplotou. Pro práci s nimi platí:  přelévají se vždy pouze pomocí nálevky  při ředění kyselin se přilévá kyselina do vody  nikdy se nepipetují ústy (pipetují bezpečnostními pipetami, pomocí balónku nebo se odměřují dávkovačem)  s koncentrovanými pracujeme v digestoři  Tuhé hydroxidy se při rozpouštění sypou do připravené vody.  Rozlité kyseliny a zásady se nejprve spláchnou vodou a zředěné se neutralizují.  Spalování, žíhání a jakákoliv manipulace s látkami dýmavými, dráždivými a zapáchajícími se provádí v digestoři s dobrým odtahem.  Jedovaté kapaliny se pipetují bezpečnostními pipetami, pomocí balónku nebo se odměřují dávkovačem.  Při zahřívání hořlavin používáme vodní lázeň a digestoř s dobrým odtahem.  Při rozlití hořlaviny je třeba zhasnout kahany a vypnout elektrické spotřebiče (páry těžší než vzduch, držící se při zemi mohou vzplanout i na dálku).  Odpadní chemikálie (hořlaviny, látky jedovaté, silné kyseliny a zásady) se nesmí vylévat do komunálního odpadu, ale do určených označených sběrných nádob.  Tlakové nádoby s plyny musí být zajištěné proti pádu řemeny, řetězy nebo v pojízdných stojanech, jejich vzdálenost od hořícího plamene smí být nejméně 3 m.  Při manipulaci se sklem a při jeho umývání je třeba dávat pozor na poškozené okraje.  Je zakázáno svévolně zasahovat do elektrického rozvodu. Zjištěné poruchy je třeba okamžitě hlásit vedoucímu cvičení a elektrické zařízení okamžitě vypnout.  Měřicí přístroje, destilační a jiné aparatury nesmí být zapnuté bez dozoru.  O všech úrazech a nehodách je třeba okamžitě informovat vedoucího cvičení. Prevence vzniku požáru:  Studenti jsou povinni chovat se tak, aby svým jednáním nedali příčinu vzniku požáru.  Studenti musí dodržovat předpisy a pokyny k zajištění požární bezpečnosti při práci, seznámit se s požárním řádem pracoviště, s obsahem požárně poplachových směrnic a být proškoleni.

5

 Při práci s vařiči dbají studenti na bezpečné rozmístění pomůcek v digestoři.  Nevychladlé tepelné spotřebiče nesmí být uloženy v uzavřené skříni.  Každý požár ,(i který se podařilo ihned uhasit) musí být oznámen vyučujícímu. Poplachové směrnice v případě požáru:  Požární poplach je vyhlášen voláním HOŘÍ.  Podle pokynů vyučujících studenti ukázněně opustí ohrožené prostory a shromáždí se na určeném místě.  Při evakuaci je důležité nevyvolávat zbytečnou paniku a neohrožovat svým chováním ostatní evakuované osoby.  Povinností osob je, při zjištění požáru, jej sám ihned uhasit nebo, není-li to možné, bezodkladně vyhlásit požární poplach dle platných poplachových směrnic a ohlásit vznik požáru.  V případě zahoření (drobný požár v laboratoři) např. vznícení par v kádince nebo baňce, kdy páry nad hladinou klidně hoří, k uhašení zpravidla postačuje překrytí nádoby hodinovým sklem, plechovým hrncem. V případě požáru se využívají ochranné prostředky (hasicí roušky, sprchy a přístroje)  Platí zákaz použití vody, vodních a pěnových hasicích prostředků k hašení elektrických zařízení pod napětím. První pomoc při zasažení žíravinami: Poznámka: Nejzranitelnějším orgánem jsou oči, tzn. při jakékoliv manipulaci s agresivními kapalinami používat ochranný štít nebo alespoň ochranné brýle.  Při zasažení očí hned vypláchnout oči proudem tekoucí vody (rozevřená oční víčka, vyndané kontaktní čočky) po dobu 10 – 30 minut od vnitřního koutku k zevnímu, aby nebylo zasaženo druhé oko. Podle situace volat záchrannou službu nebo zajistit co nejrychleji lékařské odborné ošetření.  Při styku s kůží ihned svléci potřísněné šatstvo a šperky v místě zásahu. Zasažené místo oplachovat proudem pokud možno vlažné vody po dobu 10 – 30 minut. Poleptané části kůže překrýt sterilním obvazem, na kůži nepoužívat masti ani jiná léčiva. Podle situace volat záchrannou službu nebo zajisti lékařské ošetření. Poznámka: Při zasažení látkami s leptavými účinky nepoužíváme neutralizační roztoky.

6

1.2 Vedení laboratorních záznamů Dosažení spolehlivých výsledků vyžaduje nejen pečlivé dodržování všeobecných zásad analytické práce, ale i pečlivé vedení laboratorních záznamů. Na základě laboratorních záznamů student pro každou úlohu vypracuje protokol. Výsledky naměřené v průběhu cvičení je nezbytné pečlivě zapisovat, vypočítat a zhodnotit v protokolech, které jsou vedeny na volných listech nebo v nelinkovaném sešitě A4. Pro každou úlohu student vypracuje protokol, který musí obsahovat níže uvedené údaje. Protokol o laboratorním vyšetření Název úlohy: Jméno a příjmení: Datum: V této části je třeba uvést následující údaje:  charakteristika vzorků  navážky vzorků  popis odchylek od postupu v návodu  naměřené údaje (optimální je zpracování do tabulky): spotřebovaný objem titračního činidla, hodnoty naměřených veličin získaných pomocí instrumentální techniky, např. absorbance, potenciál, index lomu atd. Výpočty: (včetně grafů) Závěr: (stručné shrnutí a interpretace výsledků) Vyhotovený protokol je student povinen odevzdat na následujícím cvičení asistentovi (resp. vedoucímu cvičení).

7

2

FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY MASA

2.1 Stanovení kyseliny mléčné Princip: Kyselina mléčná je oxidována koenzymem NAD+ za katalýzy laktátdehydrogenázy na pyruvát a NADH. Při reakci vzniklé množství NADH je ekvivalentní množství kyseliny mléčné. Hladina NADH je měřena při 340 nm.

Reakce: L-LDH

(1) L-LAKTÁT + NAD+ → L-PYRUVÁT + NADH + H+ GPT

(2) L-PYRUVÁT + L-GLUTAMÁT → L-ALANIN + -KETOGLUTARÁT Poznámka: Za účelem posunutí chemické rovnováhy na stranu pyruvátu a NADH je pyruvát v další reakci pomocí GPT (glutamát-pyruvát transaminázy) a kyseliny glutamové převáděn na alanin a kyselinu -ketoglutarovou. Chemikálie a roztoky:  ROZTOK 1: pufr - pH 10, D-glutamová kyselina, azid sodný 0,02%  ROZTOK 2: NAD+  ROZTOK 3: D-glutamát-pyruvát-transamináza (GPT)  ROZTOK 4: L-laktátdehydrogenáza (LDH)  kyselina chloristá, HClO4 70%  hydroxid sodný, KOH c = 2 mol.l-1  pufry pH 7 a 10 Přístroje a pomůcky:  homogenizátor  pH-metr a kombinovaná skleněná elektroda  spektrofotometr UV VIS

8

 laboratorní sklo, filtrační papír KA 4 (středně rychlá filtrace 130 [s], záchyt částic nad 4 [m])

Postup: Svalovina zbavená povázek, šlach a tukové tkáně se naškrábe (zmražené maso nebo maso v rigoru mortis se nakrájí na malé kousky) a naváží se 10,00 g. Přenese se do čistého mixeru a zhomogenizuje s 60 ml vychlazené HClO4 c = 1 mol.l-1 5 minut při 5 000 ot./min. Potom se homogenát přeleje do kádinky o objemu 250 ml. Do mixeru se odměří 100 ml destilované vody, zapnutím se důkladně propláchne a přidá k homogenátu. Dalšími 20 ml dest. vody se mixér naposledy vypláchne a přidá do kádinky k homogenátu. Pomocí pH-metru, kombinované skleněné elektrody, za stálého míchání a KOH c = 2,0 mol.l-1 se homogenát zneutralizuje a nastaví se pH na 10 - 11. Poté se homogenát převede kvantitativně do 250 ml odměrné baňky, doplní destilovanou vodou po rysku a promíchá. Pro odloučení tuku se nechá 15 minut stát v chladu (lednička, ledová tříšť). Dále se zfiltruje přes hustý skládaný filtr do čisté, suché zkumavky. První ml filtrátu se vylijí a z dalších se bere ke stanovení: Schéma pipetování do zkumavek: Slepá zkouška

Vzorek

1,6 ml

1,5 ml

-

0,1 ml

ROZTOK 1

0,5 ml

0,5 ml

ROZTOK 2

0,1 ml

0,1 ml

ROZTOK 3

0,02 ml

0,02 ml

Destilovaná voda Filtrát vzorku

Zkumavky se promíchají a po 5 min se změří absorbance (A1). Při měření se roztoky nalévají zpátky do zkumavek. Potom se přidá:

ROZTOK 4

Slepá zkouška

Vzorek

0,02 ml

0,02 ml

Promíchá se a po 10 minutách se změří absorbance (A2). Výpočet: U slepé zkoušky i u vzorku se vypočítá rozdíl absorbancí: 𝛥𝐴 = (𝐴2 − 𝐴1 ) 𝑉𝑍 − (𝐴2 − 𝐴1 )𝑆𝐿

9

Přepočet pro stanovení koncentrace laktátu v roztoku:

𝑐=

𝑉 ∙ 𝑀𝐺 ∙ 𝛥𝐴 [g. l−1 ] 𝜀 ∙ 𝑑 ∙ 𝑣 ∙ 1000

V

konečný objem roztoku v kyvetě [ml]

v

objem použitého filtrátu vzorku [ml]

MG

molekulová hmotnost stanovovaného substrátu [g]

d

šířka kyvety [cm]



extinkční molární koeficient NADH při 340 nm [6,3 l.mmol-1.cm-1]

Poznámka: Přepočítáním výsledku ředěním vzorku se stanoví koncentrace kyseliny mléčné v původním vzorku (g.kg-1 a mol.g-1).

10

2.2 Stanovení pH elektrometricky Princip: Stanovení pH spočívá v měření potenciálu vznikajícího na rozhraní dvou fází (elektrolytu) oddělených membránou měřící skleněné elektrody, ponořené do vyšetřovaného extraktu nebo vzorku. Tento potenciál se snímá v porovnání s konstantním potenciálem druhé - referentní elektrody. Jako referentní se nejčastěji používá elektroda kalomelová nebo argentochloridová. Chemikálie a roztoky:  pufry pH = 7 a 4 (komerční roztoky)  ethanol 95% Přístroje a pomůcky:  pH metr  kombinovaná vpichová elektroda  laboratorní sklo, filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])

Postup: Na cvičeních se používá vpichová kombinovaná skleněná elektroda. Nejprve se provede kalibrace pH metru s elektrodou pomocí pufrů (pH 7 a 4). Pokud není k dispozici pH-metr s korekcí teploty, je třeba, aby teplota měřených pufrů i vzorků byla 20 ± 2 °C. Před ponořením do pufru se elektrody několikrát opláchnou destilovanou vodou a lehce se osuší buničitou vatou. Při vlastním stanovení se elektroda ponoří do vzorku a odečte se pH na displeji. Měření pH ve výluhu Při stanovení pH se obvykle používá vodního 10% výluhu. Ze vzorku se odpreparuje tukové vazivo a šlachy. Z 30 - 40 g svaloviny se rozemletím připraví masová měl. Odváží se 10 g rozmělněného masa do kádinky o objemu 250 ml, zalije se 100 ml destilované vody (zbavené oxidu uhličitého převařením) a nechá se 15 minut stát za občasného míchání. Získaný výluh se zfiltruje. Měření pH se provede u každého výluhu jedenkrát.

11

Měření pH vpichem Vpichovou kombinovanou elektrodou je možno měřit pH přímo ve svalové tkáni. Měří-li se vzorek tuhé konzistence, je třeba nejprve do něj udělat přiměřený vpich (teflonovým bodcem), do kterého se pak elektroda zasune. Přímé měření pH vzorku bez přípravy extraktu vpichovou kombinovanou elektrodou se opakuje 10krát, přičemž elektroda se zapíchne vždy do jiného místa (vyhodnotí se pomocí základní statistiky). Čištění a uchovávání elektrody: Po ukončení měření se elektroda opláchne ethanolem a poté destilovanou vodou. Elektroda se uchovává v úchovném roztoku dle doporučení výrobce, většinou v pufru pH 7,0. Upozornění: S elektrodou je nutno pracovat velmi opatrně a citlivě, protože hrot elektrody je velmi náchylný k mechanickému poškození. Zvláště při měření pH masa v období rigoru mortis je nebezpečí poškození elektrody díky tuhosti tkáně, a proto je použití teflonového bodce nezbytné.

12

2.3 Stanovení hydroxyprolinu Princip: Vzorek masa je rozložen varem s HCl. Hydrolýzou bílkovin uvolněný hydroxyprolin se zoxiduje Chloraminem T na kyselinu 3-hydroxy-4-amino-1,3 dienvalerovou, která dává s pdimetylaminobenzaldehydem červené zbarvení. Absorbance je měřena při 558 nm. Chemikálie a roztoky:  kyselina chlorovodíková, HCl koncentrovaná  pufr pH 6,8 (26,0 g monohydrátu kyseliny citronové C6H8O7, 14,0 g hydroxidu sodného NaOH peciček a 78,0 g octanu sodného bezvodého CH3COONa se rozpustí v 500 ml destilované vody. Přidá se 100 mg Na-etylmercurythiosalycylátu a kvantitativně se převede do 1000ml odměrné baňky. Po přídavku 250 ml 1-propanolu C3H8O se doplní vodou po rysku. Pufr je nutné skladovat ve tmě při 4 °C - stálý 2 měsíce).  Oxidační roztok (1,4 g trihydrátu chloraminu T CH3C6H4SO2NClNa.3H2O je naředěn do pufru pH 6,8 do 100 ml. Při skladování v lednici je stálý 1 týden.)  Barvící roztok (10,0 g dimethylaminobenzaldehydu je rozpuštěno v 35 ml HClO4 - w = 60 %. Nakonec se opatrně přidá 65 ml 2-propanolu. Tento roztok musí být každý den čerstvý.)  Standardy: 1) Standard hydroxyprolinu 600 mg.l-1 (120 ml L-hydroxyprolinu je naředěno vodou do 200 ml odměrné baňky) 2) Standard hydroxyprolinu 6 mg.l-1 (5 ml roztoku 1 se napipetuje do 500 ml odměrné baňky a doplní po rysku) 3) Z roztoku 2) dávkujeme:10; 20; 30; 40 ml do 100 ml odměrných baněk a doplníme destilovanou vodou po rysku. Koncentrace těchto standardních roztoků jsou 60; 120; 180; 240 g.100 ml-1. Přístroje a potřeby:  analytické váhy  mlýnek na maso  vodní lázeň  varné hnízdo

13

 laboratorní sklo, filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])

Postup: Příprava hydrolyzátu: Vzorek masa se nakrájí na 1 cm kousky a pomele. 4 g dobře zhomogenizovaného vzorku masa se naváží s přesností na 1 mg do 100 ml varné baňky. Přidá se 30 ml koncentrované HCl a varné kamínky. Pomocí topného zařízení je roztok při mírném varu zahříván 8 h pod zpětným chladičem. Hydrolyzát se kvantitativně převede do 500 ml odměrné baňky, přidá se 5 ml petroletheru a doplní se vodou po rysku. Po důkladném promíchání je odstraněna vrstva petroletheru s tukem (odsátím) a vodná fáze přefiltrována přes skládaný filtr do 500 ml odměrné baňky. Hydrolyzát je stálý 4 týdny při 4 °C. Dále je hydrolyzát naředěn tak, aby se očekávaná hladina hydroxyprolinu pohybovala v rozmezí 0,6 - 2,4 mg.ml-1. Ředěním se tak dostane odpovídající objem (V). V našem případě se odměří 30 a 40 ml do 250 ml odměrných baněk a destilovanou vodou se doplní po rysku. Vlastní stanovení - vzorku: K 4 ml naředěného roztoku hydrolyzátu ve zkumavce se přidají 2 ml oxidačního činidla, zamíchá se a nechá stát 20 min při laboratorní teplotě. Potom se přidají 2 ml barvícího roztoku. Po důkladném promíchání je zkumavka rychle dána do vodní lázně o teplotě 60 °C a ponechá se 15 minut. Potom následuje ochlazení zkumavky pod tekoucí vodou 3 minuty a nechá se stát 1/2 h při laboratorní teplotě. Potom se změří absorbance při 558 nm v 1 cm kyvetě. Vlastní stanovení - standardů: Zpracovávají se stejně jako vzorky jen místo 4 ml hydrolyzátu se dají 4 ml standardu ad 3). Stejným postupem se zpracuje slepý vzorek: místo 4 ml hydrolyzátu (resp. standardů) se dají 4 ml destilované vody. Výpočet: Obsah hydroxyprolinu w (g.100 g-1) vzorku se vypočítá:

14

𝑤=

x

12,5 . 𝑥 𝑚. 𝑉

[g. 100 g −1 ]

koncentrace hydroxyprolinu v g.ml-1 v naředěném hydrolyzátu se vypočítá z kalibrační přímky

m

navážka vzorku [g]

V

objem (V) hydrolyzátu v ml, vzatý k naředění do 250 ml

Poznámka: Výsledek se přepočte na kolagen.

15

2.4 Stanovení histaminu v rybách Princip: Po provedené extrakci vzorku se filtrát i standard vyvíjejí pomocí tenkovrstvé chromatografie a po následné detekci chromatogramu se semikvantitativně stanoví obsah histaminu, porovnáním intenzity barevných skvrn vzorku a standardu. Chemikálie a roztoky:  kyselina chlorovodíková, HCl c = 6 mol.l-1  vyvíjecí směs: aceton-hydroxid amonný (čerstvý) 95:5  ninhydrin, 0,2% roztok v ethanolu (stačí připravit 25 ml roztoku)  methylalkohol  standard histamin dihydrochlorid, c = 10 mg.100 ml-1 a 20 mg.100 ml-1 Přístroje a pomůcky:  mixér  chromatografická deska Silufol  nanášecí zařízení pro chromatografii  chromatografická skleněná kyveta  vysoušeč vlasů, laboratorní sušárna  fixírka  lab. sklo, filtrační papír KA 2 (rychlá filtrace 32 [s], záchyt částic nad 8 [m])

Postup: Zpracování vzorku:  ryby s nižším obsahem tuku: K 10 g rybí svaloviny zbavené kůže a kostí se přidá 25 ml destilované vody a 5 ml HCl (c = 6 mol.l-1) a vše se homogenizuje v mixeru po dobu 120 sec. Homogenát se přepraví do kádinky a zfiltruje. Poté se 30 l filtrátu nanese na start chromatogramu.  ryby s vysokým obsahem tuku: Provede se extrakce do methylalkoholu podle následujícího postupu: 20 g rybí svaloviny zbavené kůže a kostí se homogenizuje v mixeru s 80 ml methylalkoholu po dobu 120 s. Homogenát se přepraví do kádinky a zfiltruje. Poté se 40 l filtrátu nanese na start chromatogramu. Start se vyznačí čarou 2 cm 16

od spodního okraje chromatogramu, na kterou se označí místa nanášení. Nanášení se provádí postupně po malých dávkách pomocí chromatografické jehly s následným vysušením. Příprava standardu:  Ryby s nižším obsahem tuku, vzorek zpracovaný kyselou extrakcí: Naváží se 20 mg standardu, kvantitativně se převede do 100 ml odměrné baňky a doplní destilovanou vodou po rysku. Do další baňky se z tohoto roztoku připraví roztok 10 mg.100 ml-1. Poté se 10 l standardů nanese na chromatogram vedle vzorku.  Ryby s vysokým obsahem tuku, vzorek zpracovaný extrakcí do methanolu: Příprava je stejná jako předešle, jen doplnění na konečný objem v odměrné baňce se provede methylalkoholem. Nanášení, vyvíjení a detekce: Po nanesení vzorku i standardů a po vysušení skvrn, se deska vloží do chromatografické komory a nechá se vyvíjet tak dlouho, až čelo rozpouštědla vyvíjecí směsi dosáhne 1 cm pod horní okraj chromatogramu. Deska se po vyjmutí usuší a provede se postřik roztokem ninhydrinu. Zviditelnění skvrn se provede zahřátím v sušárně (60 °C) po dobu 10 min. Posouzení: Skvrna histaminu je červenofialové barvy. Histidin zůstává na startu. Intenzita barevné skvrny vzorku se porovná se skvrnami standardů a provede se semikvantitativní vyhodnocení: obsah histaminu méně než 100 mg.kg-1, případně méně než 200 mg.kg-1. Poznámka: Dělení ryb podle obsahu tuku Libové (< 2 %)

Středně tučné (2 – 10 %)

Tučné (> 10 %)

většina treskovitých

ryby platýsovité

sleď

štika

losos

makrela

candát

pstruh

šprot

okoun

kapr

úhoř

sumec

17

2.5 Stanovení amoniaku pomocí iontově selektivní elektrody Princip: Amoniak je vytěsňován z výluhu vzorku silnou zásadou, difunduje skrz póry membrány elektrody, rozpustí se v roztoku na povrchu skleněné elektrody - tam se vytvoří jeho rovnovážná koncentrace. Z hodnot potenciálů, změřených skleněnou elektrodou se pak vypočte koncentrace plynu. Chemikálie a roztoky:  kyselina chloristá, HClO4 c = 0,1 mol.l-1  hydroxid sodný, NaOH c = 10 mol.l-1  zásobní standardní roztok chloridu amonného, NH4Cl c = 0,1 mol.l-1 Přístroje a pomůcky:  mlýnek na maso  mixér  váhy  digitální pH metr  amoniaková ISE  laboratorní sklo, vata, filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])

Postup: 4,0 g pomletého vzorku masa se vloží do mixéru a po přidání 100 ml HClO4 c = 0,1 mol.l-1 se homogenizuje 1 minutu. Potom se obsah mixéru přeleje do 200 ml odměrné baňky a mixér se promývá HClO4 až se baňka doplní po rysku. Nechá se 5 minut stát a potom se zfiltruje přes vatu, popř. řídkým filtrem. Vlastní stanovení: K měření se vezme 100 ml filtrátu, ponoří se elektroda (viz níže,) vloží se míchadlo a zapne se míchačka. Přidají se 3 ml NaOH c = 10 mol.l-1. Během 1 až 2 minut se ustálí potenciál na elektrodě a tento se odečte.

18

Poznámka: Pokud se potenciál začne vracet do původní hodnoty, znamená to, že měření už trvá moc dlouho a amoniak se uvolňuje z pufru zpátky do výluhu. Pozor: Zásadně se nedotýkat prsty membrány elektrody! Práce s elektrodou: Elektroda se rozšroubuje, z teflonového obalu se vyjme skleněná elektroda a opláchne se destilovanou vodou. Do teflonového obalu se napipetují ve svislé poloze 2 ml žlutého pufru (dodává výrobce) a elektroda se zašroubuje. Poté je elektroda připravena k měření. Elektroda se ponoří maximálně po první bílé těsnění a kontroluje, jestli není na membráně bublinka. Mezi jednotlivými měřeními se elektroda opláchne a ponoří na chvíli do destilované vody. Zhotovení kalibrační křivky: Ze zásobního standardního roztoku NH4Cl c = 0,1 mol.l-1 se naředí pomocí HClO4 6 pracovních standardních roztoků tak, aby pokryly rozmezí koncentrací 1.10-4 mol.l-1 až 1.10-3 mol.l-1. Při měření se postupuje stejně, jako u vzorku. Výpočet: Z výsledků se sestrojí kalibrační křivka závislosti potenciálu E [mV] na logaritmu koncentrace [log c] stanovované látky. Z kalibrační křivky se stanoví množství amoniaku ve filtrátu vzorku a pomocí přípravy vzorku a navážky se přepočítá na množství amoniaku v původním vzorku. Poznámka: Po skončení měření se elektroda rozšroubuje, vnitřní roztok se vyleje a teflonové pouzdro i skleněná elektroda se opláchne destilovanou vodou. Poté se elektroda opět zkompletuje.

19

2.6 Stanovení amoniaku spektrofotometricky Princip: Amoniak tvoří s Nesslerovým činidlem intenzivně zbarvený komplex, který se stanoví spektrofotometricky. Chemikálie a roztoky:  kyselina trichloroctová, CCl3COOH 20%  Nesslerovo činidlo (alkalický roztok HgI42-)  standardní roztok chloridu amonného, NH4Cl c = 3,1411 g.l-1 Přístroje a pomůcky:  mlýnek na maso  mixér  váhy  spektrofotometr  laboratorní sklo, vata, filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])

Postup: Maso se pomele a naváží se 10,0 g. Zhomogenizuje se v mixeru s 80 ml destilované vody. Přeleje se do kádinky, mixer se vypláchne 20 ml destilované vody a přidá se k ostatnímu. Potom se homogenát vyčeří 60 ml 20% kyseliny trichloroctové. Zamíchá se a nechá se 10 min stát. Poté se roztok zfiltruje nejprve přes vatu a podle potřeby přes filtrační papír do 200 ml odměrné baňky. Za promývání filtru destilovanou vodou se doplní baňka po rysku. Ke stanovení se napipetují 2 ml filtrátu do 50 ml odměrné baňky, přidá se 10 ml destilované vody, 5 ml Nesslerova činidla, promíchá se a doplní destilovanou vodu po rysku. Měření se provede na Spekolu při vlnové délce 400 nm, proti kompenzačnímu roztoku, připravenému z 5 ml Nesslerova činidla a 45 ml destilované vody. Zhotovení kalibrační křivky: Zásobní standardní roztok NH4Cl se naředí 100 krát, tzn., že v 1 ml tohoto naředěného standardu je obsažen 0,01 mg NH3. Kalibrační křivka se zhotoví z 5 roztoků získaných ředěním od 0,5 – 7 ml tohoto pracovního standardu do 50 ml odměrných baněk. Po přidání

20

10 ml destilované vody se roztoky vybarví stejným množstvím Nesslerova činidla jako u vzorku. Doplní se destilovanou vodou opět po rysku. Výpočet: Vyhodnocení se provede pomocí kalibrační křivky a přepočítá se na (mg.kg-1) amoniaku v mase.

21

2.7 Extrakce polycyklických aromatických uhlovodíků z rybí svaloviny metodou QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) Princip: QuEChERS je rychlá a účinná extrakční metoda typu kapalina/kapalina, využívající vysolovacího efektu a úpravy pH přídavkem solí a pufrů. Tento extrakční krok je následován přečištěním získaného extraktu disperzivní extrakcí na pevné fázi, d-SPE. Chemikálie a roztoky:  acetonitril pro HPLC, CH3CN  deionizovaná voda  směs standardů polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH)  komerční sada pro metodu QuEChERS, např. SampliQ QuEChERS AOAC Kit, nebo:  síran hořečnatý bezvodý, MgSO4  octan sodný bezvodý, CH3COONa  chlorid sodný, NaCl  sorbent C18  PSA (primární sekundární amin) sorbent Přístroje a pomůcky:  odstředivka  vortex  analytické váhy  kapalinový chromatograf s fluorescenčním detektorem  HPLC kolona s reverzní fází pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků  PE centrifugační zkumavky 50 a 15 ml  d-SPE zkumavky

Postup: Rybí svalovina se homogenizuje, naváží se 5 g a umístí se do 50 ml centrifugační zkumavky. Přidá se 8 ml acetonitrilu a promíchá 1 min na vortexu. Ke vzorku se přidá směs soli NaCl s bezvodým síranem hořečnatým MgSO4 a pufru octanu sodného pro extrakci. Po promíchání na vortexu (1 min) se vzorek odstředí při 4000 ot./5 min. Centrifugací se od sebe oddělí 22

3 vrstvy (vodná, vrstva zbytku vzorku a pufovacích solí, acetonitrilová vrstva). Alikvot 6 ml z acetonitrilové vrstvy se převede pro přečištění do d-SPE zkumavky s C18 a PSA sorbentem. Následuje promíchání na vortextu (1 min) a odstředění při 4000 ot./5 min. Supernatant lze přímo analyzovat kapalinovou chromatografií

23

3

FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY MASNÝCH VÝROBKŮ

3.1 Stanovení dusitanů Princip: Dusitany obsažené ve filtrátu vzorku po vysrážení bílkovin se stanovují diazotační reakcí s kyselinou sulfanilovou a následnou kopulací s alfa-naftolem za vzniku oranžového azobarviva vhodného ke spektrofotometrickému stanovení. Chemikálie a roztoky:  DIAZO I (25 mg alfa-naftolu se rozpustí 20 ml kyseliny octové a doplní se destilovanou vodou na celkový objem 100 ml)  DIAZO II (500 mg kyseliny sulfanilové se rozpustí za horka zhruba v 50 ml destilované vody a po přidání 20 ml kyseliny octové se v odměrné baňce doplní destilovanou vodou na celkový objem 100 ml)  síran zinečnatý, ZnSO4 roztok 30%  standardní roztok dusičnanu sodného, NaNO2 c = 1 g.l-1  borax, Na2B4O7 nasycený roztok Přístroje a pomůcky:  mlýnek na maso  vodní lázeň  analytické váhy  spektrofotometr, kyveta 1 cm  třepačka na zkumavky  stojánek na zkumavky  stojan + kruhy na filtraci  laboratorní sklo a pomůcky, obvazová vata, filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])

Postup: Naváží se 10,0 g 3 krát pomletého vzorku, přidá se 150 ml destilované vody a nechá se vařit ve vodní lázni 45 minut. Potom se přidá 10 ml nasyceného roztoku Na2B4O7 a nechá se vařit 24

ještě 15 minut. Pomalu po kapkách za stálého míchání se přidává ZnSO4 do celkového objemu 4 ml. Nechá se 15 minut stát, zfiltruje přes vatu a poté přes filtr do 200 ml odměrné baňky. Za stálého promývání vaty destilovanou vodou se doplní odměrná baňka po rysku. Jeli roztok zakalený, přefiltruje se přes filtrační papír. Diazotační a kopulační reakce: Činidla DIAZO I a DIAZO II se smíchají ve zkumavkách v poměru 1 : 1 (1 ml + 1 ml) a přidají se 2 ml filtrátu vzorku, respektive kalibračních roztoků, které se připraví, dle návodu viz níže. Zkumavky se protřepáním zamíchají a nechají se 30 minut vybarvovat při laboratorní teplotě. Potom se změří absorbance vzorků proti slepé zkoušce při 520 nm. Příprava kalibračních roztoků: Ze zásobního standardního roztoku NaNO2 (c = 1 g.l-1) se odpipetuje do 100 ml odměrné baňky 10 ml a doplní destilovanou vodou po rysku. Z tohoto roztoku se naředí 5 pracovních standardních roztoků o koncentraci 0,1 - 0,5 mg.100 ml-1. Výpočet: Vyhodnocení se provede metodou kalibrační přímky. Z grafu se odečte koncentrace dusitanů v mg.100 ml-1. Po zohlednění navážky a ředění se vyjádří jako mg dusitanů na 1 kg výrobku.

25

3.2 Potenciometrické stanovení chloridů z popela Princip: Chloridové ionty přítomné ve filtrátu vzorku reagují s AgNO3 za vzniku nerozpustného AgCl. Nadbytečné množství stříbrných iontů se projeví náhlou změnou potenciálu, která se indikuje potenciometricky. Chemikálie a roztoky:  dusičnan stříbrný, AgNO3 c = 0,1 mol.l-1  dusičnan hořečnatý, Mg(NO3)2 Přístroje a pomůcky:  mlýnek na maso,  elektrický vařič  muflová spalovací pec  elektromagnetická míchačka  potenciometr  váhy s přesností 0,1 g  měrná stříbrná elektroda  referentní kalomelová elektroda se solným můstkem  exsikátor  porcelánová spalovací miska  stojan + kruh na filtraci  stojan + úchyty na byretu  magnetické míchadlo + pinzeta + magnetická tyčinka  laboratorní sklo, filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])

Postup: 10,0 g jemně (3 krát) pomletého salámu se přesně odváží a převede do porcelánové spalovací misky. Přidá se 0,5 g Mg(NO3)2, promíchá se tyčinkou a za stálého míchání se obsah zuhelnatí na elektrickém vařiči. Zuhelnatělý odparek se vloží do muflové pece a zpopelňuje při teplotě 500 °C po dobu minimálně 3 hodin.

26

Popel se vylouží horkou vodou (80 °C), přefiltruje do 100 ml odměrné baňky a doplní destilovanou vodou po rysku. 10 ml vzorku se odpipetuje do kádinky o obsahu 150 ml. Doplní se libovolným množstvím destilované vody tak, aby elektrody byly ponořeny. Za použití výše popsaných elektrod a potenciometru se za stálého míchání provede titrace roztokem AgNO3. Během titrace se potenciál prakticky nemění nebo jen zvolna stoupá. Teprve před bodem ekvivalence je patrnější nárůst potenciálu. Od tohoto okamžiku se přidávává odměrný roztok po kapkách (po 0,1 ml). V bodě ekvivalence nastane prudký potenciálový skok. Přetitruje se asi o 2 ml odměrného činidla a titrace se ukončí. Výpočet: Sestrojí se potenciometrická křivka, zjistí inflexní bod a odpovídající spotřeba odměrného činidla se použije k výpočtu. 1 ml AgNO3 0,1 mol.l-1 odpovídá 3,55 mg Cl- nebo 5,84 mg NaCl Poznámka: Výsledek se přepočítá pomocí navážky na hmotnostní koncentraci. Výsledek se uvede s přesností na jedno desetinné místo.

27

3.3 Stanovení obsahu volného tuku (ČSN ISO 1444) Princip: Metoda je založena na extrakci tuku ze vzorku pomocí nepolárních rozpouštědel, odstranění rozpouštědla odpařením, sušením a vážením (gravimetricky). Chemikálie a roztoky:  extrakční rozpouštědlo (n-hexan nebo extrakční benzín) Přístroje a pomůcky:  mlýnek na maso  extrakční přístroj (Soxhletův nebo Soxtec)  písková nebo vodní lázeň  sušárna  exsikátor  analytické váhy  extrakční patrona

Postup: Vzorek po stanovení vody sušením se kvantitativně převede do extrakční patrony. Vatou navlhčenou rozpouštědlem se vytřou zbytky vzorku z misky a vata se vloží do extrakční patrony. Patrona se vloží do extrakčního přístroje. Do baňky extrakčního přístroje, která byla předtím s několika varnými kuličkami vysušena 1 h při 103 °C, ochlazena v exsikátoru na teplotu místnosti a zvážena s přesností na 0,001 g (m1), se naleje rozpouštědlo. Množství rozpouštědla musí mít nejméně 1,5 – 2násobnou kapacitu extrakční trubice přístroje. Baňka se upevní do extrakčního přístroje a zahřívá nejméně 6 hod na pískové nebo vodní lázni podle rychlosti extrakce a použitého přístroje (u přístroje Soxtec musí být doba zahřívání nejméně 2 hod). Po extrakci se vyjme extrakční baňka obsahující rozpouštědlo a rozpouštědlo se oddestiluje na pískové nebo vodní lázni. Potom se extrakční baňka suší v sušárně 1 hod při 103 °C, nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží s přesností na 0,001 g. Tento postup se opakuje do konstantní hmotnosti vzorku (m2). Výpočet: Obsah volného tuku (w) se vypočítá podle uvedeného vzorce: 28

𝑤=

(𝑚2 − 𝑚1 ) ∙ 100 𝑚0

[%]

m0

hmotnost vzorku odebraného pro sušení [g]

m1

hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami [g]

m2

hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami a tukem po vysušení [g]

Poznámka:Výsledek zaokrouhlíme na jedno desetinné místo.

29

4

FYZIKÁLNĚ – CHEMICKÉ PARAMETRY MLÉKA

4.1 Stanovení pH (ČSN 57 0530) Princip: Aktivní kyselost mléka je dána koncentrací vodíkových iontů v mléce a měří se pH metrem. Vyjadřuje se v hodnotách pH. Chemikálie a roztoky:  pufry pH 7 a pH 4 Přístroje a pomůcky:  pH metr  iontově selektivní elektroda

Postup: pH metr se nakalibruje v rozsahu pH 4-7 podle pufrů o známě hodnotě pH. Při vlastním měření je nutné postupovat podle návodu použitého pH metru. Elektrody se ponoří přímo do mléka o teplotě 20 °C a odečte se odpovídající hodnota pH. Výpočet: Aktivní kyselost se vyjádří v hodnotách pH v zaokrouhlení na 0,05 pH. Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,05 pH, shodnost 0,1 pH.

30

4.2 Stanovení titrační kyselosti podle Soxhlet-Henkela (rozhodčí metoda) (ČSN 57 0530) Princip: Kyselost mléka podle Soxhlet-Henkela je dána počtem ml 0,25 mol.l-1 roztoku hydroxidu sodného spotřebovaných při titraci 100 ml mléka za přídavku fenolftaleinu jako indikátoru. Vyjádří se ve stupních Soxhled-Henkela (SH) na 100 ml mléka. 1 SH odpovídá 1 ml 0,25 mol.l-1 NaOH. Chemikálie a roztoky:  fenolftalein, ethanolový roztok 2% - indikátor  hydroxid sodný, NaOH c = 0,25 mol.l-1, jehož faktor se stanoví titrací roztoku 0,25 mol.l-1 kyseliny šťavelové na fenolftaleinový indikátor  síran kobaltnatý, CoSO4.7H2O, 5% roztok  srovnávací roztok mléka (50 ml mléka a 1 ml 5% síranu kobaltnatého) Přístroje a pomůcky:  odměrné sklo  analytické váhy

Postup: 50 ml mléka se odměří pomocí odměrného válce do titrační baňky, přidají se 2 ml roztoku fenolftaleinu a titruje se roztokem 0,25 mol.l-1 NaOH za stálého míchání do slabě růžového zabarvení, které má srovnávací roztok 50 ml mléka + 1 ml 5% roztoku CoSO4. Zabarvení musí vydržet 30 s. Výpočet: Kyselost se vypočte ve stupních SH (x) na 100 ml mléka: 𝑥 = 2 ∙ 𝑎 [SH]

a

množství roztoku 0,25 mol.l-1 NaOH, spotřebované při titraci 50 ml mléka [ml]

Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost: 0,15 SH, shodnost: 0,3 SH.

31

4.3 Stanovení laktózy polarimetricky (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530) Princip: Obsah mléčného cukru se stanoví polarimetricky ve filtrátu získaném z mléka vyčeřením za podmínek metody. Chemikálie a roztoky:  ferrokyanid draselný, K4[Fe (CN)6].3H2O roztok c = 150 g.l-1  síran zinečnatý, ZnSO4.7H2O roztok c = 300 g.l-1 Přístroje a pomůcky:  kruhový polarimetr se sodíkovým světlem  váhy  polarimetrická trubice délky 200 mm  lab. sklo, filtrační papír KA 5 (středně rychlá filtrace 210 [s], záchyt částic nad 3 [m])

Postup: Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 50 g mléka s přesností na 0,005 g. K mléku se přidá za stálého míchání postupně 5 ml ferrokyanidu draselného a promíchá se. Po promíchání se přidá po kapkách za stálého míchání 5 ml roztoku ZnSO4.7H2O. Obsah se důkladně promíchá, doplní se destilovanou vodou při 20 °C po značku a nechá se stát při laboratorní teplotě 20 minut. Poté se obsah promíchá a zfiltruje suchým skládaným filtrem do suché kádinky. První podíly filtrátu se odstraní. Čirým filtrátem vytemperovaným na 20 °C se naplní polarizační trubice délky 200 mm a polarizuje se při 20 °C. Na polarimetru se odečte úhel otočení . Výpočet: Podle stupnice polarimetru se obsah monohydrátu laktózy v % vypočítá podle níže uvedených vzorců. Je-li pro speciální účely nutné vyjádřit obsah laktózy bezvodé, jsou uvedeny vzorce s označením pro procento bezvodé laktózy (x). Při použití polarimetru s kruhovou stupnicí:

𝑥 =

0,9518 . 𝑝1 . 100 . 𝐹 𝑎

32

a

navážka vzorku [g]

p1

kruhové stupně odečtené na polarimetru

F

faktor pro objemovou korekci na sraženinu vzniklou vyčeřením

Pro navážku přesně 50 g a průměrné složení mléka se za F dosadí přímo tyto hodnoty:  pro plnotučné kravské mléko 0,954  pro mléko s 2 % tuku 0,965  pro mléko odstředěné 0,976 Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,1 %, shodnost 0,15 %. Poznámka: Vzorce jsou sestaveny podle specifické otáčivosti monohydrátu laktózy 52,53 kruhových stupňů při 20 °C. Při stanovení laktózy v mléce jiného složení (ovčí, kozí, buvolí) nebo v mléčných výrobcích se zjistí objem sraženiny a vypočítá příslušný faktor podle vzorce:

F =

𝑉−𝑣 𝑉

V

objem, na který bylo navážené množství vzorku zředěno

v

𝑛𝑎𝑣áž𝑘𝑎 . (% 𝑡𝑢𝑘𝑢 .1,08 + % 𝑏í𝑙𝑘𝑜𝑣𝑖𝑛 .1,55) 100

Při stanovení laktózy v těchto případech je třeba při udávání výsledku uvést faktor pro objemovou korekci na sraženinu. Poznámka: Obsah bílkovin lze stanovit metodami: dle Kjeldahla (rozhodčí metoda), roztokem amidočerni 10 B (provozní metoda) a infračervenou spektrometrií. Obsah tuku lze stanovit: gravimetricky podle Röse-Gottlieba (rozhodčí metoda), acidobutyrometricky (provozní metoda) a infračervenou spektrometrií.

33

4.4 Stanovení vápníku komplexonem (provozní metoda podle ČSN 57 0530) Princip: Vápník se stanoví přímo v mléce zalkalizovaném 4 mol.l-1 roztokem hydroxidu sodného titrací roztokem komplexonu III za použití vhodného indikátoru. Obsah vápníku se vyjádří v mg na 100 g mléka. Chemikálie a roztoky:  komplexon III, c = 0,01 mol.l-1, (3,725 g komplexonu III se doplní vodou na 1000 ml), faktor se stanoví pomocí 0,01 mol.l-1 roztoku CaCl2 v němž byl vápník stanoven manganometricky  směsný indikátor (0,95 fluorexonu se smísí s 0,05 g fenolfltaleinu a 100 g NaCl a dokonale rozetře v třecí misce, nebo se 1 g murexidu smíchá se 100 g NaCl a dokonale rozetře v třecí misce)  hydroxid sodný, NaOH c = 4 mol.l-1 Přístroje a pomůcky:  odměrná baňka 250 ml  titrační baňka 250 ml  pipety 5 ml  váhy  byreta

Postup: 10 g vzorku se v odměrné baňce na 250 ml doplní vodou po značku a promíchá. 50 ml naředěného vzorku mléka se odpipetuje do titrační baňky, zředí se 100 ml vody, přidá se 5 ml roztoku 4 mol.l-1 NaOH a 0,2 g indikátoru. Rychle se titruje roztokem komplexonu III až do přechodu zelené fluorescence v světle růžové zabarvení při použití fluorexonového indikátoru, nebo z růžově fialového zabarvení do fialovomodrého, při použití murexidového indikátoru. Slepý pokus se provede s vodou.

34

Výpočet: Obsah vápníku v mg (x) ve 100 g mléka se vypočítá podle vzorce:

𝑥=

0,40 . 100 . (𝑏 − 𝑐) 𝑎

[mg. 100 g −1 ]

a

navážka vzorku v odpipetovaném podílu [g]

b

množství roztoku 0,01 mol.l-1 komplexonu, spotřebované při titraci vzorku [ml]

c

množství roztoku 0,01 mol.l-1 komplexonu, spotřebované při titraci slepého vzorku [ml]

Poznámka:1 ml 0,01 mol.l-1 komplexonu III = 0,40 mg vápníku Spolehlivost zkoušky - přesnost 5 mg % vápníku a shodnost 8 mg % vápníku.

35

4.5 Stanovení chloridových iontů (rozhodčí metoda podle ČSN 57 0530) Princip: Chloridové ionty se v mléce stanoví po přídavku kyseliny dusičné argentometrickou titrací. Chloridy se vysráží přebytkem roztoku 0,1 mol.l-1 dusičnanu stříbrného a k zpětné titraci se použije 0,1 mol.l-1 roztoku thiokyanatanu amonného. Výsledek se vyjádří v mg chloridů ve 100 g mléka. Chemikálie a roztoky:  kyselina dusičná, HNO3, roztok 25 %  thiokyanatan amonný, NH4SCN roztok c = 0,1 mol.l-1  dusičnan stříbrný, AgNO3 roztok c = 0,1 mol.l-1  síran železitoamonný, NH4Fe(SO4)2.12 H2O, roztok nasycený za studena Pomůcky:  byreta dělená po 0,05 ml

Postup: Do titrační baňky asi 100 ml se přidá několik skleněných kuliček a odváží se 10 g mléka s přesností na 0,0002 g. Pak se přidá 5 ml 25% kyseliny dusičné a 1 ml roztoku síranu železitoamonného. Po promíchání se přidá 10 ml roztoku 0,1 mol.l-1 AgNO3 a za stálého míchání se titruje roztokem 0,1 mol.l-1 NH4SCN do prvního červenohnědého zabarvení, které vydrží 30 s. Průběh titrace má být rychlý, aby byl přechod barvy dostatečně ostrý. Výpočet: Obsah chloridového iontu (x) v mg ve 100 g mléka se vypočte podle vzorce:

𝑥=

(10 − 𝑏) ∙ 3,546 ∙ 100 𝑎

[mg. 100 g −1 ]

a

navážka mléka [g]

b

množství roztoku 0,1 mol.l-1 NH4CNS spotřebované při zpětné titraci vzorku [ml]

Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 2 mg % chloridů a shodnost 3 mg % chloridů.

36

4.6 Stanovení bílkovin pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného)

Princip: Metoda je založena na elektroforéze komplexů denaturovaných polypeptidů s anionickým detergentem dodecylsulfátem sodným (SDS). Navázáním SDS se nábojové rozdíly mezi různými proteiny téměř úplně potlačí, komplexy protein – SDS jsou v neutrálním a alkalickém prostředí silně negativně nabité a putují k anodě. Procházejí-li gelem o vhodné porozitě, je jejich pohyblivost dána téměř výhradně velikostí molekuly. Srovnáním s pohyblivostí standardů o známé molekulové hmotnosti lze tak snadno a relativně přesně určovat molekulové hmotnosti proteinů, resp. jejich podjednotek. Chemikálie a roztoky:  akrylamid pro elektroforézu, CH2CHCONH2  N, N´-bisakrylamid pro elektroforézu, C7H10N2O2  peroxodisíran amonný (persíran amonný) pro elektroforézu, (NH4)2S2O8  N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) pro elektroforézu, C6H16N2  dodecylsulfát sodný (SDS), C12H25NaO4S  bromfenolová modř pro elektroforézu, C19H10Br4O5S  glycin, C2H5NO2  Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) pro elektroforézu, H2NC(CH2OH)3  2-merkaptoethanol pro elektroforézu, HSCH2CH2OH  Coomasie brilliant blue R-250 pro elektroforézu  Glycerol, C3H8O3  kyselina octová, CH3COOH  kyselina chlorovodíková, HCl  kyselina chromsírová, K2Cr2O7 + H2SO4  dichlormethan, CH2Cl2  isobutylalkohol, C4H10O  etanol, C2H6O  standardy bílkovin  Tris-HCl pH 6,8 c = 0,25 mol.l-1 (3 g Tris rozpustit v 50 ml vody, dotitrovat konc. HCl na pH 6,8 a doplnit do 100 ml vodou) 37

 10% SDS (10 g SDS doplnit do 100 ml destilovanou vodou)  redukující pufr (2,4 ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml 10 % SDS (w/v), 1 ml glycerol, 0,5 ml 2– merkaptoethanol, 4 ml destilované vody, 0,1 ml bromfenolová modř (10 mg bromfenolové modři rozpustit v 1 ml Tris-HCl pH 6,8)  Tris-HCl pH 8,8 c = 0,75 mol.l-1 (9,1 g Tris rozpustit v 50 ml vody, dotitrovat konc. HCl na pH 8,8 a doplnit do 100 ml vodou)  30% roztok akrylamidu (30 g akrylamid 99,9%, 0,8 g N, N´-methylenbisakrylamid, doplnit do 100 ml destilovanou vodou, lze zamrazit do zásoby po 20 – 30 ml)  směs na separační gel (15 % T, 2,6 % C) - základ směsi: 14,4 ml 30% roztok akrylamidu, 15 ml Tris (pH 8,8), 0,3 ml SDS (základ směsi uchovávat zamrazený). Ke 5 ml základu směsi se přidá 20 l 10% TEMEDu (0,1 ml TEMED, 0,9 ml destilovaná voda) a 55 l čerstvého roztoku persíranu amonného (0,1 g persíran amonný, doplnit na 1 g destilovanou vodou)  směs na zaostřovací gel (3 % T, 2,6 % C) - základ směsi: 1 ml 30% roztok akrylamidu, 5 ml Tris-HCl pH 6,8, 0,1 ml SDS, 3,8 ml destilované vody (základ směsi uchovávat zamrazený). Ke 2 ml základu směsi se přidá 10 ml 10% TEMEDu a 30 ml čerstvého roztoku persíranu amonného)  ekvilibrační roztok (50 ml Tris-HCl pH 8,8, 1 ml SDS, 49 ml destilované vody)  koncentrovaný elektrodový pufr (30,3 g Tris, 144 g glycinu, 10 g SDS, doplnit do 1 litru destilovanou vodou)  elektrodový pufr (100 ml koncentrovaného elektrodového pufru a 900 ml destilované vody)  barvící roztok (0,5 g Coomasie brilliant blue R-250, 450 ml ethanol, 100 ml kyselina octová, 450 ml destilovaná voda)  odbarvovací roztok (250 ml ethanol, 100 ml kyselina octová, 650 ml destilovaná voda)  sušící roztok (250 ml ethanol, 30 ml glycerol, doplnit do 1 litru destilovanou vodou) Poznámka: Akrylamid a N, N´-metylenbisakrylamid jsou neurotoxické látky. Roztoky nepipetovat ústy a pracovat v rukavicích!!! Přístroje a pomůcky:  odstředivka, mikrocentrifuga, lyofilizátor, pH metr, elektromagnetická míchačka  analytické váhy, termoblok, elektroforéza Mini-Protean III Cell Electrophoresis apparatus  třepačka, scanner, vyhodnocovací program ElfoMan 2.6, laboratorní potřeby

38

Postup: Mléko: Vzorky mléka se odstředí v 1,5 ml zkumavkách typu Eppendorf při 10 000 g po dobu 15 min. 10 l odstředěného mléka se naředí 240 l destilované vody a přidá se redukující pufr (250 l) v poměru 1:1. Vzorky se zahřívají ve vyhřívaném termobloku na 100 °C po dobu 2 min, odstředí se při 10 000 g po dobu 5 min a nanesou na elektroforetický gel. Kasein: 50 ml vzorku mléka se odstředí při 5 000 g po dobu 10 min a z povrchu se odebere tuk. Vzorek odstředěného mléka se vysráží 10% kyselinou octovou na pH 4,6. Zbylý tuk se odstraní z kaseinového precipitátu promytím v roztoku dichlormethan-voda (1:1) s následným odstředěním při 5 000 g po 10 min. Opakuje se 3 krát. Finální kaseinový precipitát se lyofilizuje. 80 mg lyofilizovaného kaseinu se rozpustí v 10 ml 0,25 mol.l-1 Tris pH 6,8. Vzorky se odstředí v 1,5 ml zkumavkách Eppendor při 10 000 g po dobu 15 min. Ke 40 l odstředěného vzorku se přidá 70 l Tris pH 6,8 a 110 l redukujícího pufru. Takto připravené vzorky se zahřívají v termobloku na 100 °C po dobu 2 min., odstředí se při 10 000 g po dobu 5 min a nanesou na elektroforetický gel. Vzorky se mohou uchovávat zamrazené při -20 °C. Příprava gelů: Do stojánku pro elektroforézu se upevní skla (skla se předem zbaví bílkovin ponořením do kyseliny chromsírové, opláchnou destilovanou vodou, odmastí denaturovaným lihem a osuší). Asi 2 cm pod horní okraj menšího ze skel se aplikuje pomocí pipety směs na separační gel (bez bublin), která se převrství isobutylalkoholem na 30 min. Během této doby dojde k polymeraci gelu. Pomocí injekční stříkačky s jehlou se odsaje isobutylalkohol a gel se převrství na 30 min ekvilibračním roztokem. Poté se ekvilibrační roztok odsaje, naleje se směs zaostřovacího roztoku a zasune plastový „hřeben“ na vytvoření jamek pro vzorky tak, aby nedošlo ke vzniku bublin. Po polymeraci zaostřovacího gelu (30 min) se hřeben vyndá. K separaci kaseinových frakcí se používá elektroforéza Mini-Protean III Cell Electrophoresis apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Připravená skla s gely se upevní do stojanů a vloží do kyvety. Anodový i katodový prostor kyvety se naplní elektrodovým pufrem tak, aby byly elektrody ponořeny. V katodovém prostoru je nutné použít vždy čerstvý pufr. Aplikace vzorků: Vzorky o objemu 1 - 25 l (záleží na koncentraci bílkovin) se nanáší pomocí mikrodávkovače typu Hamilton podvrstvením pod elektrodový pufr do jamek pro vzorky. Po nanesení vzorků se elektroforéza připojí ke zdroji Power Pac 300 (Bio-Rad laboratories, Richmond, CA). 39

Vlastní elektroforéza probíhá v poli stejnosměrného elektrického proudu při napětí 110 V při pokojové teplotě, dokud ostrá zóna bromfenolové modři nedosáhne ke spodnímu okraji gelu (cca 2 hod). Po skončení elektroforézy se skla s gely vyndají z pufru a odstraní zbytky zaostřovacího gelu. Separační gely se dále barví. Barvení gelů, sušení gelů a vyhodnocení: Separační gely se barví na Petriho miskách v barvícím roztoku s Comassie brilliant blue R-250 1 hod. Přebytek barviva se odstraní několikanásobným vymytím v odbarvovacím roztoku, dokud se neodbarví pozadí gelu a jednotlivé frakce nejsou od sebe zřetelně odlišitelné. V další fázi se gely přemístí na Petriho misky se sušícím roztokem na dobu 20 min. Barvení, odbarvování a sušení gelů probíhá za stálého třepání. Ukázka barveného gelu Coomassie brilliant blue R-250 je na obrázku 1. Po uplynutí této doby se gely suší mezi dvěma celofánovými foliemi v jednoduchém zařízení sestávajícím se ze dvou rámečků, upevněných svorkami, při pokojové teplotě. Suché gely se naskenují a vyhodnotí pomocí počítačového programu ElfoMan 2.6 (Servis a prodej laboratorních přístrojů, ČR). laktoferin BSA S2-CN S1-CN -CN -CN 

-LG -LA

Autor: Králová Obrázek 1: Gel barvený Coomassie brilliant blue R (Popis: BSA – bovinní sérový albumin, CN – kasein, LG-laktoglobulin, LA-laktalbumin

Obrázek 2: Vyhodnocení gelů pomocí programu ElfoMan 2.6 – vzorek mléka

40

4.7 Extrakce na pevné fázi (SPE) tetracyklinových antibiotik Princip: Oxytetracyklin, tetracyklin a chlortetracyklin jsou stanovovány po odstranění tuku a precipitovaných proteinů ze vzorku mléka a extrakci supernatantu na pevné fázi (SPE) Chemikálie a roztoky:  methanol čistoty HPLC, CH3OH  kyselina šťavelová, C2H2O4 vodný roztok c = 10 mmol.l-1  oxytetracyklin hydrochlorid, Mr = 496,9  tetracyklin hydrochlorid, Mr = 480,91  chlortetracyklin hydrochlorid, Mr = 515,34 Příprava roztoků pufrů pro úpravu vzorku mléka před SPE:  hydrogenfosforečnan sodný, Na2HPO4.7H2O c = 0,2 mol.l-1 (53,6 g heptahydrátu hydrogenfosforečnanu sodného rozpustíme v deionizované vodě a doplníme na konečný objem 1000 ml)  kyselina citronová, C6H8O7 c = 0,1 mol.l-1 (21,0 g monohydrátu kyseliny citronové rozpustíme v deionizované vodě a doplníme na 1000 ml)  Pufr McIlvaine, pH = 4,0 – 4,1 (smícháme 400 ml 0,2 mol.l-1 hydrogenfosforečnau sodného a 600 ml 0,1 mol.l-1 kyseliny citronové a přidáme 3,72 g komplexon III kyselina ethylendiamintetraoctová disodná sůl dihydrát, Na2EDTA.2H2O) Příprava elučních roztoků pro SPE  kyselina šťavelová, C2H2O4.2H2O c = 0,05 mol.l-1 (6,3 g dihydrátu kyseliny šťavelové rozpustíme v deionizované vodě a doplníme na 1000 ml)  roztok methanolu ve vodě c = 5 % (v/v) (5 ml methanolu doplníme deionizovanou vodou na objem 100 ml) Přístroje a pomůcky:  analytické váhy  vodní lázeň  pH metr,

41

 automatické pipety  vortex  přístroj na přípravu deionizované vody  chlazená centrifuga  vakuová jednotka, manifold pro SPE  rotační vakuová odparka  chromatografická kolona s reverzní fází C8  kapalinový chromatograf s UV/VIS nebo PDA detektorem  laboratorní sklo, Pasteurovy pipety, injekční stříkačky, SPE kolonky OASIS HLB (3 cc, 60 mg), nylonové membránové filtry (0,22 nebo 0,45 m), vialky pro HPLC

Postup: Příprava vzorku: Vzorky mléka se před analýzou zahřejí na 40 °C, promíchají a ochladí na 20 °C. 15 ml vzorku mléka se smíchá s 25 ml pufru McIlvaine s přídavkem Na2EDTA a odstředí při otáčkách minimálně 4000 ot./min. při 5 °C po dobu 10 minut. Povrchová tuková vrstvička se mechanicky odstraní. Alikvotní podíl 25 ml získaného supernatantu se podrobí extrakci na pevné fázi na SPE kolonkách Oasis HLB 3 cc, 60 mg. Nejprve se provede aktivace kolonek 3 ml methanolu a promyje 2 ml deionizované vody. Pak se nanese 25 ml supernatantu, promyje 1,5 ml 5% roztoku methanolu ve vodě a eluuje 2 ml methanolu. Eluent se odpaří, odparek zrekonstituje 50 mmol.l-1 kyseliny šťavelové na objem 1 ml a zfiltruje přes 0,22 m nylonové filtry pro HPLC stanovení. Podmínky HPLC stanovení a vyhodnocení výsledků: Pro separaci se používá chromatografická kolona Nova Pack C8, 3,9 x 150 mm o velikosti částic 4 m (Waters, USA), kapalinový chromatograf skládající se ze separačního modulu Alliance 2695 a PDA detektoru 2996 (Waters, USA). Detekce se provádí v UV oblasti při 365 nm, velikosti nástřiku 30 l, průtoku mobilní fáze 0,8 ml.min-1, Tk 35 °C. Eluci je možno provádět buď izokraticky se složením mobilní fáze methanol/acetonitril/50 mmol.l-1 kyselina šťavelová (13:13:74) nebo gradientovou elucí, kdy mobilní fází A je 10 mmol.l-1 kyselina šťavelová, mobilní fází B směs methanolu a acetonitrilu (50:50). Výsledné chromatogramy jsou vyhodnoceny pomocí příslušného chromatografického softwaru (Empower 2) metodou kalibrační přímky. 42

5

FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY MLÉČNÝCH VÝROBKŮ

5.1 Stanovení pH (ČSN 57 0530) Princip: Aktivní kyselost mléčných výrobků je dána koncentrací vodíkových iontů v mléčných výrobcích a měří se pH metrem. Vyjadřuje se v hodnotách pH. Chemikálie a roztoky:  pufry pH 7 a pH 4 Přístroje a pomůcky:  pH metr  iontově selektivní elektroda

Postup: pH metr se nakalibruje v rozsahu pH 4 - 7 podle pufrů o známě hodnotě pH. Při vlastním měření je nutné postupovat podle návodu použitého pH metru. Elektrody se ponoří přímo do vzorku o teplotě 20 °C a změří se odpovídající hodnota pH. Měření pH u tekutých vzorků se provede jedenkrát. Sýr Vpichovou kombinovanou elektrodou je možno měřit pH přímo v sýru. Měří-li se vzorek tuhé konzistence, je třeba nejprve do něj udělat přiměřený vpich (teflonovým bodcem), do kterého se pak elektroda zasune. Přímé měření pH vzorku vpichovou kombinovanou elektrodou se opakuje 10krát, přičemž elektroda se zapíchne vždy do jiného místa. Naměřené hodnoty se vyhodnotí za pomoci základní statistiky. Výpočet: Aktivní kyselost se vyjádří v hodnotách pH v zaokrouhlení na 0,05 pH. Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost 0,05 pH, shodnost 0,1 pH.

43

5.2 Stanovení titrační kyselosti podle Soxhlet-Henkela (rozhodčí metoda) (ČSN 57 0530; ČSN 57 0107) Princip: Kyselost mléčných výrobků podle Soxhlet-Henkela je dána počtem ml 0,25 mol.l-1 roztoku hydroxidu sodného spotřebovaných při titraci 100 ml (100g) mléčného výrobku za přídavku fenolftaleinu jako indikátoru. Vyjádří se ve stupních Soxhlet-Henkela (SH) na 100 ml (100 g) výrobku. 1 SH odpovídá 1 ml 0,25 mol.l-1 NaOH. Chemikálie a roztoky:  fenolftalein, ethanolový roztok 2% - indikátor  hydroxid sodný, NaOH c = 0,25 mol.l-1, jehož faktor se stanoví titrací roztoku 0,25 mol.l-1 kyseliny šťavelové na fenolftaleinový indikátor  síran kobaltnatý, CoSO4.7H2O, 5% roztok  srovnávací roztok (50 ml fermentovaného mléka, syrovátky nebo podmáslí a 1 ml 5% síranu kobaltnatého) Přístroje a pomůcky:  odměrné sklo  analytické váhy Postup a výpočet: Kyselost fermentovaných mlék, syrovátky a podmáslí 50 ml mléka se odměří pomocí odměrného válce do titrační baňky, přidají se 2 ml roztoku fenolftaleinu a titruje se roztokem 0,25 mol.l-1 NaOH za stálého míchání do slabě růžového zabarvení, které má srovnávací roztok 50 ml fermentovaného mléka (syrovátky, podmáslí) + 1 ml 5% roztoku CoSO4. Zabarvení musí vydržet 30 s. Kyselost se vypočte ve stupních SH (x) na 100 ml fermentovaného mléka, syrovátky a podmáslí: 𝑥 = 2 ∙ 𝑎 [SH]

a

množství roztoku 0,25 mol.l-1 NaOH, spotřebované při titraci 50 ml mléka [ml] 44

Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost: 0,15 SH, shodnost: 0,3 SH. Smetana, fermentovaná smetana, kefír Do titrační baňky se odváží 50 g smetany s přesností na 0,01 g, přidají se 2 ml fenolftaleinu a titruje se roztokem 0,25 mol.l-1 NaOH za stálého míchání do slabě růžového zabarvení. Kyselost se vypočte ve stupních SH (x) na 100 g výrobku: 𝑥 = 2 ∙ 𝑎 [SH]

a

množství roztoku 0,25 mol.l-1 NaOH, spotřebované při titraci 50 g vzorku [ml]

Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost: 0,15 SH, shodnost: 0,3 SH.

Jogurt Do titrační baňky se odváží 25 g vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 25 g vody, 1 ml fenolftaleinového roztoku, zamíchá se a titruje se 0,25 mol.l-1 NaOH. Kyselost se vypočte ve stupních SH (x): 𝑥 = 4 ∙ 𝑎 [SH]

a

množství roztoku 0,25 mol.l-1 NaOH, spotřebované na neutralizaci 25 g vzorku [ml]

Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost: 1,5 SH, shodnost: 2,5 SH. Sýr Naváží se 10 g sýru s přesností na 0,01g. Vzorek se kvantitativně převede do porcelánové třecí misky. Přidá se 1 ml fenolftaleinu a dokonale se rozetře. Titruje se 0,25 mol.l-1 NaOH za stálého míchání do růžového 1 minutu trvajícího zabarvení. Kyselost se vypočte ve stupních SH (x): 𝑥 = 10 ∙ 𝑎 [SH]

a

množství roztoku 0,25 mol.l-1 NaOH, spotřebované na neutralizaci 10 g vzorku [ml]

Poznámka: spolehlivost zkoušky - přesnost: 3 SH, shodnost: 6 SH. 45

Sušené mléko 8,8 g vzorku se dokonale rozmíchá s následujícím množství destilované vody: Sušené mléko plnotučné se 60 ml vody Sušené mléka polotučné se 75 ml vody Sušené mléko odtučněné s 90 ml vody. Titrace se provádí stejně jako u mléka nativního.

𝑥=

𝑝𝑜č𝑒𝑡 𝑚𝑙 0,25 𝑚𝑜𝑙. 𝑙 −1 𝑁𝑎𝑂𝐻 ∙ 100 100 − % 𝑡𝑢𝑘𝑢 − % 𝑣𝑜𝑑𝑦

[SH]

Procenta obsaženého tuku i vody jsou uvedena v deklarovaném atestu nebo se zjistí analýzou.

46

5.3 Stanovení chloridu sodného v sýrech rozhodčí metoda (ČSN 57 0107) Princip: Chlorid sodný se srazí přidáním přesně odměřeného množství roztoku 0,1 mol.l-1 dusičnanu stříbrného, jehož přebytek se po rozpuštění v koncentrované kyselině dusičné a manganistanu draselném stanoví titrací roztokem thiokyanatanu amonného. Chemikálie a roztoky:  kyselina dusičná, HNO3 koncentrovaná  manganistan draselný, KMnO4 nasycený roztok  síran železitoamonný Fe (NH4).(SO4)2.12H2O nasycený roztok (indikátor)  thiokyanatan amonný, NH4SCN c = 0,1 mol.l-1  dusičnan stříbrný, AgNO3 c = 0,1 mol.l-1  glukóza, 10 % roztok Přístroje a pomůcky:  analytické váhy  digestoř  laboratorní sklo a pomůcky (stojan, nůž, alobal)

Postup: Do kuželové baňky se naváží 2 g vzorku jemně nastrouhaného sýra s přesností na 0,001 g. Přidá se pipetou 20 ml roztoku AgNO3, odměrným válcem 25 ml HNO3 a zahřívá se za míchání k varu (v digestoři). Pak se přidá 30 ml KMnO4 a udržuje se za mírného varu 10 min. Změní-li roztok barvu, přidá se ještě 5-10 ml KMnO4 a krátce se povaří. Přebytek KMnO4 se odstraní přidáním malého množství glukózy (cca 5 ml) do odbarvení roztoku. Pak se přidá 100 ml destilované vody a 2 ml Fe (NH4).(SO4)2.12H2O. Přebytek AgNO3 se ihned titruje roztokem NH4SCN do prvního světlého červenohnědého zabarvení, které vydrží 30 s. Výpočet: 1 ml AgNO3 odpovídá 5,85 mg NaCl Výsledek se přepočítá pomocí navážky a vyjádří v % NaCl ve výrobku.

47

𝑥=

100 ∙ 0,00585 ∙ (𝑎 − 𝑏) 𝑛

x

obsah NaCl [%]

a

přidaný roztok AgNO3 [ml]

b

spotřeba NH4CSN [ml]

n

navážka [g]

48

[%]

5.4 Extrakce tukové složky pomocí onePSE extraktoru Princip: Extrakce analytů z pevných nebo polopevných vzorků za použití organického rozpouštědla. Extrakce se provádí za zvýšené teploty a tlaku, což vede ke zkrácení doby extrakce a zvýšení extrakční účinnosti. Chemikálie a roztoky:  hydromatrix PSE – Spe-ed PSE Matrix  petrolether bod varu 40 – 60 °C pro organické stopové analýzy UniSolv  isopropylalkohol p.a.  aceton LiChrosolv  ethanol  mořský písek praný  voda deionizovaná  plyny (dusík 4.0)  extrakční rozpouštědlo (petrolether, isopropylalkohol a aceton v poměru 3:2:1) Přístroje a pomůcky:  analytické váhy  vakuová rotační odparka  one PSE extraktor  laboratorní pomůcky (filtrační papír KA2, stojan + kruhy na filtraci, varná baňka, třecí misky s tloučky, patrony PSE)

Postup: Do třecí misky se dají 4 g sýru. Přidá se 4 – 5 lžic hydromatrixu PSE, aby směs byla sypká. Přidá se malá lžička skleněných kuliček pro lepší extrakci vzorku. Směs se kvantitativně převede do patrony PSE a přidá dle potřeby mořský písek, viz obrázek 3.

49

vnitřní okraj písek směs vzorek + hydromatrix

filtrační papír uzavírací šroub

frita

Obrázek 3: Patrona PSE (Foto one PSE Opereční manuál)

Extrahuje se na přístroji one PSE extraktor (Applied Separations, Inc., USA) s extrakčním rozpouštědlem za podmínek:  100 °C  100 bar  čas 1 minuta  3 cykly Po extrakci se vzorek přefiltruje přes vyžíhaný bezvodý síran sodný a filtr KA2 do baňky se zábrusem o objemu 250 ml a odpaří na vakuové rotační odparce právě do sucha.

50

5.5 Stanovení cholesterolu v mléce a mléčných výrobcích metodou HPLC Princip: Po alkalické hydrolýze vzorku methanolickým roztokem hydroxidu draselného je cholesterol z reakční směsi extrahován do n-hexanu a extrakt promyt vodou do neutrální reakce. Finální stanovení celkového cholesterolu je provedeno kapalinovou chromatografií na reversní fázi. Chemikálie a roztoky:  cholesterol  stigmasterol  hydroxid draselný, p.a. KOH  10 mol.l-1 roztok KOH (56,1 g KOH ve 100 ml vody)  methanol, p.a.  methanol pro HPLC  n-hexan, min. čistoty p.a.  síran sodný, Na2SO4 bezvodý, vyžíhaný  chlorid sodný, NaCl p.a.  fyziologický roztok (9 g NaCl v 1 l deionizované vody)  ethanol, 96%.  fenolftalein, 1% roztok v 96 % ethanolu  deionizovaná voda  standardní a pracovní roztoky cholesterolu - zásobní roztoky o koncentraci 1000 mg.l-1 se připraví rozpuštěním 100 mg pevného standardu cholesterolu ve 100 ml methanolu.  příslušným ředěním tohoto zásobního roztoku methanolem se získají pracovní roztoky v koncentračním rozmezí 10 - 1000 mg.l-1.  roztok vnitřního standardu stigmasterolu 0,1% (0,025 g pevného stigmasterolu ve směsi n-hexanu a methanolu (1:10 v/v)) Přístroje a pomůcky:  membránové filtry nylonové, 45m  injekční stříkačky 2 – 5 ml  automatické pipety  Pasteurovy pipety

51

 varná deska  laboratorní třepačka  předvážky  analytické váhy  rotační vakuová odparka  kapalinový chromatograf s UV detektorem  baňky 50 ml s plochým dnem a zábrusem, odměrné baňky 10 - 100 ml, skleněné zátky, odměrný válec 10 ml, dělící nálevky 100 ml, separační nástavec, zpětný chladič, zkumavky 10 ml se zábrusem a zátkou, vialky pro HPLC

Postup: Příprava vzorku: Do zábrusové baňky 50 ml se dá 1 g vzorku (mléko, mlezivo, sýr), 0,3 ml roztoku vnitřního standardu stigmasterolu (0,1%), 9 ml methanolu a 1 ml 10 mol.l-1 hydroxidu draselného. Za stálého míchání při teplotě 65 °C pod zpětným chladičem po dobu 30 minut se provede alkalická hydrolýza. Po ochlazení se sejme baňka z chladiče, přidá 5 ml deionizované vody a 10 ml n-hexanu. Baňka se opatří zátkou, zajistí a na laboratorní třepačce intenzivně třepe 10 minut. Pomocí separačního nástavce se odebere hexanový podíl do dělící nálevky, ve které je asi 10 ml deionizované vody s kapkou roztoku fenolftaleinu pro kontrolu pH. Obsah dělící nálevky se protřepe, po oddělení vrstev se odpustí spodní vodná vrstva a hexanový roztok v dělící baňce se opakovaně promyje 5 ml vody do neutrální reakce (asi 2x, zmizí fialové zbarvení fenolftaleinu). Hexanový podíl se přemístí do zkumavky se zábrusem, pro vysušení se přidá asi 0,5 g vyžíhaného bezvodého síranu sodného, zazátkuje a nechá 15 minut stát v chladnu a temnu. Odebere se hexanový podíl, (asi 5 – 8 ml, podle povahy extraktu) do 50 ml zábrusové baňky a na rotační vakuové odparce se odpaří právě dosucha. Teplota lázně je 60 °C, tlak 360 bar. K odparku v baňce se přidají 2 ml methanolu, rozpustí a zfiltruje se přes 0,45 μm nylonový filtr do vialky pro HPLC stanovení. Slepý vzorek: Pracujeme podle stejného postupu jako se vzorkem, namísto 1 g vzorku použijeme 1 ml deionizované vody.

52

Podmínky HPLC stanovení: Pro analýzu se použije kapalinový chromatograf, skládající se z čerpadla, zásobníku mobilních fází, UV detektoru nebo detektoru s diodovým polem, autosampleru, kolonového termostatu. Pro dělení se použije chromatografická kolona s reverzní fází C8, např. Zorbax Eclipse XDB C8 150x4,6 mm o velikosti částic 5μm (Agilent, USA). Detekce se provádí při vlnové délce 205 nm, teplota kolony je 35 °C, velikost nástřiku 20 μl. Mobilní fáze je binární směs voda/methanol 5:95, analýza se provádí v izokratickém uspořádání, průtok je 1 ml.min-1. Sběr a vyhodnocování dat je provedeno softwarem Empower 2 nebo Breeze (Waters). Pro kvantifikaci použijeme metody vnitřního standardu. Výpočet: Analýzou roztoků cholesterolu o koncentracích v rozmezí 10 – 1000 mg.l-1 se vytvoří kalibrační přímka v příslušné procesní metodě chemického programu, ze které se pak stanoví koncentrace cholesterolu v analyzovaném vzorku (mg.l-1), která se pak převede na hmotnostní koncentraci. Poznámka: Vejce - příprava vzorku: Bílek a žloutek se oddělí a obojí zváží. Žloutek se naředí v poměru 1:10 fyziologickým roztokem, např. 10 g žloutku se doplní ve 100 ml odměrné baňce po rysku a promíchá. Do zábrusové baňky 50 ml se dá 1 g takto naředěného žloutku. Další postup je shodný jako u mléčných výrobků.

53

6

FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY VAJEC

6.1 Stanovení cholesterolu enzymovou metodou Princip: Estery cholesterolu se rozštěpí cholesterolesterázou, uvolněný cholesterol se oxiduje pomocí cholesteroloxidázy, vznikající peroxid vodíku se stanoví oxidační kopulací fenolu s 4aminoantipyrinem za pomocí enzymu peroxidázy. Chemikálie a roztoky:  enzymatická souprava pro stanovení cholesterolu (Dilab, ČR) skládající se z činidel R1A a R1B  příprava pracovního činidla R1 - rozpuštění 1 lahvičky práškového činidla R1B v jedné lahvičce (1000 ml) činidla R1A. Pracovní činidlo R1 je stabilní po dobu minimálně 2 měsíců při teplotách 2 – 8 °C  cholesterol, standardní roztok  chlorid sodný, NaCl p.a.  deionizovaná voda  fyziologický roztok Přístroje a pomůcky:  automatické pipety 0,01 a 1,0 ml  předvážky  spektrofotometr  blokový termostat  kádinky  odměrná baňka 100 ml

Postup: Příprava vzorku: Bílek a žloutek se oddělí a obojí zváží. Žloutek se rozmíchá s 50 ml fyziologického roztoku, kvantitativně přenese do 100 ml odměrné baňky, doplní fyziologickým roztokem po rysku a promíchá a pipetuje do zkumavek podle následujícího schématu.

54

Schéma pipetování do zkumavek: Slepá zkouška

Standard

Vzorek

0,02 ml

-

-

Standard

-

0,02 ml

-

Vzorek

-

-

0,02 ml

2,00 ml

2,00 ml

2,00 ml

Destilovaná voda

Činidlo R1

Obsah zkumavek se promíchá a inkubuje 10 minut při teplotě 37 °C. Měří se absorbance vzorku (Avz) a absorbance standardu (Ast) proti slepé zkoušce. Měření se provádí při 500 nm. Koncentraci cholesterolu (x) v g.l-1 ve vzorku se vypočítá podle vztahu:

𝑥=

𝐴𝑣𝑧 ∙ 𝑐 [g. l−1 ] 𝐴𝑠𝑡 𝑠𝑡

Avz

absorbance vzorku

Ast

absorbance standardu

cst

koncentrace standardu cholesterolu [g.l-1]

Výpočet: Získaná hodnota se převede na mg.l-1 a přepočte na koncentraci mg cholesterolu na 1 vejce nebo 100 g vaječné hmoty.

Poznámka: Stanovení cholesterolu ve vejcích metodou kapalinové chromatografie je uvedeno v poznámce kapitoly 5.5.

55

7

FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY MEDU

Fyzikálně-chemické vyšetřování medu je prováděno dle metod popsaných v Harmonised methods of the International Honey Commission (2002). Příprava vzorků medů: Vzorek určený k analýze musí být reprezentativní. Vzorky medu se před analýzou připraví následujícím postupem: Tekuté nebo zkrystalizované medy bez pevných částic: Laboratorní vzorek se dobře promíchá (nejméně 3 minuty). Je třeba dávat pozor na možnost vzniku malých vzduchových bublin v medu, zvláště při následném stanovení HMF. Pokud je med díky krystalizaci velmi tuhý, je možné jej zahřát v termostatu či vodní lázni, ovšem teplota nesmí přesáhnout 40 °C. Tekuté nebo zkrystalizované medy obsahující pevné částice: Odstraní se hrubé částice, následně se med při pokojové teplotě promíchá a přecedí přes síto s oky o velikosti 0,5 mm. Krystalický med se přes síto jemně propasíruje pomocí špachtle nebo lžičky. Plástečkový med: Plásty se odvíčkují, pokud jsou zavíčkované. Plást se bez zahřívání mačká na sítu s oky o velikosti 0,5 mm za účelem oddělení medu od plástu.

56

7.1 Stanovení hydroxymethylfurfuralu podle Winklera Princip: Roztok zkoušeného medu po reakci s p-toluidinem a kyselinou barbiturovou dává vínově červeně zbarvenou sloučeninu, vhodnou ke spektrofotometrickému stanovení. Chemikálie a roztoky:  kyselina barbiturová, roztok 0,5% (500 mg kyseliny barbiturové vysušené při 105 °C se spláchne asi 70 ml destilované vody do odměrné baňky na 100 ml a rozpustí se zahřátím na vodní lázni. Po ochlazení a vytemperování na 20 °C se doplní vodou ke značce. Roztok vydrží delší čas uložený v chladničce. V případě vykrystalizování se opět rozpustí na vodní lázni vytemperované na 60 °C. Baňka musí být zazátkovaná lehce vloženou zátkou)  paratoluidinové činidlo, roztok 10% v isopropanolu (10 g p-toluidinu se spláchne pomocí 50 ml isopropylalkoholu do 100 ml odměrné baňky, rozpustí se 10 ml přidané kyseliny octové ledové, vytemperuje se na 20 °C a doplní isopropanolem ke značce. Činidlo se uchovává v hnědé lahvi v chladničce (3 dny). Lze jej použít až po 24 hodinách)  Carresův roztok I (hexakyanoželeznatan draselný trihydrát, K4[Fe (CN)6].3H2O 15% roztok: 15 g se doplní na 100 ml destilovanou vodou)  Carresův roztok II (heptahydrát síranu zinečnatého, ZnSO4.7H2O cca 20% roztok: 20,4 g se doplní na 100 ml destilovanou vodou) Přístroje a pomůcky:  spektrofotometr  váhy  odměrné sklo  filtrační papír KA 1 (velmi rychlá filtrace 15 [s], záchyt částic nad 15 [m])  stopky, ochranné pomůcky

Postup: 2 g medu se odváží v 25 ml kádince a několika ml čerstvě převařené destilované vody (zchlazené na pokojovou teplotu) se kvantitativně převede do kalibrované zkumavky a doplní převařenou destilovanou vodou na celkový objem 10 ml.

57

Kalné roztoky se před provedením zkoušky vyčeří Carresovýn činidlem: 2 g medu se odváží v 25 ml kádince a několika ml čerstvě převařené destilované vody (zchlazené na pokojovou teplotu) se kvantitativně převede do kalibrované zkumavky, přidají se 2 kapky roztoku I, důkladně se promíchá, poté se přidají 2 kapky roztoku II a doplní převařenou destilovanou vodou na celkový objem 10 ml. Po důkladném promíchání se obsah přefiltruje přes skládaný filtr (červené značení) nebo za vakua přes fritu S4. Ve filtrátu se stanoví HMF. Příprava kalibračních roztoků: Z čerstvě připraveného základního standardního roztoku HMF 100 mg.100 ml-1 (stačí připravit 25 ml) se ředěním připraví koncentrace pracovních standardních roztoků HMF o koncentracích: 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg.100 ml-1. Postup zkoušky: Vzorek: Do dvou zkumavek se zabroušenými zátkami se odpipetuje po 2 ml filtrátu medu a smísí se s 5 ml p-toluidinového činidla. Do prvé zkumavky, která je pro slepý pokus, se přidá 1 ml destilované vody a dobře promíchá. Obsahem se naplní kyveta a spektrofotometr se vynuluje na slepý vzorek (měření se provádí při vlnové délce 550 nm). Nejpozději do dvou minut se do druhé zkumavky přidá 1 ml kyseliny barbiturové, opět se promíchá, vpraví se do druhé kyvety a změří se absorbance. Hodnota absorbance zpočátku roste. Maxima, které odečítáme, je dosaženo mezi 2 min 30 s až 2 min 40 s od přidání kyseliny barbiturové. Poté začne absorbance rychle klesat. Standardní roztoky: 2 ml pracovních standardních roztoků se odpipetují do zkumavek se zabroušenými zátkami a smísí se s 5 ml p-toluidinového činidla. Poté se nejpozději do dvou minut přidá 1 ml kyseliny barbiturové a po promíchání se změří absorbance. Pro její odečítání platí stejná pravidla jako u vzorku. Slepý vzorek ke standardním roztokům: 2 ml destilované vody + 5 ml p-toluidinového činidla + 1 ml kyseliny barbiturové Upozornění: Vzhledem k charakteru p-toluidinového činidla je třeba jej přidávat v digestoři a žádné z činidel nepipetovat ústy 58

Poznámky: Přesnost (10 % z výsledku) a shodnost (30 %) je dodržena za těchto předpokladů:  Ředění medu je provedeno těsně před stanovením.  Toluidinový roztok musí být použit až 24 h po přípravě; nesmí být zbarven hnědě zkreslování výsledků.  Barevná reakce probíhá optimálně při 20 °C.  Každý krok, který zdržuje stanovení (včetně pomalé filtrace při deproteinaci) je na úkor přesnosti.

59

7.2 Stanovení obsahu vody refraktometricky Princip: Pomocí refraktometru se zjistí index lomu a k němu se vyhledá v tabulce odpovídající obsah vody. Přístroje a pomůcky:  refraktometr se stupnicí indexu lomu (eventuelně s termostatem)  teploměr (pokud refraktometr není vybaven termostatem)

Postup: Na matový hranol refraktometru se nanese tyčinkou z plastické hmoty nebo opatrně keramickou špachtlí malé množství medu z připraveného laboratorního vzorku, hranoly se uzavřou a asi po 1 minutě se odečte index lomu s přesností na 4 desetinná místa. Čtení indexu lomu se provádí třikrát a z výsledků se počítá aritmetický průměr. Výpočet: Ke zjištěnému indexu lomu se vyhledá v tabulce odpovídající množství vody. V případě, že stanovení bylo provedeno při jiné teplotě než 20 °C, je třeba:  u teplot nad 20 °C - přičíst k indexu lomu 0,00023 na každý °C,  u teplot pod 20 °C - odečíst od indexu lomu 0,00023 na každý °C. Výsledek obsahu vody se uvádí na jedno desetinné místo.

60

Refraktometrické stanovení obsahu vody při 20 °C. Index lomu

Obsah vody [%]

Index lomu

Obsah vody [%]

1,5044

13,0

1,4885

19,2

1,5038

13,2

1,4480

19,4

1,5033

13,4

1,4875

19,6

1,5028

13,6

1,4870

19,8

1,5023

13,8

1,4865

20,0

1,5018

14,0

1,4860

20,2

1,5012

14,2

1,4855

20,4

1,5007

14,4

1,4850

20,6

1,5002

14,6

1,4845

20,8

1,4997

14,8

1,4840

21,0

1,4992

15,0

1,4835

21,2

1,4987

15,2

1,4830

21,4

1,4982

15,4

1,4825

21,6

1,4976

15,6

1,4820

21,8

1,4971

15,8

1,4815

22,0

1,4966

16,0

1,4810

22,2

1,4961

16,2

1,4805

22,4

1,4956

16,4

1,4800

22,6

1,4951

16,6

1,4795

22,8

1,4946

16,8

1,4790

23,0

1,4940

17,0

1,4785

23,2

1,4935

17,2

1,4780

23,4

1,4930

17,4

1,4775

23,6

1,4925

17,6

1,4770

23,8

1,4920

17,8

1,4765

24,0

1,4915

18,0

1,4760

24,2

1,491

18,2

1,4755

24,4

1,4905

18,4

1,4750

24,6

1,4900

18,6

1,4745

24,8

1,4895

18,8

1,4740

25,0

1,4890

19,0

61

7.3 Stanovení elektrické vodivosti Princip: Vodivost medu je stanovena u roztoku medu obsahujícího 20 % sušiny medu ve 100 ml destilované vody a měřena pomocí konduktometru a vodivostní cely. Stanovení vodivosti je založeno na měření elektrického odporu, ke kterému je konduktivita reciproční veličinou. Přístroje a pomůcky:  konduktometr vybavený teploměrem nebo termostatem  vodivostní platinová cela  odměrná baňka na 100 ml  kádinky  váhy

Postup: V čerstvě destilované vodě se rozmíchá množství medu ekvivalentní 20 g sušiny medu, kvantitativně se přepraví do 100 ml odměrné baňky a doplní se destilovanou vodou po rysku. 40 ml takto připraveného roztoku se přelije do kádinky. Zbytkem medového roztoku se opláchne vodivostní cela. Poté se cela ponoří do roztoku v kádince a odečte se hodnota vodivosti. Jestliže cela není termostatována, zjistí se i teplota roztoku medu. Poznámka: Díky možnému polarizačnímu efektu je nutné provést měření v nejkratším čase. Pro určení množství medu ekvivalentního 20 g sušiny medu je nutné nejprve ve vzorku stanovit obsah vody refraktometricky, vypočítat sušinu ve vzorku medu a následně přepočítat na množství medu ekvivalentní 20 g sušiny. Výpočet: Jestliže cela není termostatována, musí se hodnota vodivosti upravit zohledněním korekčního faktoru:  u teplot nad 20 °C - od hodnoty vodivosti odečíst 3,2 % na každý °C,  u teplot pod 20 °C - k hodnotě vodivosti přičíst 3,2 % na každý °C.

62

7.4 Stanovení titrační kyselosti Princip: Med se rozpustí v destilované vodě prosté CO2 a ihned se ztitruje roztokem 0,1 mol.l-1 NaOH do bodu ekvivalence (pH 8,3). Titrace musí být skončena do 120 sekund. Chemikálie a roztoky:  hydroxid sodný, NaOH c = 0,1 mol.l-1, prostý uhličitanu.  pufry – pH 7 a 10.  destilovaná voda zbavená CO2 varem a následným zchlazením Přístroje a pomůcky:  pH metr se skleněnou elektrodou  elektromagnetická míchačka  elektrický vařič  váhy  odměrné sklo

Postup: K 10 g medu se přidá 75 ml destilované vody a rozmíchá se tyčinkou. Titruje se roztokem 0,1 mol.l-1 NaOH za použití skleněné elektrody a elektromagnetické míchačky do pH 8,3. Titrace má být skončena do 120 sekund od započetí titrace, neboť se v roztoku postupně uvolňují laktony, které s časem zvyšují kyselost. Výpočet: Kyselost je vyjádřena jako počet miliekvivalentů nebo milimolů kyseliny na 1 kg medu a vypočítá se: spotřeba ml 0,1 mol.l-1 NaOH × 10. Výsledek se uvádí s přesností na 1 desetinné místo.

63

7.5 Důkaz porušení medu škrobovým sirupem, škrobovým cukrem a sladovými výtažky (Fieheho reakce II) Princip: Dextriny obsažené ve škrobovém sirupu, cukru a sladových výtažcích se srážejí ethanolem v kyselém prostředí upraveném kyselinou chlorovodíkovou, kdežto dextriny přítomné v medu se za stejných podmínek nesrážejí. Chemikálie a roztoky:  kyselina chlorovodíková, HCl koncentrovaná ( = 1,18 g.cm-3 )  ethanol 96 %  tanin (prášek) Přístroje a pomůcky:  vodní lázeň  váhy  sklo  filtrační papír KA 2 (rychlá filtrace 32 [s], záchyt částic nad 8 [m])

Postup: Ze zkoušeného medu se připraví vodný roztok ve váhovém poměru 1+2 (např. 2 g medu a 4 ml destilované vody). K medovému roztoku ve zkumavce se přidá na špičku nože tanin, obsah se promíchá a zahřeje se ve vroucí vodní lázni, až se srazí bílkoviny. Pak se obsah ochladí a zfiltruje přes středně hustý filtr tak, aby filtrát byl čirý. Ke 2 ml filtrátu se přidá kapka kyseliny chlorovodíkové, obsah se promíchá a po stěně doplní 4 ml ethanolu. Při porušení medu uvedenými látkami vzniká na rozhraní vodní a alkoholové fáze bílý zákal (kroužek) sražených dextrinů. Čím je intenzivnější a širší, tím lze usuzovat na vyšší obsah cizích látek v medu. Ve včelím medu se při stejném postupu zkoušky zákal netvoří. Opalescence alkoholové vrstvy u medovicových medů se nepovažuje za pozitivní reakci. Poznámka: Zkouška bezpečně prokáže 2% přídavek škrobového sirupu a sladových výtažků ve včelím medu, 1% přídavek vytváří dubiózní výsledek za vytvoření velmi nepatrného bílého zákalu.

64

7.6 Stanovení aktivity diastázy v medu enzymovou metodou Princip: V přítomnosti diastázy (α-amylázy) dochází k hydrolýze substrátu a současnému uvolňování rozpustných barevných produktů. Po ukončení reakce přídavkem roztoku Trizma base se vzorek zfiltruje a změří na spektrofotometru při 590 nm. Absorbance měřeného filtrátu je přímo úměrná aktivitě diastázy ve vzorku. Chemikálie a roztoky:  Amylazymové tablety (stabilní déle než 5 let při skladování v suchu za nekolísavé pokojové teploty)  maleinový pufr (pH 5,6) c = 0,1 mol.l-1 (11,6 g kyseliny maleinové C4H4O4 /Sigma, M0375/ a 0,735 g dihydrátu chloridu vápenatého CaCl2.2H2O /Sigma, C5080/ se rozpustí v kádince s 800 ml destilované vody. Hodnota pH se upraví pomocí 2 mol.l-1 /8 g/100 ml/ roztoku hydroxidu sodného NaOH na 5,6 a získaný pufr se analyticky převede do odměrné baňky, doplní na celkový objem 1 litru a promíchá. K zabránění mikrobiální kontaminace lze pufr převrstvit dvěma kapkami toluenu. Pufr je stabilní přibližně 2 měsíce, pokud je skladován při 4°C).  Roztok Trizma base /roztok Tris-hydroxymethyl-aminomethanu/ (20 g Trizma base /Sigma, T1503/ se rozpustí v 900 ml destilované vody. Po ověření hodnoty pH 8,5 a případném upravení pomocí roztoku hydroxidu sodného NaOH se roztok analyticky převede do odměrné baňky, doplní destilovanou vodou na celkový objem 1 litru a promíchá. Roztok je stabilní po dobu 1 roku při skladování za nekolísavé pokojové teploty) Přístroje a pomůcky:  analytické váhy  předvážky  spektrofotometr  vodní lázeň  vortex  filtrační papír Whatman č. 1 (záchyt částic nad 11 [m]) nebo filtrační papír KA 2 (rychlá filtrace 32 [s], záchyt částic nad 8 [m]) 65

 laboratorní sklo (zkumavky - kulaté dno, rozměry 16 x 120 mm, objem cca 17 ml; kádinka 100 ml, skleněná tyčinka, odměrná baňka 50 ml se zátkou)  nastavitelný dávkovač na 10 ml, mikropipeta 1 ml, špičky 100 – 1000 μl, stopky/minutky, pinzeta, stojan a filtrační nálevky, stojánek na kyvety, křemenné, nebo jednorázové plastové kyvety

Postup: Příprava vodného roztoku medu: 2,00 g vzorku medu se odváží do kádinky o objemu 100 ml a rozpustí ve 40 ml maleinového pufru pH 5,6 o koncentraci 0,1 mol.l-1. Po úplném rozpuštění se vzorek analyticky převede do zábrusové odměrné baňky o objemu 50 ml, doplní pufrem po rysku a důkladně promíchá. Vlastní stanovení: Na dno zkumavky se napipetuje 1,0 ml připraveného medového roztoku a inkubuje 5 minut při 40 °C. Aniž by se vyjmula zkumavka z vodní lázně, vloží se do ní pomocí pinzety Amylazymová tableta a inkubuje přesně 10 minut. Pro ukončení reakce se přidá 10 ml roztoku Tris-hydroxymethyl-aminomethanu a zkumavka se důkladně promíchá na vortexu. Zkumavka se ponechá přibližně 5 minut odstát při pokojové teplotě, znovu se důkladně promíchá a obsah se zfiltruje přes filtrační papír Whatman č. 1 (nebo odpovídající). Získaný filtrát se proměří při 590 nm proti slepé zkoušce. Slepá zkouška: S každou sadou vzorků je třeba připravit i slepou zkoušku. Na dno zkumavky se napipetuje 1,0 ml pufru a inkubuje 5 minut při 40 °C. Aniž by se vyjmula zkumavka z vodní lázně, vloží se do ní pomocí pinzety Amylazymová tableta a inkubuje přesně 10 minut. Pro ukončení reakce se přidá 10 ml roztoku Tris-hydroxymethyl-aminomethanu a zkumavka se důkladně promíchá na vortexu. Zkumavka se ponechá přibližně 5 minut odstát při pokojové teplotě, znovu se důkladně promíchá a obsah se zfiltruje přes filtrační papír Whatman č. 1 (nebo odpovídající). Získaný filtrát se proměří při 590 nm proti slepé zkoušce. Výpočet: 𝐷𝑁 = 25,2 ∙ 𝐴𝑏𝑠590 [stupně Schadeho na 1 g medu]

66

DN

aktivita diastázy vyjádřená jako tzv. diastatické číslo

Abs590

absorbance vzorku při 590 nm

Poznámky: Pokud je absorbance vzorku menší než 0,30, je třeba přípravu vzorku zopakovat a prodloužit inkubační dobu na 20 minut. V takovém případě je třeba vypočtenou hodnotu diastatické aktivity vydělit dvěma.

67

8

LITERATURA

ANASTASSIADES, M., LEHOTAY, S. J., STAJNBAHER, D., SCHENCK F. J. Fast and easy multiresidue method employment acetnitrile extraction/partitioning and „dispersive solid-phase extraction“ fot the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC International, 2003, vol. 86, no. 2, p. 412–423. Application Notebook 2008/Tetracyclines in milk (antibacterials) by LC/UV, p.74, 720 00609 EN. Dostupné z: . BOEHRINGER MANNHEIM. Methods of enzymatic bioanalysis and food analysis. Mannhein, 1995, 157 p. BOGDANOV, S. Harmonised methods of the International honey commission. International Honey Commission, 2002, p. 1-62. BOGDANOV, S., MARTIN, P., LÜLLMANN, C. Harmonised methods of the European honey commission. Apidologie (Extra issue), 1997, p. 1-59. ČSN 570530 (570530). Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Praha: Český normalizační institut, 1974, 108 s. ČSN ISO 1444 (57 6020). Maso a masné výrobky – Stanovení obsahu volného tuku. 2. vydání. Praha: Český normalizační institut, 1997, 8 s. ČSN ISO 57 0107 (570107) Metody zkoušení sýrů, tvarohů, krémů a pomazánek. Praha: Český normalizační institut, 1966, 34 s. Dilab. Cholesterol (návod). Vydala firma Dilab, 2 s. DisQuE Dispersive Sample Preparation Brochure, 7 p., 720003048 EN, pdf formát. Dostupné z:
68

INGR, I. Jakost a zpracování ryb. Brno: MZLU, 2004. 100 s. In NĚMCOVÁ, B. Charakteristika suroviny pro výrobu uzených rybích výrobků. Bakalářská práce. Zlín: ÚTB Zlín, 2011, 50 s. JANŠTOVÁ, B., CUPÁKOVÁ, Š., DRAČKOVÁ, M., NAVRÁTILOVÁ, P., VORLOVÁ, L. Hygiena a technologie mléka a mléčných výrobků. Praktická cvičení I. 1. vyd. Brno: VFU Brno, 2009, 84 s. ISBN 978-80-7305-061-0. LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, no. 259, p. 680-685. LÓPEZ–FANDIÑO, R., OLANO, A., CORZO, N., RAMOS, M. Proteolysis during storage of UHT milk: differences between whole and skim milk. Journal of Dairy Research, 1993, vol. 60, no. 3, p. 339-347. Megazyme. Diastase aktivity (-amylase) in honey. Assay procedure. Bray: Megazyme International Ireland LtD., 2007, 7 s. Megazyme. L-Lactic acid (L-lactate). Assay procedure. Bray: Megazyme International Ireland LtD., 2006, 11 s. one PSE Opereční manuál. Applied Separations, Inc. www.appliedseparations.com. PAH Analysis in Fish by GC/MS using QuECHERS/dSPE Sample Preparation and a High Efficiency

DB

5ms

Ultra

Inert

GC

Column.

5990-6668

EN.

Dostupné

z:


Praha:

VŠCHT

Praha.

13

s.

[on-line].

Dostupné

z:


69

Autoři:

Prof. MVDr. Lenka Vorlová, Ph.D. MVDr. Michaela Králová, Ph.D. RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Mgr. Romana Kostrhounová, Ph.D.

Název:

Chemie potravin a chemické laboratorní metody Praktická cvičení

Ústav:

Ústav hygieny a technologie mléka

Počet stran:

69

Vydání:

1.

Povoleno:

Rektorátem VFU Brno

Podpořeno:

Projektem OP VK reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287

Vydavatel:

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

ISBN 978-80-7305-689-6