METODE PENELlTlAN Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Studi Hayati Pusat Antar Universitas (PAU) IPB Bogor, Laboratorium Genetika Departemen Biologi lnstitut Teknologi Bandung, dan Laboratorium Biologi Molekuler BB BIOGEN Cimanggu Bogor. Waktu penelitian mulai dari Januari 2004 sampai Desember 2005. Bahan dan Alat Bahan Daun jati yang digunakan sebagai bahan penelitian merupakan kultur in
vitro berumur 2 MST (Minggu Setelah Tanam), terdiri dari tanaman klon Jati Biotropika (Emas) produksi PT PPA Agricola SEAMEO BIOTROP dan klon jati lokal yang diperoleh dari hutan jati milik Perum Perhutani di perbatasan Kabupaten Sumedang dan Kabupaten Indramayu, Jawa Barat. Bahan untuk media tumbuh in vitro adalah media dasar MS (Murashige and Skoog 1962), vitamin dan zat pengatur tumbuh tanaman (ZPT). Selain itu menggunakan bahan-bahan untuk isolasi dan ekstraksi DNA, pemotongan DNA genom, ligasi adaptor, Hibridisasi, kloning vektor, transformasi, isolasi plasmid, PCR, elektroforesis dan bahan pendukung lainnya. Alat Alat yang digunakan antara lain untuk mikropropagasilkultur jaringan, isolasi dan ekstraksi DNA, pemotongan DNA genorn, ligasi adaptor, Hibridisasi, kloning vektor, transformasi, isolasi plasmid, PCR, elektroforesis dan alat pendukung lainnya. Metode Pelaksanaan Penelitian isolasi dan karakterisasi mikrosatelit pada tanaman jati dilakukan melalui beberapa tahap metode kerja (Gambar 1) mengikuti modifikasi Edwards et a/. (1996), yaitu : isolasi DNA genom jati, pemotongan DNA genom jati, ligasi dengan adaptor, hibridisasi, ligasi dengan vektor plasmid, transformasi, isolasi plasmid rekombinan, sekuensing dan perancangan primer.
Fragmentasi DNA (Alul, Rsal dan Hindl)
Isolasi DNA
DNA G e m
Fragmen W 200-1500 bp I
Ligasi Adaptor Mlld PCR dengan 21-mer Pengikatan 16 oligo krmotif mikrosatelit
$
Elusi membran
cD Enrichment DNAIPCR
l i 3 1 Skrininq biru-~utih
iKarakterisasi motif mikrosatelit
Gambar 1. Alur kerja pencarian motif mikrosatelit
lsolasi DNA Genom Jati DNA total genomik diekstraksi dari daun jati muda dengan menggunakan metode CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) dari Roger et a/. (1994) yang sudah dimodifikasi. Daun muda dibersihkan kemudian digerus sampai hancur. Hasil gerusan dimasukan ke dalam eppendorf 1,5 ml dan ditambah CTAB Buffer
secukupnya kemudian diinkubasi pada 65OC selama 3 jam. Larutan ditambah Phenol dengan perbandingan 1:1, dikocok *20 menit. Campuran disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan ClAA (Clorofom /so Amil Alkohol) kemudian dikocok i 2 0 menit. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit. Fase bawah dipindahkan ke ependorf baru, ditambahkan Sodium buffer kemudian diinkubasi pada 65 OC, selama 15 menit. Tambahkan Sodium/Potassium asetat, kocok 5 menit. Selanjutnya ditambah Ethanol absolut dingin 2 x volume, simpan di freezer 30 menit, sentriiuse pada 13.000 rpm selama 3 menit. Ethanol absolut dibuang, kemudian diganti dengan Ethanol 70%, sentrifuse pada 13.000 rpm selama 3 menit. DNA (endapan putih) dikering udarakan dan dilarutkan kembali dengan buffer TE. Untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA genom jati hasil isolasi, dilakukan analisa kuantitatii dengan menggunakan spektofotometri UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Sedangkan untuk analisa
kualitatif sampel DNA genom dielektroforesis dengan 1,2% gel agarose, diwarnai dengan etidium bromida dan difoto dengan film polaroid atau disimpan dalam bentuk gambar. Pernotongan DNA Genorn Jati Hasil isolasi DNA genom dipotong dengan menggunakan beberapa enzim restriksi yang menghasilkan potongan DNA berujung tumpul (blunt end) sesuai dengan metode Edwards et a1 (1996) yang dilakukan secara simultan. Adapun enzim restriksi yang digunakan adalah : Alul, Rsal dan Hincll.
Reaksi
pemotongan dilakukan mengikuti protokol Clark (1997) dengan sedikit modifikasi. Komposisi reaksi pemotongan disajikan dalam Tabel 2. Tabel 2. Komoosisi reaksi ~emotonaanDNA aenom
Masing-masing reaksi diinkubasi pada suhu 37°C seiama empat jam.
DNA genom jati mula-mula dipotong dengan enzim Alul kemudian dipotong lagi dengan enzim Rsal dan terakhir oleh Hincll. Untuk masing-masing reaksi diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam. Hasil pemotongan ketiga enzim restriksi dapat diketahui melalui elektroforesis dalam 1,2% agarose gel. Ligasi Fragmen DNA dengan Adaptor
Mengikuti protokol Edwards et a1 (1996) dengan komposisi reaksi disajikan dalam Tabel 3, proses ligasi dilakukan pada suhu 4°C selama semalam. Fragmen DNA hasil pemotongan enzim restriksi diligasikan dengan adaptor Mlul21-mer dan 25-mer (Produk GibcoBRL) pada sisi kanan dan kirinya. Adaptor 21-mer (21 pb) dan 25-mer (25 pb) adalah urutan yang komplemen, dimana adaptor 25-mer mempunyai satu gugus fosfat pada ujung 5'. Pasangan antara adaptor 21-mer dan 25-mer disajikan dalam gambar 2 berikut ini : Tabel 3. Komposisi reaksi ligasi DNA dengan adaptor Konsentrasi akhir
Volume
KmpMlen DNA
1.00 pl 200 ng - 400 pg 0.50 pl 2 pglpl l . 0 0 ~ I 11@d 5.00 pl 5 pl 5.00 111 5 111 1.00p1 1 3 U
2lmer 25mer I ox 'butfef l i i -
10 mM ATP T4 DNA ligase (1UIpI)
1
Air deion Total volume
36~50ul
1
50.00 lJ
Proses ligasi dilakukan pada suhu 4'C selama semalam. Keberhasilan reaksi
ligasi dapat
diuji
dengan
cara
amplifikasi
menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan adaptor 21-mer digunakan sebagai primer.
Komposisi PCR untuk mengetahui keberhasilan
reaksi ligasi disajikan dalam Tabel 4.
Gambar 2. Perpasangan adaptor 21-mer dan 25-mer
Tabel 4. Komposisi reaksi PCR DNA terligasi adaptor
Hibridisasi Hibridisasi merupakan pengikatan antara DNA hasil amplifikasi yang telah didenaturasi dengan membran Nylon Hybon yang telah
mengandung
oligonukleotida bermotif mikrosatelit. Tahapan hibridisisasi meliputi persiapan membran, proses hibridisasi dan pengdyaan DNA bermotif mikrosdtelit melalui amplifikasi DNA hasil elusi dengan PCR. Persiapan membran Sebanyak 16 macam oligonukleotida bermotif mikrosatelit produk Operon Technologies Inc., digunakan untuk mbmperkaya fragmen DNA yang diduga mengandung mikrosatelit, yaitu : [T]zs, [ATII~, [ACI15, [AGI~s,[AATIIo, [AACIlo, [AAGlio, [CTAlio, [TAGIio, [AGClio, [GCTlio, [GTGIio, [GGAIio, [GCClio, W V i o dan [AAATllo. Keenambelas oligonukleotida tersebut dibagi menjadi 3 kelompok membran mengikuti Kusumawaty (1999) berdasarkan Melting Temperature (T,) dari masing-masing oligonukleotida yang dihitung menggunakan rumus Sambrook ef a/. (1989) : T, = 81.5 + 16.6 10g [Na'] + 0.41 (%G+C) - 600111
Untuk tiap kelompok membran, 10 pl dari masing-masing oligonukleotida dicampur kemudian ditambahkan 5xSSC (45 mM Natrium Sitrat pH 7,O dan 450 mM NaCI) hingga volume akhir 1 ml. Campuran oligonukleotida diteteskan ke membran Nylon Hybond N' berukuran 0,5 cm2, dibiarkan hingga meresap dan kering baru dilakukan penetesan berikutnya sampai habis. Membran dikering anginkan dalam suhu kamar sekitar 1 jam dan dikeringkan dalam oven 65°C selama satu jam. Kemudian membran didedahkan pada
UV crosslinker (Bio-Link) selama
15 detik dengan panjang gelombang 254
nm energi 0,070 Joule dengan harapan oligonukleotida terikat kuat pada membran.
Untuk menghilangkan oligonukleotida yang terikat lemah pada
membran, dilakukan pencucian 2 kali dengan Buffer Hibridisasi (50% formamida, 3 x SSC, 25 mM Na-fosfat pH 7, 2.5% SDS) pada suhu 45°C selama 2 hail dalam oven hibridisasi (ganti buffer hibridisasi setiap 24 jam).
Kemudian
membran dicuci dengan 1 x SSC selama 3 jam pada suhu 45°C dan dibiarkan kering pada suhu ruang. Membran disirnpan dalam cawan petri steril pada suhu -20°C. Proses Hibridisasi Proses hibridisasi mengikuti protokol Edwards et a/. (1996), sampel DNA hasil ligasi didenaturasi dengan cara memasukkan tabung eppendorf berisi sample DNA ke dalam air mendidih selama 10 menit kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi 500 p1 buffer hibridisasi (3 x SSC, 25 mM Na-fosfat pH 7, 2.5% SDS) yang mengandung 1 pg primer 21-mer, dan membran yang telah mengandung motif mikrosatelit. Hibridisasi dilakukan per kelompok membran dengan suhu hibridisasi berdasarkan rata-rata Tm, yaitu membran I dilakukan pada suhu 40°C, membran II pada suhu 55°C dan membran Ill pada suhu 72"C, masing-masing selama 48 jam dengan menggunakan "Shake 'n Stack" oven hibridisasi. Setiap kelompok membran dicuci di dalam oven hibridisasi dengan suhu pencucian membran I 50"C, membran II 65°C dan membran Ill 82°C sebanyak 5x (5 menit untuk setiap l x pencucian) dalam larutan 2xSSC, 0,01% SDS dan 3x (5 menit untuk setiap l x pencucian) dalam larutan 0,5x SSC, 0,01% SDS. Amplifikasi DNA elusi DNA yang telah terikat pada rnembran kemudian dielusi dengan cara merendam membran dalam 200 p1 air de-ion mendidih selama 10 menit. DNA hasil elusi diamplifikasi (diperkaya) dengan menggunakan teknik PCR sebanyak 35 siklus dan menggunakan primer 21-mer dengan kondisi PCR sebagai berikut : denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 59°C selama 1 menit, dan elongasi 72°C selama 2 menit. Komposisi reaksi PCR disajikan dalam Tabel 5.
Produk PCR
dielektroforesis menggunakan 1,4% agarosa gel dalam 0,5xTBE. Pewarnaan gel dilakukan dengan perendaman dalam ethidium bromide 2 pg1100 ml selama 15 menit kemudian gel dicuci dengan deion selama 10 menit. Gel diamati dengan menggunakan Geldoc, gambar dapat didokumentasikan dengan menggunakan film polaroid atau disimpan dalam disket.
Tabel 5. Komposisi reaksi PCR DNA hasil elusi (enrichment)
Ligasi dengan Vektor Plasmid Reaksi ligasi DNA produk PCR dilakukan mengikuti petunjuk penggunaan kit vektor
GEM" - T Easy dari Promega.
Proses ligasi dilakukan pada suhu 4°C
selama semalam dengan komposisi reaksi ligasi disajikan dalam Tabel 6 dibawah ini. Tabel 6. Komposisi reaksi ligasi DNA ke dalam vektor
GEM" - T Easy
Transforrnasi Pembuatan sel kompeten E.Coli DH5-a Pembuatan sel kompeten mengikuti protokol lnoue et a/. (1990) dengan sedikit modifikasi.
Suhu m e ~ p a k a nfaktor yang harus diperhatikan dalam
pembuatan sel kompeten E.Coli DH5-a, suhu harus dijaga selalu dalam kondisi dingin selama proses perlakuan kimiawi dan dalam kondisi aseptik. Bakteri E.Coli D H 5 a dari stok gliserol diambil 1 ose dan diinokulasi ke dalam media SOB padat (2% Tryptone, 0,5% yeast extract, 1% (vlv) 1 M NaCI, 0,25% (vlv) 1 M KCI, 1% (vlv) 2 M MgCI,, 1,5% agar), diinkubasi pada suhu 37°C semalam. Satu koloni tunggal E.Coli umur 16-18 jam diambil dan diinokulasi ke dalam 5-6 ml medium SOB cair pada tabung falcon 50 ml (kultur cair skala kecil) diinkubasi pada suhu 37°C semalam dan dishaker pada kecepatan 250 rpm.
Dari kultur cair skala kecil, diarnbii suspensi sel sebanyak 2 rnl dan diinokulasi ke dalam 150 rnl medium SOB cair pada labu erlenrneyer 500 ml untuk dibuat kultur cair skala besar. Diinkubasi pada suhu 18°C-22°C dishaker pada kecepatan 120 rprn dan diukur ODnya sampai diperoleh ODBoo= -0,45. Suspensi sel diletakan di es selarna 1 jam, rnasukan t 30 ml ke dalarn tabung Sorval, diinkubasi di es selarna 10 rnenit disentrifugasi 3.500 rprn 4°C selama 15 rnenit. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dalarn es dengan 16 rnl buffer TP dingin (10 rnM PIPES, 15 mM CaCIZ.2H,0, 250 rnM KC1 diukur hingga pH 6.7 tarnbahkan 55 rnM IWnCIZ) dengan cara dijentik-jentik atau divortek beberapa detik, diinkubasi dalarn es selarna 10 menit, kemudian disentrifugasi 3.500 rpm pada 4°C selarna 15 menit. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dalam es dengan 4 rnl buffer TP dingin kemudian tarnbahkan 7% DMSO (280 pl) dikocok perlahan atau divortek beberapa detik. Suspensi sel diinkubasi dalam es selarna 10 rnenit dan siap digunakan sebagai sel kornpeten untuk proses transformasi. Sisa suspensi sel dialiquot ke dalam rnikrotube 1,5 ml (@ 100 pl) rnasukan secara cepat ke dalarn nitrogen cair dan disirnpan pada suhu -80°C. Transformasi Metode trdnsforrnasi yang digunAkAn adalah rnetode kejut panas (Heat Shock) mengikuti protokol lnoue ef a/. (1990) yang telah mengalami sedikit rnodifikasi. Sebanyak 5 p1 DNA hasil ligasi (plasmid rekornbinan) dirnakukkan dalam tabung Falcon 15 ml (polipropilen) dingin kernudian dicarnpur dengan 50100 p1 sel kom(3den. Tabung doentik-jentik secara perlatian agar bercdrnpur, diinkubasi dalarn es selarna 20 rnenit. Tabung di heat shock dengan cara dirnasukan ke dalam inkubator suhu 42°C selarna 50 detik dan secara cepat tabung dipindahkan ke dalam es selarna 2 rnenit. Sebagai media perturnbuhan transforman ditambahkan 950 p1 SOC (2% Tryptone, 0,5% yeast extract, 1% (vlv) 1 M NaCI, 0,25% (vlv) 1 M KCI, 1% (vlv) 2 M MgClz, 1% (vlv) 2 M glukosa), diinkubasi pada suhu 37°C di dengan pengocokan 200 rprn selarna 1-3 jam. Kultur sel transforman sebanyak 50-100 pi ditanarn pada medium LB padat yang telah mengandung 100 pglml arnpisilin, 100 pI IPTG (100 rnM Isopropythio-p-D-galactoside) dan 20 pl X-gal (50 rnglrnl), kultur diratakan dengan bola-bola kaca steril dan diinkubasi pada suhu 37°C selarna sernalam.
lsolasi Plasmid lsolasi plasrnid dilakukan berdasarkan rnetode lisis alkali (Sarnbrook et a/., 1989) dengan sedikii rnodifikasi. Koloni putih tunggal yang berasal dari kultur transforman diiurnbuhkan dalarn 5 rnl media selektiif Tenifc Broth (1,2% tryptone, 2,4% yeast extract, 0,4% glycerol, 0,23% KH2P04, 1,25% K2HP04) yang rnengandung 100 pglrnl arnpisilin, diinkubasi sernalarn pada suhu 37OC dengan pengocokan 250 rpm. Panen sel kultur bakteri dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 14.000 rprn selarna 20 detik. Pelet yang terbentuk dilarutkan dalarn 200 p1 GTE (50 rnM glukosa, 25 rnM Tris-CI pH 8,0, 10 rnM EDTA pH 8,O) dan dihornogenkan dengan vorteks. Suspensi sel ditarnbahkan dengan 400 p1 buffer lisis (0,2 M NaOH, 1% SDS), tabung dibolak-balik beberapa kali. Kernudian ditarnbahkan 150 pl 5M Potasiurn asetat, sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rprn selarna 2 menit. Supernatan dipindah ke tabung baru kernudian DNA plasmid diendapkan dengan penarnbahan ethanol absolut dingin 2x volume, tabung dibolak-balik dan dipresipitasi selarna 30 rnenit pada suhu -80°C.
Selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rprn selama 2 rnenit, pelet yang terbentuk dicuci dengan ethanol 70% dingin dan dikeringkan dengan vacum. Pelet dilarutkan kernbali dengan TE buffer yang rnengandung RNAse 10 pglrnl (Sarnbrook et a/., 1989) dan disirnpan pada suhu -20°C. Untuk rnengetahui kepastian bahwa fragrnen
DNA insert hasil
transforrnasi telah tersisip dalarn plasrnid maka dilakukan verifikasi dengan rnelakukan pernotongan DNA rekornbinan atau hasil transforman menggunakan enzirn restriksi EcoRI. Tabel 7. Komposisi reaksi pernotongan plasmid dengan EcoRl
Sekuensing Analisis sekuensing dilakukan di PT. Charoen Pokphand Indonesia Jakarta menggunakan ABI PRISM 3100 XL Sequenser. Sampel DNA plasrnid yang akan disekuensing disarankan rnempunyai nilai kernurnian berkisar 1,s dengan konsentrasi 100 nglpl. Sekuensing dilakukan satu arah dengan rnenggunakan primer T7. Sedangkan untuk produk PCR rnenggunakan primer 21-mer. Perancangan Primer Urutan sekuen hasil sekuensing dibuat dalarn format fasta untuk dianalisis
lebih
lanjut
menggunakan
program
CIustalW
dari
@w
vvvvvv.ebi.ac.uWclustaIvv
~.basic.nwu.edulbiotoolsl~rimer3 mendesain primer, dan
&&@
menganalisis primer yang sudah dibuat.
&& www.cvberaene.se
Sernua program analisis tersebut
diakses melalui internet. Desain primer menggunakan Program Primer3 untuk menentukan posisi forward dan reverse dengan mernasukan kriteria yang diinginkan seperti ukuran primer (jurnlah basa), kandungan G+C dan besar Tm. Hasil program Primer3 rnencakup jumlah (panjang) dan urutan basa kandidat dati suatu primer beserta posisi primer tenebut di dalam sekuen DNA sarnpel, posisi basa tempat awal primer (forward dan reverse), ukuran produk, dan beberapa kandidat primer lain. Pada perancangan primer spesifik ini apabila hasil Primer3 belum cukup baik rnaka penentuan posisi dan sekuen dari primer forward dan reverse dilakukan secara kasat rnata (manual). Pengujian kualitas primer rnenggunakan program Primer Design Analysis w.cvberqene.se. E&&
-58
t;?atrrirM
(fonvard dan reverse) yang sudah dipilih baik yang ditentukan secara manual rnaupun hasil analisis Primer3. Output Cybergene meliputi ada tidaknya struktur sekunder (haipin dan palindrom), jumlah basa primer, annealing dan melting temperature, serta rasio GIC. Sekuen primer dari daerah pengapit motif mikrosatelit secara umurn dirancang untuk rnenghasilkan primer yang panjangnya 18-20 dengan kandungan GC mendekati 50% dan T,
nukleotida,
sekitar 60°C yang dapat
digunakan untuk mengamplifikasi fragrnen unik bermotif mikrosatelit pada tanarnan jati.
