BULLETIN VÚRH VODŇ ANY

Ročník 44(4)

říjen–prosinec

2008 Volume 44(4) October–December ___________________________________________________________________________

B U L L E T I N V Ú R H

V O D Ň A N Y

4

Vydává Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický ve Vodňanech Published by University of South Bohemia České Budějovice, Research Institute of Fish Culture and Hydrobiology, Vodňany, Czech Republic

ISSN 0007-389X

Bulletin VÚRH Vodňany

44(4) – 2008

OBSAH CONTENTS Původní články – Original papers V. PIAČKOVÁ, D. POKOROVÁ, S. RESCHOVÁ, T. VESELÝ KHV – přehled publikovaných výsledků výzkumu KHV – The review of published results of research

90

V. PIAČKOVÁ, E. SUDOVÁ, M. FLAJŠHANS Citlivost diploidního, triploidního a gynogentického lína obecného (Tinca tinca L.) k infekci chlopka (Ergasilus sieboldi) Susceptibility of diploid, triploid and gynogenic tench (Tinca tinca L.) to infection of ergasilus sieboldi

95

M. RODINA, M. FLAJŠHANS Využití RFID technologie ke značení ryb v ČR Application of RFID technology for fish tagging in the Czech republic

100

Překlady článků (zkrácené) – Translations of papers (shortened) M. VANDEPUTTE, M. KOCOUR, S. MAUGER, M. RODINA, A. LAUNAY, D. GELA, M. DUPONT-NIVET, M. HULÁK, O. LINHART Genetická variance růstu u kapra obecného (Cyprinus carpio L.) ve věku jednoho a dvou let: Odhady heritability a selekční odezva Genetic variation for growth at one and two summers of age in the common carp (Cyprinus carpio L.): Heritability estimates and response to selection

109

Poděkování

118

Pokyny pro autory

120

89


44(4) – 2008

KHV – PŘEHLED PUBLIKOVANÝCH VÝSLEDKŮ VÝZKUMU KHV – THE REVIEW OF PUBLISHED RESULTS OF RESEARCH V. PIAČKOVÁ1, D. POKOROVÁ2, S. RESCHOVÁ2, T. VESELÝ2 1

Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický ve Vodňanech, Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany, e-mail: [email protected] 2 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Hudcova 70, 621 00 Brno, e-mail: [email protected] Abstract Disease of common carp and koi carp caused by koi herpesvirus (KHV) was firstly noted in 1998 in Israel and U.S.A. Since that time, the disease has spread into many other countries around the world and it has inflicted considerable economical damages. Since the first outbreak of the disease, notable international research centres engaged in the field of fish diseases has studied the new disease, looked for its etiological agent, its properties, possibilities of diagnostics, therapy and prophylaxis. About sixty original scientific papers on the topic of KHV were published during less than ten years. The review submitted represents only some of them, especially articles published during the last three years. Klíčová slova: koi herpesvirus, rezistence, diagnostika, vakcína Key words: koi herpesvirus, resistance, diagnostics, vaccine

ÚVOD Chovy kapra obecného (Cyprinus carpio) a jeho okrasné variety (koi kapra) v mnoha zemích Asie, Ameriky a Evropy jsou od konce dvacátého století ohrožovány vysoce kontagiózním a vysokou morbiditu a mortalitu vyvolávajícím onemocněním známým pod názvem koi herpesviróza. Vzhledem k vysokým ekonomickým ztrátám, které toto onemocnění chovatelům působí, je výzkum v oblasti diagnostiky a prevence tohoto onemocnění v popředí zájmu mnoha světových výzkumných a vědeckých pracovišť. Tato práce v krátkosti představuje výsledky některých z nich. Původce onemocnění Původní předběžné zařazení viru mezi herpesviry a jeho pojmenování – koi herpesvirus, KHV (Hedrick a kol., 2000), bylo po čase zpochybněno, virus byl označen jako nezařazený a byl pojmenován „carp nephritis and gill necrosis virus“ – CNGV (Ronen a kol., 2003; Hutoran a kol., 2005). Na základě studia morfologických a biologických vlastností byl však virus posléze přece jen zařazen do čeledi Herpesviridae a bylo mu přiřazeno oficiální označení Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) (Waltzek a kol., 2005). Diagnostické metody Mnoho světových výzkumných pracovišť se zabývá zdokonalováním diagnostických metod použitelných pro detekci KHV v tkáních ryb. Preferovány jsou zejména metody molekulárně-biologické, především „polymerase chain reaction“ (PCR) a v posledních letech díky menší finanční a časové náročnosti doporučovaná „loop-mediated isotermal amplification“ (LAMP reaction) (Gunimaladevi a kol., 2004; Soliman a El-Matbouli, 2005; Yoshino a kol., 2006). Hlavním mezinárodně uznávaným diagnostickým nástrojem však přece jen zůstává PCR. V této oblasti je snaha zaměřena především na zvyšování citlivosti a spolehlivosti metody. Jako první publikovali PCR metodiku diagnostiky KHV Gilad a kol. (2002) a Gray a kol. (2002). Sekvence specifických primerů pro nově vyvinutou „real-time TaqMan“ PCR byly publikovány Giladem a kol. (2004). Bercovier a kol. (2005) použili oligonukleotidové primery založené na nukleotidové sekvenci kódující thymidin kinázu. Jejich metoda byla shledána citlivější než původní metoda Giladova, založená na sekvenci

90


44(4) – 2008

kódující neproteinovou oblast KHV genomu. Bergmann a kol. (2006) sestavili nested PCR a pro potvrzení výsledků popsali in situ hybridizaci za použití různých prób. Vedle PCR metody byla pro diagnostiku KHV sestavena i „klasická“ imunologická metoda – ELISA (Enzyme Linked Imunosorbent Assay) – pro detekci specifických protilátek v krevním séru infikovaných ryb (Adkison a kol., 2005). Bylo zjištěno, že protilátky proti KHV jsou v séru ryb přeživších infekci detekovatelné ještě rok po odeznění přirozené infekce. Ryby, které ještě po roce mají v séru vysoký titr protilátek, mohou být považovány za potenciální nosiče viru. Identifikací a eliminací těchto ryb při screeningovém vyšetření chovů kaprů a koi kaprů by mohlo být zabráněno dalšímu šíření nákazy. Profylaxe Ve snaze zabránit velkým finančním ztrátám způsobených hromadnými úhyny ryb se některé výzkumné týmy zabývají možnostmi ochrany obsádek před vznikem onemocnění. V této oblasti jsou významné zejména práce izraelských a japonských autorů. Perelberg a kol. (2005) se zabývali možností imunizace kaprů vůči KHV pomocí atenuovaného (oslabeného) viru. Bylo zjištěno, že po mnohonásobné pasáži na buněčných liniích virus ztrácí svou patogenitu (schopnost vyvolat onemocnění), ale zachovává si imunogenní vlastnosti (schopnost navozovat u ryb rezistenci vůči onemocnění). Při pokusech s oslabeným virem zjistili, že k navození imunity stačí desetiminutová expozice viru v koupeli a že imunogenní schopnosti viru se mohou nejlépe uplatnit, jsou-li ryby i po expozici viru drženy při optimální teplotě, tj. 23 °C. Zároveň se ukázalo, že atenuovaný virus si v koupeli zachovává svou imunogenitu pouze po dobu prvních dvou hodin, poté jeho schopnost navodit rezistenci ryb prudce klesá. Aby se minimalizovala možnost zpětného získání patogenity, exponovali pasážemi oslabený virus ještě UV záření. Různým koncentracím takto ošetřeného viru byly vystaveny vnímavé ryby (plůdek kapra), po 22 dnech byly umístěny do nádrže s nemocnými rybami a byl sledován průběh mortality během dalších třiceti dní. Bylo prokázáno, že imunizující koupel musí obsahovat virus v koncentraci minimálně 10 pfu (plaque-forming units).ml-1, aby bylo dosaženo výrazného snížení mortality (10 % oproti 99 % v kontrole). V Japonsku byly prováděny pokusy s orální imunizací kaprů pomocí liposomové vakcíny (Yasumoto a kol., 2006). KHV inaktivovaný formalínem byl vpraven do membránové složky liposomů a aplikován jako sprej na suchou peletovanou krmnou směs. Ryby byly vakcínou krmeny 3 dny, poté byly 21 dní krmeny normální krmnou směsí. Kontrolní skupina byla po celou dobu krmena směsí bez antigenu. Po 22 dnech od podání poslední dávky vakcíny byly všechny ryby podrobeny experimentální infekci – suspenze viru jim byla aplikována individuálně na povrch žaber. Dalších 23 dní byla sledována mortalita ryb. U skupin krmených liposomální vakcínou bylo zaznamenáno signifikantně vyšší přežití než u skupin kontrolních. Několik izraelských vědeckých a výzkumných institucí spolupracovalo na projektu zabývajícím se studiem rozdílů vnímavosti k onemocnění KHV mezi různými liniemi kapra a jejich vzájemnými kříženci (Shapira a kol., 2005). Do sledování byly zařazeny dvě domestikované linie lysců – Našice (N; dovezená z bývalé Jugoslávie) a Dor-70 (D) – a divoký amurský sazan (S; Cyprinus carpio haematopterus). Zamražené sperma sazana bylo do Izraele přivezeno z České republiky – z Výzkumného ústavu rybářského a hydrobiologického ve Vodňanech. Při umělém výtěru bylo vytvořeno potomstvo NxN, NxD, NxS, DxD a DxS. Rezistence vůči viru byla testována vystavením ryb viru v laboratorních i poloprovozních podmínkách. Laboratorní testy byly prováděny při teplotě 22–23 °C a ryby byly infikovány kohabitací s nemocnými rybami. Nejvyšší rezistenci (přežití 60,7 %) vykazovali kříženci DxS a nejvnímavější byla čistá linie NxN (přežití 8,0 %). Ostatní skupiny se od sebe vzájemně signifikantně nelišily (NxS 33,7 %, DxD 27,0 % a DxN 17,7 %).

91


44(4) – 2008

Výsledky poloprovozního testování v rybnících byly velmi podobné výsledkům laboratorních testů, kromě výsledku testování NxS, který v laboratorních podmínkách byl průměrný, zatímco v přirozených podmínkách rybníku bylo přežití této skupiny nejlepší ze všech (68,5 %). Přežívání viru v prostředí, přenos infekce a možnosti asanace Bylo zjištěno, že k přenosu infekce dochází nejčastěji přímým kontaktem vnímavých ryb s infikovanými, nebo vodou přitékající z prostředí, kde jsou přítomny nemocné ryby. Otázkou je, jak dlouho může virus přežívat v prostředí bez hostitele, zda je možný přenos prostřednictvím jiných druhů ryb a jak je možno virus v prostředí likvidovat. Shimizu a kol. (2006) sledovali přežívání koi herpesviru ve volných vodách bez přítomnosti ryb. V intaktních vzorcích vody nebo sedimentu z přírodních lokalit Japonska, do nichž byl inokulován virus, rapidně klesl infekční titr KHV během 3 dnů. V autoklávované nebo ultrafiltrované vodě (0,45 µm) zůstal virus infekční více než 7 dní. V autoklávované vodě s přídavkem neošetřeného sedimentu klesl titr KHV pod mez detekce během sedmi dní po inokulaci. Bylo zjištěno, že rychlý pokles infektivity viru v přírodních vodách je způsoben činností některých bakterií, u nichž byly prokázány anti-KHV vlastnosti. To by znamenalo, že bez přítomnosti hostitelů je KHV v přírodních vodách rychle inaktivován. Pracovníci výzkumné laboratoře CEFAS ve Weymuthu ve Velké Británii (St-Hilaire a kol., 2005) se zabývali zjišťováním možnosti reaktivace infekce KHV po určitém období latence. Provedli dvě kohabitační studie, během nichž byly ryby vystaveny koi herpesviru a následně byly přechovávány při dvou různých teplotních režimech. Ve skupinách, které byly po expozici viru drženy v teplotě 21 °C, byla vyvolána vysoká a ve skupinách, které byly drženy po infekci KHV při teplotě 12 °C nízká počáteční mortalita. Ve třech z pěti pokusných tanků se po několika měsících od expozice ryb viru, po převedení ryb do optimální teploty (23 °C), projevila reaktivace infekce KHV, bez ohledu na počáteční mortalitu. V přírodních ohniscích nákazy KHV došlo vždy k onemocnění a úhynům pouze kapra obecného a koi kapra. Nabízí se však otázka, jestli jiné druhy ryb nemohou být latentními přenašeči viru a také, po zkušenostech s jinými rybími viry, zda se po určité době působení ve vodním prostředí již virus KHV neadaptoval i na jiné druhy, u nichž by také mohlo docházet i ke klinickým projevům onemocnění. Hedrick a kol. (2006) prováděli pokusy zaměřené na sledování vnímavosti koi kapra, kapra obecného, zlatého karasa a kříženců zlatého karase a kapra obecného k infekci CyHV-3 (KHV). Všem čtyřem skupinám ryb byl injekčně aplikován virus kultivovaný na KF-1 buněčné linii. Kumulativní mortalita během následujících 25 dní byla u koi kapra 95%, u kapra obecného 17%, u zlatého karase 0% a u hybridů 5%. V kontrolních skupinách, kterým bylo aplikováno pouze živné médium pro tkáňovou kulturu, neuhynula žádná ryba. Nízkou mortalitu kapra obecného si autoři vysvětlují možnými rozdíly ve vnímavosti různých linií, jak popsal Shapira a kol. (2005). Likvidací viru KHV pomocí UV záření, teploty a různých desinfekčních prostředků se zabývali Kasai a kol. (2005). Testovali působení zmíněných desinfekcií na virus kultivovaný na buněčné linii KF-1 (koi fin). Výsledkem jejich pokusů bylo zjištění, že virus KHV je inaktivován UV zářením v dávce 4 x 103 µWs.cm-2 a působením teploty 50 °C po dobu 1 min. Účinnost desinfekčních prostředků testovali při třech různých teplotách (0; 15 a 25 °C). Benzalkonium chlorid byl při uvedených teplotách účinný v dávkách 60; 60 resp. 30 mgl-1 , jodofor v dávkách 130; 200 resp. 200 mg.l-1 a etylalkohol v koncentracích 40; 40 resp. 30 %, a to vše již po třicetisekundovém působení. U benzalkonia a jodoforu bylo zjištěno, že prodloužením doby působení na 20 min se koncentrace látky nutná k likvidaci koi herpesviru nesníží. U etylalkoholu se prodloužením doby působení při teplotách 15 a 25 °C snížila koncentrace na 30, resp. 25 %. U desinfekčních prostředků na bázi chlóru dochází k rychlé redukci koncentrace volného chlóru jeho navázáním na organické látky ve vodě. Bylo

92


44(4) – 2008

zjištěno, že k inaktivaci KHV je potřeba koncentrace chlóru 3mg.l-1. Vzhledem ke snižování účinnosti vlivem organických látek je nutno při desinfekci rybniční nebo říční vody aplikovat takovou dávku desinfekčního činidla, aby koncentrace chlóru byla minimálně 11,2 mg.l-1. DISKUSE Výzkumem KHV se zabývá mnoho renomovaných světových laboratoří. Svým malým dílem se snaží přispět i některé české výzkumné instituce. V letech 2004–2006 pracovníci VÚRH JU, Výzkumného ústavu veterinárního lékařství a Veterinární a farmaceutické univerzity Brno spolupracovali při řešení projektu „Ochrana chovů kapra obecného (Cyprinus carpio L.) před onemocněním způsobeným koi herpesvirem (KHV)“. Vzhledem k tomu, že problematika KHV je stále velmi aktuální, byl podán a posléze přijat navazující projekt s názvem „Monitoring výskytu KHV a testování vnímavosti vybraných linií kapra a jejich hybridů k onemocnění KHV“, jehož řešení bylo zahájeno 1. 5. 2007 a potrvá do konce roku 2011. Náplní projektu, jak už z názvu vyplývá, bude nejen pokračování v monitoringu výskytu KHV v českých chovech kapra a koi kapra, který byl prováděn už v rámci minulého projektu, ale také laboratorní a poloprovozní testování odolnosti vybraných linií chovaných v ČR a jejich nejčastěji využívaných produkčních hybridů. Laboratorní část projektu bude probíhat ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství v Brně a o poloprovozní testování jsme požádali pracovníky výzkumné stanice Dor v Izraeli, kde podobné experimenty byly již v minulých letech prováděny (Shapira a kol., 2005). Souhrn Onemocnění kaprů a koi kaprů způsobené koi herpesvirem (KHV) bylo poprvé zaznamenáno v roce 1998 v Izraeli a v USA. Od té doby se rozšířilo do mnoha dalších zemí po celém světě a chovatelům ryb způsobilo značné ekonomické ztráty. Od prvního vzplanutí onemocnění se začala přední světová výzkumná centra, pracující v oblasti nemocí ryb, zabývat studiem nového onemocnění, hledáním původce, jeho vlastností, možnostmi diagnostiky, terapie a prevence onemocnění. Neuplynulo ještě ani deset let a na téma KHV bylo publikováno kolem šedesáti původních vědeckých prací. Předkládaný souhrn představuje jen některé z nich, zejména práce publikované v posledních třech letech. Poděkování Práce byla provedena za podpory projektu MZe ČR č. QH71057, projektu MSM6007665809 a projektu MZe ČR č. MZE0002716201 LITERATURA Adkison, M.A., Gilad, O., Hedrick, R.P., 2005. An Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for detection of Antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the Serum of Koi Cyprinus carpio. Fish Pathology, 40(2): 53-62. Bercovier, H., Fishman, Y., Nahary, R., Sinai, S., Zlotkin, A., Eyngor, M., Gilad, O., Eldar, A., Hedrick R.P., 2005. Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidin kinase and its use for highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiology, 5: 13. Bergmann, S.M., Kempter, J., Sadowski, J., Fichtner, D., 2006. First detection, confirmation and isolation of koi herpesvirus (KHV) in cultured common carp (Cyprinus carpio L.) in Poland. Bulletin of European Association of Fish Pathologists, 26(2): 97-104. Gilad, O., Yun, S., Andree, K.B., Adkison, M.A.,Zlotkin, A., Bercovier, H., Eldar, A., Hedrick, R.P., 2002. Initial characteristic of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Diseases of Aquatic Organisms, 48: 101-108. Gilad, O., Yun, S., Zagmutt-Vergara, F.J., Leutenegger, C.M., Bercovier, H., Hedrick, R.P., 2004. Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Diseases of Aquatic Organisms, 60: 179-187. Gray, W.L., Mullis, L., LaPatra, S.E., Groff, J.M., Goodwin, A., 2002. Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish. Journal of Fish Diseases, 25: 171-178.

93


44(4) – 2008

Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M.N., Sakai, M., 2004. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases, 27: 583-589. Hedrick, R.P.,Gilad, O., Yun, S., Spangenberg, J.V., 2000. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp. Journal of Aquatic Animal Health, 12: 44-57. Hedrick, R.P., Waltzek, T.B., McDowell, T.S., 2006. Susceptibility of koi carp, common carp, goldfish, and goldfish x common carp hybrids to cyprinid herpesvirus-2 and herpesvirus-3. Journal of Aquatic Animal Health, 18: 26-34. Hutoran, M., Ronen, A., Perelberg, A., Ilouze, M., Dishon, A., Bejerano, I., Chen, N., Kotler, M., 2005. Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species. Journal of Virology, 79(4): 1983-1991. Kasai, H., Muto, Y., Yoshimizu, M., 2005. Virucidal effects of ultraviolet, heat treatment and disinfectants against koi herpesvirus (KHV). Fish Pathology, 40(3): 137-138. Perelberg, A., Ronen, A., Hutoran, M.,Smith, Y., Kotler, M., 2005.Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine. Vaccine 23(26): 3396-3403. Ronen, A., Perelberg, A., Abramovitz, J., Hutoran, M., Tinman, S., Bejerano, I., Steinitz, M., Kotler, M., 2003. Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio. Vaccine, 21 (32): 4677-4684. Shapira, Y., Magen, Y., Zak, T., Kotler, M., Hulata, G., Levavi-Sivan, B., 2005. Differential resistance to koi herpesvirus (KHV)/ carp interstitial nephritis and gill necrosis virus (CNGV) among common carp (Cyprinus carpio L.) crossbreds. Aquaculture, 245: 1-11. Shimizu, T., Yoshida, N., Kasai, H., Yoshimizu, M., 2006. Sirvival of koi herpesvirus (KHV) in environmental water. Fish Pathology, 41(4): 153-157. Soliman, H. and El-Matbouli, M., 2005. An inexpensive and rapid diagnostic method of koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal., 17(2): 83. St-Hilaire, S., Beevers, N., Way, K., Le Deuff, R.M., Martin, P., Joiner, C., 2005. Reactivation of koi herpesvirus infections in common carp Cyprinus carpio. Diseases of Aquatic Organisms, 67: 15-23. Waltzek, T.B., Kelley, G.O., Stone, D.M., Way, K., Hanson, L., Fukuda, H., Hirono, I., Aoki, T., Davison, A.J., Hedrick, R.P., 2005. Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae. Journal of General Virology, 86: 1659-1667. Yasumoto, S., Kuzuya, Y., Yasuda, M., Yoshimura, T., Miyazaki, T., 2006. Oral immunization of common carp with a liposome vaccine fusing koi herpesvirus antigen. Fish Pathology, 41(4): 141-145. Yoshino, M., Watari, H., Kojima, T., Ikedo, M., 2006. Sensitive and rapid detection of kou herpesvirus by LAMP method. Fish Pathology, 41(1): 19-27.

94


44(4) – 2008

CITLIVOST DIPLOIDNÍHO, TRIPLOIDNÍHO A GYNOGENETICKÉHO LÍNA OBECNÉHO (TINCA TINCA L.) K INFEKCI CHLOPKA (ERGASILUS SIEBOLDI) SUSCEPTIBILITY OF DIPLOID, TRIPLOID AND GYNOGENIC TENCH (TINCA TINCA L.) TO INFECTION OF ERGASILUS SIEBOLDI V. PIAČKOVÁ, E. SUDOVÁ, M. FLAJŠHANS Jihočeská univerzita v českých Budějovicích, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany, e mail: [email protected]; [email protected] a [email protected] Abstract Ergasilus sieboldi Nordmann, 1832 is a widely distributed gill parasite of many European freshwater teleosts. The aim of this study was to find out potential differences among diploid (2n), triploid (3n) and meiotic gynogenic (MeiG) tench in sensitivity to Ergasilus sieboldi infection. Ten specimens of each 2n tench , 3n tench and MeiG tench were used in the experiment. These fish were cohabitated in aquaria at 20 °C with tench naturally infected with E. sieboldi, obtained from an aquaculture farm. Mortality of experimental and control fish were noticed. One specimen of MeiG, one specimen of 2n and four specimens of 3n perished in experimental groups during the experiment. One control group containing 5 specimens of MeiG, 5 specimens of 2n and 5 specimens of 3n completely perished probably because of technical problem with aeration. After 20 days of cohabitation, the surviving fish were sacrificed and all gill arches were macro- and microscopically investigated to find out the presence of parasites. In addition to E. sieboldi, Ichthiophthirius multifiliis was found. Mean intensity and prevalence of infection of E. sieboldi were evaluated. The highest mean intensity as well as prevalence were detected in 3n tench (10 specimens of E. sieboldi per fish, prevalence 67 %). In 2n tench, mean intensity was 6 parasites per fish and prevalence 44,4 %. In MeiG tench, mean intensity was 4 parasites per fish and prevalence 55,6 %. Differences among groups were insignificant. Hence, no any group of tench under study appeared to be of significantly higher resistance to Ergasilus sieboldi infection. Klíčová slova: žaberní parazit, lín, intenzita infekce, ploidie Keywords: gill parasite, tench, intensity of infection, ploidy

ÚVOD Ergasilus sieboldi Nordmann, 1832 (chlopek) je široce rozšířený parazit žaber řady sladkovodních ryb. Zástupci rodu Ergasilidae, mezi něž je chlopek řazen, se vyskytují prakticky po celém světě (Song a kol., 2008; Amado a da Rocha, 2001). Jedná se o parazita s nízkou druhovou specifičností, avšak v našich podmínkách se nejčastěji vyskytuje u štiky, okouna, lína a ježdíka (Vykusová, 2004). Vývojový cyklus ektoparazita je přímý s plnou vazbou na vodní prostředí (Lom and Dyková, 1991). Jako opravdový parazit se chová u ryb jen samička, která má hruškovitý tvar těla a dosahuje délky až 1,5 mm. U pohlavně zralých samiček lze po stranách zadní části těla pozorovat 2 vaječné vaky s více než 100 vajíčky. Vývoj parazita probíhá přes 6 larválních (naupliových) a 5 kopepoditových stadií, která se volně pohybují ve vodě a jsou součástí zooplanktonu (Abdelhalim a kol., 1991). Po dosažení pohlavní dospělosti vyhledávají korýši svého partnera. Samci po kopulaci hynou a oplozené samičky přecházejí na parazitický způsob života. Přichycují se na žábrách, kde se živí epitelem a krví. Vlivem jejich činnosti pak dochází k narušení integrity žaberního epitelu napadených ryb a jeho hyperplasii. Masivní napadení pak u ryb vede k hubnutí a zpomalení růstu. Invazi chlopka výrazně napomáhá vysoké nahloučení ryb spolu s vyššími teplotami vody. Onemocnění probíhá spíše chronicky a stupeň poškození závisí hlavně na intenzitě invaze a velikosti napadených ryb. Cílem práce bylo zjistit citlivost diploidního, triploidního a gynogenetického lína k infekci chlopka a posoudit případné rozdíly mezi jednotlivými skupinami. 95


44(4) – 2008

MATERIÁL A METODIKA K pokusu byli použiti tříletí diploidní (2n; průměrná kusová hmotnost 194 ± 44,9 g), triploidní (3n; prům. kusová hmotnost 323 ± 85,5 g) a gynogenetičtí (MeiG; prům. kusová hmotnost 214 ± 42,8 g) líni odchovávaní před pokusem ve společné obsádce v zemním rybníku (Flajšhans a kol., 2004). Po převozu do laboratoře byly z každé populace (2n, 3n a MeiG) náhodně vybrány čtyři ryby a vyšetřeny na přítomnost ektoparazitů. Vyšetření bylo zaměřeno hlavně na přítomnost chlopka (Ergasilus sieboldi) na žaberních obloucích. U většiny vyšetřovaných ryb (9 z 12) byla zjištěna mírná polyparazitární infekce Ichthyophthirius multifiliis, Trichodina sp. nebo Gyrodactylus sp. na kůži, u některých z nich (n = 3) byl zaznamenán ojedinělý výskyt Ichthyophthirius multifiliis na žábrách. U žádné z vyšetřovaných ryb nebyla zjištěna přítomnost chlopka. Do pokusných a kontrolních skupin bylo zařazeno po deseti kusech ryb z každé populace (2n, 3n, MeiG). Byly vytvořeny celkem čtyři skupiny (2 pokusné (P1, P2) a 2 kontrolní (K1, K2), do nichž byly ryby rozděleny podle pohlaví. Složení jednotlivých skupin je znázorněno v tabulce 1. Tab. 1. Složení pokusných a kontrolních skupin na začátku experimentu Tab. 1. Composition of experimental and control groups at the beginning of experiment Pokusné skupiny P1 – samice P2 – samci (kromě MeiG) MeiG (F; n=5) MeiG (F; n = 5) 3n (F; n = 5) 3n (M; n = 5) 2n (F; n = 5) 2n (M; n = 5) NIF (n = 6) NIF (n = 6)

Kontrolní skupiny K1 – samice K2 – samci (kromě MeiG) MeiG (F; n = 5) MeiG (F; n = 5) 3n (F; n = 5) 3n (M; n = 5) 2n (F; n = 5) 2n (M; n = 5)

(MeiG – meiotičtí gynogeni; 3n – triploidi; 2n – diploidi; F – samice; M – samci; NIF – přirozeně infikované ryby) (MeiG – meiotic gynogens; 3n – triploids; 2n – diploids; F – females; M – males; NIF –naturally infected fish)

Před zahájením vlastního experimentu byly ryby týden aklimatizovány v akváriích. Počáteční teplota vody byla stejná jako v rybníce (17 °C) a denně byla zvyšována o 0,5 °C, takže na konci aklimatizační fáze dosáhla 20 °C (tato teplota byla udržována po celou dobu experimentu). Nasycení vody kyslíkem bylo kontrolováno jednou denně a kromě technického problému, který nastal v nádrži skupiny C1, nekleslo pod 80 %. Po týdnu aklimatizace byly k pokusným skupinám přidány ryby přirozeně infikované E. sieboldi. Tyto ryby (271 ± 87,2 g ž.hm.) byly získány z produkčního rybářství. Intenzita napadení jejich žaber chlopkem byla 72–3 160 jedinců na rybu (Obr. 1) se stoprocentní prevalencí.

96


44(4) – 2008

Obr. 1. Foto žaber lína přirozeně infikovaného chlopkem (Ergasilus sieboldi) Fig. 1. Macroscopic images of gills of tench naturally infected with Ergasilus sieboldi

Poté byly ryby drženy společně v nádržích po dobu 20 dní. Během této doby byla zaznamenávána mortalita pokusných i kontrolních ryb. Přežití ryb v jednotlivých skupinách je zaznamenáno v tabulce 2. Tab. 2. Složení pokusných a kontrolních skupin na konci experimentu Tab. 2. The structure of experimental and control groups at the end of trial Pokusné skupiny P1 – samice P2 – samci (kromě MeiG) MeiG (F; n=5) MeiG (F; n = 4) 3n (F; n = 5) 3n (M; n = 1) 2n (F; n = 5) 2n (M; n = 4) NIF (n = 5) NIF (n = 2)

Kontrolní skupiny K1 – samice K2 – samci (kromě MeiG) úhyn celé skupiny MeiG (F; n = 5) 3n (M; n = 4) 2n (M; n = 5)

(MeiG – meiotičtí gynogeni; 3n – triploidi; 2n – diploidi; F – samice; M – samci; NIF – přirozeně infikované ryby) (MeiG – meiotic gynogens; 3n – triploids; 2n – diploids; F – females; M – males; NIF –naturally infected fish)

Na konci experimentu byly přeživší ryby utraceny a vyšetřeny na přítomnost ektoparazitů, zvláště E. sieboldi. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny analýzou variance (ANOVA) a multiple range testem (Statgraphics v. 5.0).

97


44(4) – 2008

VÝSLEDKY A DISKUSE Do konce pokusu (po 20 dnech) přežilo 24 pokusných (devět MeiG, šest 3n a devět 2n) a 14 kontrolních ryb (pět MeiG, čtyři 3n a pět 2n). Z důvodu technického výpadku aeračního systému v akváriu došlo v průběhu pokusu přes noc k úhynu všech ryb z kontrolní skupiny K1 (pět MeiG, pět 3n a pět 2n). S přihlédnutím ke konečnému nízkému počtu ryb použitých v pokusu byly výsledky vyhodnocovány a porovnávány pouze vzhledem k rozdílům v ploidním stavu ryb, vzhledem k pohlaví nebylo možno výsledky porovnat. Přidáním infikovaných ryb k rybám pokusným došlo k úspěšnému přenosu chlopka na žábry všech skupin pokusných ryb. Nejvyšší průměrná intenzita a prevalence byla zaznamenána u triploidních línů (10 jedinců chlopka na rybu, prevalence 67 %). Průměrná intenzita napadení u diploidních ryb byla 6 chlopků na rybu a prevalence dosahovala 44,4 %. U gynogenetických línů byla průměrná intensita 4 chlopci na rybu a prevalence 55,6 %. Meziskupinové rozdíly nebyly statisticky významné (P > 0,05). Napadení žaber chlopkem však nedosáhlo v průběhu pokusu takové intenzity, aby byla pro ryby letální. Zvýšený úhyn, který byl zaznamenán ve skupině P2, byl způsoben pomnožením Ichthyophthirius multifiliis. Z výsledků vyplývá, že žádná ze 3 skupin línů definovaného ploidního stavu neprojevila statisticky významně vyšší odolnost vůči infekci Ergasilus sieboldi. Toto zjištění je v rozporu s výsledky publikovanými Piačkovou a Flajšhansem (2006), kteří potvrdili vyšší citlivost gynogenetických línů k parazitálním infekcím v dlouhodobém testu prováděném v provozních podmínkách na rybníku. Tyto rozdíly mohou být způsobeny odlišným kondičním stavem ryb v průběhu prováděných testování (rybník vs. akvárium), stejně tak i rozdílnou dobou, po kterou byly ryby vystaveny infekci. Souhrn Chlopek (Ergasilus sieboldi Nordmann, 1832) je v mnoha evropských zemích široce rozšířeným žaberním parazitem. Cílem této práce bylo posoudit potenciální rozdíly v citlivosti diploidních, triploidních a gynogenetických línů k infekci chlopka. Do pokusných a kontrolních skupin bylo zařazeno po deseti kusech ryb z každé populace (2n, 3n, MeiG). Byly vytvořeny celkem čtyři skupiny (2 pokusné a 2 kontrolní). Po týdnu aklimatizace v akváriích (20 °C) byly k pokusným skupinám přidány ryby (271 ± 87,2 g ž. hm.) přirozeně infikované E. sieboldi, které byly získány z rybí farmy. V průběhu pokusu byla zaznamenávána mortalita ryb v jednotlivých skupinách, která byla: 1 gynogenetický lín, 1 diploidní lín a 4 triploidní líni. Z důvodu technického výpadku aeračního systému v akváriu došlo v průběhu pokusu přes noc k úhynu všech ryb z kontrolní skupiny K1 (pět MeiG, pět 3n a pět 2n). Ryby byly společně 20 dní v nádržích, po této době byly přeživší ryby utraceny a vyšetřeny na přítomnost ektoparazitů, zvláště E. sieboldi. Na podkladě výsledků vyšetření byla vypočítána průměrná intensita a prevalence infekce E. sieboldi. Nejvyšší průměrná intenzita a prevalence byla zaznamenána u triploidních línů (10 jedinců chlopka na rybu, prevalence 67 %). Průměrná intensita napadení u diploidních ryb byla 6 chlopků na rybu a prevalence dosahovala 44,4 %. U gynogenetických línů byla průměrná intensita 4 chlopci na rybu a prevalence 55,6 %. Meziskupinové rozdíly nebyly statisticky významné (P > 0.05). Z výsledků není patrná vyšší citlivost některé z testovaných ploidních skupin k infekci chlopka. Poděkování Tato práce byla provedena za finanční podpory výzkumného záměru MŠMT ČR č. MSM6007665809 a projektu GA ČR 524/07/0188.

98


44(4) – 2008

LITERATURA Abdelhalim, A.I., Lewis, J.W., Boxshall, G.A, 1991. The life-cycle of Ergasilus sieboldi Nordman (Copepoda, Poecilostomatoida), parasitic on British fresh-water fish. Journal of Natural History, 25(3): 559-582. Amado, M.A.P.D., da Rocha, C.E.F., 2001. Copepods of the family Ergasilidae (Poecilostomatoida) parasitic on fishes from Khor al-Zubair Lagoon, Iraq. Hydrobiologia, 459: 213-221. Flajšhans, M., Kocour, M., Gela, D., Piačková, V., 2004. The first results on interactions among diploid, gynogenic and triploid tench, Tinca tinca L. under communal testing. Aquaculture International, 12: 103118. Lom, J., Dyková, I., 1991. Fish diseases. Parasitic diseases. In: Svobodová, Z., Vykusová, B., Diagnostics, prevention and therapy of fish diseases and intoxications - Manual for International Training Course on Fresh-Water Fish Diseases and Intoxications: Diagnostics, Prophylaxis and Therapy. Research Istitute of Fish Culture and Hydrobiology, Vodnany, Czech Rep., 270 pp. Piačková, V., Flajšhans, M., 2006. Long-term examination of health conditions in monoculture of communally tested amphimictic diploid, diploid gynogenic and triploid tench, Tinca tinca L. Aquaculture International, 14(1-2): 47-59. Pšenička, M., Dietrich, G.J., Wojtczak, M., Nynca, J., Rodina, M., Linhart, O., Cosson, J., Ciereszko, A., 2008d. Acrosome staining and motility characteristics of sterlet spermatozoa after cryopreservation with use of methanol and DMSO. Cryobiology, 56(3): 251-253. Pšenička, M., Rodina, M., Nebesářová, J., Linhart, O., (submitted): Study on fertilization process in sturgeon, function of acrosome and prevention of polyspermy. Song, Y., Wang, G.T., Yao, W.J., Gao, Q., Nie, P., 2008. Phylogeny of freshwater parasitic copepods in the Ergasilidae (Copepoda: Poecilostomatoida) based on 18S and 28S rDNA sequences. Parasitology Research, 102(2): 299-306. Tepla, O., Peknicova, J., Koci, K., Mika, J., Mrazek, M., Elzeinova, F., 2006. Evaluation of reproductive potential after intracytoplazmatic sperm injection of varied human semen tested by antiacrosomal antibodies. Fertil. Steril., 86: 13-120. Tollner, T.L, Yudin, A.I., Cherr, G.N., Overstreet, J.W., 2003. Real-time observations of individual Macaque sperm undergoing tight binding and the acrosome reaction on the zona pellucida. Biol. Reprod., 68: 664672. Vykusová, B., 2004. Ergasilus sieboldi Nordmann, 1832 – biologie, rozšíření, patogenita a možnosti profylaxe (přehled). Bull. VÚRH Vodňany, 40(1): 29-34.

99


44(4) – 2008

VYUŽITÍ RFID TECHNOLOGIE KE ZNAČENÍ RYB V ČR APPLICATION OF RFID TECHNOLOGY FOR FISH TAGGING IN THE CZECH REPUBLIC M. RODINA, M. FLAJŠHANS Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický ve Vodňanech, Zátiší 728/II 389 25 Vodňany, e-mail: [email protected]

Abstract Fish tagging, either group or individual, is an essential prerequisite for breeding, scientific and handling activities. Several factors should be taken into account to chose suitable method of tagging. The most important are: count of tagged fish, stability, work difficulty of tagging and tag reading (and possibilities of automatization of this activities), price and availability of tags, damage of fish by tagging and probability of fish injury by tag application, tag reading or next manipulations with fish as a last but not least. There are not many possibilities of individual, long-term and stable tagging applicable in fish and delicate to fish. RFID technology conforms to international standard and all requirements mentioned above. The aim of this paper is to sumarize the experience with utilization of this technology of fish tagging in the Czech Republic. Tags conformed to ISO 11784/11785, with working frequency 134,2 kHz and FDX-B mode are standardized for EU and most frequently used for animals. „Glasstag“ type tags applicated to dorsal muscle by aplicator on principle of grounting point are used for fish. Utilization of RFID technology in fisheries is complicated by moisture of working environment, low temperature and dependence on electricity. Applications in fisheries require usage of devices with protection (IP65-68). Before purchase of mobile reading device - water resistance, reading distance for tags, quickness and precision of reading, possibility of conection with PC, battery or accumulator persistence and possibility of external power supply should be approved. Computer database is the most suitable form of fish evidence and data logging. Klíčová slova: RFID, značení ryb, PIT, čipování Key words: RFID, fish tagging, PIT tagging

ÚVOD Značení ryb, skupinové i individuální, je nezbytným předpokladem pro šlechtění (zákon č.154/2000 Sb.), vědeckou činnost (Brannas a kol., 1994) i chovatelskou manipulaci. Při volbě způsobu značení je třeba zohlednit řadu okolností a požadavků. Jsou to především počet značených ryb, trvanlivost značení, pracnost aplikace, čtení značek, možnost zautomatizovat tyto činnosti, cena a dostupnost značek a v neposlední řadě míra či nebezpečí poškození ryby při aplikaci, čtení značek a manipulaci s rybami. Jedním z mála způsobů, který v současné době umožňuje individuální dlouhodobé a trvanlivé značení použitelné pro ryby, které je zároveň šetrné k rybám a odpovídá i mezinárodní standardizaci, je použití RFID technologie, lidově nazývané „čipování“ (Brannas a kol., 1994). Cílem tohoto článku je shrnout zkušenosti s používáním této techniky u ryb v ČR a poskytnout tyto informace potenciálním zájemcům především proto, že cena komponentů, která byla hlavní překážkou rozšíření tohoto způsobu značení, klesla na úroveň běžné spotřební elektroniky. Základní pojmy RFID systémy RFID sytémy (Radio frequency identification systems – radiofrekvenční identifikační systémy) jsou bezkontaktní elektronické identifikační systémy tvořené transpondérem – tagem (což je vlastní identifikační prvek či nosič informací) a čtecím zařízením, přičemž k přenosu informací z transpondéru do čtecího zařízení (a naopak) dochází prostřednictvím rádiových vln. 100


44(4) – 2008

Transpondér (nebo také tag, či nesprávně „čip“) Transpondér je tvořen vlastním paměťovým tagem různého typu a kapacity, který je obvykle spolu se zdrojem energie uložen ve společném pouzdře. Transpondéry lze dělit podle různých hledisek: podle zdroje energie na aktivní (mají vlastní aktivní zdroj el. energie – např. baterii) či pasivní (nemají vlastní aktivní zdroj energie, mají pouze cívku, nabíjející kondenzátor, který zastupuje baterii) (Anonym 1, online); podle pracovní frekvence na tzv. LF (Low Frequency – nízkofrekvenční) transpondéry s frekvencí 125 kHz – 134,2 kHz a na tzv. HF (High Frequency – vysokofrekvenční) transpondéry (tagy) s frekvencí 13,56 MHz až 5,8 GHz; podle kapacity paměťového tagu (64 bit, 128 bit, 512 bit,…); podle možnosti čtení a zápisu dat do paměti na R/O tagy (read only – pouze pro čtení) a R/W tagy (read/write – pro čtení i zápis). Podle módu komunikace mezi tagem a čtecím zařízením rozeznáváme tagy HDX (Half-Duplex – pracuje v režimu podobném vysílačkám – čtecí zařízení vyšle signál a transpondér odpovídá) a FDX tagy (Full-Duplex – pracuje v režimu podobném telefonu“ – transpondér i čtecí zařízení vysílají signál ve stejném okamžiku) (Malát, 2008 online). Podle typu a materiálu pouzdra rozeznáváme např. tzv. glasstagy (hermeticky uzavřené skleněné válečky o průměru několik mm), plastové identifikační karty, přívěsky, ušní značky atd. (Anonym 2, online). Pro značení ryb jsou použitelné pouze pasivní (obvykle LF, R/O ) tagy, proto též někdy nazývané PIT tagy (Passive Integrated Transponder – „pasivní integrovaný transpondér“). Pokud se transpondér ocitne v elektromagnetickém poli antény, v cívce transpondéru se indukuje napětí, které nabíjí kondenzátor. Energie kondenzátoru umožní vyslat informaci uloženou v paměťovém tagu transpondéru do čtecího zařízení, které signál dekóduje a odešle na komunikační rozhraní. Téměř výlučně se pro značení ryb používají transpondéry typu glasstag (Obr. 4), což je paměťový čip s miniaturní cívkou a kondenzátorem zapouzdřený biokompatibilním sklem do válečku, nejčastěji o průměru 2 mm a délky 11–15 mm a hmotnosti 0,1 g (Anonym3, online; Anonym4, online), který je možné implantovat do těla ryby. V průběhu 90. let 20. století bylo ve světě vyvinuto a používáno u různých druhů ryb, např.: u sivena amerického (Salvelinus fontinalis) (Brannas a kol., 1994), u pstruha obecného (Salmo trutta) (Ombredane a kol., 1998), u jesetera ostronosého (Acipenser oxyrinchus desotoi) (Clugston, 1996), sumečka skvrnitého (Ictalurus punctatus) (Moore, 1992), několik nekompatibilních systémů lišících se použitými pracovními frekvencemi, kapacitou paměti tagu, způsobem kódování a používanou pracovní frekvencí. Čtecí zařízení (readery, čtečky) Čtecí zařízení jsou konstruována jako přenosná (Obr. 1, 3) nebo stacionární zařízení v různém provedení (Anonym 5, online), ale principielně se skládají z antény (cívky), mikroprocesorové jednotky (dekodéru), komunikačního rozhraní a samozřejmě elektrického zdroje. Anténa je v podstatě cívka (vzdušná nebo s feritovým jádrem), v jejímž elektromagnetickém poli dochází ke čtení transpondéru a předurčuje jednu z důležitých vlastností čtecích zařízení, čtecí vzdálenost. Ta bývá u přenosných čtecích zařízeních řádově 1–15 cm (pro glasstagy LF 12 mm). Nejjednodušší kapesní čtečky mají anténu integrovanou v pouzdře přístroje. Přenosné profi přístroje mají diskovou či prutovou anténu. Antény stacionárních přístrojů jsou obvykle deskové, rámové nebo trubkové. Mikroprocesorová jednotka řídí proces čtení a dekódování informace z transpondéru. Ve většině současných přístrojů je schopna dekódovat více systémů. Taková zařízení jsou označována jako Multi readery. Seznam podporovaných systémů je další důležitý parametr čtecího zařízení. Komunikačním rozhraním může být pouze displej a funkční tlačítka či klávesnice nebo

101


44(4) – 2008

i porty pro připojení k PC, kapesnímu počítači PDA, datovému terminálu atd. Nejjednodušší modely obvykle disponují jednořádkovým LCD displejem a jedním nebo několika funkčními tlačítky. Existují i jednoduché čtečky bez displeje, pouze pro připojení k počítači. Pokročilejší modely bývají navíc vybaveny počítačovým rozhraním, nejčastěji RS232 nebo USB, modernější modely podporují i bezdrátový přenos dat přes IR, Bluetooth nebo WIFI. Zvláštním typem rozhraní jsou systémové konektory RFID čtecích modulů pro datové terminály, např. typu PSION Wotkabout MX, PSION Wotkabout PRO2G nebo rozhraní typu CF pro kapesní počítače PDA. Stacionární čtecí zařízení mohou navíc využívat přenos dat prostřednictvím LAN či připojení do GSM sítě. Zdroj elektrické energie je stěžejní pro spolehlivý provoz zařízení. Přenosná zařízení bývají napájena z vestavěných nebo výměnných akumulátorů nebo z baterií (článků), přičemž provozně nejvhodnější jsou vyměnitelné Li-ion a Li-Pol akumulátory. Vhodnou alternativou je možnost napájení z AC/DC adaptéru nebo vnějšího DC zdroje. Stacionární čtecí zařízení bývají napájena přes AC/DC adaptér ze sítě (Anonym 5, online). Různé RFID systémy využívané v rybářství Prvním v ČR, u ryb použitým RFID systémem, byl systém od americké firmy Destron Fearing s tagy TX1400L, který používá 64bitový R/O paměťový čip podle specifikace FDXA FECAVA pracující na frekvenci 125 kHz. Vlastní kód transpondéru (číslo tagu) je 10místný alfanumerický hexadecimální kód (čísla 0–9, písmena A–F), např.: 7F7B14552F. Tento systém do Evropy dodávala firma Fisheagle z Anglie. Použitelnost tohoto systému byla nejprve experimentálně ověřena na různých velikostních kategoriích ryb (Flajšhans a Daněk, 1994) a poté jím byly v ČR značeny ryby v létech 1993–2002, především v rámci šlechtitelského programu kapra obecného (Cyprinus carpio). Největším problémem tohoto systému byla špatná dostupnost čtecích zařízení v ČR a v Evropě a jeho cena. Pro ilustraci: cena čtecího zařízení byla v roce 1992 v řádu desítek tisíc korun, cena jednoho „tagu“ kolem 200 Kč. Proto byla hledána dostupnější a levnější náhrada z evropských zdrojů. V současnosti evropským standardem pro RFID značení zvířat je systém podle normy ISO 11784/11785, který využívá 128bitový R/O paměťový čip H4105 pracující na frekvenci 134,2 kHz v režimu FDX-B. Vlastní kód transpondéru (číslo tagu) je 15místný numerický kód, např.: 968000003837127. Transpondéry tohoto systému dodává řada firem z celého světa pod různým označením, např.: AEG – AEGID162, Destron – TX1400SST, HONGTENG – HT850, Trovan FDX-B – ID1053/HT2/13, Datamars, Ordicam a další. Tento systém je v ČR nejrozšířenější a pro ryby je používán od roku 2002–2003. V současné době je s ním v ČR značeno několik tisíc ryb v rámci plemenářské a šlechtitelské práce u kapra obecného (Cyprinus carpio), lína obecného (Tinca tinca), sumce velkého (Silurus glanis), pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss), jeseterů (např. jesetera malého Acipenser ruthenus) a samozřejmě v rámci experimentální činnosti, např. na pracovištích Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, Výzkumného ústavu rybářského a hydrobiologického. Současná cena nejjednodušších čtecích zařízení se pohybuje kolem 5 000 Kč a ceny transpondérů se pohybují v rozmezí 50–150 Kč (podle odebraného množství a dodavatele) (Anonym 6, online). Mimo oba výše uvedené systémy se ve světě i v ČR pro RFID značení zvířat používají nebo používaly některé další systémy, např.: AVID Microchip – americký systém společnosti American Veterinary Identification Devices, pracující na frekvenci 125 kHz, nesoucí devítimístný numerický kód např.: 040*117*122, pro ryby používaný např. v Mexiku, pro zvířata v zájmových chovech v USA a Kanadě. TIRIS – je opět americký RFID systém firmy Texas Instruments, pracující na frekvenci 134,2 kHz v režimu HDX; disponuje 64bitovými transpondéry R/O i R/W i v provedení

102


44(4) – 2008

glasstag velikostí 23 a 32 mm určený primárně pro technické aplikace. Glasstagy velikosti 32 mm byly testovány ve Španělsku (Domezain a kol., 2001) pro značení jesetera adriatického (Acipenser naccarii). Pravděpodobně pro velikost transpondéru se pro ryby neosvědčily, čitelnost po 15 měsících byla pouze 70 % tagů (Domezain a kol., 2001). Další systém, nazývaný UNIQUE, používá 64bitový R/O paměťový čip H4102, pracující na frekvenci 125 kHz v režimu FDX-A. Vlastní kód transpondéru (číslo tagu) je 10místný alfanumerický hexadecimální kód, např.: 10A12F5F62. Tento systém je široce používán pro technické a logistické účely, v zahraničí je nabízen i pro značení zvířat. Transpondéry Unique dodává řada firem z celého světa i jako glasstagy různých velikostí pod různým označením, např. AEG-ID102 (Anonym 7, online). Posledním ze zmiňovaných systémů je TROVAN UNIQUE (nebo také EURO I.D.Trovan), který používá 64bitový R/O paměťový čip pracující na frekvenci 125 kHz (není kompatibilní s předešlým). Vlastní kód transpondéru (číslo tagu) je 10místný alfanumerický hexadecimální kód, např. 00-05ED-FD0F. Systém je distribuován i v ČR (označení transpondéru AEG-ID100) a je používán pro exotická zvířata a zvířata v zájmových chovech (Čáp, 2008 online). Aplikace transpondérů (PIT tagů) typu glasstag Jak již bylo uvedeno výše, pro značení ryb se používají transpondéry typu glasstag, což je skleněný váleček o průměru 2 mm, délky 12–15 mm a hmotnosti zhruba 0,1 g, který je možné implantovat do těla ryby pomocí aplikátoru fungujícího na principu injekční jehly (viz Obr. 2). Nejideálnějším řešením je situace „1 čip – 1 aplikátor“ používaný v případě, kdy jsou tagy dodávány sterilně balené po jednom včetně aplikátoru. Za předpokladu sterilizace nebo alespoň dezinfekce je možné použít i jednorázové aplikátory opakovaně. Před vlastní aplikací je třeba prověřit, zda již ryba není PIT tagy značená, protože nejčastěji používané PIT tagy ISO nemají antikolizní vlastnosti (Anonym 8, online) a v případě vícenásobného označení ve stejném místě nelze následně přečíst ani jeden tag. Pro bezpečnější a šetrnou aplikaci tagů je vhodné, především u větších ryb, použít různých anestetik (Kolářová a kol., 2007). PIT tag se aplikuje nejčastěji do hřbetní svaloviny na levém boku ryby v úrovni začátku hřbetní ploutve, popř. za hlavou pod ostrým úhlem (asi 30°) do hloubky asi 1–1,5 cm. Kolmý vpich, stejně tak vpich těsně pod kůži, není vhodný, protože kolmo vpíchnutý PIT tag je špatně čitelný a naopak těsně pod kůži vpíchnutý tag lze při manipulaci s rybou poškodit. U ryb, které mají velké šupiny (kapr, amur), je třeba věnovat pozornost tomu, abychom PIT tag neaplikovali jen do šupinového pouzdra pod šupinu. U ryb, jako je úhoř nebo sumec, volíme místo vpichu těsně za hlavou. Alternativním způsobem aplikace PIT tagu je aplikace do tělní dutiny za bází břišní ploutve kaudálním směrem mezi břišní stěnu a vnitřní orgány. Tento způsob je použitelný i pro velmi malé ryby. Flajšhans a Daněk (1994) uvádějí, že je tento způsob značení možné použít u sumce o hmotnosti 12 g. Je však méně používaný, pravděpodobně pro subjektivní obavu z možného poškození vnitřních orgánů ryb. Z dalších, méně obvyklých způsobů aplikace PIT tagů, lze uvést aplikaci do rostra („vesla“) veslonosa amerického, který byl používán v USA při značení veslonosů vypouštěných do řek (Linhart – ústní sdělení) či aplikaci do hlavy dospělých jeseterů (Rien, 1994). Po aplikaci místo vpichu dezinfikujeme vhodným dezinfekčním roztokem. Bezprostředně po aplikaci je třeba prověřit čitelnost tagu a zanést jej do databáze: aktivujeme čtečku, obvykle stiskem tlačítka SCAN nebo obdobného tlačítka a přejíždíme čtečkou, resp. anténou v místě vpichu či předpokládaného umístění PIT tagu. Načtená hodnota je zobrazena na displeji přístroje, popř. odeslána na komunikační port. Načítání tagu může být někdy rušeno blízkým elektromagnetickým polem v okolí některých elektrických či elektronických

103


44(4) – 2008

přístrojů (jako jsou např. elektronické váhy). Proto je třeba před vlastním značením ryb prověřit funkčnost celého systému (PIT tag – čtečka – počítač) na místě použití. Propojení čtečky k PC, kapesnímu počítači PDA, datovému terminálu atd. V případě, že značíme či vyhledáváme více než 50 jedinců, je třeba z praktických důvodů počítat s potřebou přímého propojení čtečky s elektronickou databází uloženou v počítači, PDA nebo datovému terminálu. Nejčastější je připojení prostřednictvím sériového nebo USB kabelu, ale praktičtější je využití některé z bezdrátových technologií (např. Bluetooth). Pro načtení kódu do databázové aplikace máme dvě možnosti. Použít softwarovou utilitu, která převádí hodnoty ze zvoleného portu počítače do klávesnicové paměti a vloží je na místo kurzoru v běžící aplikaci (Anonym 9, online). V tomto případě hovoříme o tzv. klávesnicovém emulátoru, který bývá dodáván s některými čtečkami nebo je dostupný na internetu jako freeware, např. Softwedge nebo komerční SW např. SerialMagic. Druhou možností je naprogramovat komunikaci s portem přímo v databázové aplikaci (Flajšhans a Daněk, 1994). Specifické problémy při použití RFID zařízení v rybářství, požadavky na přenosná čtecí zařízení Specifické problémy při použití RFID zařízení v rybářství, a tím i požadavky na techniku vyplývají ze tří základních, pro elektroniku nepříznivých faktorů, kterými jsou: vlhké prostředí, často nízká teplota a práce v terénu, kde není možné nebo bezpečné připojení k elektrické síti. Ideální přenosné čtecí zařízení pro použití v rybářství by proto mělo splňovat následující požadavky: • Provedení do mokra – krytí IP66 až IP68 tj. prachotěsné, odolné vůči intenzivně tryskající vodě až trvalému ponoření (Anonym 10, online). • Disková nebo tyčová anténa – je předpokladem spolehlivého čtení, kompaktní čtečky nejsou tak spolehlivé. • Napájení z vyměnitelného Li-ion nebo Li-Pol akumulátoru – při nízkých teplotách dochází u běžných NiMH či NiCd akumulátorů i baterií ke značnému snížení kapacity, takže čtečka nemá patřičnou výdrž a výkon. Tím se snižuje i spolehlivost načítání. Používání Pb akumulátorů omezuje jejich vysoká hmotnost. Přístroje s vestavěnými akumulátory obvykle nepracují při nabíjení. Výhodou je možnost provozu na externí zdroj (AC/DC adaptér, externí akumulátor). • Komunikační rozhraní mimo displeje: USB nebo RS232 a Bluetooth – pro běžný provoz využívat bezdrátový přenos, pro případ technických problémů je k dispozici ještě komunikace s kabelem. Veškeré konektory však musí být doplněny příslušnými záslepkami. „Recyklace“ tagů V souvislost s používáním RFID tagů pro individuální značení především při experimentech, které se zakončují usmrcením ryb, vyvstává logicky otázka možnosti opětovného použití tagů, protože cena 1 ks není stále zanedbatelná. V principu lze tuto možnost využít při dodržení několika zásad: • Při vyjmutí tagu z těla usmrcené ryby nesmí dojít k jeho mechanickému poškození. • Tagy je třeba dokonale vyčistit (např. enzymaticky pomocí alkalázy či pepsinu). • Následně je třeba jednotlivé tagy vizuálně zkontrolovat a vyřadit tagy s poškozeným, třeba jen naprasklým pouzdrem. • U každého tagu zkontrolovat jeho čitelnost a vyřadit případné nečitelné tagy. • Tagy sterilizovat (chemicky – např. přípravky na bázi etanolu nebo peroxidu). • „Recyklované“ tagy používat jen tak, aby nemohlo dojít k záměně identit, např. 104


44(4) – 2008

používat je pouze v rámci časově omezených experimentů, u jiného druhu apod. V žádném případě nelze připustit používání „recyklovaných“ tagů z jedinců vedených v plemenářské evidenci opět pro značení plemenných ryb! Trendy a možnosti do budoucnosti Současným trendem v aplikaci RFID technologie je integrace RFID čteček do tzv. mobilních datových terminálů, což jsou „kapesní počítače“ (dnes obvykle s operačním programem WinCE nebo Win Mobile) určené zejména pro aplikace sběru dat v terénu (Anonym 11, online). Tyto přístroje disponují dotykovým displejem, alfanumerickou klávesnicí, možností bezdrátové komunikace, softwarem kompatibilním s kancelářským software od Microsoftu včetně databázových aplikací. To vše v provedení do terénu s krytím IP65. Příkladem může být přístroj PSION Workabout PRO2G doplněný čtečkou (např. Agrident AIR 100, viz Obr. 5) nebo jejich předchůdci pracující s jinými operačními systémy – PSION WotkaboutMX se čtečkou (Dalton EID Systems, Obr. 6) či TagLogger od holandské firmy A-Boca (Obr. 7). S narůstající kapacitou paměťových čipů se naskýtá možnost ukládat uživatelská data (např. data o původu značených jedinců) přímo v transpondéru typu R/W. Tato, na první pohled výhodná možnost, naráží při aplikaci pro značení zvířat na několik problémů: kompatibilitu s dosud používanými systémy a zařízeními, standardizaci struktury ukládaných dat a hlavně zajištění unikátnosti identifikačního kódu. Přesto nelze tuto možnost do budoucna zavrhovat, jde pouze o uspokojivé technické vyřešení nastíněných problémů. Souhrn • Pro spolehlivé individuální značení ryb pro potřeby chovatelské, plemenářské a experimentální praxe je vhodné RFID značení. V současnosti jsou v EU pro značení zvířat standardizovány a nejčastěji používány tagy a čtecí zařízení podle normy ISO 11784/11785, pracující na frekvenci 134,2 kHz v režimu FDX-B. • U ryb se používají implantovatelné tagy typu glasstag aplikované nejčastěji do hřbetní svaloviny pomocí aplikátoru na principu injekční jehly. • V rybářství komplikují použití této techniky především mokré prostředí, často nízká teplota prostředí a závislost na elektrické energii. Proto její aplikace v rybářství vyžaduje používat zařízení s patřičným krytím, především proti vodě (IP65-68). • Při pořizování mobilního čtecího zařízení je mimo odolnosti vůči vodě třeba dále prověřit: čtecí vzdálenost pro používané tagy, rychlost a spolehlivost čtení, možnosti připojení k počítači, výdrž baterie či akumulátoru a možnosti napájení z vnějšího zdroje. • Pro evidenci značených jedinců je třeba zvolit vhodnou formu záznamu. V současnosti je nejčastěji používaná některá z počítačových databází. Poděkování Tato práce vznikla za podpory Výzkumného záměru VÚRH JU Vodňany MSM6007665809 Biologické, environmentální a chovatelské aspekty v rybářství.

Zajímavé odkazy na www stránky s RFID tématikou v českém jazyce http://www.altercan.com/ctecky/ http://www.elatec.cz/rfid/ http://www.mikrocipy.cz/cms/mikrocipy http://www.pointx.cz/hwsw_terminaly_do_ruky.php http://www.taurisplus.cz/TROVAN_znaceni_zvirat.htm

105


44(4) – 2008

Zajímavé odkazy na www stránky s RFID tématikou v angličtině http://sunbesttech.en.alibaba.com http://www.a-boca.nl/NL/index2.html http://www.aegid.de http://www.agrident.com/ http://www.avidid.com/ http://www.biomark.com/ http://www.daltoneid.com/pages/products/hand.html http://www.datamars.com http://www.destronfearing.com/

Obr. 1. Souprava na aplikaci a čtení RFID tagů Fig. 1. RFID/PIT tagging kit Obr. 2. Různé typy aplikátorů Fig. 2. Various types of implanters Obr. 1

Obr. 2

Obr. 3. Příklad ruční čtečky RFID tagů ( Euro 1000 firmy AEG) Fig. 3. Example of portable tag reader ( Euro 1000 by AEG company) Obr. 4. Detailní záběr glasstagu (Destron TX1400L) v porovnání se špendlíkem Fig. 4. A PIT-tag by Destron TX1400L viewed in comparison with pin Obr. 4

Obr. 3 106


44(4) – 2008

Obr. 5. Datový terminál PSION Workabout PRO2G doplněný čtečkou Agrident AIR100 Fig. 5. PSION Workabout PRO2G hand-held computer with RFID Reader AIR100/200 by Agrident company Obr. 6. Datový terminál PSION WotkaboutMX se čtečkou Dalton EID Systems Fig. 6. PSION Workabout MX Handheld Computer with RFID Reader by Dalton EID Systems Obr. 7. Datový terminál TagLogger od holandské firmy A-Boca Fig. 7. TagLogger hand-held terminal by A-Boca company

Obr. 5

Obr. 7

Obr. 6

LITERATURA Anonym 1. What is rfid [online]. [cit. 2008-12-12]. < http://www.elatec.cz/rfid/what_is_rfid.php> Anonym 2. Typy RFID tagů pro bezkontaktní identifikaci [online]. [cit. 2008-12-12]. Anonym 3. Systém radiofrekvenční identifikace zvířat EURO I. D. – TROVAN [online]. [cit. 2008-12-12]. Anonym 4. RFID Tags & Implanters [online]. [cit. 2008-12-12]. < http://www.biomark.com/RFID-tags.htm> Anonym 5. Technický popis elektronického identifikačního systému trovan [online]. [cit. 2008-12-12]. Anonym 6. Kompletní ceník Mikročipového identifikačního systému [online]. [cit. 2008-12-12]. Anonym 7. Glass tube ID 102 [online]. [cit. 2008-12-12]. http://www.aegid.de/fileadmin/user_upload/Datenblaetter/transponder/ID_102.pdf Anonym 8. RFID čipy [online]. [cit. 2008-12-12]. < http://www.elatec.cz/rfid/chips.php> Anonym 9. SerialMagic [online]. [cit. 2008-12-12]. < http://serialio.com/products/SerialMagic/index.php> Anonym 10. Ochrana krytím - IP kódy [online]. [cit. 2008-12-12]. < http://hw.cz/Teorie-apraxe/Dokumentace/ART603-Ochrana-krytim---IP-kody.html> Anonym 11. Terminály do ruky [online]. [cit. 2008-12-12]. Brannas, E., Lundqvist, H., Prentice, E., Schmitz, M., Brannas, K., Wiklund, B. S., 1994. Use of the Passive Integrated Transponder (PIT) in a fish indentification and monitoring system for fish behavioral studies. Transactions of the American Fisheries Society, 123: 395-401. Clugston, J.P., 1996. Retention of T-bar anchor tags and passive integrated transponder tags by Gulf Sturgeon. North American Journal of Fisheries Management 16: 682-685. Čáp, M. Čipování – moderní metoda označování a identifikace zvířat. [online]. [cit. 2008-12-12]. Domezain, A., Soriguer, M.C., Domezain , J., Hernando, J.A., 2001. Comparative study of various identification markers for use with sturgeon: proposal for a selection method. In:4th Symposium on Sturgeon – Poster Papers – Extended Abstracts , 4th Symposium on Sturgeon, July 8–13 Oshkosh, Wisconsin, USA, PP22 Flajšhans, M., Daněk, O., 1994. Použití systému PIT tagging a programu GENOA verze 1.0 ke značkování a

107


44(4) – 2008

operativní evidenci sumce velkého (Silurus glanis)ve šlechtitelském programu, Bulletin VÚRH Vodňany, 30(4): 128-133. Kolářová, J., Velíšek, J., Nepejchalová, L., 2007. Anestetika pro ryby. Metodika VÚRH JU 77, 20 str. Malát, K. Elektronická identifikace zvířat (EID) [online]. [cit. 2008-12-12] Moore, A., 1992. Passive integrated transponder tagging of channel catfish. Progressive Fish-Culturist 54: 125127. Ombredane, D., Bagliniere, J. L., Marchang, F., 1998. The effects of passive integrated transponder tags on survival and growth of juvenile brown trout (Salmo trutta L.) and their use for studying movement in a small river. Hydrobiologia 371/372: 99-106. Rien, T. 1994. Method of PIT tagging adult sturgeon in the head. Oregon Department of Fish and Wildlife. Zákon č. 154/2000 Sb. o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon).

108


44(4) – 2008

GENETICKÁ VARIANCE RŮSTU U KAPRA OBECNÉHO (CYPRINUS CARPIO L.) VE VĚKU JEDNOHO A DVOU LET: ODHADY HERITABILITY A SELEKČNÍ ODEZVA M. VANDEPUTTE1,2, M. KOCOUR3, S. MAUGER1, M. RODINA3, A. LAUNAY1, D. GELA3, M. DUPONT-NIVET1, M. HULÁK3, O. LINHART3 1

INRA UR544, Unité de Génétique des Poissons, F-78350 Jouy-en-Josas, Francie IFREMER, chemin de Maguelone, F-34250 Palavas les Flots, Francie 3 Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický ve Vodňanech, 389 25 Vodňany, Česká republika 2

(Český zkrácený překlad práce publikované v roce 2008 ve vědeckém časopise Aquaculture: Vandeputte, M., Kocour, M., Mauger, S., Rodina, M., Launay, A., Gela, D., Dupont-Nivet, M., Hulák, M., Linhart, O., 2008. Genetic variation for growth at one and two summers of age in the common carp (Cyprinus carpio L.): Heritability estimates and response to selection. Aquaculture, 277: 7-13). Překlad provedl M. Kocour.

ÚVOD Kapr obecný, Cyprinus carpio, je jedním z hospodářsky nejdůležitějších sladkovodních druhů ryb. Až do současnosti je chován výhradně v rybnících s extenzivním nebo polointezivním způsobem hospodaření, kde je růst ryb vysoce závislý (z 50 a více %) na dostupnosti přirozené potravy (plankton, bentos). Podmínky prostředí mají na užitkovost kapra tedy významný vliv a v minulosti byl kladen především vysoký důraz na optimalizaci rybářského hospodaření na rybnících (např. Horvath a kol., 1992). Genetické zlepšování užitkovosti kapra je dalším vhodným nástrojem pro zvýšení efektivity chovu kapra. Zlepšování genetického potenciálu kapra obecného šlo cestou všech dostupných šlechtitelských metod (Hulata, 1995), ale jedinou dosud široce využívanou metodou v rybářské praxi je meziplemenné křížení (Kocour a kol., 2005). Ohledně vnitroplemenné selekce existuje u kapra dosud jediný dobře zdokumentovaný experiment, který je ale pořád kontroverzní (Kinghorn, 1983), a při kterém nebyla selekce shledána pro zlepšování růstových vlastností efektivní (Moav a Wohlfarth, 1976). Odhady heritability rychlejšího růstu se ale u různých experimentů, i když mnohdy prováděných nevhodným způsobem, pohybovaly v rozmezí 0,0–0,5 (Vandeputte, 2003). V předešlé studii u kapra obecného použili Vandeputte a kol. (2004) molekulární metodu s využitím mikrosatelitních márkerů k identifikaci rodičů testovaných potomků chovaných v jednotných podmínkách prostředí. Použitím 10 samic a 24 samců pro tvorbu 240 úplných rodin se pohybovaly koeficienty heritability u růstových vlastností (hmotnost, délka těla a Fultonův koeficient) v rozmezí 0,33 až 0,37. Bohužel odhady byly dělány u mladých ryb ve věku 8 týdnů. Protože byly ale výsledky velmi povzbudivé, zejména vzhledem k možnosti aplikace hromadné selekce pro zvýšení růstu kapra, provedli jsme další podobný experiment s cílem odhadnout heritabilitu růstových vlastností v tržní velikosti. MATERIÁL A METODIKA Reprodukce a odchov kapra obecného v rámci experimentu byly prováděny na zařízeních Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, Výzkumného ústavu rybářského a hydrobiologického. Užitkové znaky byly zaznamenávány u ryb z generace č. 2 (G2) a č. 3 (G3).

109


44(4) – 2008

Založení a odchov G1 Potomci generace G1 byli získáni v květnu 2001 při plném faktoriálním křížení mezi 24 G0 samci a 10 G0 samicemi linie HSM (Maďarská syntetická linie) (Vandeputte a kol., 2004). Část ocasní ploutve (asi 1 cm2) byla odebrána od všech 34 rodičů z G0 a uchována v 98% etanolu. První pokus o selekci ryb z G1 byl proveden dle délky těla (DT) a byly vybírány ryby (s nejmenší DT, s největší DT a neselektované) v červenci 2001 a dubnu 2002. Bohužel v létě v roce 2002 postihly velké území ČR povodně, které zapříčinily smíchání těchto selektovaných skupin držených v oddělených rybnících. Proto jme se rozhodli zopakovat experiment s použitím samců z této generace (G1), neboť jsme u většiny z nich mohli identifikovat jejich rodiče z G0, což nám umožnilo získat navíc jednu generaci v rodokmenu. Založení a odchov G2 V květnu 2003 jsme vybrali z G1 147 samců ve věku 2 let, kteří již pouštěli mlíčí a křížili je obdobným způsobem jako v předchozím případě s 8 samicemi z G0 (Vandeputte a kol., 2004; Kocour a kol., 2006). Potomstvo (G2) bylo od počátku inkubováno a chováno společně (ve společném rybníce), abychom zaručili stejné životní podmínky pro všechny jedince v experimentální populaci. Po první vegetační sezóně v září 2003 byl náhodný vzorek 2000 jedinců z odchovaných ryb individuálně označen elektronickými čipy a všem takto označeným jedincům, stejně jako jejich rodičům při výtěru, byl odebrán vzorek DNA v podobě 1 cm2 ocasní ploutve k identifikaci jejich původu. Označené ryby byly dále odchovávány ve společných podmínkách až do září 2004, kdy bylo přeživších 1 458 ryb individuálně měřeno (délka těla) a váženo. Založení G3 direkcionální selekcí a odchov U generace G2 se vyskytly asi u 42 % ryb (pravděpodobně vlivem prostředí v raném vývoji) deformace úst, které měly vliv na rychlost růstu (Kocour a kol., 2006). Proto pouze 848 ryb bez deformací bylo vybráno jako potenciální otcové pro produkci G3. Na základě dat ze září 2004 jsme podle výsledků v délce těla identifikovali potenciální samce. Délka těla byla vybrána, neboť je s hmotností vysoce geneticky korelována (Vandepute a kol., 2004) a tento parametr je ve srovnání s hmotností mnohem rychleji zjistitelný v provozních podmínkách. Konečný selekční práh byl 12 % ryb s nejmenší délkou (D-down); 9,2 % ryb s největší délkou (U-up) a 16,2 % v oblasti kolem průměrné hodnoty populace (C-control). Do dubna 2005 přežilo 833 ryb a mezi předvybranými jedinci bylo identifikováno 99 samců uvolňujích mlíčí (32 ks s nejmenší DT; 34 samců s DT kolem průměru populace a 30 ks samců s nejvyšší DT). Z důvodu zkrácení trvání experimentu byly ryby z G2 populace ve věku 2 let a samice této populace nebyly ještě pohlavně dospělé (u kapra v našich podmínkách se samice pro umělý výtěr vybírají nejdříve ve věku 4–5 let), a proto jsme vzali samice (8 ryb) z původní G0 populace. V květnu 2005 proběhl umělý výtěr ryb. Schéma křížení bylo obdobné jako v předchozím experimentu, podobně jako následný odchov. V tomto případě jsme však nasadili potomstvo G3 do dvou rybníků o výměře 0,16 ha (20 000 ks K0 na rybník). Ve věku K1 (září 2005) bylo náhodně vybráno, změřeno, zváženo a individuálně označeno 750 ks ryb z každého rybníka a všech 1 500 ks ryb bylo nasazeno k dalšímu odchovu ve společné obsádce. Od všech ryb byl rovněž odebrán vzorek DNA ke stanovení jejich původu. Přeživší ryby byly poté znovu měřeny a váženy v dubnu a listopadu 2006. Určování rodičovství Následující ryby byly identifikovány: • 34 rodičů G0 (10 samic, 24 samců) použitých k založení G1;

110


44(4) – 2008

• • • •

147 G1 samců a 8 G0 samic použitých k založení G2; 812 ryb z G2 náhodně vzorkovaných v září 2003; 96 G2 samců a 8 G0 samic použitých k založení G3; 797 náhodně vybraných jedinců z G3 (z celkem 2 x 750 náhodně vzorkovaných jedinců měřených v září 2005). Všechny ryby byly identifikovány užitím 6–11 mikrosatelitních márkerů (Crooijmans a kol., 1997): MFW7, MFW9, MFW11, MFW16, MFW18 a MFW26 pro všechny a MFW3, MFW12, MFW20, MFW29, MFW40 jen pro některé. Přiřazení ryb k rodičovskému páru bylo provedeno na základě vylučování s jednou nebo dvěma tolerovanými chybami pomocí VITASSIGN (Vandeputte a kol., 2006). Pouze ryby přiřazené k jedinému rodičovskému páru byly použity ke statistické analýze. Statistická analýza Významnost rozdílů mezi pevnými a náhodnými efekty byla odhadnuta použitím SASGlm u G3. Hodnoty odhadované heritability pro délku těla a hmotnost ve všech věkových kategoriích (K1 podzim, K1 jaro a K2 podzim) byly počítány pomocí VCE 5.1.2 (Kovac a Groeneveld, 2003) dle modelu: Y = Xβ + Zu + e Kde Y je vektor sledovaných znaků, β je vektor pevných efektů včetně roku a rybníku (u G3) a deformací úst (u G2), u je vektor náhodných aditivních genetických efektů, e je vektor náhodných reziduálních efektů. X a Z jsou známé vektory matic.

Celkový soubor dat (rodokmen od G0 do G3, fenotypy G2 a G3) byl použit pro odhad heritabilit napříč generacemi, zatímco celý rodokmen ale jen s fenotypy G2 nebo G3 byl použit pro odhad heritabilit uvnitř generací. Pro odhad heritability byly použity jednofaktorové modely, dvoufaktorové modely byly použity pro kalkulaci genetických korelací mezi délkou těla a hmotností v každém věku a třífaktorový model byl použit pro kalkulaci genetických korelací mezi délkou těla (respektive hmotností) v různém věku (K1 podzim, K1 jaro a K2 podzim). Odhady plemenné hodnoty byly kalkulovány in VCE použitím kompletního souboru dat. Rozdíly mezi selektovanými skupinami byly testovány dle následujícího modelu (SASGlm): Yij = µ + Gi + eij Kde Yij je odhadovaná plemenná hodnota ryby j z genetické skupiny i, µ je celkový průměr v populaci, Gi je fixní efekt genetické skupiny (G0, G1, G2, G3-U, G3-C, G3-D) a eij je náhodné reziduum.

Porovnání průměrných hodnot mezi genetickými skupinami bylo provedeno použitím Tukey-Kramerova testu pro mnohonásobná porovnání. Realizovaná odpověď na selekci pro vyšší růst byla počítána dvěma způsoby. Prvně jako dvojnásobek rozdílů mezi průměrnou plemennou hodnotou G3-U a G2 a poté jako dvojnásobek rozdílu mezi průměrnými plemennými hodnotami G3-U a G3-C. Rozdíly byly násobeny dvěma, neboť u G3 vznikla jen selekcí samců na rychlost růstu, a tak je pozorovaný rozdíl jen polovinou skutečně očekávaného rozdílu v případě použití selektovaných rodičů obojího pohlaví. Stejná kalkulace byla provedena i pro odpověď na pomalejší růst. Realizovaná heritabilita byla kalkulována jako poměr mezi realizovanou selekční odezvou (standardizovanou jako směrodatné odchylky fenotypových hodnot) a selekčním diferenciálem.

111


44(4) – 2008

VÝSLEDKY Selekční proces Fenotypové hodnoty selektovaných ryb z G2 populace jsou v tabulce č. 1 včetně selekčního diferenciálu kalkulovaného jen u ryb bez deformací úst. Určení rodičovství K jedinému rodičovskému páru bylo přiřazeno: • 85,7 % samců z G1 vybraných k založení G2; • 75,7 % ryb náhodně vybraných z G2; • 65,6 % samců z G2 použitých k založení G3; • 81,2 % ryb se vzorkovaných jedinců z G3. Tyto výsledky nám umožnily sestavit rodokmen zahrnující jedince ze všech 4 generací (G0– G3), který zahrnoval 195 ryb bez známých fenotypových hodnot (48 z G0 a 147 z G1) a 1 321 ryb s fenotypy (674 z G2 a 647 z G3). Tab. 1. Počet a velikost ryb v G2 ve věku dvou let (podzim 2004) před a po selekci. U – ryby s nejrychlejším růstem, C – ryby s růstem kolem průměru populace, D – ryby s nejpomalejším růstem Počet ryb Ryby s deformacemi úst Ryby s normálními ústy Vybraní samci (U) Vybraní samci (C) Vybraní samci (D)

610 848 30 36 33

DT ryb v mm ± S.D. (podzim 2004) 234,0 ± 20.7 249,4 ± 19.3 282,4 ± 7.5 250,6 ± 5.3 218,1 ± 9.4

Selekční diferneciál (v jednotkách S.D. u DT) +1,71 +0,06 -1,63

Odhad heritability růstových vlastností Zjištěné koeficienty heritability u modelu s použitím fenotypových hodnot z G2 a G3 se v jednotlivých obdobích odchovu pohybovaly mezi 0,31–0,44 u hmotnosti a 0,21–0,33 u délky těla. Genetická korelace mezi hmotností měřenou po první vegetační sezóně a před ní byla vysoká (0,96 ± 0,01), ale mezi hmotností v prvním a druhém roce byla již mnohem menší (0,34–0,41). U délky těla byla genetická korelace mezi hodnotami po prvním a druhém roce o něco vyšší (0,64–0,67). Pokud byla zjištěná hmotnost a délka těla ve stejném věku u různých generací považována za samostatné znaky, byly výsledky heritability těchto vlastností odlišné – mnohem vyšší u G2 oproti G3 (tabulka č. 2). Tab. 2. Odhady heritability (± S.E.) u hmotnosti a délky těla v různých věkových obdobích s využitím metody „animal model“ se znalostí rodokmenu čtyř generací a fenotypu 2 generací (G2 a G3, celý soubor) nebo jen jedné generace (jen G2 nebo jen G3)

Věk K1 podzim K1 jaro K2 podzim

Celý soubor dat Jen G2 Jen G3 Hmotnost Délka těla Hmotnost Délka těla Hmotnost Délka těla 0,31 ± 0,04 0,21 ± 0,03 0,61 ± 0,03 0,39 ± 0,04 0,18 ± 0,06 0,25 ± 0,07 0,33 ± 0,04 0,26 ± 0,03 0,67 ± 0,03 0,46 ± 0,04 0,20 ± 0,07 0,27 ± 0,08 0,44 ± 0,05 0,33 ± 0,04 0,48 ± 0,03 0,36 ± 0,05 0,37 ± 0,13 0,40 ± 0,13 112


44(4) – 2008

Odezva na selekci Průměrné fenotypové hodnoty sledovaných růstových vlastností jsou uvedeny v tabulce č. 3 a plemenné hodnoty jednotlivých skupin pro oba znaky jsou uvedené v tabulce č. 4. Jak bylo očekáváno, žádné rozdíly v plemenné hodnotě nebyly zjištěny u neselektovaných generací 0, 1 a 2. U generace 3 (G3) jsou vidět významné rozdíly u vypočtených plemenných hodnot mezi potomstvem po otcích s nižším růstem, s růstem kolem průměru populace i vyšším růstem jen ve stáří jednoho roku. V dalších obdobích nebyly mezi potomstvem po otcích s nižším růstem a s růstem kolem průměru populace zjištěné statisticky významné rozdíly v jejich plemenné hodnotě. Potomstvo po otcích s vyšším růstem vykazovalo ale plemennou hodnotu významně vyšší. Srovnáním plemenné hodnoty mezi generacemi 2 a 3 bylo zjištěno, že potomstvo (G3) po otcích s nižším růstem a s růstem kolem průměru populace vykazovalo srovnatelnou plemennou hodnotu s G2. Potomstvo (G3) po samcích s vyšším růstem mělo plemennou hodnotu vyšší. Pokud byl genetický zisk odhadnut jako rozdíl mezi plemennými hodnotami odlišných skupin jedinců G3, byla realizovaná heritabilita na úrovni 0,24. Pokud byla selekční odezva počítána jako rozdíl mezi plemennou hodnotou mezi potomstvem G3 po otcích s vyšším růstem a G2 populací, pohybovala se realizovaná heritabilita na úrovni 0,34, ale u potomstva po otcích s nižším růstem jsme zjistili realizovanou heritabilitu jen na úrovni 0,14. Tab. 3. Fenotypová data u hmotnosti (HM) a délky těla (DT) (průměr ± S.D. v závorce) zjištěná u potomstva populace G3 po otcích o různých růstových vlastnostech Otcové

K1 na podzim K1 na jaře n HM (g) DT (mm) n HM (g) DT (mm) Vyšší růst 202 32,1 93,0 103 32,4 97,0 (11,4) (12,7) (9,7) (9,9) Průměrný růst 225 30,7 92,0 112 30,8 95,6 (10,5) (11,2) (8,4) (9,1) Nižší růst 220 30,4 91,5 110 31,1 95,9 (9,7) (11,8) (9,4) (9,7)

K2 na podzim n HM (g) DT (mm) 66 703 306 (173) (26) 72 659 300 (152) (22) 62 670 299 (161) (23)

Tab. 4. Odhad velikosti plemenných hodnot různých genetických skupin linie HSM počítané metodou “animal model” na základě všech dostupných údajů u hmotnosti a délky těla v jednotlivých věkových kategoriích; hodnoty se stejným znakem horního indexu se významně neliší v rámci daného řádku (Tukey-Kramerův test, P > 0,05). Proměnná DT K1 podzim HM K1 podzim DT K1 jaro HM K1 jaro DT K2 podzim HM K2 podzim *

G0 (n=48) -0,5ab -0,8ab -0,5a -1,0a -0,4a -6,4a

Genetická skupina G1 G2 G3-U G3-C G3-D * * (n=147) (n=670) (n=66-201 ) (n=72-225 ) (n=62-219*) -0,4ab -0,8ab 1,9c 0,1b -1,0a -0,9ab -1,3ab 2,2c -0,3b -1,5a -0,5a -0,5a 2,8b 0,6a -1,3a -1,2a -1,1a 4,1b 0,2a -2,1a 0,1a 0,0a 6,9b 2,3a -2,6a -5,6a -5,8a 53,7b 12,2a -17,2a

Vyšší n platí pro K1 na podzim, nižší pro K2 na podzim

113


44(4) – 2008

DISKUZE Určení rodičovství Celkem 1 451 jedinců z 1 852 vyšetřovaných ryb mohlo být přiřazeno k jedinému rodičovskému páru (78,3 %). Procento úspěšnosti je v našem případě ve srovnání s jinými autory nižší, než je u ryb obvyklé (obvykle 90–99 %, např. Fishback a kol., 2002; Norris a Cunningham, 2004). V našem případě byla ale používána schémata křížení s velkým počtem možných rodičovských párů (v G2 147 samců x 8 samic = 1 176 možných rodičovských párů a v G3 96 samců x 8 samic = 768 možných rodičovských párů). Při takto vysokém počtu potenciálních rodičovských párů bývá úspěšnost stanovení i u jiných druhů ryb nižší (např. 73,5 % u pražmy velké při 250 potenciálních rodičovských párech, Perez-Enriquez a kol., 1999). Nižší procento úspěšnosti při hledání rodičovského páru je nutno přičíst především nižší variabilitě mikrosatelitních márkerů způsobené pravděpodobně historií domestikace kapra obecného, která vedla k redukci počtu zastoupených alel (Kohlmann a kol., 2005). S ohledem na způsob vlastní metodiky (molekulární analýzy, použitý software atd.) je určování rodičovství tímto způsobem zatíženo jen velmi malou chybou, což dělá použitou metodiku vhodnou k těmto analýzám. Je ale potřeba najít márkery s vyšší variabilitou či více mikrosatelitních márkerů, neboť nepřiřazení více než 20 % jedinců z populace k jejich rodičům by bylo ekonomicky nepřijatelné. Heritabilita a korelace Odhady heritability pro růstové vlastnosti (hmotnost, délka těla) pro celý soubor dat se pohybovaly v rozmezí 0,21–0,44, což jsou hodnoty v běžném rozmezí pro kapra obecného (Nagy a kol., 1980; Tanck a kol., 2001 – viz přehled od Vandeputte, 2003). Ve srovnání s našimi pozorováními jsou tyto hodnoty podobné k těm, které jsme zjistili u kapra ve věku 8 týdnů (0,33; Vandeputte a kol., 2004), ale nižší ve srovnání s těmi zjištěnými u kapra v tržní velikosti (0,7; Kocour a kol., 2007). Pokud bychom se ale podívali na heritabilitu ryb z G2 populace, získáme hodnoty 0,48–0,67, což jsou právě ryby, které byly pro odhad v článku Kocour a kol. (2007) použity. Průměrná heritabilita v již zmiňovaném rozpětí 0,21–0,44 řadí kapra do stejné kategorie jako většinu ostatních druhů využívaných v akvakultuře (Gjedrem a Olesen, 2005). Tyto hodnoty nechávají dostatečný prostor pro aplikaci selekčního programu u kapra obecného. Genetické korelace mezi růstovými vlastnostmi (hmotnost nebo délka těla) v prvním a druhém roce nebyly příliš vysoké (0,3–0,4 u hmotnosti a 0,6–0,7 u délky těla). Pokud jsme vlastnosti u G2 a G3 hodnotili jako odlišné znaky, byly odhady heritability nejnižší u G3 v prvním roce, kdy byly ryby chovány ve dvojím opakování. Tyto nízké odhady by mohly být vysvětleny, pokud by užitkovost potomků po různých samcích byla odlišná v obou rybnících. Bohužel malý počet potomků v rodině (6,8 potomků/samce celkem nebo 3,4 v každém z rybníků) nám neumožnil otestovat interakce mezi samcem a prostředím s dostatečnou statistickou sílou. Nicméně interakce mezi prostředím a genotypem u kapra obecného jsou zdokumentovány (např. Gross a Wohlfarth, 1994; Moav a kol., 1975), takže se mohly vyskytnout i v našem případě. Z důvodu nízké závislosti ve velikosti ryb po prvním a druhém roce se také zdá být časná selekce jako zbytečná z důvodu nízké efektivity. Dalším důvodem, proč selekci v raném věku neprovádět, je možnost nízkého přežití selektovaných ryb. V našem případě u G3 ve věku K2 na podzim žilo pouze 32 % ryb vybraných na podzim ve věku K1. Z tohoto důvodu se zdá být vhodnější počkat se selekcí do období, kdy se přežití ryb ustálí na vyšších hodnotách. Na druhou stranu, vezmeme-li v úvahu obtíže a náklady spojené s selekcí v pozdějším věku (problémy s transportem a selekcí ryb, omezené rybniční plochy, náklady na krmení atd.), zdá se být selekce v mladším věku pořád ekonomicky výhodnější. V podmínkách střední Evropy doporučujeme po zvážení všech kladů a záporu provádět selekci u ryb ve věkové kategorii K2 (300–600 g).

114


44(4) – 2008

Genetická korelace mezi délkou těla a hmotností ve stejném roce byla velmi vysoká, z toho důvodu se zdá být vhodnější provádět selekci na základě délky těla, což je v běžných podmínkách chovu lépe a rychleji proveditelné. Na druhou stranu je ale heritabilita pro délku těla o něco nižší než u hmotnosti, proto by účinek selekce nebyl tak efektivní. Je proto na zváženou, zda neprovádět raději efektivnější, i když méně praktičtější, selekci na základě živé hmotnosti ryb. Odezva na selekci Celková pozorovaná odezva na selekci byla nízká. Nepozorovali jsme u G3 žádnou odezvu při selekci na nižší růst ve srovnání s genetickou úrovní populace G2. Tento výsledek byl přesným opakem toho, co zjistili v Izraeli u první generace při aplikaci direkcionální selekce (Moav a Wohlfarth, 1976). Problémem v našem případě je skutečnost, že výsledek byl zjištěn ve věku K2 u G3 z dat o velikosti souboru v rozmezí 62–72 ryb. Proto mohl být zjištěný výsledek dost nepřesný. Dosažená heritabilita při selekci na vyšší růst (0,24–0,34) je v podobném rozsahu jako odhadované hodnoty metodou „animal model“ (0,21–0,33 pro délku těla). Je potřeba ale pamatovat na skutečnost, že výsledky byly zjištěny při testování všech genetických kategorií ryb v jednotných podmínkách (v jednom rybníce, tzv. společné či komunální testování). Při tomto testování bylo u kapra obecného prokázáno (Moav a Wohlfarth, 1974), že rozdíly v užitkovosti jednotlivých skupin mohou být ve srovnání s odděleným chovem několikrát znásobeny. To by znamenalo, že naše zjištění, ač nikterak výrazná, mohla být nadhodnocena. Na druhou stranu výhodou testování, které jsme zvolili, je, že naše odhady nejsou zatíženy vlivy prostředí. Pokud bychom chovali genetické skupiny v oddělených rybnících, museli bychom pro každou skupinu zajistit 20 opakování, abychom byli schopni zachytit s jistotou 10% rozdíl mezi skupinami daný genetickou složkou proměnlivosti. Při použití kontrolní skupiny by bylo možno snížit počet opakování na 4–5 (Gross a Wohlfarth, 1994; Vandeputte a kol., 2002), ale i toto množství je s ohledem na dostupnost vhodných rybníků příliš vysoké. Vezmeme-li v úvahu jako možnou heritabilitu při selekci kapra obecného hodnotu 0,25, dosáhli bychom při selekci 10 % ryb z populace selekční zisk na úrovni 12 % u hmotnosti a 4 % u délky těla. Běžný generační interval, tedy věk ryb při jejich prvním umělém výtěru, u kapra obecného v ČR je 4,5 let (4 roky pro samce a 5 let pro samice). Selekční zisk za jeden rok by tedy byl u hmotnosti 2,7–3 %. Pro zlepšení účinku selekce připadá v úvahu i selekce rodin, která je ale v rybničních podmínkách chovu kapra obecného z důvodu nutnosti určování rodičovství za použití molekulárních metod stále cenově nepřijatelná. Z toho důvodu připadá v úvahu jen individuální hromadná selekce nejlépe kombinovaná s dalšími znaky (např. obsahem tuku měřeným na živých zvířatech a zvýšením výtěžnosti filetů nepřímou selekcí na relativní délku hlavy; Kocour a kol., 2007). I v tomto případě by bylo ale nutno počítat se selekčním programem v délce 10–15 let za velkých časových i materiálních investic, než by byly výsledky selekce jednoznačně pozorovatelné kvůli variabilitě užitkovosti z roka na rok a od rybníka k rybníku (tzn. zlepšení o 30–40 % oproti výchozí populaci). Globální dopad při provádění selekce na velkém počtu podniků by byl viditelný dříve. Vliv interakcí mezi genotypem a prostředím by bylo také nutno podrobněji prostudovat použitím většího vzorku ryb chovaných v různých podmínkách. Závěrem, s ohledem na možné genetické zvýšení růstu u kapra obecného, je potřeba pamatovat na skutečnost, že celková produkce ryb v rybníce je závislá na přirozené úrodnosti rybníka, množství předkládaného doplňkového krmiva a přežití ryb (např. Szumiec, 1990). Můžeme tedy předpokládat, že lepší genetický potenciál ryb zvýší celkovou produkci rybníka? Toto by bylo možné jen v případě, že vyšší růst by byl kladně geneticky korelován i s konverzí krmiva. Bohužel tato korelace je mezi druhy velmi variabilní, např. u pstruha obecného nebyla prokázána (Sanchez a kol., 2001), u pstruha duhového je průměrná (Kause a

115


44(4) – 2008

kol., 2006) a u lososa obecného relativně vysoká (Thodesen a kol., 1999). V každém případě by pro maximální efektivitu selekce bylo zapotřebí upravit systém hospodaření na rybnících (např. nižší obsádky, vyšší krmení či lepší krmivo, podpora přirozené produkce rybníka atd.). Pokud bychom již nechtěli nebo nemohli zvyšovat produkci z plochy rybníka, nabízí se možnost zvýšení produkce jedlých částí, tedy zvýšení podílu masa, což je základě předchozích výsledků také možné (Kocour a kol., 2007). Poděkování Autoři děkují všem zaměstnancům oddělení genetiky a šlechtění ryb, VÚRH JU ve Vodňanech, kteří se na pracích aktivně podíleli. Tato práce byla podporována prostředky z Národní agentury pro zemědělský výzkum při MZe, ČR č. QF4117, prostředky z výzkumného záměru VÚRH JU č. MSM6007665809, fondů INRA, Francie, oddělení pro šlechtění zvířat a z prostředků česko-francouzkého bilaterálního programu BARRANDE č.03218RF, 07508SA a 2004-044-2. LITERATURA Crooijmans, R.P.M.A., Bierbooms, V.A.F., Komen, J., Van der Poel, J.J., Groenen, M.A.M., 1997. Microsatellite markers in common carp (Cyprinus carpio L.). Anim. Genet. 28: 129-134. Fishback, A.G., Danzmann, R.G., Ferguson, M.M., Gibson, J.P., 2002. Estimates of genetic parameters and genotype by environment interactions for growth traits of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) as inferred using molecular pedigrees. Aquaculture, 206: 137-150. Gjedrem, T., Olesen, I., 2005. Basic statistical parameters. In: Gjedrem, T. (Ed.), Selection and Breeding Programs in Aquaculture. Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 45-72. Gross, R., Wohlfarth, G.W., 1994. Use of genetic markers in growth testing of common carp, Cyprinus carpio L., carried out over 2 or 3 year cycles. Aquacult. Fish. Manage. 25: 585-599. Horvath, L., Tamas, G., Seagrave, C., 1992. Carp and pond fish culture. Blackwell Scientific Publications Ltd., UK, 158 pp. Hulata, G., 1995. A review of genetic improvement of the common carp (Cyprinus carpio L.) and other cyprinids by crossbreeding, hybridization and selection. Aquaculture, 129: 143-155. Kause, A., Tobin, D., Houlihan, D.F., Martin, S.A.M., Mantysaari, E.A., Ritola, O., Ruohonen, K., 2006. Feed efficiency of rainbow trout can be improved through selection: Different genetic potential on alternative diets. J. Anim. Sci., 84: 807-817. Kinghorn, B.P., 1983. A review of quantitative genetics in fish breeding. Aquaculture, 31: 283-304. Kocour, M., Gela, D., Rodina, M., Linhart, O., 2005. Testing of performance in common carp Cyprinus carpio L. under pond husbandry conditions I: top-crossing with Northern mirror carp. Aquacult. Res., 36: 12071215. Kocour, M., Linhart, O., Vandeputte, M., 2006. Mouth and fin deformities in common carp: is there a genetic basis? Aquacult. Res., 37: 419-422. Kocour, M., Mauger, S., Rodina, M., Gela, D., Linhart, O., Vandeputte, M., 2007. Heritability estimates for processing and quality traits in common carp (Cyprinus carpio L.) using a molecular pedigree. Aquaculture, 270: 43-50. Kohlmann, K., Kersten, P., Flajshans, M., 2005. Microsatellite-based genetic variability and differentiation of domesticated, wild and feral common carp (Cyprinus carpio L.) populations. Aquaculture, 247: 253-266. Kovac, M., Groeneveld, E., 2003. VCE5 user's guide and manual version 5.1. Department of Animal Sciences, University of Ljubljana, Ljubljana, 68 pp. Moav, R., Hulata, G., Wohlfarth, G.W., 1975. Genetic differences between the Chinese and European races of the common carp. I. Analysis of genotype-environment interactions for growth rate. Heredity, 34: 323340. Moav, R., Wohlfarth, G.W., 1974. Magnification through competition of genetic differences in yield capacity in carp. Heredity, 33: 181-202. Moav, R., Wohlfarth, G.W., 1976. Two way selection for growth rate in the common carp (Cyprinus carpio L.). Genetics, 82: 83-101. Nagy, A., Csanyi, V., Bakos, J., Horvath, L., 1980. Development of a short-term laboratory system for the evaluation of carp growth in ponds. Bamidgeh, 32: 6-15. Norris, A.T., Cunningham, E.P., 2004. Estimates of phenotypic and genetic parameters for flesh colour traits in farmed Atlantic salmon based on multiple trait animal model. Livest. Prod. Sci., 89: 209-222.

116


44(4) – 2008

Perez-Enriquez, R., Takagi, M., Taniguchi, N., 1999. Genetic variability and pedigree tracing of a hatcheryreared stock of red sea bream (Pagrus major) used for stock enhancement, based on microsatellite DNA markers. Aquaculture, 173: 413-423. Sanchez, M.P., Chevassus, B., Labbe, L., Quillet, E., Mambrini, M., 2001. Selection for growth of brown trout (Salmo trutta) affects feed intake but not feed efficiency. Aquat. Liv. Resour., 14: 41-48. Szumiec, M.A., 1990. Stochastic model of carp fingeling growth. Aquaculture, 91, 87-99. Tanck, M.W.T., Vermeulen, H., Bovenhuis, H., Komen, J., 2001. Heredity of stress-related cortisol response in androgenetic common carp (Cyprinus carpio L.). Aquaculture, 199: 283-294. Thodesen, J., Grisdale-Helland, B., Stale, J., Gjerde, B., 1999. Feed intake, growth and feed utilization of offspring from wild and selected Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 180: 237-246. Vandeputte, M., 2003. Selective breeding of quantitative traits in the common carp (Cyprinus carpio L.): a review. Aquat. Liv. Resour., 16: 399-407. Vandeputte, M., Kocour, M., Mauger, S., Dupont-Nivet, M., De Guerry, D., Rodina, M., Gela, D., Vallod, D., Chevassus, B., Linhart, O., 2004. Heritability estimates for growth-related traits using microsatellite parentage assignment in juvenile common carp (Cyprinus carpio L.). Aquaculture, 235: 223-236. Vandeputte, M., Mauger, S., Dupont-Nivet, M., 2006. An evaluation of allowing for mismatches as a way to manage genotyping errors in parentage assignment by exclusion. Mol. Ecol. Notes 6, 265-267. Vandeputte, M., Peignon, E., Vallod, D., Haffray, P., Komen, J., Chevassus, B., 2002. Comparison of growth performances of three French strains of common carp (Cyprinus carpio) using hemi-isogenic scaly carp as internal control. Aquaculture, 205: 19-36.

117


44(4) – 2008

Redakce časopisu Bulletin VÚRH tímto srdečně děkuje následujícím kolegům, kteří vynaložili svůj čas a úsilí při oponování vědeckých prací v rámci 44. ročníku tohoto časopisu: Ing. Petr Dvořák, Ph.D. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Katedra rybářství a myslivosti Ing. Jiří Fiala, Ph.D. MZLU Brno, Ústav zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství Ing. Pavel Horký, Ph.D. VUV Praha, Odbor aplikované ekologie, Oddělení ekologie vodních organismů Dr. Ing. Pavel Jurajda Ústav biologie obratlovců, Akademie věd ČR, v.v.i., Ekologie ryb Ing. Lukáš Kalous, Ph.D. Česká zemědělská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Katedra zoologie a rybářství RNDr. Zdeňka Kopicová, CSc. Výzkumný ústav potravinářský, Praha, Oddělení jakostních znaků a mikrobiálních produktů RNDr. Josef Kurfürst, CSc. Česká zemědělská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Katedra zoologie a rybářství doc. Dr. Ing. Jan Mareš MZLU Brno, Ústav zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství RNDr. Lukáš Merta, Ph.D. Agentura ochrany přírody a krajiny ČR, AOPK ČR Olomouc MVDr. Helena Modrá, Ph. D. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie doc. MVDr. Stanislav Navrátil, CSc., Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí VFU Brno doc. Jana Pěknicová, Ph.D Biotechnologický ústav AV ČR Praha, Laboratoř diagnostiky pro reprodukční medicínu RNDr. Antonín Prouza Státní veterinární ústav České Budějovice doc. Ing. Petr Ráb, DrSc. Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR Liběchov, Sekce evoluční biologie a genetiky obratlovců, laboratoř genetiky ryb 118


44(4) – 2008

Mgr. Ondřej Slavík, Ph.D. VÚV Praha, Odbor aplikované ekologie RNDr. Irena Šetlíková, Ph.D. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, Katedra biologických disciplín Ing. Pavel Vejsada, Ph.D. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, Katedra rybářství a myslivosti MVDr. Tomáš Veselý, CSc. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.

119


44(4) – 2008

Pokyny pro autory Odborné zaměření časopisu Bulletin VÚRH přijímá k publikování a následně po lektorování uveřejňuje původní vědecké práce, krátká sdělení, přehledové referáty a recenze, týkající se všech aspektů sladkovodního rybářství, ichtyologie a akvakultury. Tato odborná oblast zahrnuje především vědecké práce týkající se: biologie, fyziologie, reprodukce, genetiky, šlechtění, chovu, výživy a nemocí sladkovodních ryb a dále také sladkovodní ekologie, toxikologie, hydrobiologie, rybářské statistiky a ekonomiky chovu ryb. Příležitostně jsou v něm publikovány i příspěvky přednesené na vědeckých a odborných konferencích či seminářích. Autorská práva předkládané práce Autor předkládané práce je plně odpovědný za původnost práce a za její věcnou i formální správnost. Autor se při předkládání práce do redakce časopisu zaručuje, že tato práce je jeho autorské dílo, které nebylo nikde publikováno a neporušuje (či nebude porušovat) autorská díla třetích osob. První autor předkládané práce přebírá veškerou zodpovědnost za všechny spoluautory práce. Autoři práce se zaručují, že žádná část jejich práce nebude dále publikována či nijak rozšiřována bez souhlasu vydavatele Bulletinu VÚRH Vodňany. V případě využití částí děl jiných autorů se autor zavazuje dodržovat citační pravidla dle § 31 autorského zákona 121/2000 Sb. Proces předložení, posouzení, lektorování a následné uveřejnění předkládané práce Autoři předkládají práce (především odborné a přehledové články) výhradně elektronicky bez tištěného originálu na emailovou adresu [email protected]. Předložená práce je posouzena redakcí časopisu. Poté je práce zaslána ke korektuře. Dva nezávislí odborní oponenti z jiných českých vědecko-výzkumných institucí posoudí předloženou práci z hlediska odborného a věcného. Po korektuře a případných vyžádaných úpravách, které jsou realizovány a odsouhlaseny samotnými autory, je předložená práce doporučena k uveřejnění. O konečném uveřejnění prací rozhoduje redakční rada časopisu, a to se zřetelem k vědeckému významu, přínosu a kvalitě předložené práce. Před konečným uveřejněním první autor práce odsouhlasí publikování práce v konečné podobě vlastním podpisem na speciálním formuláři „Souhlas s vytištěním dané publikace“. Po tomto odsouhlasení se práce stává majetkem vydavatele. Všechny následná autorská práva jsou poté chráněny copyrightem vydavatele. Technická úprava rukopisu Text příspěvku bude zpracovaný v českém jazyce v programu Microsoft Word (pokud možno v co nejaktuálnější verzi) s příponou *. rtf. Vyžadovaný formát příspěvku je: formát stránky A4; řádkování 2; zarovnání textu do bloku; font Times New Roman CE; základní písmo textu velikosti 12; okraje 2,5 cm po všech stranách; stránky i řádky textu budou průběžně číslovány; u každého odstavce bude odsazení prvního řádku 1 cm; žádný text ani informace nesmí být v záhlaví ani v zápatí stránky. Text je doporučeno graficky upravit tak, jak si jej autor přeje otisknout, tedy s vložením tabulek, grafů i obrázků přímo do textu. Vyžaduje se tabulky přímo vytvářet v programu Microsoft Word. Obrázky a grafy se vyžaduje vkládat do textu jako grafický formát „obrázek“ a to v černobílém provedení (stupních šedi). Všechny grafy a obrázky musí být dělány s dostatečným rozlišením, velikostí písma atd., aby byly přehledné a čitelné i po zmenšení na jednu stránku formátu velikosti A5. Nepřehledné, barevné či jinak neodpovídající grafy a tabulky nebudou do textu zařazeny. Pro kvalitnější otištění se vyžaduje grafy a obrázky zaslat ještě elektronicky ve formátu *.tif, *,bmp, *,jpg. Na každou tabulku, graf či obrázek musí být odkaz v textu (jako např.: Tab. 1 nebo Obr. 1). U tabulek nejsou povoleny žádné barevné prvky ani stínování buněk tabulky. Nadpis a legenda tabulky, grafu a obrázku jsou vždy umístěny nad tabulkou, grafem či obrázkem velikostí písma 12, s řezem písma obyčejné. Pod českým názvem je vyžadován anglický překlad nadpisu a legendy, který je psán kurzívou s velikostí písma 12. V práci je nutné používat jednotky odpovídající soustavě SI. Pokud autor používá v práci zkratek jakéhokoliv druhu, je nutné, aby byla zkratka při prvním použití vysvětlena. V názvu práce a v souhrnu se použití zkratek nedoporučuje. Jakékoliv cizí názvosloví je nutné při prvním použití

120


44(4) – 2008

v textu vysvětlit v českém jazyce. Při první zmínce v textu o živočišném či rostlinném taxonomickém subjektu je nutné uveřejnit jejich vědecký český (pokud je znám) i latinský název. Vlastní úprava práce Název Název se píše velkými písmeny, tučně se zarovnáním na střed, velikost písma 14. Anglický název se uvede hned pod český název velkými písmeny, kurzívou (ne tučně), velikost písma 13 se zarovnáním na střed. Mezi českým a anglickým názvem není žádné odsazení řádků. Autoři Autorský kolektiv se uvede pod název práce s odsazením jednoho řádku, velikost písma 12, tučně, zarovnání na střed, všechna písmena velká. Uvádí se nejprve počáteční písmeno křestního jména autora následované celým příjmením daného autora. Jednotliví autoři se od sebe oddělují čárkou, za počátečním písmenem křestního jména daného autora se dává tečka (bez čárky). Afilace Pod jména autorů se s odsazením jednoho řádku uvádí adresy pracoviště autorů včetně emailových adres. Velikost písma 10, kurzíva, zarovnání do bloku. Jsou-li autoři z více pracovišť, uvede se na každý řádek jedno pracoviště a u jednotlivých autorů se jejich příslušnost k adrese vyznačí číslicí s horním indexem za jejich příjmením. Abstrakt Po afilaci autorů s odsazením 2 řádků následuje anglický abstrakt. Abstrakt se píše kurzívou, velikost písma 10, zarovnání do bloku. Vypracování abstraktu je nutné věnovat zvláštní péči. Autor do něj má shrnout vše, co je na jeho práci pozoruhodné a nové a co má být zdokumentováno. Abstrakt má být nekritickým informačním výběrem významného obsahu a závěru článku, nikoli však jeho pouhým popisem. V abstraktu se nepoužívají žádné zkratky. Abstrakt musí obsahovat základní číselné údaje včetně statistických hodnot. Abstrakt se uvádí jen v jednom odstavci a jeho rozsah je maximálně 250 slov. Klíčová slova Klíčová slova následují s odsazením 1 řádku po anglickém abstraktu v českém a následně anglickém jazyce. Velikost písma 10, zarovnání do bloku, klíčová slova v českém jazyce – obyčejný řez písma, klíčová slova v anglickém jazyce - kurzíva. Úvod Má obsahovat současný stav studovaného problému a hlavní důvody, proč byla práce uskutečněna. Je nutno se v něm vyhnout rozsáhlým historickým přehledům. Materiál a metodika Metody se popisují pouze tehdy, jsou-li původní, jinak postačuje citovat autora metod a uvádět jen případné odchylky. Je popsán pokusný materiál. Popis metod by měl umožnit, aby kdokoliv z odborníků mohl podle něho a při použití uvedených citací práci opakovat. Členění textu na podsekce je možné, grafické řešení ale musí být řešeno přehledně a srozumitelně. Výsledky Tato část by neměla obsahovat teoretické závěry ani dedukce, ale pouze faktické nálezy a hodnoty. Doporučuje se dát přednost grafickému vyjádření a minimalizovat počet tabulek. Tabulky, grafy a obrázky v textu nesmí obsahovat zdvojené informace. Tzn. co se vyjádří v textu, se již nesmí uvádět v tabulce či jiném grafickém vyjádření. Diskuse Obsahuje zhodnocení práce a vlastní postřehy autorů. Výsledky práce se konfrontují s dříve publikovanými výsledky, pokud mají souvislost nebo jsou s předloženou prací srovnatelné. Souhrn (v českém jazyce) U původních prací (včetně přehledových prací) následuje po diskusi souhrn v českém jazyce, který je obdobou anglického abstraktu na začátku předložené práce. Poděkování Zde se uvádí především titul, číslo a zdroj finančních prostředků poskytnutých k provádění publikované práce a dále poděkování těm spolupracovníkům, kteří svým úsilím jakkoliv významně přispěli k realizaci publikované práce.

121


44(4) – 2008

Literatura Všechny publikace citované v textu příspěvku musí být zahrnuty do seznamu použité literatury. Velikost písma u seznamu literatury je 10. První řádek každého literárního odkazu je předsazen o 1 cm. Literární odkazy v textu musí obsahovat jméno autora a rok vydání, podle vzoru: (Al-Sabti, 1986); … jak uvádí Linhart (1991) … Práce kolektivu tří a více autorů budou v textu citovány podle vzoru: (Kouřil a kol., 1988); … podle Streisingera a kol. (1984)… V těchto případech však budou u příslušného příspěvku v seznamu literatury uvedeni všichni spoluautoři. Seznam literatury bude sestaven abecedně podle jmen autorů a chronologicky u jednotlivých autorů podle pořadí: 1) chronologický seznam publikací autora, 2) chronologický seznam publikací téhož autora s jedním spoluautorem, 3) chronologický seznam publikací téhož autora s více než jedním spoluautorem. Více prací jednoho autora v témž roce bude odlišeno písmenem (např. 1989a, 1989b, atd.). Publikace budou v seznamu literatury uvedeny podle vzoru: Publikace v periodikách: Svobodová, Z., Vykusová, B., Máchová, J., Bastl, J., Hrbková, M., Svobodník, J., 1993. Monitoring cizorodých látek v rybách z řeky Jizery v lokalitě Otradovice. Bull. VÚRH Vodňany, 29(1): 2842. Publikace z konferencí ve sbornících a zvláštních vydáních periodik: Flajšhans, M., Ráb, P., Kálal, L., 1993. Genetics of salmonids in Czechoslovakia: Current status of knowledge. In: J.G. Cloud and G.H. Thorgaard (Editors), Genetic Conservation of Salmonid Fishes. Proceedings of NATO.ASI, June 24 – July 5 1991 at Moskow, ID and Pullman, WA, U.S.A. Plenum Press, New York: pp. 231-242. Knižní publikace: Bartík, M. and Piskač, A. (Editors), 1981. Veterinary toxicology. Developments in Animal and Veterinary Sciences, 7. Elsevier, Amsterdam, 346 pp. Další zdroje publikací: Citace nepublikovaných příspěvků se neuvádějí. Informace v dopise se uvádí zkratkou (in litt.), osobní sdělení zkratkou a časovým údajem, tj. rokem (Fuka, os. sděl., 1993); podle Fuky (os. sděl., 1993). Při nedostupnosti původního zdroje se citace uvádějí formou: Meske, 1983 (ex Hamáčková a kol., 1993). Příspěvky, které nesplňují požadavky dle pokynů pro autory, budou před posouzením a vlastním lektorováním vráceny zpět k přepracování.

BULLETIN VÚRH VODŇANY č. 4/2008 – Vychází čtvrtletně jako účelový tisk Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích Výzkumného ústavu rybářského a hydrobiologického ve Vodňanech - © - JU VÚRH Vodňany 389 25 Vodňany – Registr. č. MK ČR E 12997. IČO 600 76 658. Šéfredaktor: Ing. T. Policar, Ph.D. – Redakční rada Bulletinu VÚRH Vodňany: Ing. T. Policar, Ph.D., doc. Ing. M. Flajšhans, Dr.rer.agr., prof. Ing. O. Linhart, DrSc., Ing. P. Kozák, Ph.D., Ing. T. Randák, Ph.D., Z. Dvořáková, prof. MVDr. Z. Svobodová, DrSc., doc. Dr. Ing. J. Mareš, prof. A. Ciereszko, Ph.D., Mgr. R. Grabic, Ph.D., A. Viveiros, Ph.D., Dr. V. P. Fedotov, Dr. G. J. Martín Tisk: PTS Vodňany, s.r.o. Toto číslo bylo předáno do tisku: 21. 1. 2009

122

BULLETIN VÚRH VODŇ ANY

Recommend Documents