Další vzdělávání pro pracovníky škol v Plzeňském kraji CZ.1.07/1.3.47/02.0010
Chemie potravin a výživy
Doc. Ing. Zdeněk Zloch, CSc.
28. 2. 2014
Chemie potravin a výživy Celková antioxidační kapacit potravin jako významný ukazatel jejich nutriční hodnoty a metody jejího laboratorního stanovení
Osnova 1. Cíl 2. Úvod 2.1. Úloha chemických disciplin při výrobě potravin a kontrole jejich kvality 2.2 Podstata celkové antioxidační aktivity potravin a význam jejího laboratorního stanovení 3. Výkladová část 3.1 Hypotéza oxidačního stresu 3.2 Zdravotní rizika oxidačního stresu 3.3 Prevence oxidačního stresu aplikací antioxidantů 3.4 Antioxidační potenciál potravin rostlinného původu, možnosti jeho laboratorního stanovení a praktického využití 3.5 Přehled laboratorních metod stanovení celkového antioxidačního potenciálu potravin 3.6 Přehled in vitro metod 3.7 Přehled in vivo metod 3.8 Doplňující poznámky 4 Praktická část 4.1 Příklady jednoduchého laboratorního stanovení TAC potravin – podrobné návody 4.1.1 Příprava vzorku potraviny k analýze 4.1.2 Stanovení celkové antioxidační aktivity potravin metodou FRAP 4.1.3 Stanovení celkové antioxidační kapacity potravin metodou DMPD 4.1.4 Stanovení celkového obsahu fenolových látek ve vzorku potraviny 4.1.5 Stanovení celkového obsahu polyfenolů ve vzorku potraviny 4.2 Test velikosti příjmu potravy rostlinného původu na základě antioxidačních parametrů moči 4.2.1 Stanovení obsahu fenolových látek v moči 4.2.2 Stanovení obsahu vitaminu C v moči 4.2.3 Stanovení antioxidační kapacity moči 5. Shrnutí 6. Seznam citované literatury 7. Příloha (tabulky a obrázky vztahující se k textu) 8. Test k ověření získaných znalostí
1. Cíl Náplní semináře bude výklad pojmu celková antioxidační kapacita potravin (TAC), přehled nejčastěji používaných laboratorních metod jejího stanovení a hodnocení a vzájemné porovnání výpovědních hodnot těchto metod. Budou charakterizovány okolnosti, které velikost TAC podmiňují a na základě nových poznatků bude přehodnocen vztah mezi TAC potravin a jejich nutriční hodnotou. Posluchačům budou poskytnuty návody na jednoduché laboratorní stanovení TAC potravin při výuce chemie. 2. Úvod 2.1 Úloha chemických disciplín při výrobě potravin a kontrole jejich kvality
Éra vědeckého poznávání základního chemického složení potravin se datuje od 18. st. (A. Lavoisier, později J. V. Liebig, L. Pasteur aj.). Postupně byly objevovány základní procesy trávení (rozklad bílkovin na aminokyselin, štěpení škrobu na glukosu) a látkové přeměny živin (kvašení resp. glykolýza a tvorba oxidu uhličitého). Se vznikem a rozvojem analytické chemie se zdokonalovaly chemické rozbory potravin a díky nim se také prohlubovalo poznání chemické struktury a chemických a biologických účinků jednotlivých základních složek potravin (bílkovin, tuků, sacharidů). Laboratorní analýza potravin byla později aplikována a rozvíjena při kontrole technologických procesů během výroby potravin a při prokazování jejich pravosti resp. falšování nebo zkaženosti (v českých zemích má v tomto směru nejstarší tradici cukrovarnictví a organická chemie sacharidů, např. E. Votoček, K. Balling, V. Veselý, K. Šandera aj.). Mezinárodní věhlas si získal J.Hanuš, profesor analytické chemie a analýzy potravin na Chemicko-technologické fakultě ČVUT v Praze, který na sklonku 19. st. vypracoval tzv. jódové (též Hanušovo) číslo tuků, charakterizující stupeň nenasycenosti mastných kyselin. Ve 20. st. se pozornost zaměřila zejména na identifikaci esenciálních živin, především na vitaminy a na mikroelementy. Byly stanoveny struktury všech vitaminů (naposledy vitaminu D a kobalaminu v 50. – 60. letech 20. st.) a dostupnými se staly metody jejich synthesy a analytického stanovení, a to nejen v potravinách, ale i v tělesných tkáních nebo v moči (byly a dosud jsou aplikovány v klinické chemii, v klinické biochemii a v biologickém výzkumu). Jako hraniční biologické obory vznikly nauka o výživě, o nemocech z nedostatku nebo z nadbytku živin a pravidla optimálních stravovacích zvyklostí z hlediska prevence závažných nemocí (tzv. civilizačních) a z hlediska podpory a posilování zdraví. V současnosti je důležitým cílem potravinářských chemiků nalézání náhrad za tradiční potraviny, které by měly vyhovující senzorickou hodnotu, ale snížený energetický obsah, a byly by zdravotně nezávadné. Kromě kalorické stránky je velká pozornost věnována přípravě poživatelných a biologicky obohacených potravin, které by doplňovaly živiny a nutriční faktory, jež jsou ve standardní stravě u nás spíše nedostatkové; vznikl tak široký sortiment funkčních potravin, suplementovaných potravin (vitaminy, minerálními látkami, vlákninou, polynenasycenými mastnými kyselinami aj.) a doplňků potravy a je stále řešen problém přípravy dietních potravin obsahujících např. náhražky sacharosy, lepku apod. 2.2 Podstata celkové antioxidační aktivity potravin a význam jejího laboratorního stanovení Stravovací praxe každého člověka je podmíněna mnoha objektivními i subjektivními faktory. V prvním případě hraje hlavní roli nabídka sortimentu, ve druhém případě jeho cenová dostupnost, tradiční preference určitého stylu stravování, výběru potravin a způsobu jejich úpravy. Nemalý význam má působení sdělovacích prostředků a popularizační odborné literatury a ovlivňování názorů veřejnosti na význam správné stravovací praxe. V současné době je v celospolečenském zájmu změnit převažující způsob stravování, a tím i výživový stav populace. Cílem je snížit výskyt rizikových faktorů spočívajících v nevyváženém složení potravy (podílejících se v podstatné míře na výskytu nejzávažnějších nemocí) a dosáhnout poklesu výskytu těchto chorob a zvýšení střední délky života. Všechny tzv. civilizační nemoci mají svůj původ z velké části v celoživotních nedostatcích v nutriční hodnotě běžné stravy, mezi které patří zejména nízký příjem ovoce a zeleniny, nedostatečný příjem železa, vápníku, hořčíku, selenu a kyseliny listové. Metodami chemické analýzy je nedostatečné zásobení lidského organismu řadou esenciálních živin, které se vyskytuje u velké části našeho národa, jednoznačně dokumentováno. Předpokládá se, že tyto nedostatky způsobují nepříznivý zdravotní stav populace minimálně ze 30 %. Disciplína Chemie potravin pro praktické využívání vypracovala a dále zdokonaluje a rozvíjí laboratorní metody (někdy značně jednoduché), kterými je možné testovat různé
stránky výživové hodnoty potravin a také jejich zdravotní nezávadnosti. Jedná se v řadě případů o ukazatele, které podle výsledků novějšího výzkumu mohou nejen výživový, ale i celkový zdravotní stav každého jedince významně ovlivnit. Ze starších analytických znaků je to např. stanovení obsahu cholesterolu, chloridu sodného, vlákniny celkové a hydrosolubilní, dusičnanů a dusitanů aj. Samostatnou a velmi intenzívně řešenou stránkou tohoto zaměření chemie potravin je laboratorní hodnocení tzv. celkové antioxidační kapacity potravin (dále TAC). Základními důvody, proč je této chemické charakteristice potravin věnována mimořádná pozornost a proč bylo doposud vypracováno mnoho principiálně odlišných laboratorních metod a jejich modifikací, je všeobecně rozšířená hypotéza oxidačního ohrožení a oxidačního poškození organismu. To je pokládáno za jeden z hlavních faktorů vzniku a rozvoje jednak všech civilizačních chorob a jednak biologického stárnutí organismu. Jeho účinná prevence je možná pouze zvýšenou a cílenou aktivní antioxidační ochranou. Panuje všeobecné přesvědčení, že účinnou antioxidační ochranu může organismus získat dostatečným a pravidelným konzumem potravin, které jednak potřebný pravidelný přísun antioxidantů zajišťují a jednak ovlivňují jejich endogenní tvorbu. V rámci výzkumu TAC bylo dosud shromážděno velké množství poznatků, které poskytují nejen přehled o antioxidační účinnosti mnoha potravin (převážně rostlinného původu), ale také o její závislosti na různých podmínkách zemědělské produkce potravinářských surovin, jejich průmyslového zpracování , skladování a prodeje a na způsobu jejich úpravy v domácnosti. V další části se stručně uvádí hypotéza tzv. oxidačního stresu a možnosti jeho prevence nebo terapie a význam potravy a stravovacích zvyklostí při posilování antioxidační ochrany lidského organismu. Posléze je uveden přehled nejčastěji používaných laboratorních metod na stanovení TAC potravin a limitů a možností interpretace jejich výsledků. Jsou také připojeny podrobnější pracovní návody na jednoduché (ale v praxi často využívané) metody stanovení TAC proveditelné např. ve školní laboratoři. 3. Výkladová část 3.1 Hypotéza oxidačního stresu Od 60. let minulého století se v oblasti věd o živé přírodě shromažďovaly informace o spojení patologických procesů včetně počínajících i pokročilejších stadií nemocí člověka s oxidačními alteracemi nejrůznějších biostruktur (odvozených od aminokyselin, peptidů a bílkovin, od lipidů, sacharidů a nukleových kyselin). Ty byly postupně detekovány a identifikovány moderními metodami analytické chemie. V následujícím časovém úseku, přibl. od 80. let, vznikla hypotéza tzv. oxidačního poškození živého organismu, mechanismů jeho vzniku a progrese a jeho významu v etiopatogenezi chorob( hypotéza oxidačního stresu)1. Rychle se rozvíjely laboratorní metody detekce a kvantitativního vyhodnocování různých fází oxidačních poškození organismu, prohlubovalo se poznání příčin a reakčních mechanismů nekontrolovaných oxidačních změn in vivo (hypotéza vlivu volných radikálů, později tzv. reaktivních forem kyslíku, dusíku, chlóru, síry aj. označované jako ROS, RNS, RClS, RSS) a jejich příčinného vztahu k rozvoji nemocí. 3.2
Zdravotní rizika oxidačního stresu Všechny aerobní organismy využívají molekulární kyslík k tvorbě adenosintrifosfátu (v průběhu dýchacího procesu a oxidativní fosforylace), který uchovává chemickou energii využitelnou pro všechny životní pochody. Evoluce vyšších forem života na Zemi byla možná díky jejich schopnosti vázat a transportovat kyslík, distribuovat ho do nejrůznějších tkání a zapojit ho do oxidačních přeměn nejrůznějších substrátů, z největší části redukovaných NADa FAD- koenzymů v dýchacím řetězci.
Avšak molekulární kyslík je zároveň toxický, a to sám o sobě a ve větší míře ve formě svých tzv. reaktivních druhů (ROS). Ty vznikají jeho postupnou, jednoelektronovou redukcí na superoxid (volný radikál, VR), peroxid vodíku (ROS) a hydroxylový radikál (VR). K volným kyslíkovým radikálům (a ostatním ROS) se přiřazují další velmi reaktivní sloučeniny, vznikající často jako produkty oxidačních přeměn kyslíkatých, halogenovaných nebo sirných látek. Nejvýznamnější z nich je oxid dusnatý a peroxodusitan (oba jsou VR) a kyselina chlorná. Volné radikály kyslíku jsou tvořeny z velké části v průběhu mitochondriálního dýchacího pochodu, ostatní kyslíkové aj. reaktivní formy vznikají při mnoha dalších biochemických přeměnách i jednoduchých chemických reakcích in vivo, zejména oxidoredukčních. Nemalý podíl na tvorbě těchto reaktivních faktorů mají různé vlivy zevního prostředí, např. účinky xenobiotik (včetně složek cigaretového kouře), záření, interakce organismu s infekčními podněty aj. Uvedené volné radikály a ostatní reaktivní formy kyslíku, dusíku, chlóru ad. hrají v organismu velmi aktivní a zároveň ambivalentní roli – poškozují struktury významných biomolekul, jako jsou nenasycené mastné kyseliny v membránách, všechny typy nukleových kyselin, bílkoviny aj., a tím narušují jejich fyziologické funkce. Na druhé straně aktivují pochody, nezbytné pro homeostázi organismu, např. aktivní účastí při signálních přenosech, tvorbou transkripčních faktorů, induktivních antioxidačních enzymů atd.1 V každém aerobním organismu působí nepřetržitě řada látkových a enzymatických prostředků, endogenních i exogenních, které pohotově VR a ROS odstraňují nebo reparují jimi způsobená strukturní poškození. Proto vznik, účinek a zánik VR a ostatních reaktivních faktorů jsou za normálních okolností ve vzájemné rovnováze. Avšak často dochází ke krátkodobé i dlouhodobější poruše tohoto vyváženého stavu, nejčastěji k převážení oxidačních podnětů, a vzniká tak stav ohrožení zdraví označovaný obecně jako oxidační stres (OS). Některé z významných zdrojů VR a RO(N)S Přenos elektronů v dýchacím systému, zejména v systému ubichinon – semihydroubichinon a NADH – CoQ reduktasa. 1–3% kyslíku, který vstupuje do dýchacího řetězce, je přeměněno na superoxidový anion, který z řetězce vystupuje. Enzymy, které tvoří peroxid vodíku – např. acylCoA oxidasa, xantin oxidasa. Systém cytochromu P 450, který je aktivován různými xenobiotiky. NADPH oxidasa vznikající a hrající významnou roli např. při aktivaci makrofágů. NO synthesa, která v endotelu cévních stěn ovolňuje NO z argininu. Reakcí se superoxidem vzniká peroxodusitan. Tvorba prostaglandinů z kyseliny arachidonové ve fázi účasti cyklooxygenasy aj. enzymů. Aktivita myeloperoxidasy, kterou se tvoří kyselina chlorná z kyseliny chlorovodíkové (při tzv. oxidačním vzplanutí makrofágů). Velmi zjednodušený přehled zdraví škodlivých účinků VR a RO(N)S je uveden na schématu na obr. 7.1 a 7.2. VR a další reaktivní formy napadají bílkoviny s následky jejich zrychleného metabolického obratu, snížené aktivity enzymů a strukturního poškození biomembrán. Konečným efektem může být vážné poškození buněk končící jejich nekrotickým nebo apoptotickým zánikem. Poškození bílkovinné i tukové složky lipoproteinů o nízké denzitě (LDL) je vstupním krokem k urychlenému atrosklerotickému procesu v cévách. Ten je zpravidla potencován oxidačními změnami (převážně peroxidačními) nenasycených matných kyselin v lipoproteinech. Oxidačně je poškozována rovněž DNA a hromadící se její mutace vedou k chromozomálním a geonomovým změnám, jež vyúsťují opět v poškození buněk a
potenciálně též v iniciaci nádorového procesu. Poškození sacharidů vázaných nebo volněji připojených k membránám může poškodit všechny funkce těchto útvarů, např. přenos látek a signálů, funkce receptorové aj. Rejstřík nemocí a nežádoucích klinických změn, v jejichž etiopatologii hrají roli VR aj. reaktivní faktory, je široký; zmiňujeme ty nejzávažnější z nich: biologické stárnutí aterosklerosa jaterní cirhóza hemochromatosa
alkoholické poškození nádory glomerulonefritida ischemicko-reperfúzní poškození tkání
Alzheimerova choroba šedý oční zákal dna Parkinsonova choroba revmatická artritida
Bylo zde opakovaně zdůrazněno, že tvorba volných radikálů v organismu patří mezi běžné, zčásti nezbytné biologické pochody a jen nadměrné hromadění a působení těchto faktorů může být zdraví škodlivé. Z této skutečnosti vyplývá závěr, že ochrana před nežádoucími účinky VR a RO(N)S spočívá v omezení vlivů, které jejich tvorbu vyvolávají a v posilování obranyschopnosti organismu proti těmto škodlivým faktorům. 3.3 Prevence oxidačního stresu aplikací antioxidantů Tato obranyschopnost je založena • na stimulaci endogenní tvorby antioxidačně ochranných látek, • na stimulaci aktivity tzv. antioxidačních enzymů, • na dostatečném příjmu ochranných antioxidačních látek potravou. Mezi endogenní ochranné látky patří glutathion, SH-proteiny, ceruloplasmin, transferin, kyselina močová, bilirubin, melatonin, koenzym Q, metalothionein aj. (obr. 7.3) Nejvýznamnějšími antioxidačními enzymy jsou: • SOD, superoxid dismutasa (Cu-Zn, cytosolová, sérová a Mn – mitochondriální) • kataláza • glutathion peroxidasa (Se-dependentní) • glutathion reduktasa (NADPH dependentní) • glukosa-6-fosfát dehydrogenasa (obr. 7.4). Příkladem exogenních ochranných látek vyskytujících se v potravinách jsou: • antioxidační vitaminy a provitaminy – C, E, • karotenoidy, dále rostlinné polyfenoly včetně flavonoidů, fenolické kyseliny, isothiokyanáty aj. • selen, zinek, měď, mangan • butylhydroxytoluen, glukosinoláty, dithiolthiony, probudil, ebselen, trolox aj. Pojem antioxidant(y) patří nejen v odborné chemicko-technologické, ale i v lékařské a nutricionistické terminologii stále k velmi frekventovaným. Z hlediska výživových doporučení a výživové praxe je důraz na dostatečný příjem potravních antioxidantů i jejich syntetických preparátů účinným přístupem k prevenci nemocí a prostředkem k dosažení dlouhého a kvalitního života. Mezinárodní statistiky ukazují, že ve vyspělých zemích pravidelně kupuje a užívá antioxidační vitaminy C, E, beta karoten a další preparáty, jako selen, N-acetylcystein, směsi fenolových kyselin a polyfenolů aj. přibl. 30-40 % populace (u nás je situace podobná), ve skupině osob s vážnějšími zdravotními problémy až 80 %, často
bez vědomí ošetřujícího lékaře. Naproti tomu spotřeba ovoce a zeleniny, které jsou hlavními zdroji antioxidantů, je u nás stále nedostatečná. Pravidelné užívání velkých dávek antioxidantů zdůvodňované zjednodušeným prvoplánovým výkladem jejich účinku může být kontraproduktivní a pro organismus nežádoucí. Tento důležitý a poměrně nedávný poznatek vyplývá zřetelně z metaanalýz výsledků významných epidemiologických studií, při kterých se vybraným skupinám osob podávaly dlouhodobě relativně velké dávky antioxidantů a sledovaly se u nich a u skupin kontrolních vývoj zdravotního stavu a výskyt kardiovaskulárních, popř. nádorových onemocnění. Výsledky metaanalýz ukázaly, že efekt velkých dávek antioxidantů je nejednoznačný a v celkovém výsledku málo účinný nebo dokonce škodlivý. Mnohostranné a někdy protichůdné funkce antioxidantů se typicky projevují při známých a často se vyskytujících situacích, např. při tělesné námaze a při záměrně sníženém dlouhodobém energetickém příjmu (kalorické restrikci). Závěrem je uvedeno souhrnné hodnocení významu antioxidantů pro zdraví z hlediska novějších poznatků oxidačních rizik, funkce různých reaktivních forem prvků a volných radikálů a tzv. oxidačního stresu5,7,8. • pravidelný a dostatečný příjem antioxidantů je nezbytnou podmínkou uchování zdraví; • tento příjem je zpravidla zaručen při spotřebě potravin rostlinného původu, zejména ovoce, zeleniny a cereálií podle výživových doporučení (doporučená spotřeba 450 g zeleniny a 250 g ovoce na osobu a den). • jen za zvláštních okolností, při kterých vzniká riziko vzniku oxidačního stresu, je vhodné užívat v přiměřeném množství doplňky antioxidantů (např. u kuřáků je doporučený denní příjem vitaminu C 100–120 mg/den); • pravidelný příjem velkých dávek antioxidačních vitaminů aj. antioxidantů je neúčinný a potenciálně škodlivý; • karotenoidy a rostlinné fenoly, přijímané ve formě čistých farmaceutických preparátů, se dnes považují za přírodní látky s různými pozitivními biologickými účinky, ale s pochybnou antioxidační aktivitou; • racionální aplikace antioxidantů by měla být založena na znalosti oxidačně-redukčního potenciálu těchto látek a jejich oxidačních produktů, na znalosti jejich možných vedlejších účincích, na povaze jejich látkové přeměny v lidském organismu a na jejich dostupnosti pro cílové tkáně, ve kterých je antioxidační intervence žádoucí. Grafické znázornění prostředků antioxidační ochrany organismu je v příloze č. 7 3.4
Antioxidační potenciál potravin rostlinného původu, možnosti jeho praktického využití Z výše uvedených důvodů se brzy obrátila soustředěná pozornost teoretického i klinického výzkumu k otázkám antioxidační ochrany organismu přírodními i syntetickými antioxidanty, ke vhodnosti a metodám jejich účelné aplikace v prevenci i v terapii. Mnoho výzkumného úsilí bylo vynaloženo na vytvoření spolehlivých laboratorních postupů zaměřených k vyhodnocení tzv. antioxidačního potenciálu a antioxidační kapacity člověka a k možnostem jeho ovlivnění různými intervenčními postupy. Potraviny rostlinného původu, které jsou v převážné míře zdrojem antioxidantů, byly postupně mnoha druhy chemických analýz vyhodnocovány a klasifikovány z hlediska jejich předpokládaného oxido-redoxního potenciálu v určitých, z fyzikálně chemického hlediska přesně definovaných podmínkách a v podmínkách, které panují v organismu v průběhu trávení. Další části tohoto textu se zaměří na současný stav metodologie bioanalýz potravin z hlediska jejich ochranného účinku a na otevřené otázky, kterou jsou a budou řešeny v blízké budoucnosti. Spektrum známých přírodních antioxidantů obsažených především v potravinách rostlinného původu se v posledních letech podstatně rozšířilo o skupiny tzv. sekundárních
fyziologických metabolitů rostlin. Dosud jich bylo izolováno, identifikováno a testováno více než 10 tisíc (např. fytochemické látky, fenolové kyseliny a polyfenoly ad.). Některé z těchto látek byly z hlediska své biologické aktivity studovány už dříve (např. flavonoidy byly ve 30. létech minulého století pokládány za vitaminy skupiny P) a jejich antioxidační aktivita byla prakticky využívána už dříve např. k ochraně potravních tuků před oxidačním žluknutím. Bylo prokázáno, že schopnost odstraňovat reaktivní volné radikály různých látek a reaktivní formy kyslíku a dusíku a chránit nenasycené mastné kyseliny, bílkoviny, nukleové kyseliny aj. biomolekuly v různých tělesných tkáních a buněčných strukturách před oxidačním rozkladem si uchovávají i po požití potravin, které je obsahují, a že podobné vlastnosti také mají produkty jejich trávení a látkové přeměny v lidském organismu. Tyto poznatky byly získány a prověřovány v mnoha pokusech s lidskými dobrovolníky, v experimentech na zvířatech, v testech na tkáňových kulturách a studiem povahy produktů jejich metabolismu a vlastností těchto metabolitů. Byly také podpořeny výsledky mnoha epidemiologických studií, které umožnily komplexněji vysvětlit všeobecně zdravotně prospěšný vliv potravy rostlinného původu. Dnešní úroveň přístrojové techniky používané v analytické chemii umožňuje stanovit obsah a strukturu všech reálně se vyskytujících přírodních látek, a proto tak rychle stoupá jejich počet a počet jejich poznaných metabolitů. Takovýto sice velmi exaktní, ale nákladný postup je využíván v moderních výzkumných pracovištích, ale má spíše povahu základního výzkumu, který nemá bez- bezprostřední dopad na běžnou praxi oceňování biologické hodnoty potravin. Proto byly během uplynulého desetiletí zavedeny nové metody laboratorního určování antioxidačního potenciálu potravin, které dovolují postihnout a souhrnně vyhodnotit sumu všech antioxidačně účinných složek (v jednom druhu potraviny jich může být několik set), a to metodami poměrně jednoduchými, levnými a rychlými. Dosud tak bylo shromážděno nepřehledné množství informací o potenciálně antioxidačním účinku přírodních látek, převážně těch, které se vyskytují v potravinách rostlinného původu (jedná se o řádově o 10 tisíc chemických individuí). Má-li se kvantitativně vyhodnotit celkový antioxidační potenciál jakékoli potraviny (nebo jiné komodity), je nereálné sumarizovat dílčí antioxidační příspěvky jednotlivých přírodních látek, které jsou v dané potravině přítomné. Proto byly vyvinuty metody, které umožňují hodnotit celkový antioxidační účinek projevující se za přesně definovaných fyzikálně chemických podmínek a týkající se všech aktivních složek potraviny včetně těch, které ještě nebyly identifikovány. Byl zaveden termín Celková antioxidační kapacita (TAC) potravin a k jejímu stanovení bylo vyvinuto mnoho různých laboratorních metod. Tyto metody jsou neustále zdokonalovány a obohacovány o nové metodické přístupy. Do běžné praxe se zároveň prosadila zásada, že se TAC potraviny má stanovit paralelně dvěma až třemi odlišnými metodami. Ty zpravidla u daného druhu analyzovaného vzorku dávají více nebo méně odlišné výsledky, ale jejich vzájemné porovnání a korelační analýza nakonec poskytne objektivnější charakteristiku antioxidačních vlastností vzorku. Předkládáme rámcový přehled základních principů, na kterých jsou relevantní metody stanovení TAC založeny a naznačíme jejich nedostatky, popříp. přednosti a meze, ve kterých mohou být úspěšně aplikovány. V příloze 7 je uveden příklad výsledků stanovení celkové antioxidační kapacity v potravinách (tab. 7.1 a 7.2) a korelačního hodnocení některých zjištěných parametrů (kromě TAC též obsahu vitaminu C a fenolových látek – obr. 7.5, 7.6, 7.7, 7.8).
3.5
Přehled laboratorních metod stanovení celkového antioxidačního potenciálu potravin
V následující části je uveden přehled metod analytického stanovení tzv. celkové antioxidační kapacity (TAC) a antioxidační aktivity potravin, které se v celosvětové praxi v posledních letech nejlépe osvědčily, jsou nejčastěji používány a jejich aplikace (často v několika různých alternativních modifikacích) je doporučena v posledním dokumentu IUPAC (IUPAC Technical Report, Pure Appl.Chem. 85:957-998, 2013) a dále v literatuře3,4,6. Připojen je popis principu metod a jsou komentovány jejich přednosti a nedostatky. Z hlediska chemického mechanismu oxidačně redukčních interakcí mezi testovaným vzorkem a analytickým činidlem je vhodné rozlišovat:2 • interakce spočívající v přenosu 1 elektronu (single e- transfer) ET mechanismy • interakce spočívající v přenosu H atomu - HAT Příkladem prvního typu reakcí jsou činidla: • 2,2-azino-di-(3-ethylbenzothiazolin)-sulfonová kyselina/ABTS/ • 2,2-difenyl-1-pikryhydrazyl/DPPH/ • Cu2+- redukující kapacita a příslušné kuproinové činidlo/metoda CUPRAC/ • Fe3+ - redukce /metody FRAP/ Metodou založenou na druhém typu interakcí je • ORAC, absorpční kapacita kyslíkového radikálu • celkový potenciál absorpce radikálu, TRAP. Každá jednotlivá antioxidační látka přítomná v potravinovém (nebo obecně biologickém) vzorku reaguje s uvedenými činidly různou rychlostí, důležitou roli hrají použité reakční podmínky. Metody stanovení TAC potravin a antioxidačního potenciálu organismu jsou obvykle tříděny do skupiny in vitro a in vivo metod. Do první patří postupy zaměřené na potravní nositele antioxidačních vlastností, ve druhé jsou shromážděny způsoby laboratorního testování přirozené antioxidační obranyschopnosti organismu, a to přímým stanovením antioxidačních biomolekul a enzymů a kvantitativním stanovením odpovědi organismu na účinky exogenních oxidantů. 3.6 Přehled in vitro metod 3.6.1 Zhášecí aktivita vzorku k DPPH3 (1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (aa-difenyl-ß-pikrylhydrazyl) –dle IUPAC Je to stabilní volně radikálová sloučenina s nelokalizovaným elektronem, díky němuž má v ethanolovém roztoku tmavě fialové zbarvení. Přidá-li se k roztoku DPPH s extraktem analyzovaného vzorku, který je schopný předat H atom, dojde v důsledku redukce k odbarvení roztoku. Měří se tudíž absorbance roztoku DPPH před a po přidání testovaného vzorku, její změna je úměrná antioxidační (redukční) aktivitě vzorku. Jedná se o metodu, která je jednoznačně používána univerzálně a nejčastěji z celé početné škály požitelných metod. 3.6.2 Zhášecí aktivita vzorku k DMPD3,4 (N,N-dimethyl-p-phenylen diamine dihydrochloride) dle IUPAC Účinkem redukčních (antioxidačních) složek testovaného vzorku se radikál DMPD v přítomnosti železité soli odbarvuje. Vyhodnocuje se míra redukce tj. odbarvení DMPD, antioxidačním standardem je obvykle Trolox, hydrosolubilní analog tokoferolu. 3.6.3 Metoda TEAC3,4,6 Trolox equivalent antioxidant capacity/ABTS radical cation decolorization assay; . Měří se zeslabení barvy po přidání vzorku do roztoku ABTS•+ ((2,2-azino-bis(3ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)), který je zelenomodře zbarvený. Antioxidační
složky vzorku redukují ABTS•+ na ABTS, čímž jej odbarví. Trolox je ve vodě rozpustný analog vitaminu E, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina. V této metodě se požívá jako antioxidační standard. 3.6.4 FRAP – Ferric reducing-antioxidant power3,4,6 Zde se měří schopnost antioxidačních látek obsažených v analyzovaném vzorku potraviny (nebo jiného biologického materiálu) redukovat železitou sůl na železnatou v kyselém prostředí. Fe3+ se aplikuje v komplexu s 2,3,5-trifenyl-1,3,4-triaza-2-azoniacyclopenta-1,4dien chloridu (TPTZ). Redukce železitého iontu se monitoruje spektrofotometricky změnou absorbance roztoku při vlnové délce 593 nm. 3.6.5 RP metoda – Reducing power method3,4,6 Antioxidační složky testovaného vzorku redukují ferrikyanid draselný na ferrokyanid, ,který následně reaguje se železitou solí v kyselém prostředí na barevný (modrý) komplex. Zvýšení absorbance reakčního roztoku je úměrné „redukční síle“ (antioxidační aktivitě) vzorku. 3.6.6 FTC metoda – Ferric thiocyanate method3,4,6 Používá se směsi vzorku, kyseliny linolové v alkoholu, roztoku thiokyanatanu amonného a chloridu železnatého. Po inkubaci v kyselém prostředí se měří intenzita zbarvení, která je úměrná antioxidační kapacitě vzorku. 3.6.7 HORAC – Hydroxyl radical averting capacity3,4,6 Měří se schopnost antioxidantů vázat do chelátů kovy, a tak zabránit vzniku Fentonovy reakce (peroxid vodíku + Fe2+ → OH• + voda) a produkci hydroxylového radikálu. Průběh chelatační reakce (v přítomnosti Cu2+) se detekuje fluorescenční metodou. Jako antioxidačního standardu se používá kyseliny gallové. 3.6.8 ORAC – Oxygen radical absorbance kapacity3,4,6 Jedná se o revoluční novinku v metodologii TAC. Testuje se jí tzv. antioxidační síla potraviny a jiných látek. Jako cílových molekul se používá ß-phycoerithrin nebo fluorescein. Standardem je Trolox. V průběhu reakcí se používá radikálové formy sloučeniny AAPH (2,2azobis-2-amidopropan dihydrochlorid) a měří se pokles hodnoty fluorescence jako výsledek účinku zhášečů radikálu AAPH. Metodu lze aplikovat s využitím polypropylenových fluorescenčních plátů, ragují hydrofilní i lipofilní látky. 3.6.9 CUPRAC – Cupric ion reducing antioxidant kapacity3,4,6 Jako chromogenní a zároveň oxidační činidlo se používá bis(neocuproine)copper (II) chlorid, který reaguje především s polyfenoly, a to v ekvimolárním poměru. Fenolové struktury jsou oxidovány na chinony, uvolněné protony jsou zachyceny síranem amonným. Neocuproin Cu (II)-Nc je redukován na silně barevný chelát Cu (I)-Nc, který je intenzívně barevný (450 nm). Antioxidačním standardem je Trolox, velikost TAC vzorku je úměrná změně zbarvení reakčního roztoku. Nejnověji se používá metoda on-line HPLC-CUPRAC, která umožňuje přímou a specifickou (individuální) identifikaci a kvantifikaci antioxidačních sloučenin. Metoda je založena na chromatografické separaci jednotlivých látek, které jsou následně testovány postupem CUPRAC.
3.6.10 ß-carotene linoleic acid method/conjugated diene assay3,4,6
Jedná se o rychlou scríningovou metodu, při které se provede oxidace kyseliny linolové uměle připravenými reaktivními formami kyslíku (oxygenovanou vodou). Produkt oxidace mastné kyseliny způsobí oxidaci ß-karotenu a následné odbarvení roztoku. Antioxidanty ve vzorku sníží velikost odbarvení, tato změna se monitoruje spektrofotometricky (434 nm). Antioxidačním standardem je kyselina askorbová. 3.6.11 Xanthine oxidase (XO) inhibition activity of polyphenolic compounds3,4,6 Využívá se vlastnosti polyfenolů inhibovat aktivitu xantin oxidasy, a tím i tvorbu produktu reakce – kyseliny močové. Monitoruje se velikost tvorby urátu (295 nm) nebo tvorba urátu a peroxidu vodíku modifikovanou metodou CUPRAC. Také tento postup může být spojen s HPLC separací a identifikací jednotlivých polyfenolových látek. 3.7 Přehled in vivo metod Jsou zpravidla vypracovány pro biologické tkáně popř. tekutiny získané od člověka nebo od experimentálních zvířat (moč, plazma, sliny, erytrocyty, homogenáty jater a.). Zpravidla se podávají známá množství potravin a v určitých intervalech se testuje míra oxidačního poškození tkání nebo velikost antioxidační ochrany organismu. 3.7.1 Ferric reducing ability of plasma Velmi rychlý a oblíbený test, vhodný pro rutinní analýzy. Měří se vzestup absorbance způsobený tvorbou železnatých iontů z činidla FRAP obsahujícího TPTZ (2,4,6-tripyridyl-striazin) a chlorid železnatý. Tato změna je úměrná antioxidační kapacitě vzorku plazmy. 3.7.2 LPO – lipid peroxidation assay LPO je autokatalytický proces, který je spojen s odumíráním buněk. Může být způsoben zánětem, zhoubným bujením, toxicitou xenobiotik nebo stárnutím organismu. Jedním z produktů LPO je malondialdehyd,který se proto považuje za indikátor lipidové peroxidace. Je stanoven např. v krevní plazmě nebo ve tkáňových homogenátech reakcí s kyselinou 2thiobarbiturovou a spektrofotometrickým měřením barevného produktu. (532 nm). Nověji je malondialdehyd chromatograficky separován a kvantifikován. 3.7.3 Změny aktivit antioxidačních enzymů Jedná se o skupinu enzymů, které se stanovují nejčastěji v krevní plazmě nebo v erytrocytech. Indikují velikost endogenní antioxidační obranyschopnosti organismu. Ve světle nových poznatků o širší spektru biologické aktivity ROS a volných radikálů (mohou indukovat tvorbu těchto enzymů) je interpretace výsledků analýz méně jednoznačná. Nejčastěji se určují aktivity enzymů: glutathion peroxidasa, superoxid dismutasa, glutathion-S-transferasa, glutathion reduktasa, katalasa. 3.8 Doplňující poznámky • Jeden test sám o sobě nemůže postihnout komplexně antioxidační kapacitu vzorku, neboť ta je souhrnem mnoha dílčích faktorů, které v úplnosti žádná dosud vyvinutá laboratorní metoda nedetekuje; důležitou roli také hrají zvolené reakční podmínky. • V praxi se proto běžně při analýzách potravin i biologických vzorků aplikuje alternativně několik laboratorních metod (zachycení přítomných fenolů a polyfenoů, odlišení hydro- a liposolubilních látek) • Metody ke stanovení TAC krevní plazmy se často používají v klinické chemii a biochemii. Bývají doplněny o stanovení antioxidačních enzymů, a umožňují tak testovat účinnost endogenní (lidské) antioxidační obranyschopnosti nebo míru
• •
•
•
oxidačního poškození organismu. Také zde platí omezení uvedená v předchozím odstavci. Nověji se specifičnost a komplexnost antioxidačního potenciálu potravin určuje kombinací separace a identifikace účinných látek (HPLC) a jejich testováním v izolovaném stavu. Dosud neexistuje databáze antioxidačních hodnot potravin – výsledky analýz se liší laboratoř od laboratoře, použitými laboratorními podmínkami a také rozdílností agrotechnických aj. podmínek, které ovlivňují kvalitu potravin rostlinného původu během zemědělské produkce, zpracování, skladování apod. V přítomné době se uskutečňují pokusy zvýšit validitu laboratorních analýz na TAC potravin tím, že se vzorky vystavují účinku trávicích enzymů, které působí v lidském organismu. Teprve vzniklá směs produktů trávení je testována běžnými metodami na TAC9 Hodnota TAC jen orientačně naznačuje pravděpodobný zdravotně ochranný účinek dané potraviny; vzhledem k relativní jednoduchosti jejího stanovení je však stále velmi intenzívně používána.
4 Praktická část 4.1 Příklady jednoduché laboratorní metody stanovení TAC vzorku potraviny – podrobné návody 4.1.1 Příprava vzorku potraviny k analýze Vzorek ovoce nebo zeleniny, event. hroznové víno, zelený nebo černý (nebo ovocný) čaj, těstoviny apod. • Asi 20 g potraviny + 80 ml směsi voda + metanol (1:1), event. voda + etanol se po dobu několika vteřin mixuje při max. otáčkách • zfiltruje se přes papírový filtr (v příp. potřeby se napřed odstředí při 4 000 ot/min, supernatant se zfiltruje) • filtrát je možno uchovávat v chladničce po dobu 1–3 dnů nebo v mrazničce po dobu několika týdnů • suchý čaj – 1 g + 100 ml vroucí vody, ponechá se 10 min stát, zamíchá se a slije • révová vína lze odebírat k analýzám neředěná • potraviny s mimoř. nízkým obsahem přírodních látek/meloun, okurky apod. – extrakt zahustit ve vakuu na ¼ objemu 4.1.2 Stanovení celkové antioxidační kapacity potravin metodou FRAP Princip metody: Redukující látky v analyzovaném vzorku redukují ferrikyanid na ferrokyanid; ten za daných podmínkách reaguje se železitou solí, produkt je intenzívně modrý; intenzita zbarvení je přímo úměrná antioxidační (redukční) aktivitě vzorku. Pracovní roztoky: 0,2 M fosfátový pufr pH 6,5 1% roztok ferrikyanidu draselného (vodný) 10% roztok kyseliny trichloroctové (vodný) 0,1% roztok chloridu železitého (vodný) standardní roztok kyseliny gallové: 10 mg/100 ml (vodný) Pracovní postup: Do plastových zkumavek se pipetuje 0,95 ml pufru 50 µl vzorku (standardu event. vody) 0,5 ml rozt. ferrikyanidu
zahřívá se na vodní lázni (50 °C) po dobu 20 min. přidá se 0,25 ml roztoku kys. trichloroctové a 0,5 ml vody přidá se 0,2 ml roztoku chloridu železitého promíchá se a změří se absorbance při 700 mm proti vodě TAC se vypočte jako ekvivalentní množství kyseliny gallové, které má stejnou hodnotu TAC pro 1 g vzorku. 4.1.3 Stanovení antioxidační kapacity potravin metodou DMPD Princip stanovení: Sloučenina DMPD se účinkem železité soli převede na svou radikálovou formu, která má červené zbarvení; přítomné antioxidační látky tento radikál „neutralizují“ a tím odbarvují; velikost odbarvení je přímo úměrná antioxidační aktivitě vzorku. Pracovní roztoky: 0,1 M Na – acetátový pufr, pH 5,25 roztok chloridu železitého – 20 mg hexahydrátu a 100 ml vody standard: 10 mM Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina, dod. Aldrich, Fischer Sci. aj.), 25 mg + 10 ml ethanolu nebo kys. gallová 10 mg/100 ml vody roztok DMPD (N,N-dimethyl-p-phenylendiamin dihydrochlorid) vždy čerstvý!, 25 mg + 5 ml vody bezprostředně před zahájením analýzy se smísí 30 ml acetát. pufru 1,5 ml roztoku chloridu železitého 1,5 ml roztoku DMPD Pracovní postup: Do zkumavek se pipetuje 2 ml prac. roztoku DMPD, 50 µl vzorku (standardu, vody). !dojde-li rychle k odbarvení, postup se zopakuje s 10nás. zředěným vzorkem! Promíchá se, po 10 min se fotometruje proti vodě při 505 nm. Vyhodnocuje se zeslabení absorbance standardem a vzorkem, ze vzájemného srovnání se vyjádří TAC vzorku jako ekvivalentní množství Troloxu ( nebo kys. gallové) na 1 g vzorku. 4.1.4 Stanovení celkového obsahu fenolových látek ve vzorku potraviny Jedná se o velmi často používané a zároveň snadné vyšetření, které poskytuje doplňující informace o hlavních nositelích antioxidační kapacity. Často se provádí korelační analýza hodnotící vztah mezi TAC a obsahem fenolových látek v potravině. Princip metody: Folin-Ciocalteaovo činidlo (fosfomolybdenan amonný) reaguje v alkalickém prostředí s fenoly za vzniku modrozeleného zbarvení, jehož intenzita je přímo úměrná obsahu fenolových látek. Pracovní roztoky: Fol.Ciocalt. činidlo (dodává např. Fischer Sci. aj.).pracovní roztok se ředí 10nás. vodou nasycený roztok uhličitanu sodného – přibližně 7,5 g + 95 ml vody roztok kyseliny gallové – 10 mg + 20 ml vody Pracovní postup: Do zkumavek se pipetuje 1 ml zředěného Fol.-Ciocalt. Činidla, 1 ml vody, 50 µl vzorku (standardu, vody). Promíchá se, po 5 min se přidá 1 ml roztoku uhličitanu sodného. Promíchá se, po 15 min se fotometruje při 750 nm. Obsah (poly)fenolových látek se vyjádří jako ekvivalentní množství kys. gallové v 1 g (nebo 1 kg) potraviny.
4.1.5 Stanovení obsahu polyfenolů ve vzorku potraviny Jedná se o orientační stanovení celkového obsahu flavonoidů; je to nejpočetnější skupina polyfenolů v potravinách rostlinného původu, dosud bylo izolováno a identifikováno přibližně 4 tisíce individuí. Princip metody: Flavonoidy reagují s hlinitou solí a s dusitanem za vzniku červeně zbarveného komplexu. Pracovní roztoky: 5% roztok dusitanu sodného v dest. vodě 10% roztok chloridu hlinitého v dest. vodě 1 M roztok hydroxidu sodného 1 mM roztok katechinu (katechin hydrát, 10 mg + 30 ml dest. vody – standard) Pracovní postup: Nutné použít původní extrakt vzorku (neředěný), event. extrakt 3x vakuově zahuštěný Do zkumavek se pipetují: 0,5 ml vzorku + 1,5 ml redest. vody (paralelně 0,5 ml stand. resp. vody 0,2 ml rozt. dusitanu, promíchá se po 5 min 0,2 ml rozt. chloridu hlinitého, promíchá se, po 5 min 1,5 ml rozt. hydroxidu sodného a 1 ml redest. Vody, promíchá se, po 15 min se fotometruje proti slepému vzorku při 510 nm. Výsledky se vyjádří jako obsah katechinu. 4.2 Test velikosti příjmu potravy rostlinného původu na základě antioxidačních parametrů moči Vzorek moči: ranní čirá moč. 4.2.1 Stanovení obsahu fenolových látek v moči Pracovní postup: Do zkumavek se pipetuje: 1 ml redest. vody + 1 ml zřed. Folin-Ciocalteuova činidla + 20 µl moči paralelně místo moči se přidá stejný objem standardního roztoku (kys. gallové nebo dest. vody - standardní a slepý roztok), protřepá se, další postup jako při analýze potravin 4.2.2 Stanovení obsahu vitaminu C v moči Pracovní roztoky: 2% roztok konc. kys. octové ve vodě roztok 2,6-dichlorfenolindofenolu (0,03 g látky se rozpustí ve 200 ml vroucí dest. vody), po ochlazení se zfiltruje; ofaktoruje se standardním roztokem kyseliny askorbové: kys. askorbová p.a. se přesně odváží (přibl. 0,1 g) a rozpustí a následně se zředí roztokem 2 % kyseliny octové v dest.vodě na výslednou koncentraci 100 µg/1 ml Pracovní postup: 2–5 ml moči + 1 ml 2% roztok kys. octové + voda (alternativně 1 ml standardního roztoku kyseliny askorbové). Titruje se roztokem dichlorfenolindofenolu z mikrobyrety do vzniku růžového zbarvení přetrvávajícího min. 5 sekund. 4.2.3 Stanovení celkové antioxidační kapacity moči - aplikovat metodu FRAP a DMPD (či jinou) postupem popsaným pro analýzu tekutých potravin; - jako vzorek vzít 0,5 ml moči; je-li výsledek příliš nízký, postup zopakovat s 1-2 ml vzorku.
Poznámka: Toto testování bylo prováděno jako laboratorní kontrola pacientů obezitologické poradny. Cílem bylo ověřit, zda pacienti dodržují dietní doporučení spočívající ve zvýšeném příjmu ovoce a zeleniny. Metoda je založena na skutečnosti, že: • Při větší spotřebě ovoce nebo zeleniny se nárazově zvýší vylučování vitaminu C močí. • V moči se v takovém případě také zvýší obsah jednoduchých fenolových a polyfenolových sloučenin a produktů jejich katabolického štěpení. Ty mají zpravidla zachovánu fenolovou strukturu, která je reaktivní s Fol.-Ciocalt. činidlem a podílí se na celkové antioxidační kapacitě. Při jejím stanovení reaguje pozitivně také kyselina askorbová. Uvedené tři dílčí analytické výsledky prokazatelně korelují s velikostí recentního (během posledních 18–12 hod.) příjmu ovoce a zeleniny (TAC, celkové fenoly a vitamin C) resp. luštěnin a cereálií (vše mimo vitamin C). Zajímavé rozdíly těchto stanovení se získají rozborem moči člověka s pestrým jídelníčkem (rostlinné i živočišné potraviny ve stravě) a člověka se zvýšeným konzumem potravin rostlinného původu a vegetariána apod. 5.
Shrnutí Předpoklad, že oxidační poškozování různých konstitutivních a funkčních biostruktur, které je v proměnlivé intenzitě-průvodním jevem života každého jedince, způsobuje vážné zdravotní poruchy a může způsobit vznik onemocnění, je přijímán jako spolehlivě ověřená skutečnost a jako jeden z podstatných rizikových faktorů pro lidské zdraví. Kromě snahy o prevenci oxidačních podnětů je velká pozornost věnována potravním faktorům, které mohou oxidační ohrožení lidského organismu korigovat a také metodám, umožňujícím hodnotit velikost ochranného antioxidačního potenciálu nejrůznějších potravin, zejména rostlinného původu. V uplynulých 30 letech bylo vyvinuto a do praxe potravinářských a klinických laboratoří zavedeno mnoho desítek laboratorních metod určujících tzv. celkovou antioxidační kapacitu různých potravin. Tyto metody umožňují klasifikovat potenciál potraviny posilovat svými přírodními látkami a jejich metabolity antioxidační obranyschopnost člověka a tuto schopnost postulovat jako významnou stránku biologické a nutriční hodnoty potravin. Mnohé z těchto metod jsou relativně jednoduché a málo instrumentálně náročné a mohou být aplikovány také jako testy kvality potravin v závislosti na způsobu pěstování zemědělských surovin, jejich technologického zpracování nebo výsledné kulinářské úpravy. 6. Seznam literatury 1. Štípek S. a kol., Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci. Avicenum-Grada, Praha, 2000. 2. Rébrová Z., Vliv vnějších faktorů na aktivitu antioxidantů. Chem.Listy 2011,105: 667673. 3. Apak R., Gorinstein S., Böhm V., Schaich K.M., Özyürek M., Güclü K., Methods of measurement and evaluationof natural antioxidant capacity/activity (IUPAC technical report) Pure Appl.Chem. 2013, 85(5): 957-998. 4. Alam N., Bristi N.J., Rafiquzzamann Md., Review on in vivo and in vitro methods of antioxidant aktivity evaluation. Saudi Pharmaceut.J. 2013, 21: 143-152. 5. Taverne Y.J.H.J., Bogers ad J.J.C., Duncker D.J., Merkus D., Reactive oxygen species and the cardiovascular system. Oxid.Med.Cell.Longev. 2013, ID 862423, p. 1-14. 6. Apak R., Güclü K., Demirata B., Özyürek M., Celik S.E., Bektasoglu B., Berker K.I., Comparative evaluation of various total antioxidant capacity assays applied to Phenolic compounds with the CUPRAC assay. Molecules 2007, 12: 1496-1547.
7. Rautiainen S., Levitan EB, Mittleman MA, Wolk A, Total antioxidant capacity of diet and the risk of heart failure: A population-based prospective cohort of women. Am.J.Med. 2013,126(6): 494-500. 8. La Vecchia C., Decarli A., Serafini M., Parpinel M., Bellocco R. Galone C., Bosetti C., et al., Dietary total antioxidant capacity and colorectal cancer: A large case-control study in Italy. Int.J.Cancer 2013, 133(6): 1447-1451. 9. Gong LX, Jin C., Wu XQ, Zhang Y.: Relationship between total antioxidant capacities of cereals measured efore and after in vitro digestion. Int.J.Food Sci.Nutr. 2013, 64(7): 850856. 10. Čelakovský J., Zloch Z., Tůmová O., Celková antioxidační kapacita některých našich potravin a její význam z hlediska ochrany veřejného zdraví. Hygiena 2006, 51(2): 36-41. 7 Přílohy Tabulka 7.1 Výsledky TAC (výsledky získané z 25 vybraných vzorků každou ze tří aplikovaných laboratorních metod jsou vyjádřeny v mg kyseliny gallové/100 g čerstvého vzorku)10 Vzorek potraviny Avokádo Meloun vodní Hruška letní Jablko letní Mandarinka Grapefruit Citron Pomeranč Hrozen červený Hrozen bílý Víno červené (Frankovka) Víno bílé (Veltlín) Čaj černý - indický Cibule žlutá Paprika zelená Paprika červená Kapusta Okurka salátová Zelí bílé Cuketa Brambor Rajče Květák Salát hlávkový
Metoda FRAP 51,0 65,6 86,0 92,4 116,7 187,3 48,3 84,1 379,0 456,0 1323 56,6 39,6 (na 1 g) 178,0 10,3 67,2 98,3 26,5 97,1 13,4 17,9 66,6 96,2 59,8
Metoda LPX Metoda DMPD 66,6 61,3 8,5 432,0 296,0 297,5 287 113,9
9,0 6,6 24,8 7,3 10,7 17,9 14,1 7,1 56,8 65,2
108,2 178,2 15,1 (na 1 g) 186,1 1018 665,0 102,9 3,4 32,6
343,0 139,7 7,8
56,4 (na 1 g) 116,7 11,0 5,1 39,5 16,2 26,2 1,1 4,7 215,4 27,0
Tabulka 7.2 Obsahy vitaminu C, fenolických kyselin (jako kyselina gallová) a polyfenolů (jako katechin) ve stejných vzorcích potravin (v mg/100 g čerstvého vzorku)10 Vzorek potraviny Avokádo Meloun vodní Hruška letní Jablko letní Mandarinka Grapefruit Citron Pomeranč Hrozen červený Hrozen bílý Víno červené (Frankovka) Víno bílé (Veltlín) Čaj černý - indický Cibule žlutá Cibule červená Paprika zelená Paprika červená Kapusta Okurka salátová Zelí bílé Cuketa Brambor Rajče Květák Salát hlávkový
Vitamin C (mg/100 g) 3,2 3,6 2,5 10,5 46,8 51,3 41,4 56,0 0,3 0,5 0,4
8,4 5,4 109,6 122,0 64,0 1,4 24,9 1,7 3,4 12,8 34,0 3,5
22,5 83,0 155,0 20,7 20,4 19,7 113,2 259,0 202,0 60,8
Polyfenoly (mg/100 g) 11,0 5,9 11,0 61,3 8,3 10,7 7,4 15,5 25,0 48,0 45,7
23,2 62,8 (na 1 g) 42,7 16,4 93,4 53,1 164,0 29,5 47,4 22,4 64,3 31,4 51,7 48,6
6,8 18,4 (na 1 g) 5,6 8,9 5,7 5,8 6,9 5,1 3,2 4,5 3,9 8,4 6,9 24,5
Fenoly (mg/100 g)
Komentář k výsledkům uvedeným v tab. 7.1 a 7.2: Z přehledu výsledků je patrné, že jednotlivé hodnoty TAC stanovené třemi různými metodami se u téhož vzorku často liší, a to až v rozmezí 1 řádu (např. u grapefruitu, pomeranče a vína). Bylo také zjištěno, že relativně nejvyšší hodnoty TAC byly získány metodou DMPD a naopak nejmenší výsledky metodou LPX. Tyto rozdíly nejsou překvapující, uvádějí je běžně také zahraniční autoři, a jsou odrazem velmi odlišného spektra antioxidačních látek v daném vzorku, které mohou vstoupit do oxidačně-redukční reakce s použitým činidlem rozdílnou reakční rychlostí. Z porovnání našich výsledků se ukazuje, že všeobecně nejvyšší hodnotu TAC mají mandarinka, grapefruit, hrozny červené i bílé, červená vína a do jisté míry také jablko, fermentovaný i zelený čaj, cibule, kapusta, rajče a květák. Naopak všeobecně nepříznivější hodnoty TAC byly zjištěny u citronu, melounu, zelené papriky (sic!), cukety, brambor a dále u švestky a pórku. Výsledky stanovení vitaminu C odpovídají hodnotám běžně uváděným v různých tabulkách výživových hodnot potravin. Hodnoty fenolů a polyfenolů je třeba posuzovat opatrněji, neboť byly stanoveny málo specifickými metodami a mohly být ovlivněny neúplným uvolněním těchto látek z glykosidických vazeb před analýzou a jejich částečnou spontánní oxidací během úpravy vzorků. Dostatečná věrohodnost výsledků stanovení TAC je podpořena výsledky korelačních analýz, jimiž byly navzájem porovnávány hodnoty TAC zjištěné s použitím různých
laboratorních metod a také velikosti TAC a obsah vitaminu C, resp. fenolů a polyfenolů ve stejných vzorcích.
Obr. 7.1 Volně radikálová poškození
Obr.7.2 Antioxidanty
obr.7.3 Potravní zdroje antioxidačních vitaminů
Obr.7.4 Mechanismus účinku některých antioxidantů
DMPD
1500,0
Lineární (DMPD)
1000,0
DMPD
y = 0,7557x + 211,33
500,0
0,0 0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
1200,0
1400,0
FRAP
Obr 7.5 Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky (metody DMPD a FRAP) Na obr. 7.5 je uveden tvar regresní křivky, její rovnice a korelační koeficient odpovídající porovnání hodnot TAC získaných metodou DMPD a FRAP. Po vyloučení jediné odlehlé extrémní hodnoty DMPD je tento vztah statisticky významně závislý10. Korelační koeficient ⇒ 0,6732. Podobně těsný vztah byl vypočítán mezi výsledky TAC stanovenými metodou LPX a FRAP. Protože se na velikosti TAC pravděpodobně také podílí obsah vitaminu C a fenolických resp. polyfenolových látek, byla provedena korelační analýza také mezi jejich hodnotami.
3500,0
DMPD
3000,0 2500,0
DMPD
2000,0
Lineární (DMPD)
1500,0
y = 5,6951x + 185,07
1000,0 500,0 0,0 0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
Vit. C
Obr. 7.6 Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky DMPD a vitamin C
Na obr.7.6 je ukázka korelačního vztahu odrážejícího závislost mezi obsahy vitaminu C a hodnotami DMPD. Je charakterizován statisticky významnou vzájemnou závislostí obou proměnných veličin10. Korelační koeficient ⇒ 0,61227987 Podobná závislost byla určena pro vztah obsahu flavonoidů versus TAC stanovenou metodou FRAP. Naopak při srovnávání obsahu vitaminu C a výsledků metody FRAP těsné vztahy nalezeny nebyly. Interpretace výsledků laboratorních vyšetření potravin na jejich celkovou antioxidační kapacitu může směřovat k určitému hierarchickému uspořádání jednotlivých druhů potravin podle klesající nebo stoupající TAC. Sestavení takových žebříčků od nejlepších potravin k nejhorším je lákavé. Avšak takovéto zhodnocení potravin se musí přijímat s opatrností a je nutno respektovat podmíněnost zjištěných hodnot různými okolnostmi, např.: • oxidačně-redukční podmínky v extraktech potravin a antioxidační potenciál jednotlivých přírodních látek v těchto extraktech nejsou shodné s antioxidační aktivitou těchto látek a jejich metabolitů in vivo, např. v trávicím ústrojí, v krvi nebo v cílových tkáních, • do krevního oběhu člověka se dostává z potravy jen část požitých přírodních látek (asi 20–50 %) a ta je způsobem, který dosud nebyl uspokojivě objasněn, metabolizována na produkty, o jejichž struktuře a dalších osudech v organismu není dosud dostatek spolehlivých poznatků, • oxidační činidla používaná k detekci antioxidantů v potravním extraktu (in vitro) jen přibližně simulují rozmanitou směs oxidačních agens působících v organismu (in vivo). Také fyzikálněchemické podmínky pro interakce mezi oxidanty a potravními antioxidanty jsou v živém organismu odlišné od podmínek uměle vytvořených v laboratorních podmínkách. Současnými představiteli systematického testování antioxidační kapacity potravin (každý měsíc vychází v odborných časopisech desítky nových prací s mnoha analytickými údaji) jsou tato úskalí pracovních postupů a omezené možnosti interpretace výsledků respektovány. Další vývoj laboratorních metod bude směřovat k minimalizaci těchto nedostatků a k vytvoření optimálních podmínek pro biologicky korektní interpretaci získaných výsledků..
8. 1. a) b) c) d)
Test Ve kterých z uvedených vzorků se provádí rutinně testy na TAC ? izolované přírodní látky, zejména alkaloidy potraviny rostlinného původu potraviny rostlinného i živočišného původu surovinové produkty zemědělské produkce, jako brambory, obilí, řepka apod.
2. a) b) c) d)
Na hodnotě TAC se přímo podílejí např. tyto složky rostlinného materiálu: askorbát, thiamin, biotin selen, železo, hořčík, vápník fenolové kyseliny, flavonoidy, taniny, resveratrolů antokyaniny, karotenoidy, chlorofyl, pektin
3. a) b) c) d)
Mezi antioxidační enzymy nepatří: GSH reduktasa aminoacyltransferasy katalasa GSH peroxidasa
4. Ve zkratce FRAP je písmeno F odvozeno od a) ferric b) flavonol c) flavin d) flavinol 5. Které tvrzení je správné: a) všechny testy použité ke stanovení TAC určité potraviny musí poskytnout statisticky stejné výsledky b) výsledky různých testů použitých ke stanovení TAC určité potraviny jsou často statisticky rozdílné 6. Které látky se používají jako standard k vyjádření obsahu fenolických látek v potravinách? a) resorcinol b) resveratrol c) tanin d) kyselina gallová 7. a) b) c) d)
Které tvrzení je nesprávné? hodnota TAC citrusů je vždy větší než TAC melounu hodnota TAC brambor je vždy menší než TAC červeného vína hodnota TAC černého rybízu je vždy větší než TAC okurek hodnota TAC zeleného čaje (pevné substance) je vždy menší než TAC dýně
8. a) b) c) d)
Na hodnotě TAC krevní plasmy se vždy podílí: (větší počet tvrzení je správný) obsah vitaminů C a E, obsah karotenoidů obsah plasmatického Fe obsah kyseliny listové a retinolu obsah produktů katabolismu fenolových látek
9. Které tvrzení je správné? a) tzv. megadávky vitaminu E, ß-karotenu, vitaminu C zajistí spolehlivě saturaci organismu těmito živinami a jejich antioxidační funkci b) při dostatečném příjmu ovoce a zeleniny (250 g resp. 450 g na os. a den) je dostatečný příjem potravních antioxidantů c) suplementace potravy antioxidanty je užitečná a neškodná v jakémkoli množství 10. Poly(fenolové) látky v potravě a) jsou v lidském organismu metabolizovány až na oxid uhličitý a vodu b) jsou dlouhodobě ukládány v tukové tkáni c) jsou rychle v nezměněné podobě vyloučeny močí d) jsou štěpeny na nízkomolekulární produkty se zachovanou fenolovou strukturou, které jsou po krátké době vyloučeny močí a stolicí
Správné řešení: 1b, 2c, 3b, 4a, 5b, 6d, 7d, 8a,c,d, 9b, 10d
