Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Írta:

NÉMETH ÁRON Lektorálta:

REZESSYNÉ SZABÓ JUDIT

IPARI MIKROBIOLÓGIA Egyetemi tananyag

2011

COPYRIGHT: 2011-2016, Dr. Németh Áron, BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék LEKTORÁLTA: Dr. Rezessyné Szabó Judit, Budapesti Corvinus Egyetem Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. TÁMOGATÁS: Készült a TÁMOP-4.1.2-08/2/A/KMR-2009-0028 számú, „Multidiszciplináris, modulrendszerű, digitális tananyagfejlesztés a vegyészmérnöki, biomérnöki és vegyész alapképzésben” című projekt keretében.

KÉSZÜLT: a Typotex Kiadó gondozásában FELELŐS VEZETŐ: Votisky Zsuzsa AZ ELEKTRONIKUS KIADÁST ELŐKÉSZÍTETTE: Benkő Márta ISBN 978-963-279-478-5 KULCSSZAVAK: biotechnológia, ipari mikrobiológia, alkalmazott mikrobiológia, mikrobiológiai műveletek, mikrobiális anyagcsere, mikrobiális rendszertan, ipari baktériumok, ipari gombák, ipari algák, kevert tenyészetek alkalmazása. ÖSSZEFOGLALÁS: Az elmúlt években vitathatatlan biotechnológiai fejlődésnek voltunk és vagyunk tanúi, amely fejlesztések során mindig feltűnnek a mikroorganizmusok, akár mint termelő biokatalizátorok, akár mint termékek, vagy egyre gyakrabban mint gén/enzim források. Ennek köszönhetően a biotechnológiai/biomérnöki képzésben az Általános mikrobiológiát egy specifikus Ipari mikrobiológia követi, amelynek célja rendszerezetten összefoglalni a mikrobák nyújtotta lehetőségeket, potenciálokat, illetve az ezek kiaknázásához szükséges alapismereteket. Ezt szem előtt tartva a jegyzet először a bevezetés után a mikroorganizmusokkal és kezelésükkel kapcsolatos műveleteket és alapismerteket (fiziológiai, biokémiai) tekinti át, majd pedig a mikrobiális rendszertant követve – abból kiemelve az ipari vonatkozású törzseket – bemutatja a mikrobákban rejlő ipari lehetőségeket, és utal a már működő technológiákra.

Tartalom

3

TARTALOM ALAPISMERETEK, IPARI MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZEREK ................................................ 5 1.1. Bevezetés az ipari mikrobiológiába ............................................................................................. 5 Vörös biotechnológia .................................................................................................................. 5 Fehér biotechnológia ................................................................................................................... 6 Zöld biotechnológia .................................................................................................................... 6 Esettanulmány 1. – Lizingyártás ................................................................................................ 7 Esettanulmány 2. – 1,3-propándiolgyártás .................................................................................. 9 1.2. (Ipari) Mikrobiológiai műveletek ............................................................................................... 14 Törzsizolálás ............................................................................................................................. 14 Törzsfenntartás .......................................................................................................................... 20 Törzs-screening ......................................................................................................................... 21 Identifikáció .............................................................................................................................. 25 Törzsfejlesztés........................................................................................................................... 26 1.3. Mikroorganizmusok ipari alkalmazása ...................................................................................... 31 Az oxigén szerepe ..................................................................................................................... 31 Aerobok tenyésztése ................................................................................................................. 32 Anaerob fermentációk (erjesztések) .......................................................................................... 32 Szubmerz kontra felületi fermentáció ....................................................................................... 37 2. AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA BIOKÉMIAI ÉS FIZIOLÓGIAI HÁTTERE ............................. 40 2.1. Szénforrások hasznosulása, különleges metabolizmusok .......................................................... 40 C1-források hasznosulása ........................................................................................................ 40 C2-metabolizmus ...................................................................................................................... 41 C3-metabolizmus ...................................................................................................................... 42 C4-metabolizmus ...................................................................................................................... 43 C5-metabolizmus ...................................................................................................................... 43 C6-metabolizmus ...................................................................................................................... 44 C7-metabolizmus ...................................................................................................................... 44 Speciális energianyerő metabolizmusok (biometallurgy) ......................................................... 44 2.2. Primer metabolitok ..................................................................................................................... 46 2.3. Szekunder metabolitok ............................................................................................................... 46 De novo szekundermetabolit-termelés ...................................................................................... 46 Szteroid- (szekunder metabolit) konverzió ............................................................................... 50 3. AZ IPARI MIKROORGANIZMUSOK ÉS TECHNOLÓGIÁK TÁRGYALÁSA TÖRZSRENDSZERTANBA ILLESZTVE .................................................................................. 57 3.1. Mikrobiális rendszertan .............................................................................................................. 57 Klasszikus rendszertan .............................................................................................................. 58 Filogenetikus rendszertan ......................................................................................................... 58 Bakteriális filogentika .............................................................................................................. 59 A baktériumok törzsének elágazási sorrendje ........................................................................... 60 Az indelmodell megbízhatósága és prediktív lehetőségei ........................................................ 61 3.2. Ipari szempontból fontos (ős)baktériumok ................................................................................. 65 1. Archeák ................................................................................................................................. 65 2. Firmicutes ............................................................................................................................. 68 3. Actinobacterek ...................................................................................................................... 72 4. Thermotoga ........................................................................................................................... 79 5. Fusobacteriumok ................................................................................................................... 80 6.-7. Deinococcus-Thermus ...................................................................................................... 80 8. Chloroflexi ............................................................................................................................ 81 9. Cyanobacterek ....................................................................................................................... 81 10. Spirohaeták ......................................................................................................................... 82 11., 12,. 13. Chlorobik, Fibrobacterek, Bacteroidesek .............................................................. 82 1.

© Németh Áron, BME

© www.tankonyvtar.hu

4

1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek

14., 15., 16. Planctomyceta-k, Verrucomicrobiumok, Chlamydiák .......................................... 83 17. Aquificae ............................................................................................................................. 83 18., 19., 20., 21., 22. Proteobacterek ......................................................................................... 84 3.3. Ipari szempontból fontos gombák .............................................................................................. 95 Basidomycotak .......................................................................................................................... 97 Ascomycotak............................................................................................................................. 99 Zygomycotak .......................................................................................................................... 100 3.4. Iparilag jelentős algák .............................................................................................................. 101 3.5. Vegyes tenyészetek alkalmazása .............................................................................................. 102 3.6. A vakcinagyártás mikrobiológiája ........................................................................................... 103 4. A MIKROORGANIZMUSOK IPARI FELHASZNÁLÁSÁNAK ETIKAI ÉS KOCKÁZATI KÉRDÉSEI .................................................................................................................................. 106 5. KITEKINTÉS .............................................................................................................................. 109 6. SZÓSZEDET ............................................................................................................................... 110 7. ÖNELLENŐRZŐ KÉRDÉSEK AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA CÍMŰ JEGYZETHEZ ............ 118 Tesztmegoldó kulcs ......................................................................................................................... 128 8. HIVATKOZÁSOK ...................................................................................................................... 129 ÁBRÁK, ANIMÁCIÓK, VIDEÓK, TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE ................................................... 138 Ábrák, animációk, videók ............................................................................................................... 138 Táblázatok ....................................................................................................................................... 139




1.

5

ALAPISMERETEK, IPARI MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZEREK

1.1. Bevezetés az ipari mikrobiológiába Az 1990-es években sok olyan jóslat látott napvilágot, melyek szerint a XXI. sz. a biotechnológiai forradalmat követően a biotársadalommal lesz jellemezhető. Valóban, az utóbbi évtizedek mikrobiológiai, biokémiai, genetikai, molekuláris biológiai és biotechnológiai fejlesztései lassan a hétköznapi emberhez is ilyen vagy olyan formában eljutnak, és különösen a környezetvédelmen keresztül szélesebb társadalmi csoportokban is érezhetővé válnak. A biotechnológiát – amely tehát a „Biotársadalom” meghatározó része – sokféleképpen definiálták már. Talán a legegyszerűbb úgy megadni, mint egy olyan fogalom, amely a biológiai rendszerek emberi célú (gyakran termelés orientált) felhasználását jelenti. Annak bemutatására, hogy az utóbbi évtizedekben mekkorára duzzadtak a biotechnológia kutatási és alkalmazási területei az 1.1.1. táblázatban került összefoglalásra a különböző szakterületeket jelző színkódrendszer. 1.1.1. táblázat: Színkódrendszer a Biotechnológiai területek jelölésére Szín Vörös Fehér Zöld Kék Barna Fekete Bíbor Sárga Arany Szürke

Biotechnológiai kutatási és alkalmazási terület Egészségügyi, orvosi, diagnosztikai biotechnológia Ipari biotechnológia Mezőgazdasági, környezetvédelmi biotechnológia Vízparti és tengeri biotechnológia Száraz, sivatagi biotechnológia Bioterror, biológiai fegyverek Biotechnológiai találmányok, szabadalmak Élelmiszer- és táplálkozástani biotechnológia Bioinformatika, nanotechnológia Klasszikus fermentáció és Bioprocess

Noha az egyes színek használata még nem széleskörűen elterjedt, és olykor diszkrepanciával terhelt, a táblázatban szereplő első három területet már szinte egy évtizede e három színkóddal jelölik, ezért ezeket hasonlítjuk össze az alábbiakban az ágazatot jellemző termékek, mikrobiológiai, biokémiai és technológiai igények szempontjából. Vörös biotechnológia Mivel a vörös biotechnológia termékeit az egészségügyben gyógyászati célokra használják (diagnosztikumok, vakcinák, gyógyszerek), ezért termékoldalról „kis mennyiség – nagy érték” (low volume – high value) jellemzi őket. Ez azt jelenti, hogy az éves világtermelés termékenként néhány száz tonna, amelyek ára viszont igen magas (penicillin: 10-12 $/kg, vakcinák: 20-30 $/dózis). A vörös biotechnológiai termékek előállításakor – legyenek azok (rekombionáns) fehérjék vagy biokonverzióval nyert másodlagos anyagcseretermékek (ld. később) – enzimeket vagy nyugvó-, illetve aktívan szaporodó tenyészeteket használnak. Biokémiai szempontból a termelő törzsekkel szemben támasztott követelmény, hogy jó hozammal, kevés szennyező melléktermék kíséretében termeljék a célterméket. Ezt gyakran törzsfejlesztéssel érik el, illetve a termelő mikroorganizmussal szemben támasztott másik mikrobiológiai elvárás gyakran a jó expressziós képesség (megfelelő fehérjeszerkezet kialakítása mind a 4 szinten1, lehetőleg extracellulárisan). Technológiai oldalról talán a legmeghatározóbb a minőségFehérjeszerkezet 4 szintje: Elsődleges szerkezet: aminosavsorrend; másodlagos sz.: hosszabb szakaszok térrendeződése a-hélix vagy b-redő formába; harmadlagos szerkezet: 3D „feltekeredés”, amelyet másodlagos kötések stabilizálnak; negyedleges: alegységek kapcsolódási szerkezete (pl.: 222) 1



6

Ipari mikrobiológia

biztosítás, amelynek szinte mindent alárendelnek, és amely a költségeket is jelentősen befolyásolja (=mindig ugyanolyan kiváló minőség). Fehér biotechnológia A fehér biotechnológia célja a „vegyipar kifehérítése”, azaz környezetkímélőbbé tétele. Ez céljaiban hasonló a széleskörűen használt „zöldkémia” kifejezéssel, ám míg ez utóbbi a kémiai szintézisek környezetkímélőbbé tételét kívánja elérni, addig a fehér biotechnológia a kémiai szintézisek mellett biológiai gyártásokat kíván a vegyiparban meghonosítani, mivel ezek energiaigénye és környezetterhelése általában kisebb az azonos terméket előállító vegyipari eljárásnál. A vegyipar jelenleg is fennálló struktúrája kőolajalapú, azaz ásványi olajból nyerik finomítással az elsődleges alapanyagokat, illetve az energiát is. Ennek analógiájára a fehér biotechnológia eredményeit felhasználva kb. egy évtizede terjed a biofinomító elnevezés, amely tehát olyan biokombinát, amely megújuló alapanyagból fedezi a nyersanyag- és energiaigényét is. A biofinomítókhoz szorosan kapcsolható a platformalkotó vegyület fogalma, amelyet olyan vegyületekre használunk, amelyeknek egy sor piacképes, értékes származékát konvencionális vegyipari folyamatokkal elő lehet állítani. A platformvegyületeket általában szénatomszám szerint csoportosítják, így léteznek C3-C4-C5-C6-C7 platformok. A biofinomítók gyakran biológiai úton megújuló nyersanyagból ilyen platform kemikáliát állítanak elő. A fehér biotechnológia termékeit is a vegyipari termékekhez hasonlóan – amelyek más iparágak (kozmetikai, oldószer, polimer iparok) viszonylag olcsó tömeges alapanyagaiként szolgálnak – a „nagy tömeg – kis érték” (high amount – low value) jellemzi, és általában de novo fermentációs eljárással készülnek (pl.: oldószerek 0,4-1,4 $/kg). Biokémiai szempontból az olcsó tömegtermékek miatt a jó szubsztráthasznosulás még fontosabb, illetve a megfelelő metabolikus utak aktiválása és a többi inaktiválása is csökkenti a feldolgozási (downstream) és termékkinyerési költségeket. Mikrobiológiai szempontból a termelő törzs terméktoleranciája fontos, és a törzsfejlesztésnek itt is fontos szerepe van. Technológiai aspektusból az abszolút költséghatékonyság a cél mindenekfelett (olcsó up/downstream). A kis termelői és kereskedelmi árrés miatt a hatékony technológia mellett nagy mennyiségek előállítása, azaz nagy termelőkapacitások szükségesek minimális műveleti lépés mellett. Zöld biotechnológia A zöld biotechnológiába korábban beleértették a környezetvédelmi, mezőgazdasági és élelmiszer-ipari ágazatokat, ám ezek lassan külön színkódot kapnak. Az viszont mindegyikre igaz, hogy a termékeik nagy tömegben kerülnek előállításra kicsi vagy közepes értékkel (takarmányok, étrend- kiegészítők, biopeszticidek, talajjavítók stb.). Biokémiai szempontból a speciális ízek kialakításhoz az egy termékű de novo fermentációk helyett a heterofermentatív anyagcseréjűek kedvezőbbek, illetve a speciális tápértékek kialakításához különböző anyagok (fehérjék, vitaminok) akkumulációjára képes mikrobák kerülnek felhasználásra. Olykor enzimes technológia is előfordul (izocukorgyártás). Ehhez mikrobiológiai szempontból különösen a biopeszticidek gyártásakor szükséges továbbá a haszonnövény-károkozó viszonyának, és a károkozás mechanizmusának ismerete. Technológia szempontból – különösen az élelmiszer-ipari termékeknél – a minőségbiztosítás ismét jelentős szerephez jut, amely erősen felhasználó centrikus (kedvező színű, szagú, halmazállapotú termék). A fenti BIOTECHNOLÓGIAI példákon igyekeztünk demonstrálni, hogy noha a biotechnológia mára egy sok területet átölető ágazattá vált, az egyes szakterületek közös pontja a MIKROBA, amely az egyes technológiákat és termékeket alapvetően befolyásolja. Például egy tejsav-fermentációnál az alkalmazott tápközegnek olcsónak kell lennie, de a mikroba valamennyi igényét (C, N, vitaminforrás) ki kell elégítenie úgy, hogy a feldolgozási műveletek a lehető legegyszerűbben (és legolcsóbban) nyerhessék ki a terméket. Ahhoz, hogy a biotechnológia kulcsszereplőjét, a mikrobát megismerjük, és céljainknak megfelelően a leghatékonyabban kihasználjuk, a mikrobatudománnyal, de legalább annak ipari mikrobiológiai részével kell tisztában lennünk.




7

E jegyzet célja, hogy az iparban használatos mikrobiológiai műveleteket, élettani jelenségeket, potenciálokat bemutassa. A napjainkban egyre nagyobb méretet öltő szövettenyésztési eljárások azonban nem kerülnek tárgyalásra. Amint azt a vörös/fehér/zöld biotechnológia rövid bemutatásánál láttuk, az ipari mikrobiológia 3 tudományterület között elhelyezkedő interdiszciplináris tudomány: Biokémia, Mikrobiológia, Mérnöki tudományok (1.1.1. ábra).

1.1.1. ábra: Az ipari mikrobiológia helye a tudományban Az ipari mikrobiológia tárgya tehát szükségképpen a termelő mikroorganizmusok (természetes és rekombináns törzsek, illetve kevert tenyészetek), valamint a hozzájuk kapcsolódó (mikrobiológiai) műveletek. Bevezetésként következik két esettanulmány az ipari mikrobiológia eredményeinek demonstrálására. Esettanulmány 1. – Lizingyártás [1]

O NH2

HO NH2

1.1.2. ábra: A lizin képlete A lizin egy esszenciális aminosav (1.1.2. ábra), ezért előállítása mind az állati takarmányozás, mind a humán élelmezés szempontjából fontos. A lizinpiac évi 600 000 t terméket produkál, amely évente további 5-7%-kal bővül (2005). Az előállítás első kulcslépése a fermentáció. Ezt glükóz/szaharóz- vagy melaszalapon végzik, és 30-40%-os hozammal képződik a lizin (100–150 g/L koncentrációban). A fermentációt Corynebacterium glutamicum-mal végzik, amelyet először 1956-ban izoláltak egy korabeli „új” módszer segítségével (bioautográf technika) glutaminsavtermelés céljából. A módszer lényege, hogy az izolátumokat Petri-csészében lévő agar tápközegen kinövesztik, replika módszerrel a Petri-csészéről másolatot készítenek, majd a másolaton kinőtt telepeket UV-val elölik, végül föléje egy



8


újabb agaros tápközeget rétegeznek, amelybe a keresett metabolitra hiánymutáns mikrobát szuszpendálnak, és újra inkubálják. Ennek következtében az elölt izolátumok már nem, a hiánymutánsok pedig csak ott fognak kinőni a 2. agar felszínén, ahol az alsó agaron kinövesztett izolátum a hiányzó metabolitot termelte (1.1.3. animáció) [2]. Számos izolátum vizsgálatából kiderült, hogy a glutaminsav-termelők lizintermelésre is alkalmasak, mert mindkét aminosav a citrátkör (TCA ciklus) intermedieréből eredeztethető (1.1.4. ábra).

1.1.3. animáció: A bioautográf módszer A mikroorganizmus által szénforrásként elfogyasztott cukrok a glikolízisen keresztül bomlanak le piroszőlősav – foszfoenolpiruvát – acetil-koenzim-A útvonalon. Az utóbbi molekula az acetilcsoportját egy oxálecetsavnak átadva citromsavat hoz létre, amely két lépésben dekarboxileződik (2 széndioxid keletkezése közben) és oxálecetsav marad vissza, a következő acetil-csoport eloxidálására. A körfolyamat egyes intermedierjei azonban az aminosavfermentáció esetén beépülnek az előállítandó aminosavba, így a körfolyamat megszakadna. Ennek ellensúlyozására működnek az anaplerotikus (feltöltő) reakciók, amelyek szintén a cukrokból a piruváton át vagy akár a foszfoenolpiruvátból közvetlenül is oxálecetsavat termelnek. Az 1.1.4. ábrán az is látható, hogy a TCA-ból a lizin felé vezető metabolikus út elágazik, és homoszerinen keresztül további aminosavak (treonin, metionin, izoleucin) képződnek, csökkentve ezzel a bevitt cukrok lizinre történő hasznosulását (hozamát). Ennek okán a kezdeti (’60-as évek, 20%-os hozam [1]) törzsfejlesztések homoszerin útvonal nélküli törzsek kialakítására irányultak, amelyek előállításához a klasszikus random mutáció – szelekció ciklikus ismétléses módszerét alkalmazták. A sejtek élettani funkcióihoz azonban szükség volt azokra az aminosavakra is, amelyek a homoszerin útvonalon képződtek, így a homoszerin hiánymutáns (Hom-) törzsek termelőképessége nem az elvárt mértékben javult. Ennek kiküszöbölésére a hiányzó aminosavakat a tápközegbe kellett adagolni, ami növelte az eljárás költségeit. Ennek elkerülésére kifejlesztették a „leaky mutáns” (csepegő, áteresztő) módszert, amely olyan mutánsok szelektálását célozta meg, amelyekben nem eltűnt, hanem jelentősen lecsökkent egy útvonal kulcsenzimének aktivitása. Így a mellékútvonal csak kis anyagáramot (fluxust) „pocsékolt” el, viszont egyetlen aminosavból sem volt teljes hiánya a sejteknek. A következő, még mindig klasszikus törzsfejlesztéssel kivitelezett cél olyan regulációs mutánsok létrehozása volt, ahol a negatív visszacsatolások eliminálódtak. Például a képződött lizin az aszparagin-kináz enzimet magasabb koncentrációban már gátolja, amely így az aszparagin – lizin útvonal leállásához vezet. Mivel az ipar számára a költséghatékonyabb termelés és léfeldolgozás a cél – azaz a magas termékkoncentráció az előnyös –, az ipari fermentáció számára fontos volt, hogy az ezt akadályozó regulációs mechanizmusokat kiiktassák. A „leaky mutánsok” szabályozási (regulációs) szempontból is jelentősnek bizonyultak, mivel a csökkent fluxus kisebb koncentrációkat eredményezett a melléktermék-útvonalon, így a melléktermékek negatív feedback mechanizmusa elhanyagolhatóvá vált. A modern kori (’80-as évek) törzsfejlesztések során új módszereket vetettek be. Ezek közé tartozik a metabolikus fluxus analízis (MFA), amelyet izotópos nyomkövetéssel is alátámasztottak. Ezekkel a módszerekkel megállapítást nyert, hogy anyagáram szempontjából az anaplerotikus reakciók jelentik a szűk keresztmetszetet. Megállapították azt is, hogy a két lehetséges feltöltő mechanizmus közül a piruvátkarboxiláz enzimen keresztül vezető út felel az anaplerotikus aktivitás 90%-áért. A fenti törzsfejlesztések eredményeképpen napjainkban 150 g/L végtitert és kb. 50%-os hozamot lehet elérni a lizinfermentáció során.




9

1.1.4. ábra: Glutaminsav- és lizinmetabolizmus Esettanulmány 2. – 1,3-propándiolgyártás Az 1,3-propándiolgyártás az utóbbi két évtizedben futott fel közel 200 000 t/év mennyiségre (1.1.5. ábra). Ennek a gyors és intenzív növekedésnek az alapja a megnövekedett piaci igény. Korábban csak



10


oldószerként, kenőanyagként és fagyállóként alkalmazták, ám a ’90-es évek óta a műanyagipar használja fel legnagyobb mennyiségben a poli-trimetilén-tereftalát (PTT) előállítására. A PTT különleges szerkezettel rendelkezik a hasonló célokra hagyományosan használt polietilén-tereftaláthoz (PET) és polibutilén-tereftaláthoz (PBT) képest. (1.1.6. ábra). 250.000

PD [t/év]

200.000 150.000 100.000 50.000 0 1990

1995

2000

2005

2010

1.1.5. ábra: Az 1,3-propándiol-előállítás alakulása az utóbbi két évtizedben

1.1.6. ábra: A propándiol okozta különleges szerkezetű PTT polimer (PET: polietilén-tereftalát, PTT: poli-trimetilén-tereftalát, PBT: polibutilén-tereftalát, ET: etilén, PR: propilén, BU: butilén, TFS: tereftálsav) Az ábráról látszik, hogy a propándiollal alkotott kopolimer szerkezete különleges hajtogatással rendelkezik. Ennek oka az, hogy míg mind az etilén, mind a butilén esetében a diol OH csoportok szimmetrikusak egymáshoz képest és tökéletes cisz vagy transz helyzetűek, addig a propándiol esetében az OH csoportok hidrogénjei (amelyek helyére a ftálsav köt) egymással szöget zárnak be (1.1.7. animáció). Ez a különleges szerkezet igen előnyös tulajdonságokat kölcsönöz a PTT-nek, amelynek következtében egyre kiterjedtebben használják fel textiliák, szálak, szövetek, ecsetszőrök gyártásában.

1.1.7. animáció: 1,3-PD különleges szerkezete




11

Noha mindkét monomert napjainkig javarészt szintetikusan állítják elő kőolaj-alapanyagon (PD: akrolein hidrolízisével vagy etilénoxid hidroformilezésével), az 1,3 propándiolt fermentációs úton is előállítják, így a belőle készített műanyagok „megújulóvá” váltak (a fermentáció alapjául szolgáló cukrot növényekből nyerik). A szintetikus eljárások esetén nagy nyomást és hőmérsékletet, valamint nehézfém-katalizátorokat használnak (1.1.8. ábra), ugyanakkor a DuPont és a Tate & Lyle által közösen felépített fermentációs üzem pedig ehhez képest 30%-kal kevesebb energiát igényel és 55%-kal kevesebb üvegházhatású gázt termel az enyhébb körülményeknek köszönhetően. H2O, H+

H Degussa:

O

H

50-70°C

H2, Ni O

HO

135bar, 75-140°C

Akrolein

Shell Chemicals:

O

katalizátor

+

CO

Etilénoxid

Dupont+Tate&Lyle:

kukorica

mag

+

H2

HO OH 1,3-propándiol

100°C, 100bar

25-30°C 55-90°C glicerin keményítõ glükóz E.coli

1.1.8. ábra: az 1,3-propándiol-előállító technológiák Ipari mikrobiológiai szempontból a termelő törzset érdemes megvizsgálni. A természetben előforduló mikroorganizmusok közül a lactobacillusok, klebsiellák, citrobacterek, enterobacterek, clostridiumok [5] képesek glicerin anaerob (levegő kizárt) fermentációjával 1,3propándiolt előállítani. Amint az az 1.1.9. ábrán látható, a fenti mikrobák a glicerint egy oxidációs lépést követően (glicerin-dehidrogenáz enzim EC 1.1.1.6) a glikolízisen és a citrátkörön keresztül hasznosítják. Mind a glikolízis, mind pedig a TCA-ciklus redukált koenzimet termel (NADH2), amely aerob esetben a terminális oxidációban a légköri oxigén segítségével víz keletkezése mellett oxidálódik vissza (regenerálódik). A felsorolt mikrobák egyik része fakultatív anaerob anyagcseréjű, azaz levegő jelenlétében is és anaerob körülmények között is képes szaporodni, a másik részük pedig obligált anaerob metabolizmussal rendelkezik. 1,3-propándiol azonban kizárólag az anaerob körülmények mellett jelenik meg, mert élettani szerepe a terminális oxidáció pótlása, azaz a koenzim visszaoxidálása anaerob körülmények mellett. Mindezek alapján a következő megfontolások tehetők: 1) a természetes termelő törzsek nem alkalmasak ipari termelésre, mert A) patogének, B) sok más metabolit mellett kevés 1,3-propándiolt termelnek C) szubsztrát inhibíció vagy termékgátlás áll fent, D) csak glicerinből képesek 1,3-propándiol előállítására (a glicerin mint alapanyag csak a biodízelgyártás elterjedése és a szennyezéstűrő – metanol, sók, katalizátorok – mikrobák kifejlesztésével vált jelentőssé). 2) A biotechnológusok „háziasított” mikrobája, az Escherichia coli csak valamelyik természetes propándiol termelő törzs enzimjeinek segítségével tehető képessé a propándiol-előállításra, ám ehhez még szükséges valamilyen mikrobiális (Saccharomyces) gén és géntermék, amelyekkel a glükózból a glicerin előállítható. 3) Jól termelő törzs kifejlesztéséhez tehát ezúttal nem a klasszikus izolálás-screening-mutáció screening műveletsorral, hanem rekombináns technikával jutottak. A természetes 1,3-propándiol-termelő törzsekből 4 kulcsenzimet volt szükséges az Escherichia coli-ba átvinni: 1) gliceirn-dehidrogenáz (GDH, EC 1.1.1.6, NAD+ koenzim segítségével a glicerint 1,3© Németh Áron, BME


12


dihidroxiacetonná alakítja; 2) glicerin dehidratáz (GDHt, EC 4.2.1.30, amely B12 koenzim segítségével gyökös reakcióban vizet hasít le a glicerinről); 3) 1,3-propándiol-oxidoreduktáz (PDOR, EC 1.1.1.202, amely redukált NADH2 koenzim segítségével redukálja a vízkilépéssel kapott 3-hidroxipropionaldehidet 1,3-propándiollá (1.1.10. ábra). Ezáltal a sejten belül a glicerin diszproporciója valósul meg.

1.1.9. ábra: Az anaerob glicerin metabolizmus




H2C OH O H2C OH

DHA-foszfát Glikolízis

13

GDH

H2C OH HC OH H2C OH

DHA

Glicerin NAD+

NADH2 H2O H2C OH HC OH H2C OH Glicerin

GDHt

HC O CH2 H2C OH

PDOR

H2C OH CH2 H2C OH

HPA

PD

1.1.10. ábra: A glicerinmetabolizmus enzimei: GDH, GDHt, PDOR, (DHA: dihidroxiaceton, HPA: hidroxipropionaldehid, PD: 1,3-propándiol) A 4. kulcsenzim (ez idáig „rendszertanba” nem sorolt) a GDHt kulcsenzim reaktivációjához szükséges, mivel a GDHt minden molekula átalakítása után a B12 koenzimével komplexben marad, ahonnan ez az enzim szabadítja fel mind a koenzimet, mind a kulcsenzimet ATP energia segítségével. Ahhoz, hogy glükózalapon lehessen 1,3-propándiolt előállítani, még további 2 enzimre volt szükség: G3DH (glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz) és GPP (glicerin-3-foszfatáz). Ezekkel a génátvitelekkel már képessé tették az E.coli-t az 1,3-propándiol-termelésre, de még ipari használatra nem volt alkalmas. A gyártásba való bevonás előtt a termékinhibíció hatását ki kellett küszöbölni (terméktoleráns mutánsok), illetve a melléktermékeket (további metabolitokat) termelő útvonalakat kellett minimalizálni. Mindezek végére az elkészült törzs 160 g/L PD-t is képes előállítani, ha a B12 koenzimet adagolják (ezt nem termli az E. coli). Az 1,3-PD technológiája követhető nyomon az 1.1.11 hiperpicture-ön.

1.1.11. hyperpicture: A rekombináns PD fermentációs technológia A technológia első lépése a kis léptékű oltóanyag-előállítás 2L-es rázatott lombikban. A laboratóriumi steril 2YT tápközeget oltják be a termelő E.coli fenntartó (ld. Törzsfenntartás, ferde agaros kémcső, Petri-csészés tenyészet, liofilizált ampulla) tenyészetéről. A fermentáció 34°C-on zajlik, és egyéb C-forrás hiányában a szerves nitrogénforrások széntartalmából (tripton, élesztő) épülnek fel a kultúra sejtjei. A rázatás a keverés mellett a levegőztetést is biztosítja. Mintegy 10h tenyészidő után kerül az oltóanyag az előkészített (tápközeggel feltöltött lesterilezett) 1500 L-es oltóreaktorba. A rekombináns technológia alkalmazásának egyik hátránya, hogy a termelő hasznos mutánsok megtartásának érdekében állandó szelekciós nyomást kell fenntartani, és ezt ez esetben is – mint általában – antibiotikum hozzáadásával oldják meg, mivel az antibiotikum-rezisztencia a heterológ génekhez van kapcsolva. Ebben a léptékben tehát már antibiotikum (Spectinomycin 250g/10m3) hozzáadásával védik a termelőképesség megmaradását, illetve tápközegnek nem egy hagyományos laboratóriumi, hanem a termelő törzsre optimált tápközeget használnak. A fermentációt



14


33-34°C-on és pH=6,8-on végzik 0,3VVM (DO=10%) levegőztetés mellett kevert levegőztetett bioreaktorban, szakaszos technikával 21h hosszan. A termelő reaktorban ugyanezen körülmények és 34%-os hozam mellett történik glükózalapon 42h hosszan az 1,3-propándiol fermentációja. A termékképzést B12 koenzim hozzáadásával (két részletben) indukálják, mivel a gazdaszervezet (E.coli) nem képes ennek szintézisére, ugyanakkor a GDHt (2. kulcsenzim) aktivitásához szükséges. A termelő reaktorban azonban a glükózt rátáplálással biztosítják, és mintegy 10g/L körüli értéken tartják. Az elkészült fermentlevet „visszasterilezés” után (75°C-os inaktiválás 45 p-en keresztül) átadják a feldolgozóüzemnek, ahol első lépésként az elölt és részben flokkulált sejtektől mikroszűréssel szabadulnak meg (termék a permeátumban található). További membrán műveletekkel (ultra-, majd nanoszűrés) és ipari kromatográfiával szabadulnak meg előbb a fehérjék nagy részétől, később valamennyi kísérő szennyező anyagtól. A fenti két példa megmutatta, hogy a klasszikus véletlenszerű mutáció-szelekció folyamat és rekombináns DNS technika miként hasznosulhat technológia szinten, illetve hogyan térülhetnek meg a mikrobiológiai törzsfejlesztésre fordított források.

1.2. (Ipari) Mikrobiológiai műveletek Minden iparban használt mikroba „őse” egy természetből szándékkal vagy véletlenül kiválasztódott (=izolált) mikroba. Az ipari termékspektrum, illetve termelési hatékonyság növelése érdekében fontos további hasznosítható metabolitok, illetve mikrobák felkutatása, valamint gyakran a korábbinál hatékonyabb termelők keresése. E folyamat három lépésből áll: kinyerés (izolálás), szűrővizsgálat (screening), azonosítás (identifikáció). E három művelet igen szorosan épül egymásra, hiszen egy fajokban dús természetes élőhelyről nagyon sok fajta mikroba tenyészthető ki, ezért a nagyobb hatékonyság érdekében az izolálást már előszűréssel kombinálják, vagyis az adott feladatnak megfelelő tulajdonságokra szelektíven történik az izolálás. Törzsizolálás A mikroorganizmusok legnagyobb számban és diverzitásban a különböző talajok felső rétegeiben fordulnak elő, de természetesen (tenger)vízből és levegőből is lehet mikrobákat izolálni. A talaj kulcsfontosságát a mikrobák izolálásában mi sem tükrözi jobban, mint hogy a törzskereséssel és fejlesztéssel foglalkozó intézmények (törzsgyűjtemények, gyógyszergyárak) gyakran őriznek talajmintákat a világ legkülönbözőbb helyeiről, és ezekről indítják az izolálást. Az izolálási technika függ attól, hogy A) célzottan, egy a szakirodalom alapján megfelelőnek vélt mikrobát találjunk, vagy B) minden potenciális mikrobát szeretnénk kinyerni, amelyek egy adott tulajdonsággal rendelkeznek. Szilárd mintából A szilárd mintából/ról történő izolálást foglalja össze az 1.2.1. ábra. A) Ha egy célmikrobát szeretnénk izolálni, akkor az első szelektív lépés lehet a minta különböző intenzitású szárítása, amelynek következtében először a vegetatív sejtek (hifák, baktériumok) pusztulnak el, aztán az egyre kitartóbb spórák is. B) Ha minden kedvező tulajdonságú (pl. enzimtermelő) mikroba potenciális kiválasztott lehet, akkor nem célszerű szárítással „frakcionálni” a talajminta mikroflóráját. A mintát tehát előszárítással vagy anélkül 1) folyékony tápközegbe juttatjuk, és hígítás után vagy anélkül szélesztjük (soil-dilution-plate method), vagy 2) Petri-csészés agarlemez felszínére szórjuk, és steril vízzel nedvesítjük, majd szétkenjük (soil-plate method), vagy 3)steril pálcával a mintafelszínéről veszünk mintát, és ezt érintkeztetjük Petri-csészés vagy folyékony tápközeggel.




15

1.2.1. ábra: Izolálás szilárd mintáról Talajmintából történő izolálást mutat be az 1.2.1. videofilm.

1.2.1. videó: Izolálás Bármelyik módon is került a minta érintkezésbe a tenyésztő tápközeggel, általában a homogenitás a cél, illetve inkubálással kinöveszteni az izolátumo(ka)t. Az izolálás során preszelekció céljából a tápközeget különböző adalékokkal egészíthetik ki. Az adalékok célja lehet a másfajtájú mikrobák elnyomása (pl. baktériumok izolálásakor gombák, penészek visszaszorítása), illetve a célmikroba iránti szelektivitást lehet így növelni (speciális szubsztrátok sók alkalmazása). A klasszikus ipari mikrobiológia során szintén talajmintából izolálták a főbb antibiotikum termelő törzseket. Mivel az antibiotikumok általában gyógyszerként kerülnek piacra, ezért az izolálástól a termék- (és profit) termelésig hosszú út vezet, amely során a tiszta tenyészet izolálását követően



16


fermentációs fejlesztéseket (tápközeg-optimálás, pH-, hőmérséklet-, cukorprofil stb. meghatározása), biológiai-, majd kémiaiaktivitás-teszteket végeznek, végül toxikológiai és klinikai vizsgálatok (3 fázisban) után kerül sor a piaci bevezetésre. Folyadékmintából A folyadék fázisú minta előnye, hogy könnyen érintkeztethető a tápoldattal, viszont általában kevesebb csírát tartalmaz, ezért első lépésként dúsításra van szükség. Ennek érdekében vagy 1) magát a mintát inkubálják, és ezt követően adják a tápoldathoz, majd az újabb inkubáció után oltják agarlemezre, vagy 2) tápoldattal együtt inkubálják, és erről oltanak szilárd táptalajra, vagy 3) steril szűrőmembránon átszűrik a mintát, és a membránt inokulumként adják a tápközeghez (oldatba vagy agarlemezre). Levegő-(gáz)mintából Ez esetben a legkisebb a csíraszám, ezért itt 1) intenzív dúsítást alkalmaznak a gáz átszűrésével vagy 2) nyitott Petri-csészés agarlemezzel „exponálnak”. Ilyenkor a nyitott és tápközeggel töltött agarlemez érintkezik a gáztérrel, és a benne lévő mikrobák inkubáció után megjelenhetnek az agaron. Az alábbiakban különböző rendszertani csoportok izolálásakor alkalmazott körülményeket mutatjuk be. 1. Fonalas baktériumok (Actinomyces-ek) izolálása Előfordulás: leggyakrabban a Streptomyces és Micromonospora fajok fordulnak elő mezőgazdasági talajokban, tavak folyók és tenger üledékeiben. Termofil fajták silókban és komposztban is megtalálhatók. Az Actinplanes fajok (antibiotikum ((teichoplanin)) termelő) avarból és talajból izolálhatóak, különlegességük, hogy aktívan mozgó spórákkal rendelkeznek, amelyek kemotaxissal keresik meg a kedvezőbb körülményeket (huminsav, KCl, kitin). Streptosporangiumok (szintén antibiotikumtermelők) száraz, alkalikus talajból izolálhatóak. Az Actinomycesek közé tartoznak a Corynebacterium-ok is (ld. Lizingyártás, illetve 3. fejezet Actinomyceták). Mintavétel: a talaj felső 4-5cm-es részéből történik, a minta tárolása ideálisan -20–30°C között lehetséges. A minta kíméletes szárításával a konkurens Gram-negatív baktériumok elölhetőek, magasabb hőmérséklet (120°C, 1h) alkalmazásával pedig minden vegetatív baktérium és gomba eliminálódik. Tápközeg: gyakran gombaölő szerekkel (cikloheximid, nystatin) akadályozzák meg az izolátum penészesedését. Az adalékolással az izolálás céljaira a kemotaxis is kiaknázható. Szelektív szénforrásként kolloid kitint vagy sók, vitaminok kíséretében huminsavat szoktak alkalmazni. Kitenyésztés: a mezofilek (Topt.:25-30°C) 7-14 nap alatt nőnek ki, a termofilek (Topt.: 45-50°C) 2-5 nap alatt. 2. Anaerobok izolálása Előfordulás: levegőtől elzárt, gyakran extrém élőhelyeken, mint például bendőben (biogáztermelő metanogének), mélytengeri üledékekben (Streptomyces griseus B12-gyártáshoz), gejzírekben, hőforrásokban (termostabil enzimek Archea baktériumokból (=”Ősbaktériumok”) Mintavétel: „Hungate” technikával, amely részletesen a www.dsmz.de weboldalon olvasható (szeptumos tenyésztő edényt injekciós fecskendőbe zárt inert gázzal öblítik át, majd szintén a tűn keresztül oltják be, illetve vesznek mintát). A szigorúan anaerob mikrobák érzékenyek a légköri oxigénre (amely reaktív peroxid gyököket okoz a sejtben), ezért a minták kezelésekor a levegő teljes kizárására kell törekedni.




17

Tápközeg: szükséges oxigéninikátor (pl.: resazurin), és gyakran redukált komponensek alkalmazása (ezek oxidálódjanak a sejtkomponensek helyett), mint például: NaSH, DiTioTreitol (DTT), cisztein stb. Kitenyésztés: Anaerob boksz gázadszorbenssel vagy „gáztér átöblítés” oxigénmentesített (oxigénmentesített) (lugol oldaton átbuborékoltatott) inert (N2) gázzal (1.2.2. ábra). A gázadszorbens működhet úgy, hogy citromsavat, mészkövet és diatóma földet kevernek össze, és nedvesítés után zárják be az anaerob tenyésztőedénybe. Ekkor a diatóma föld megköti az oxigént, a savas közegben a karbonát CO2-t bocsát ki, azaz kicserélődik a levegő oxigénje CO2-ra. Egy másik esetben az adszorbensből H2 és CO2 fejlődik, és előbbi palládiumkatalizátor mellett vízzé reagáltatja az oxigént. Az inert gázzal történő átöblítést az edény másik csonkjának megvákuumozásával is elő lehet segíteni.

1.2.2. ábra: Anaerob tenyésztőrendszerek 3. Fonalas gombák izolálása Előfordulás: heterotróf szaprofita fajaik talajban, illetve rothadó szerves anyagokon találhatók meg minden égövben. Egyes fajaik szimbionita életformában zuzmókban, illetve mikorrhizában fordulnak elő, de vannak paraziták is, amelyek a gazdanövényről, rovarról, halról, emlősről stb. izolálhatóak. Mintavétel: mivel szinte mindenhol előfordulnak, kétféle megoldás használatos: 1) „Ökológiai megközelítés”: a kívánt tulajdonságnak megfelelő élőhelyről próbálnak izolálni (pl.: termostabil gombákat hőforrásokból, vegyszerlebontókat szennyezett talajból stb.) 2) „Taxonómiai (rendszertani) megközelítés”: rokonok tulajdonságai alapján pl.: citromsavtermelő faj rokonait is be lehet vonni izolálás+screening programba jobb citromsavtermelő keresésekor. 3) „Csalétek módszer”: lebontandó anyagot párás melegbe helyezik, így az „megpenészedik”, azaz olyan fonalas gombák kolonizálják, amelyek képesek lebontani és felhasználni a „csalétket”. Előkészítés: kíméletes szárítással vagy hűtéssel (+5– -18 °C). Tápközeg: széles irodalommal rendelkeznek. Általában enyhén savanyú (pH=4,5-6), magas Cforrás- tartalmú tápközegeket használnak, amelyekben a N-forrás gyakran csak ammónia vagy nitrát, de a leggyakoribb fonalasgomba-táptalajok szerves nitrogénforrást is tartalmaznak (pl.: PDA, kukoricaliszt agar, malátakivonat stb.). Ezek a tápközegek szelektívvé vagy félszelektívvé tehetők (100-200 mg/l) antibiotikum kiegészítéssel, illetve a gyorsan kolonizáló („burjánzó”) penészek ellen adalékokkal kiegészíthetőek.



18


Fonalas gombák izolálásánál és tenyésztésénél komoly gondot okozhatnak az atkák, amelyek a gombával táplálkoznak, és keresztbe fertőzhetik a Petri-csészés kultúrákat. Inkubálás: mezofilek: 25-30°C 7–14 nap, termofilek: 45-50°C 2–5 nap A fonalas gombák különböző rendszertani egységei annyira különböznek egymástól, hogy izolálásukban is eltérhetnek: A) Ascomycetes, Deuteromycetes (Imperfekt): ubiquiterek (széles körű előfordulás), jól sporulálnak, ezért könnyű az izolálásuk (aspergillusok, penicilliumok, fusariumok). B) Basidomycetes: makroszkopikusak: (kalapos, pöffeteg, tapló) termőtestből, mikorrhizából történhet az izolálás mikroszkopikusak: (rozsda és üszöggombák ) mikorrhizából, de nehéz fenntartani, mert csak az élő gazdanövényen szaporodik. Jól tűrik a benomylt (gombaellenes növényvédőszer), ezért 0,5-5mg/l benomyl melletti izolálás esetén javarészt ezek nőnek ki, a többi gomba visszaszorul. C) Zygomycetes: ezek is ubiquiterek, és a legburjánzóbb növekedésűek. A Petri-csészén általában az első kinövők (Mucor, Rhizopus, Trichoderma) A fonalas gombák izolálásának jelentőségét széles körű felhasználásuk is indokolja (1.2.1. táblázat) 1.2.1. táblázat: Fonalas gombák ipari felhasználása Elsődleges metabolitok

Másodlagos metabolitok

Enzimek előállítása

Tradicionális élelmiszerek Egyéb

Fonalas gomba Aspergillus terreus A. niger A. niger, Yarrowia lipolytica Eremothecium ashbyii Aureobasidium pullulans Saccharomyces cerevisiae Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Aspergillus fumigatus Claviceps purpurea Penicillium sp. A. niger A. oryzae A. awamori Mucor sp. Mucor, Rhizopus kevert tenyészet Trichoderma polysporum Rhizopus, Fusarium

Termék Itakonsav glükuronsav citromsav riboflavin pullulan etanol penicillinek cefalosporinok fumagillin ergot alkaloidok griseofulvin lipáz α-amiláz glucoamylase rennin ragi shoyu ciklosporinok szteroidkonverziók

4. Élesztőgombák izolálása Előfordulás: „fermentatív” fajaik, amelyek cukrok felhasználásával nyerik a szükséges energiát, cukortartalmú gyümölcsökön, bogyókon, virágokon találhatók meg. Ezek esetében többnyire a terminális elektronakceptor nem a légköri oxigén, hanem a cukormolekula degradációs termékei (így keletkeznek az elsődleges metabolitok.) „aerob” fajaik: nehezen fermentálható C-forrásokon találhatók főleg meg, mint például C4-C5, metanol, etanol, és különböző poliolok (növényeken, gombákon, rovarokon, kevés a talajban, némely azonban csak ott). Mintavétel: steril zacskóba, üvegbe kell gyűjteni a mintát, amely nem tárolható jól. Talajminta esetén a felső 10 cm-ből célszerű az izolálást végezni. © Németh Áron, BME



19

Előkészítés: dúsítás lehet szükséges: pH=3,5-4 rázatott lombikban (levegőztetve), így előszaporítva. Tápközeg: Malátakivonat (maltextract), krumplifőzet (potatoe-dextrose-agar, PDA), de a pH 3,8 kell legyen, azaz savasabb, mint a fonalas gombákénál. 50–200 mg/l kloramfenikol hozzáadásával baktériummentes izolátum nyerhető. Általában ozmotoleránsok, azaz 3040% glükóz mellett is tenyészthetők Inkubálás: mezofileket 20-25°C-on, a pszichrofileket 10-12°C-on szüksées tenyészteni. A következő két csoport rendszertantól független, ezért egyaránt tartalmaz baktériumokat, gombákat stb-t. 5.

Alkalofilek izolálása

Az alkalofilek lúgos pH optimumú mikrobák, jelentőségük az antibiotikumok, mosószerenzimek gyártásában van. Előfordulás: alkalikus (szikes) talajok Mintavétel: szilárd mintából/ról Előkészítés: vizes szuszpenzió Tápközeg: glükóz vagy keményítő, peptonnal élesztőkivonattal, sókkal kiegészítve, pH=8,5-12 Kitenyésztés: általában mezofilek, így 30-37°C-on 2-3 nap alatt érhető el. 6. Termofilek izolálása A termofilek magas hőmérsékleti optimummal (55-75°C) rendelkező mikrobák. A termofilhőmérséklet-optimum a mezofil és az extrém termofil között helyezkedik el, és különbözik a termotoleráns fogalomtól: míg előbbieknél az optimális növekedési hőmérséklet alapján történt a besorolás, addig a termotoleráns csak elviseli (esetleg növekszik is) a magasabb hőmérsékleten, de messze nem maximális sebességgel szaporodik és termel. A termofilek között baktériumok, gombák és ősbaktériumok is megtalálhatók, mint ipari termelő vagy enzim-, illetve génforrás mikroorganizmusok: -

-

fonalas gombák: mivel 55-60°C között számos gomba izolálható, de 62°C-on már egy sem, úgy tűnik, hogy az eukarióták növekedésének 60°C körül korlátja van, amelynek oka feltehetően, hogy nem tudnak termostabil jól funkcionáló belső membránokat létrehozni [166]. Termofil fonalas gombára példa a Thermomyces lanuginosus (50°C optimummal [167]), a Sporotrichum thermophile (45-50°C [168]), és a Rhizomucor miehei (35-45°C [169]). baktériumok: thiobacillusok (acidophilek), bíborbakt: (fotoszint), cianobakt, actinomiceták. továbbá algák, protozoák, ősbaktériumok

Előfordulás: geotermikus hőforrások (gejzírek), spontán melegedő szubsztrátok (siló), fűtött környezet (erőművi hűtővíz), talaj, édesvízi és tengeri üledékek (1.2.2. táblázat) Mintavétel: gyakran obligát anaerobok (pl.: Thermotoga maritima), hiszen vagy az élőhelyük levegőtől elzárt, vagy a magas hőmérsékleten nem oldódik be az oxigén a vizes közegbe, ezért a mintavételhez Hungate-technika (ld. Anaerobok izolálása) javasolt. Előkészítés: párologtató szükséges, hogy ne száradjon ki a tenyészet a magas hőmérsékleten Tápközeg: komplex tápközeg ajánlott, amelynek összetétele az eredeti élőhelynek megfelelő (mélytengeri, vulkanikus stb.). A szokásos szilárdító ágens (agar-agar) legfeljebb 65°C-ig használható, efelett gellán gumi (100°C) vagy gelrite (+Ca2+ és Mg2+ sók) használata javasolt a magasabb olvadáspont miatt. Inkubálás: párologtató, esetleg anaerob kamra lehet szükséges.



20


1.2.2. táblázat: Termofil mikroorganizmusok lelőhelyei Lelőhely Geotermikus hőforrások (savas-semleges-alkalikus)

Spontán melegedő szubsztrátok (silók, komposztok)

További fűtött környezetek (erőművi hűtővíz, konzervek stb.) Nem fűtött szubsztrátok (talaj, por, levegő, üledék)

faj Thermoproteus spp. Thiobacillus spp. Clostridium spp. Thermoanaerobium spp. Thermus spp. Bacillus spp. Thermotoga spp. Bacillus spp. Thermoactinomyces spp. Streptomyces spp. Thermomyces spp Talaromyces spp. Thermoascus spp. Clostridium spp. Thermomonospora spp. Thermus spp. Dactilarya spp. Methanospirillium spp. Methanogenium spp. Thiobacillus spp. Bacillus spp. Lactobacillus spp. Clostridium spp.

baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok ősbaktériumok baktérium baktérium fonalas baktériumok fonalas gomba fonalas gomba fonalas gomba baktérium baktérium baktérium fonalas gomba ősbaktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok

Törzsfenntartás A természetből izolált és/vagy mutációkkal nyert színtenyészetek fenntartása szintén kiemelkedő fontosságú területe az ipari mikrobiológiának. Gondoljuk csak meg, hogy egy működő üzemnél, ahol lehetőleg saját izolálású vagy fejlesztésű termelő mikrobát alkalmaznak, micsoda következménye lenne a termelő törzs elvesztésének, tönkremenetelének. Ennek szem előtt tartásával tehát a törzsfenntartás célja, hogy eredeti állapotában, azaz ugyanolyan szaporodó és termelőképességű formában tartsa fenn a termelő törzset az üzem indításától a bezárásáig, kedvező esetben akár évtizedekig (persze közben mindig kicsit újabb és újabb fejlesztésű sejtvonalat használnak, de a törzs általában azonos marad). Az izolátumok eltartására kétféle mód létezik: A) inaktív, és B) aktív formában. Az aktív formában történő törzsfenntartást mutatja be az 1.2.3. videó.

1.2.3. videó: Törzsfenntartás aktív formában Az inaktív forma jelenti a természetes szaporítóképletek (pl.: spórák) eltartását különböző megoldások segítségével (folyadékszuszpenzióban, szilárd hordozóra adszorbeáltatva, micéliummal együtt megszárítva stb.). Az aktív forma jelenti a nagyobb kihívást, hiszen ilyenkor a vegetatív sejtek fenntartásáról beszélünk, amelyek érzékenyek a környezeti hatásokra, és bár lassan, de szaporodnak, ami pedig a genetikai változás (mutációk) veszélyét is magában hordozza. A vegetatív sejtek legjobban eltartható




21

aktív formája a liofilezést (fagyasztva szárítást) követően kapott sejtpor. Az eljárás lényege, hogy kíméletes fagyasztást követően a tápközegből és a sejtekből egyre nagyobb vákuum alkalmazásával elszublimáltatják a jeget, és végül csak a szárazanyag-tartalomnak megfelelő por marad vissza. A kíméletes fagyasztás következtében azonban a sejtmembrán nem sérül, így steril folyadék (víz, fiziológiás sóoldat, puffer vagy tápközeg) hozzáadásával a sejtek rehidratálhatóak, és ismét tenyészhetőek. Ezt az eljárást hosszabb távú (évtizedes) tárolás esetén alkalmazzák, például a törzsgyűjteményekben, így az onnan beszerzett mikrobák rendszerint ilyen formában kerülnek a megrendelőhöz. A mindennapi használat során azonban aktívan növő tenyészeteket használnak, amelyek szaporodási sebessége a hűtőszekrény 6-10°C-os környezetében rendkívül lelassul, így általában kb. 1 hónapig eltarthatók túlöregedés nélkül. Ehhez Petri-csészébe öntött, megszilárdított (pl.: agaros) tápközeget lehet alkalmazni, vagy helytakarékosság okán, illetve anaerob esetekben kémcsőben és esetenként ferdén szilárdított tápközegen történik az eltartás. Az anaerob esetekben a tenyészet fölé paraffinolaj rétegezése is bevett szokás, illetve gyakran a szokásos agarfelszínre oltás helyett oltótűvel szúrt tenyészeteket hoznak létre (1.2.4. ábra).

1.2.4. ábra: Ferdeagaros, anaerob és szúrt tenyészetek, Petri-csészék és oltókacsok Az ilyen formában tárolt tenyészetekről való átoltással egyrészt a termelő fermentációk inokulumai kerülnek beoltásra, másrészt az öregedés ellen is a tárolt tenyészetet át kell időről időre oltani. Az átoltást steril fülke alatt vörös izzásig leégetett steril oltókaccsal végzik autoklávban (vagy egyéb módon) sterilezett tápközegre. Az átoltás után inkubálni kell a tenyészetet, amíg megjelennek a telepek és/vagy a csíkozott tenyészetek, majd ezt követően kerülnek vissza a hűtőszekrénybe újabb 1 hónapos fenntartásra, vagy esetleg időközben fermentáció indításához való felhasználásra. Törzs-screening Az előbbiekben bemutatott mikrobaizolálási eljárásokkal különböző fajtájú, képességű, eredetű és tulajdonságú mikrobák tucatjaira tehetünk szert létrehozva egy törzsgyűjteményt. Amikor azonban ezek között keresünk egy adott tulajdonsággal rendelkezőt, akkor ezt a több tucat mikrobát kell szűrővizsgálat alá vetni. Az ilyen vizsgálatok jellemzője, hogy adott tulajdonságot keres, lehetőleg gyorsan, több száz minta analízisén keresztül. Az ipari mikrobiológiában a szűrővizsgálatot jobb termelőképességű egyedek keresésére is használják, ilyenkor tehát nemcsak a kvalitatív szűrővizsgálatot, hanem a kvantitatívot is el kell végezni, azaz nem elég kiválogatni a termelő- képes mikrobákat, hanem a legjobb termelőképességűeket kell kiválasztani (a legnagyobb hozamút, produktivitásút, végtiterűt. A szűrővizsgálat tehát nagyfokú automatizáltságot kívánna meg, mivel nagyszámú mintát lehetőleg gyorsan és – kvantitatív esetben – pontosan kell elemezni. Ugyanakkor minden feladat más természetű, más indikációjú, tehát nem lehet rutinfeladatként végrehajtani. A szűrővizsgálatok első lépcsőjében (általános vizsgálat nem optimált körülmények mellett) még minden potenciális jelöltet ki kell szelektálni, a bizonytalanokat is, amelyek a későbbi lépcsőkön esetleg elvéreznek, de az is lehet, hogy optimált körülmények között azok lesznek a legjobb termelők. Ezért szükséges az automatizált szűrővizsgálatok manuális felügyelete, esetleg felülbírálata is.



22


A nagy hatékonyságú és kapacitású analitikával ellátott szűrőrendszereket HTS-nek (High Throughput System) nevezzük. A szűrővizsgálati módszer nagyban függ attól, hogy milyen céltulajdonságot keresünk (pl.: 1. adott enzimtermelő mikrobát, 2. primermetabolit-termelőt, 3. valamely szekunder metabolitot termelő mikrobát). A klasszikus szűrővizsgálatok során enzimtermelő mikrobák keresésekor alapvetően az enzimaktivitás-méréssel (assay) azonosítják a termelőket, illetve szelektív tápközeggel segítik ezek izolálását is. A primermetabolit-termelőket klasszikusan szelektív tápközegen vizsgálják, és valamilyen nagy kapacitású és hatékonyságú analitikai módszerrel (GC, HPLC) követik nyomon a metabolitok keletkezését. Ugyanez igaz a klasszikus szekunder metabolitot termelők screeningjére is, azzal kiegészítve, hogy esetükben további analitikai vizsgálatokat is végeznek, mint például a biológiai aktivitás és MIC- (minimal inhibitory concentration) meghatározás. A modern eljárások a screening vizsgálatokat miniatürizálták, és egy kb. 10x16cm-es műanyag lap 96 furatában párhuzamosan végezhetővé tették. Ehhez szükséges, hogy valamilyen indikációja legyen a pozitív eredménynek (pl.: színreakció), amelyet egy plate-reader (lemezleolvasó) fotométerrel és a hozzákapcsolt megfelelő szoftverrel lehet kiértékelni (1.2.5. ábra).

1.2.5. ábra: Microplate reader – HTS szűrővizsgálathoz Klasszikus módszerek a szűrővizsgálatokhoz A) Enzimtermelők szűrése Proteázok termeléséhez a proteolitikus aktivitás indikációja szükséges, ezért a táptalajba kicsapott fehérjét kevernek. A pozitiv eredményt a telep körül megjelenő tisztulási zóna adja, mivel a kicsapott turbid fehérjét feloldja a proteáz termelő izolátum.




23

A keményítőbontó amiláztermelő mikrobák izolálása hasonló elven történik, de a kicsapott fehérjék helyett vízben nem oldodó (=emiatt turbid) keményítőt alkalmaznak, és az amiláztermelő mikrobák ezt oldják fel szintén tisztulási zónát eredményezve a telep körül. Az ipari szempontból érdekes további két enzim (celluláz és lipáz) esetében is ugyanezt az elvet alkalmazzák, előbbi esetében cellulózrostok, utóbbi esetében olaj emulzió „feloldása” eredményezi a tisztulási zónát a pozitív telepek körül. A legnagyobb enzimgyártók egyike a Novo, amelyik az 1970-es években mosószerenzimek előállítása céljából keresett termostabil alkalikus proteázokat. Ennek okán az alkalikus talajmintákat kíméletesen megszárították, így a vegetatív sejteket elölték, csak a spórás mikrobák maradtak izolálhatóak. Az ezután kinövő telepeket pH=9-10-re állított, kicsapott haemoglobint tartalmazó agarra vitték, és 45-50°C-on inkubálták. A kinőtt telepek közül a kioltási (tisztulási) zónával rendelkezőket tovább vizsgálták. Mivel a lombikos fermentációk során kapott proteolitikus aktivitás nem korrelált a tisztulási zóna méretével, a kisebb zónájú telepeket is érdemes volt tovább vizsgálni. B) Primermetabolit-termelők keresése Az elsődleges anyagcseretermékeket hatékonyan előállító mikrobák izolálásakor két módszert használnak. Az egyik (ld. bioautográf módszer 1.1.3. animáció) szerint a keresett metabolitra hiánymutáns mikrobát hoznak először létre random mutagenezissel, majd ezt szuszpendálják a táptalajba. Az izolátumok ráoltása után inkubálják, majd az izolátumokat UV-val elölik, és újabb inkubáció következik a hiánymutánsok tenyésztésére. Ezek csak ott tudnak kinőni, ahol az izolátum a hiányzó keresett metabolitot előzőleg megtermelte, így itt nem tisztulási zónát, hanem új telepet kerestek. Ennek a módszernek egyszerűbb formája, ha létezik olyan természetes törzs, amely a keresett metabolitot tovább hasznosítani tudja, így nem kell hiánymutánst létrehozni. Erre példa a tejsavtermelők keresésekor propionsav baktériumok használata (ld. 2.1. C3 metabolizmus). A másik módszer a szerves savak nem specifikus indikációjára alkalmas. Ebben az esetben mészkőport (CaCO3) kevernek a táptalajba, amelyet a képződött szerves savak feloldanak ismét tisztulási zónát eredményezve. C) Szekundermetabolit-termelők keresése A fermentációs ipar történetének legtöbb szekunder metabolitja az antibiotikumok közé tartozik. Az ezek előállításhoz szükséges termelő mikrobák keresésekor a táptalajba a szenzitív mikrobát szuszpendálták, amely ellen hatékony antibiotikumot kerestek. Az antibiotikum termelő izolátumok körül kioltási zónát lehet tapasztalni. Az antibiotikumok detekátlására agarkorongos módszert szoktak használni, amely módszert szintén lehet screening célra adaptálni. Az agarkorongos módszer során egy steril papírkorongot átitatnak az antibiotikummal, és olyan táptalajra helyezik, amelybe a szenzitív mikrobát előre szuszpendálták, és ismét kioltási zónát vizsgálnak inkubáció után. Modern HTS szűrővizsgálatok A) Enzimtermelők szűrése megoldható kapcsolt enzimes reakcióval, ahol a kapcsolt reakció szubsztrátja vagy koenzime (pl.: NAD+/NADH2 340nm-en mérhető) nyomon követhető fotometriásan. Hasonlóan optikailag követhető a kromogén vagy fluorogén szubsztát vagy szubsztrát analógok használata a célenzimet termelő mikrobák esetében. Ilyenkor a fent bemutatott készülékben (1.2.5. ábra) nagyszámú izoltáumot lehet nyomon követni speciális lemezeken (plate), amelyek furataiba a kromogén/fluorogén szubsztrátot/szubsztrátanalógot előre adszorbeáltatják, így a pozitív választ adó izoltáumokat a platereader (lemezolvasó) készülék azonosítani tudja. B) Esetenként kromogén/fluorogén szenzorokat alkalmaznak az előbbihez hasonló reakciók kimutatására mikrotiterlemez-olvasó készülék helyett.



24


C) Szintén a modern módszerek közé tartozik a „microarray” technika. Ehhez fejlett bioinformatikai adatbázisra van szükség, mivel a módszer elve, hogy a keresett tulajdonságot kódoló gén klompenter DNS-ét kromogén/fluorogén jelzéssel ellátva adszorbeáltatják egy mikrolemezre („DNS chip”), és az izolátumokkal együtt inkubálják. Ezt követően a nem kötődött, jelzett DNS-t eltávolítják, és a kötött DNS-eket detektálják (pozitív izolátumok esete). D) Gyakran nincs lehetőség a keresett tulajdonság azonnali in-situ indikációjára az inkubációval paralell, ilyenkor a HTS rendszerek csak a nagyszámú kis térfogatú minta tenyésztésére használhatók, és a tenyésztés végén online vagy off line analitika (GC, HPLC, MS, infraspektroszkópia, NMR stb.) szükséges. Az alábbiakban néhány ipari példát mutatunk be termelő törzs szűrővizsgálatban történt szelekciójára. 1.

Antibiotikum-termelők szűrésére bevált módszer, hogy a potenciális termelőtörzzsel egy agarlemez kb. 1/3-ad nagyságú körszeletét oltják be, és az inkubáció során a biomasszaképződés mellett az esetlegesen termelt antibiotikum az agar be nem oltott részei felé is diffundál. Az első inkubációt követően tesztorganizmusokat oltanak a be nem oltott 2/3-adra, és ismét inkubálják az agarlemezeket. A tesztorganizmus(ok) növekedéséből megállapítható, hogy volt-e és milyen mértékű antibiotikum-termelés (több antibiotikum messzebbre diffundál, rövidebb teszttelep 1.2.6. ábra).

1.2.6. ábra: Antibiotikum-termelők szűrővizsgálati tesztje 2.

Egy japán gyógyszergyárban új enzimtermelő mikrobát kerestek szűrővizsgálattal. A cél a 7aminocephalosporánsav (7-ACA) oldallánc-módosításával félszintetikus cephalosporinszármazékok előállítása volt, amihez 7-ACA-deacetiláz enzimre volt szükség. A 7-ACADA enzimtermelők kiválogatása érdekében a táptalajba 7-ACA-t adtak egyedüli szénforrásként, így csak az ennek hasítására képes mikrobák szaporodhattak el. A vizsgált különböző fajok közül a Rhodotorula glutinis élesztő került ki „győztesen” a feladatra.

3.

Enziminhibítorok keresésére sikerrel alkalmazták a mikrotiter módszert, amelynek feltétele valamilyen kis léptékben is alkalmazható színreakció. A β-laktamáz inhibítorok keresésekor az enzimaktivitás-csökkenést követték nyomon valamilyen színreakcióval (pl.: penicillin esetében a β-laktamáz enzimaktivitásának eredményeként keletkező penicilloinsav sztöhiometrikusan oxidálható jóddal, így a keményítő-jód kék komplexe elszíntelenedik, β-laktamáz inhibítor jelenlétében kék marad).




25

4. A gyógyszergyártás során gyakran szükséges a gyógyítás eléréséhez valamely receptor blokkolása vagy egy anyag receptorhoz kötésének megakadályozása kompetitiv receptor antagonistával. Az erre alkalamas metabolitok keresésekor általában a receptort kipreparálják és mikrotiterlemezre immbolizálják színreakcióval kombinálva. 5. Új biotranszformációkhoz szükséges mikrobák szűrővizsgálatára példa a múltból és a jelenből is [6] a compactin-pravastatin átalakítás esete. A compactin egy penicilliumok fermentációjával előállítható vegyület, amelyből szelektív hidroxilezéssel pravastatint lehet előállítani, amely a máj koleszterinszintézisét szelektíven gátolja, ezzel elősegítve a kardiovaszkuláris betegségek gyógyítását. A szűrővizsgálat során különböző szénforrások mellett 500 mg/L compactint adtak az agaros tápközeghez, és több mint 100 compactin rezisztens mikroba közül sikerült két jó hidrexilező aktivitásút kiválasztani (Pseudonocardia autotrphica, Streptomyces griseolus). 6. A szűrővizsgálatokat egyre gyakrabban alkalmazzák olyan metabolitok keresésére, amelyek az immunrendszerre hatnak (pl.: immunszupresszánsok). Ilyenkor a screening során a fehérvérsejtekkel (limfocitákkal) való reakciót vizsgálják. 7. Az agrár-biotechnológia területén rovarkárosító metabolitokra végeznek gyakran szűrővizsgálatokat. Ilyenkor a screening rendszer a célrovart vagy annak hernyóját is alkalmazza. Mikrobiológiai szűrővizsgálatokat alkalmaznak továbbá új gyomirtószerek, haszonnövénynövekedést serkentő (auxinhatású) metabolitok keresésére is tesztnövény screeningbe iktatásával. Gyakran van szükség egy ismert hatóanyag jogvédett előállításának alternatívájára is, ilyenkor szintén szűrővizsgálattal keresnek másik termelő mikroorganizmust. Végezetül meg kell említeni, hogy a törzsfejlesztés (ld. Törzsfejlesztés) során is alkalmaznak szűrővizsgálatokat az új mikrobák között a kedvezőbbek kiszűrésére. Identifikáció A mikrobiológiai azonosítás (identifikáció) célja az új izolátumok rendszertani meghatározása, besorolása. Ehhez számos tulajdonságot kell megvizsgálni, amelyekkel az adott faj egyértelműen meghatározható. A rendszertan (taxonómia) valamilyen hasonlóságaik alapján rendszerezi az élőlényeket. A(z ipari) mikrobiológia hőskorában a rendszertani besoroláshoz a külső megfigyelések és (később) a biokémiai tulajdonságok alapján osztályozták a mikroorganizmusokat. Napjainkban a rendszertan átalakulás alatt van, mert a modern géntechnikák lehetővé tették a molekuláris (gén) szintű rokonságok feltérképezését, és ez gyakran eltér a külsőleg megfigyeltektől. Meg kell jegyezni, hogy az ipari mikrobiológia területén gyakran szükséges ugyan az új izolátumok azonosítása, ám sok esetben ezeket a költséges és munkaigényes vizsgálatokat nem, vagy csak részben végzik el iparjogvédelmi célzattal, hogy ne lehessen könnyen lemásolni a technológiát. A klasszikus rendszertani besoroláshoz a következő vizsgálati szempontok szerint írják le az izolátumokat: makroszkopikusan: telep morfológiája, színe, szaga, mérete mikroszkopikusan: A) vizuálisan: sejt mérete, alakja, mozgásszerve, sejtmagja B) mikrobiológiai festésekkel: Gram-festés (sejtfal), spórafestés, csillószínezés, tokfestés stb. biokémiai reakciók: oxidázpróba (aerotolerancia), továbbá indol-, ureáz-, kénhidrogén-, arginin-, xilóz-, ammoncitrátpróbák, aerob/anaerob dextróz fogyasztása. A rendszertannal bővebben foglalkozik e jegyzet a 3. fejezetben.



26


Törzsfejlesztés A fermentációs iparban kevés természetből izolált „eredeti” mikrobát használnak. Mivel egy fermentáción alapuló technológia költségét alapvetően befolyásolja a termelő mikrobatörzs hatékonysága (hozam, produktivitás, végtiter), ezért különösen a régebbi technológiák az eredeti termelő törzset mára már jelentősen továbbfejlesztették. Noha a felsorolt 3 kulcsparaméter (hozam, produktivitás végtiter) jelentősen javítható technológiaoptimálással (pH, oldott oxigén, hőmérséklet, keverés, lépték stb.), de csak bizonyos korlátokig, ám jobb termelő törzzsel optimálás után még sokkal jobb hatékonyság érhető el. Mivel a fenotípusos tulajdonságokat a genom (genotípus) határozza meg, ezért ezt kell megváltoztatni a fejlesztés érdekében. Klasszikus törzsfejlesztés

1.2.7. videó: Klasszikus törzsfejlesztés A klasszikus technika véletlenszerű mutációk segítségével változtatta meg a termelő mikroba genomját, majd a megváltozott képességű utódok közül szelektálta a jobban teljesítőket (=random mutagenezis+screening). Ilyen UV-val generált random mutagenezist mutat be az 1.2.7. videó. A véletlenszerű mutációk generálása, majd a kedvezőbb klónok szelekciója azt eredményezi, hogy a kívánt cél eléréséhez igen nagyszámú mutánst kell létrehozni, és így igen sok mutáns utód közül kell kiszűrni a jobban teljesítőket. Ez azt is jelenti, hogy noha a termelési körülmények eltérnek a laboratóriumitól, mégis kizárólag kis léptékben lehet gazdaságosan törzsfejlesztést véghezvinni. A laborléptékben jól teljesítő mutánsokat azután fokozatos léptéknöveléssel (pilot plant =”kísérleti (fél) üzemi” léptéken keresztül) lehet a termelési szintre juttatni. Általában a törzsfejlesztés olyan ciklikus folyamat, ahol a fent leírt random mutagenezis+screening kombinációt folyamatosan ismétlik. Az egyetlen lehetőség a véletlen mutációk „irányítására” a szelekciós nyomás alkalmazása, azaz olyan körülmények alkalmazása, amely már a célnak megfelelő mikrobák kitenyésztését segíti, a nem megfelelőkét hátráltatja. A modern géntechnológiák lehetővé tették, hogy a korábbi véletlenszerű (random) mutációk helyett célzott genetikai változást lehessen eszközölni, és így a vizsgálandó mutánsok száma is radikálisan lecsökkent, ami a törzsfejlesztés (költség)hatékonyságát nagyban megnövelte. A célzott genetikai beavatkozásokhoz ismerni kell a genom és a funkció kapcsolatát, az anyagcsereutakat és azok szabályozását (gén azaz expresszió szintű szabályozás, vagy fehérje szintű szabályozás (aktivátor/inhibítor), előre/visszacsatolások) Noha hatékonysága kisebb, mégis napjainkban is gyakran használt módszer a klasszikus mutagenezis+screening kombinációja a törzsfejlesztés céljából. A random (véletlenszerű) mutációk előidézésére kémiai vagy fizikai mutagéneket alkalmaznak. Míg fizikai behatásként UV besugárzást szokás alkalmazni, a leggyakoribb kémiai ágens a nitrozoguanidin (ami a DNS-t változtatja meg), illetve bázisanalógok, amelyek hibás DNS-replikációt eredményeznek, valamint a frame shift mutagének (általában akridin festékek, amelyek eltolják egy vagy néhány bázispárral a leolvasási kódot). Bár a random mutagenezis+screening rendkívül egyszerű (és olcsó, ezek miatt használatos még ma is), komoly kihívást jelent a megfelelő mutagén dózis megtalálása. Túl nagy dózis esetén annyi mutáció jut egy sejtre, hogy az elpusztul, és a mutációk után nem marad túlélő. Túl alacsony dózis pedig nagyon kisszámú mutációt eredményez, amelyek között kisebb valószínűséggel található © Németh Áron, BME



27

kedvező fenotípusú egyed. Az UV sugárzásnál a besugárzási idő és a fény intenzitása a két optimálható paraméter, amelyek függenek a gazdaszervezettől. A kémiai mutagéneknél az egyik paraméter a kontaktidő, a másik a mutagén koncentrációja. Mivel ezek fajtól függetlenül a DNS-t változtatják meg, általában rákkeltőek! A random mutációt követő szűrővizsgálat is kétféle elven történhet: A) a random módszer minden izolátumot megvizsgál termelőképességre, míg a B) racionális módszer valamely biokémiai tulajdonsághoz köti a termelőképességet, és ezt a biokémiai tulajdonságot monitorozza (pl.: antimetabolit rezisztens törzsek sokkal több metabolitot termelnek, ha túlélnek). Modern törzsfejlesztés – anyagcsere-mérnökség (metabolic engineering) [21] A modern törzsfejlesztés során a genetikai eszközök kihasználásával a klasszikus véletlenszerű (random) genomváltozásokat lehet kiváltani célzott változtatásokra. Ezáltal jelentősen megnő az esélye a kívánt tulajdonságú mikroba elérésének (nem kell sok véletlen mutációra várni), és jelentősen lecsökken a fölöslegesen vizsgált (a nem megfelelően mutálódott) minták száma. Ezzel együtt is a modern törzsfejlesztés a klasszikushoz hasonlóan gyakran cirkuláris (ismétlődő) műveletsorból áll (1.2.8. ábra)

1.2.8. ábra: A modern törzsfejlesztés vázlata A fejlesztés a meglévő törzs metabolikus fluxus analízisével kezdődik, majd ennek módosítását kell megtervezni a célnak megfelelően (melléktermékképző útvonalak kikapcsolása, új útvonal génjeinek bevitele, kofaktoregyensúly megtartása stb.), majd a szintézis során a terveknek megfelelő mikrobát lehet létrehozni. Ezt követően ismét analízisre van szükség, és esetleg ennek során további fejlesztés (tervezés+szintézis) lehetősége merül föl, illetve kiderülhetnek olyan, korábban ismeretlen szabályozási mechanizmusok, amelyek a megváltoztatott genom következtében megzavarják, megváltoztatják a mikroba valódi metabolizmusát a tervezettől eltérően. Azokban az esetekben, amikor heterológ fehérjeexpresszióra van szükség a termelő mikroba kialakításához (azaz pl.: új terméket kell előállítani egy adott gazdaszervezettel, vagy ki kell terjeszteni a szubsztrát spektrumát), a metabolic engineering folyamat metabolikus útvonaltervezéssel kezdődik. Ez tartalmazhat empirikus terveket vagy kivitelezhető in silico analíziseket, azaz a sejtek részletes metabolizmus modelljét. Ezután az „útvonaltervezés” után a tervezett törzs elkészítése, majd további optimalizálás következik a metabolic engineering ciklus szerint. Míg a molekuláris biológia gyors fejlődésével a szintézislépés sok esetben viszonylag triviálissá vált (még ha az ipari törzsek fejlesztése az alacsony transzformációs hatékonyság miatt fáradtságos is), addig a gyors és hatékony iparszerű környezetben végezhető fenotípus-meghatározás eszközei az analízis lépéshez hiányosak. A teljes genomszekvenciák rendelkezésre állása új HighThroughput System (HTS) analitikai technikákat eredményezett a transzkriptom, proteom, metabolom számára. Ezek a technikák azonban további finomításra szorulnak, hogy a szabályozókat azonosítani lehessen, amelyek kulcsszerepet játszanak a másodlagos anyagcsere útvonalak fluxusainak szabályozásában.



28


Mivel ezen a területen gyakran esik szó egy szervezet valamilyen típusú molekuláinak összességéről, ezért ezekre a készletekre a gén–genom analógiájára „-om” végződéssel (angolban „omics”) bevezettek további fogalmakat. A gén–genom felől indulva az RNS-készlet következik transzkriptom elnevezéssel, majd a proteom (fehérjekészlet), illetve az ezek regulátorainak összessége, az interaktom (kölcsönhatók). Bevezették továbbá a metabolitok összességére a metabolom és a fluxusok összességére a fluxom elnevezéseket is. A biológia központi alapelve („central dogma of biology”), hogy az információ a DNS-en tárolódik, onnan íródik át az RNS-re, amiről pedig a fehérjék szintetizálódnak. Kiderült azonban, hogy számos olyan szabályozási funkció létezik, amelyek miatt egy-egy génhez nem lehet egyértelműen funkciót rendelni. Ezért létre jött egy új kutatási terület a funkcionális genomika (functional genomics), amelynek feladata, hogy egy adott gén által kódolt fehérje funkcióit feltérképezze. Ehhez azonban szükséges volt a sejten belüli folyamatok analitikájának fejlődésére. Az anyagcsere-mérnökség legfőbb célja, hogy genetikai manipulációkkal fejlessze a termelő törzs metabolikus fenotípusát. A kapott fenotípusok ennek ellenére gyakran szuboptimálisak és nem kielégítőek a genetikai módosítások közvetett hatásai vagy ismeretlen szabályozó kölcsönhatások miatt. Ezért erősen ajánlott a teljes metabolikus szabályozást figyelembe venni az anyagcseremérnökség során. A metabolizmus szabályozása vagy enzim, vagy gén szinten fordul elő. Utóbbi globális szabályozók és/vagy szigmafaktorok hatása alatt áll. A génszabályozások változnak az idővel a tenyésztési feltételektől vagy a sejt állapotától függően. A klasszikus metabolikus mérnöki megközelítések egyik hátránya, hogy ezt nem veszik figyelembe, vagy kevés figyelmet tulajdonítanak ennek. Bőséges információ áll rendelkezésre a lokális genetikai szabályozásról és a sejtmetabolizmus biokémiájáról, illetve fiziológiájáról, de meglepően keveset tudunk a teljes anyagcsere átfogó szabályozásáról. Sőt, noha a HTS technikákban benne van a lehetőség, hogy a transzkriptomok, proteomok, metabolomok és fluxonomok közötti mehanizmust feltárja, többségük csak pillanatképet ad egy állapotról, és az a módszer, ami a különböző szintű információkat egységbe foglalná még ismeretlen. Így még mindig messze vagyunk a szabályozási elvek sejtszintű megértésétől. Bár már sikerült megalkotni az Escherichia coli teljes sejtmodelljét, még fontosabbá vált az in vivo vizsgálatok analízise és a posztgenomikai kutatásokhoz a sejtek egész rendszerének együttes kezelése. Ezen cél eléréséhez fontos az anyagcsere átfogó szabályozásának vizsgálata a különböző szintek (genom, transzkriptom, proteom stb.) információinak integrált figyelembe vételével A legfontosabb információ a komplex anyagcsere-szabályozás mechanizmusának megértésében a centrális anyagcsere fluxusainak eloszlása lehet, mivel ez a gén- és fehérjeexpresszió (vagy enzimaktivitás) és az intracelluláris metabolitok kifejeződése. A metabolikus fluxus analízise a kulcsmetabolitok anyagmegmaradási elvén alapszik. A sejten belüli fluxusokat a mért fluxusokból anyagmérlegek segítségével határozzák meg. A mérhető külső fluxusok száma korlátozott, és a sztöhiometriai korlátok miatt gyakran alulhatározott algebrai rendszert kapunk. Ezért kofaktor anyagmérlegeket is néha be kell vonni a sztöhiometriai modellbe, vagy egy optimalizálandó objektív függvényt kell bevezetni. A centrális anyagcsere anabolikus és katabolikus funkciókat is ellát (felépítő és lebontó is), hiszen kofaktorokat és építőköveket szolgáltat a makromolekulák szintéziséhez (anabolizmus), csakúgy, mint az energiatermeléshez (katabolizmus). Az optimálást a katabolizmus vagy az anabolizmus, vagy mindkettő szempontjából el lehet végezni a sztöhiometriai korlátok mellett. A fluxusmérleg-analízist széleskörűen használják a steady state (állandósult állapot) metabolikus fluxusainak becslésére a sejtnövekedés maximalizálásának érdekében. Az E. coli szinte optimálisan hasznosítja a szénforrást, ami ennek a törzsnek a különleges előnye. Ennek ellenére a fluxusszámítások pontossága a kofaktorbecslések megbízhatóságától függ, és a megfelelő objektív függvényválasztástól. Ismeretlen reakciók jelenléte, amely kofaktort generál vagy fogyaszt, érvénytelenítheti azt a megközelítést, hogy a kofaktor koncentrációja egyensúlyban marad, és a kiválasztott objektív függvény nem lesz megfelelő, vagy a megbízhatósága csak bizonyos sejtállapotokra fog korlátozódni. Egy alternatív megközelítés az izotóp-nyomkövetés, ami mérhető mennyiségeket határoz meg az intracelluláris fluxuseloszláshoz kapcsolódóan. Izotóppal jelzett szubsztrátot lehet adni a sejtnek, és a




29

jelölt szénatom el fog oszlani az anyagcsere-hálózaton. A végső izotópdúsulás a sejten belüli metabolitkészletben mérhetővé válik. A biomassza-hidrolizátumokban az aminosavak sokkal nagyobb feleslegben vannak jelen, mint prekurzoraik a centrális metabolizmusban. Így könnyebb következtetni a proteinogén aminosavak jelölt mintázatából az intracelluláris metabolitok jelölési mintájára a prekurzor–aminosav kapcsolat alapján. A nyomjelző kísérletek általában NMR spektroszkópiát használnak vagy GC-MS technikát. Az NMR-t a C13 helyi dúsulásának meghatározására egydimenziós H1 NMR-rel végzik, vagy az izotopomerek mennyiségi meghatározására egydimenziós C13 NMR-t, vagy kétdimenziós C13 H1 COSY NMR-t alkalmaznak. Bár a C13 NMR egy hatékony és vonzó technika a metabolikusfluxus-analízis számára, nagy mennyiségű mintát igényel, és a módszer nem képes detektálni a metabolitokat 10-4M-os koncentráció alatt. Másrészt a GC-MS módszer könnyen analizál 10-7M-os koncentrációban is. Mindezek miatt a GC-MS megfelelő lehet az alacsony biomassza-koncentrációjú tenyészetek fluxusanalíziséhez is. Pillanatnyilag ezek a nyomkövető technikák a közvetlen extracelluláris fluxusmérésekkel kombinálva a legmegfelelőbb módszerek az intracelluláris metabolikus fluxuseloszlások (metabolic flux distribution=MFD) megállapítására, csupán néhány modellezési feltételezést használva. Emellett a fluxusarány-analízis is használható az elágazások fluxusainak megállapítására. Bár alkalmazásaikban a TCA ciklusra korlátozódnak, néhány további analitikai megoldást a jelölési kísérletekhez számba kell még venni. A becsült fluxusok konfidencia-intervallumát statisztikai analízissel lehet megadni. A jelölési kísérletek tervezésének optimalizálására is fejlesztettek már ki módszereket, és így azonosíthatósági analíziseket is bevezettek. Bár a C13 fluxusanalízist széles körben alkalmazzák az olyan mikrobákra, mint E. coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, más élőlényekre is kiterjesztették, mint például cianobaktériumok, növényi sejtek és emlős sejtek (köztük egér-, agyi és idegsejtek, valamint rákos sejtek). Az proteogén aminosavak izotopomer eloszlásainak használata esetén egy jelentős korlát, hogy csak steady-state esetben alkalmazható. Annak érdekében, hogy az analízist az iparilag érdekes szakaszos tenyésztésekre vagy dinamikus analízisre lehessen kiterjeszteni, az intracelluláris metabolitokat kell először meghatározni. Ezek mérhetőek CE-TOF-MS, GC/MS-MALDI/TOF, MS, LC-MS/MS, vagy LC-MS technikákkal2. A fluxus dinamikáját GC-MS rendszerrel egymagában is lehet mérni 1,3-propándiolgyártás során. A nem stacionárius fluxusok analíziséhez gyakran kinetikai modelleket is felhasználnak. Mivel az elsődleges metabolitkészlet nagyságrenddekkel kisebb, mint a proteogén aminosavakból felépített molekulakészlet, az izotópeloszlás hamarabb éri el az állandósult állapotot. A fluxusváltozás becsülhető a készletméretekkel felírt differenciálegyenletekkel. Mind a számításos fluxusmérleg-analízis (fluxus balance analysis – FBA), amely mátrix műveletek segítségével képes kezelni a több tucat metabolikus reakcióegyenletet, mind pedig a fluxusok meghatározására bevezetett kísérletes MFD módszerek hasznosak a sejtfiziológia megértésében. FBA egyszerre tud kezelni több száz metabolikus útvonalat, míg a kísérletes megközelítés hasznos a főbb metabolikus útvonalak elsődleges meghatározásában. A fluxuseredményeknek összhangban kell lennie vagy integrálva kell lennie más információkkal, mint például az anyagcserefluxusok irányával, az enzimek metabolitok általi allosztérikus szabályozásával és transzkripciós szabályozásokkal stb., mivel a metabolikus háló funkcionális viselkedése a génexpresszió, fehérjeexpresszió és az intracelluláris metabolitok koncentrációjának eredménye. A jelentős méréstechnikai fejlődésnek köszönhetően minden szintű „omics”-nak a globális monitorozása lehetséges. Annak érdekében, hogy a metabolikus szabályozás tisztázódhasson, nagyon fontos a metabolikus fluxusok és a többi „omics” integrálása. Ez a systems biology-nak keresztelt, viszonylag új tudományterület feladata. Meg kell jegyezni, hogy a génexpresszió, fehérjeexpresszió, sejten belüli metabolitkoncentráció közvetlenül mérhető, míg a metabolikus fluxusok vagy reakciósebességek nem, ezért becsülni kell őket. A számos megvalósult példa közül az Escherichia coli-n végzett szisztematikus anyagcseremérnökséget mutatjuk be. Az E. coli teljes levegőztetés mellett is termel jelentős mennyiségű ecetsavat, amely 10-30%-a is lehet a teljes szénfluxusnak. Ennek oka az, hogy nem megfelelően kontrollált a glükóz felvétele, és a túl sok intracelluláris glükózlebontási terméket (azaz piruvátot) a citrátkör nem tudja elég hatékonyan feldolgozni, ezért vagy előbb acetil-CoA, majd abból ecetsav képződik (Pta+Ack, azaz PhosphateAcetylTransferase+Acetil-kináz), vagy a piruvátból közvetlenül (pox azaz 2

Balla József: Analitikai kémia, Budapest, BME



30


piruvát-oxidáz) is ecetsavat állít a sejt elő, előbbi esetében ATP is keletkezik. A glükóz elfogyása után az ecetsavat visszaalakítja a sejt ATP segítségével acetil-CoA-vá, és a citrátkörön és a terminális oxidáción keresztül energiatermelésre fordítja. Mivel az ecetsavképződés jelentős szubsztráthányadot elhasznál, illetve citotoxikus metabolitként a sejtnövekedést gátolja, a kiküszöbölése alapvető fontosságú az E. coli-val végzett rekombináns (heterológ) fehérjeexpresszió és -előállítás során. Az egyik lehetőség, hogy csökkent aktivitású glükóztranszferrel rendelkező mutánsokat kell létrehozni a piruvát akkumlációjának elkerülésére, vagy lehet a glükózkoncentrációt rátáplálásos technika segítségével alacsony értéken tartani, illetve lehet a foszfotranszferáz rendszer (PTS) glükózspecifikus enzimének expresszióját csökkenteni egy represszor molekula expresszáltatásával. Ezeken felül lehetőség van a citrátkör és a glioxilát ciklus intenzifikálására is. Ez utóbbi enzimeit az aceBAK gén kódolja az izocitrát-dehidrogenázzal együtt. Ez a gén ecetsavon vagy zsírsavakon történő növekedéskor aktív, glükózon, glicerinen és piruváton represszálva van. A regulon transzkripciós faktorai közül a fadR mutációjával elérhető, hogy az utóbbi szénforrásokon is aktív legyen az aceBAK gén. Így tehát a citotoxikus és szubsztrátveszteséget okozó ecetsav képződése kiküszöbölhető az E. coli-nál (1.2.9. ábra)

1.2.9. ábra: E. coli ecetsav képzésének eliminációja: A) glükóz transzfer deficiens mutáns, B) aceBAK génekkel megnövelt glioxalát- és citrátkör- aktivitás.




31

A tejsav fermentatív előállításának régóta ismert problémája, hogy a jól termelő lactobacillustörzsek igen összetett tápanyagforrásokat (pl.: élesztőkivonat) igényelnek, amelyek viszonylag költségesek, és feleslegük drágítja, illetve nehezíti a downstream folyamatokat. Ezért E. coli-t is módosítottak úgy, hogy elfogadható tejsavtermelővé váljon. Ehhez a törzs glükóz- specifikus PTS fehérjéjének, illetve a piruvát-formiát-liáz enzimének, valamint a saját laktátdehidrogenázának génjét inaktiválták, és egy lactobacillus eredetű L-LDH (laktát-dehidrogenázt) expresszáltattak vele. Így az E. coli alkalmassá vált több mint 70 g/L koncentrációban tejsavat termelni 77%-os hozammal ecetsav, etanol, formiát és D-tejsav nélkül.

1.3. Mikroorganizmusok ipari alkalmazása A mikroorganizmusok ipari alkalmazásakor a leghatékonyabb termelés érdekében különböző igényeik (tápkomponens, levegőztetés, pH stb.) figyelembe vétele és kielégítése a biotechnológus feladata. Részletesen ezekkel a feladatokkal a Biomérnöki műveletek3 foglalkozik, de néhány mikrobiológiai aspektust e jegyzet keretein belül is célszerűnek véltünk tárgyalni. Az oxigén szerepe A mikrobák centrális (központi) anyagcseréje a következő sémával szemléltethető (1.3.1. ábra)

G L I K O L Í Z I S

Terminális oxidáció 1.3.1. ábra: A mikrobák centrális anyagcseréje A központi anyagcsereút során a szénforrás lebontása (pl.: cukrok) a glikolízissel kezdődik és a piroszőlősavig tart. Az ebből képződő acetilcsoport lép be a citrátkörbe, ahol az oxálecetsavval összekapcsolódik, és a képződött citromsav két lépésben dekarboxileződik, és CO2 kerül kibocsátásra (ld. 1.1.4. ábra). A citrátkör során a szén-dioxid-távozás mellett redukált koenzimek is keletkeznek (NADH2), amelyek a terminális oxidációban a légköri oxigén segítségével a respirációnak nevezett folyamatban regenerálódnak jelentős ATP energia keletkezése közben. Ha a mikroba légköri oxigént használ, akkor gyakran találkozik peroxigyökökkel, amelyek igen reaktívak, és így kártékonyak a sejtekre. Ezek közömbösítésére az aerotoleráns és/vagy aerob mikrobák kataláz enzimeket termelnek (gyakran peroxiszómában), amelyek a káros peroxidgyököket ártalmatlanítják. A fermentatív anyagcsere esetében azonban nincs lehetőség a légköri oxigén felhasználására a redukált koenzimek regenerálása céljából így energianyerésre sem, ezért különböző szerves vegyületek (metabolitok) segítségével történik meg az oxidáció és a kisebb mértékű, de nélkülözhetetlen 3

Lásd Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok. Budapest, Typotex Kiadó, 2011



32


energiatermelés. Ezek a különböző erjedési folyamatok, amelyek megkülönböztetendők az anerob légzéstől (amikor is az elektrondonor szerves molekula, pl. cukor), de az elektronakceptor sem nem a légköri oxigén ((légzés)), sem szerves anyag (fermentáció), hanem oxigéntől eltérő szervetlen molekula). Oxigénigény szempontjából a mikrobák lehetnek aerobok (életfunkcióhoz szükséges a légköri oxigén), aerotoleránsok (nincs szükségük oxigénre, de el tudják viselni ((általában kataláz pozitívak)), fakultatív anaerobok (ha van oxigén, használják, ha nincs, akkor is élnek és szaporodnak), obligát anaerobok (nincs szükségük oxigénre, és nem tudják elviselni sem (toxikus rájuk nézve). A jegyzetben tárgyalt anyagcsere utakat foglalja össze a 2. fejezetben részletesen tárgyalt 2.1.2. Anyagcsere utak összefoglalása című hyperpicture. Aerobok tenyésztése Az oxigén egy különleges szubsztrát, mert gázhalmazállapotban kell a rendszerbe juttatni, és a redoxegyensúlyon keresztül az oxigén mennyisége befolyásolhatja a mikroba anyagcseréjét. Egyes fermentációk a termék-előállításhoz oxigénfelesleget igényelnek (ekkor maximális a termékhozam), mások pedig különleges oxigénprofilt, esetleg oxigénlimitet. Mindezek miatt az aerob fermentációknál vagy felületi tenyésztést kell alkalmazni (szilárd fázisú fermentáció, nem igazán lehet az oxigénszintet szabályozni), vagy a fermentlébe beoldódott oxigén mennyiségét mérni és gyakran szabályozni kell, amihez a legcélszerűbb az oxigénelektród használata (pl.: Clark-féle elektród4). Az elektród szolgáltatta jel alapján több helyen lehet beavatkozni: 1) keverési sebesség növelésével csökken a buborékméret és nő az anyagátadási felület, tehát javul az oxigénellátottság; 2) a levegő térfogatáramának növelésével szintén több oxigén juttatható a fermentlébe; 3) nagyobb nyomású levegő alkalmazásával is több oxigén vihető be; 4)végső esetben oxigénnel dúsított levegőt is lehet használni. Noha a hőmérséklettől jelentősen függ a telítési oxigénkoncentráció (amitől pedig az oxigénbeoldódás hajtóereje függ), az alkalmazott hőmérsékletet általában a mikroba hőmérsékleti optimuma határozza meg. A magas hőmérsékleten végzett fermentációknál tehát komoly gondot jelent a megfelelő levegőztetés biztosítása, mert 60-70°C-on már rosszul oldódik az oxigén (pl.: Thermus thermophylus) Az ipari fermentációknál (pl.: citromsav- vagy fehérjetermelés E. coli-val) gyakran jelent problémát, hogy a nagy léptékű reaktorok alja és teteje között jelentős hidrosztatikai nyomáskülönbség van, ami miatt az oxigénbeoldódás is különbözik, tehát inhomogénné válhat a reaktor. Ennek kiküszöbölésére több helyen vezetnek be levegőt a fermentorba. A fejtérbe vezetett levegővel a habzás mértéke is visszaszorítható. Anaerob fermentációk (erjesztések) A fejezet elején már részletesen bemutattuk az oxigént hasznosító és nem hasznosító mikroorganizmusokat. Az oxigént nem igénylő mikrobákat (obligát anaerobok, aerotoleránsok, fakultatív anaerobok) tenyésztési szempontból most egyszerre tárgyaljuk. Mindegyik fajta tenyésztésekor mentesülünk a levegőztetés okozta problémáktól (oxigénlimit, magas keverő fordulatszám és nyíróerő, habzás stb.). A szigorúan anaerobok esetében azonban inert gáz bevezetésére és alapos eloszlatására (diszpergálására) van szükség, pont, mint az oxigén esetében, ezért ilyenkor gyakran ugyanazt a gázbevezető rendszert használják, mint a levegőztetéskor. A klasszikus fermentációs ipar a primer metabolitok termelésével alakult ki. Ezek nagyobb, iparilag is hasznosítható mennyiségben a különböző erjesztések során keletkeznek, amikor a cukor részben savakká és alkoholokká oxidálódik, részben pedig az eközben keletkezett redukált koenzim (NADH2) regenerációjakor redukált szerves vegyületekké alakul (pl. piroszőlősavból tejsav képződik stb.). Ezeket az erjesztéseket tekintjük át az alábbiakban. 1. Etanolos erjedés A hexózok erjesztésekor élesztők (Saccharomyces cerevisiae) és egyes baktériumok (Zymomonas mobilis) metabolizmusa során 1:1 arányban etilalkohol és szén-dioxid keletkezik a piroszőlősavon (glikolízis) keresztül. Az első lépés a hexokináz katalizálta szubsztrát 4

Lásd Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok. Budapest, Typotex Kiadó, 2011




33

foszforilezés, majd a foszfo-frukto kináz által végzett második foszforilezés eredményeként a 6 szénatomos szubsztrát 2 db 3 szénatomos glicerin-aldehid foszfátra bomlik, amelyek a glikolízisben foszfoenolpiruvát-piroszőlsav-acetaldehid-etanol útvonalon alakulnak át a termékké. A szubsztrát felvétele történhet A) támogatott diffúzióval vagy B) aktív transzporttal. Előbbire azért van szükség, mert noha a sejten kívüli térben található magasabb koncentrációban a szubsztrát így a spontán diffúzió is a felvételt segíti, de viszonylag nagy molekulájúak a monoszacharidok, amelyek ezért csak lassan tudnak a sejtmembránon átjutni, ezért hordozó molekulák segíthetnek. A termékleadás egyszerű diffúzióval történik, így a magas termékkoncentráció gátolhatja a saját képződését. A diszacharidok különböző utakon jutnak el a lebontó apparátushoz: a szacharóz esetében az invertáz enzim a periplazmás térben hasítja két monoszacharidra a szubsztrátot, amelyek onnan a fenti mechanizmus szerint hasznosulnak; a laktóz először transzportálódik, majd intracelluláris β-galaktozidáz hidrolizálja; maltóz esetében ugyanez a helyzet, de α-glükozidáz végzi az első intracelluláris hasítást Napjaink kutatásainak fókuszában állnak azok a mikroorganizmusok (pl.: Pichia stipitis), amelyek pentózokból képesek etanol előállításra, mivel a 3. generációs bioetanol-előállítás hemicellulóz-tartalmú növényi hulladékok felhasználását tűzte ki célul (a keményítő- és cellulózalapú technológia után). Az etanolos erjedés melléktermékei lehetnek az acetaldehid (néha akkumlálódik, de etanollá alakulhat), illetve a glicerin-aldehid-3-foszfát akkumlációjával a glicerin jelenik meg melléktermékként. Tapasztalatok szerint az optimális erjesztéshez némi oxigén is szükséges (a biomasszanövekedéshez, mert teljesen anaerob körülmények mellett erre képtelenek az élesztők). Az alkoholos erjedésnél két szabályozási mechanizmust kell figyelembe venni: Pasteur-effektus – az oxigénlimitben műkődő tenyészet anaerob metabolizmusra vált (lassabb szaporodás, ami oxigént igényel és etanoltermelés); Crabtee-effektus: magas cukorkoncentráció esetén a biomassza-képződés helyett az aerob fermentáció anaerob anyagcserére helyezi a hangsúlyt, mert korlátozott a terminális oxidációs kapacitása a mikrobának. Az etanoltermelés során így szubsztrát- és termékinhibíció is fellép, utóbbi kb. 112-114 g/L titernél, ami épp a gazdaságosan kinyerhető termékkoncentráció határán mozog. A termék etanolfelhasználása széles körben ismert, mint például fertőtlenítőszerek, tisztítószerek, italok, üzemanyagok, szintézisek stb. 2. Tejsavas erjedés A tejsav termelődése igen gyakori az élővilágban a mikrobáktól kezdve az emberig bezárólag. A mikrobák esetében a legjelentősebb tejsavtermelők a tejsavbaktériumok (lactobacillusok, lactococcusok, pediococcusok, streptococcusok, leuconostoc fajok stb. ), bacillusok, egyes gombák (pl.: Rhizopus) és élesztők (pl.: Kluyweromyces lactis). A tejsavas erjedés tipikus példája a terminális oxidáció pótlásának: oxigén hiányában a redukált koenzim (NADH 2) visszaoxidálásához a centrális metabolizmus molekuláját a piroszőlősavat használják a molekulát a laktát-dehidrogenáz enzim segítségével, így a koenzimből NAD a piroszőlősavból tejsav keletkezik. A lactobacillusok emellett a saját biomasszájuk felépítésére szerves nitrogénforrásokat igényelnek, amelyek nitrogéntartalma mellett a széntartalom is tápanyagként szolgál, az emellett jelen lévő szénhidrátok bontásával pedig a piroszőlősavon keresztül történő tejsav-előállítás során energiát termelnek, így bizonyos esetekben a cukor szinte kizárólag tejsavvá alakul (magas ~95-99%-os hozammal). Míg a szubsztrát általában aktív transzportal jut be (pl.: glükóz, laktóz – permeáz segítségével), a termelt tejsav disszociálatlan formában szabadon ki/be jut, ám ez toxikus a sejtekre nézve. A laktátion a protonokkal együtt szimport formában transzportálódik.



34


A bejutott szubsztrát metabolizmusa szerint a tejsavtermelőket két csoportra szokás osztani: homofermentatívak és heterofermentatívak. Előbbiek esetében a hexózok az Embden– Meyerhof–Parnas (glikolízis) útvonalon keresztül 1:2 mólarányban tejsavat képeznek, míg a heterofermentatívak előbb dekarboxilezik a hexózt (a szén-dioxid távozását buborékolás jelzi), majd a képződött pentózból tejsavat (3 szénatom) és valamely 2 szénatomos mellékterméket képezik, általában ecetsavat vagy alkoholt. Nyilván a fehér biotechnológia számára a homofermentatívak a kedvezőek a magas hozammal és konverzióval, de a heterofermentítvak is iparilag jelentősek: az élelmiszeriparban használatosak, ahol a melléktermékek aránya adja a kívánt aromát, ízt. A tejsavtermelők általában fakultatív anaerobok, ami ipari szempontból szintén kedvező, hiszen nincs szükség költséges levegőztetésre, sem inert gázra, a spontán beoldódó oxigén viszont nem zavarja a mikrobákat, ugyanakkor gázbevezetés híján habzással sem kell számolni, ettől a reaktor is jobban kihasználható. A termék tejsav széles körű felhasználással rendelkezik az élelmiszeriparban, gyógyszer- és higiéniás termékekben, polimer,- bőriparban stb. Egy speciális eset a Rhizopus oryzae, amely oxigén jelenlétében a cukrokat szén-dioxiddá oxidálja, és biomasszát képez, anoxikus (kevés oxigén) körülmények között tejsavat termel, ám teljesen anaerob körülmények között etanol a főtermék. Noha a termékprofil nagyban függ a morfológiájától, a fenti három eset általános e fonalas gombánál. A tejsavtermelés szempontjából a pelletes morfológia a legkedvezőbb, amelynek kialakulása viszont igen sok tényezőtől függ 1.3.2. ábra [7]. Anyagátadási szempontok miatt az optimális pelletek sima felületűek és 1-2 mm átmérőjűek. Egy ilyan pellet felszínét mutatja be az 1.3.3. video, illetve különböző morfológiák láthatók az 1.3.4-1.3.7 ábrákon. Felület aktív anyagok

Szilárd részecskék

Törzs Keverés

Spóra kora

Polimerek

Tápközeg

pH

Spóra konc.

Pellet képződés 1.3.2. ábra: A pelletképződést befolyásoló tényezők

1.3.3. Pelletes morfológia © Németh Áron, BME



1.3.4. ábra: Bolyhos pellet (1-2mm)

35

1.3.5. ábra: Óriás (1cm) pellet és szabálytalan alakú pellet

1.3.6. ábra: Amorf és óriás (2-3 cm) pellet 1.3.7. ábra: Pelletfelszín mikroszkópos képe (400-szoros nagyítás) 3. Homoacetogén erjedés Az ecetsavról mint melléktermékről már több esetben említést tettünk, létezik azonban olyan erjedési folyamat, amely a fermentlébe az ecetsavat bocsátja ki fő termékként, és emellett szén-dioxidgáz képződik és távozik a rendszerből. Ilyenkor egy hexózból 2 ecetsav és 2 CO2 keletkezik, melléktermékként etanol fordulhat elő. A hexózok a glikolízisen át, a pentózok pedig a pentóz foszfát cikluson kersztül bomlanak le piroszőlősavvá, amelyből képződik közvetlenül vagy acetil-foszfáton keresztül az ecetsav. A szubsztrátfelvételre és a termékleadásra a tejsavhoz hasonlóan aktív transzport és disszociálatlan forma jellemző, amely utóbbi ez esetben is citotoxikus hatású. A termelő mikrobák gyakran termofilek (pl.: Clostridium thermoaceticum, Acetogenium kiwi), a képződött ecetsavat pedig jellemzően a vegyipar használja fel (az élelmiszeriparban ezek a mikrobák nemkívánatosak). 4. Propionsavas erjedés A propionsav jellemzően heterofermentációs folyamatok terméke, ahol a főkomponens, a propionsav és mellette az ecetsav, a borostyánkősav és a tejsav is megjelenhet. A termelő anyagcsere során a hexózok a glikolízisen keresztül eljutnak a piroszőlősavig, majd részben tejsavvá és ecetsavvá, részben oxálacetáttá alakulnak, amely utóbbi a fumársav-borostyánkősavpropionilCoA-án keresztül propionsavat képez. Jellemzően mezofil, anaerob mikrobák végzik ezt a fajta fermentációt, mint például Propionibacterium acidipropionici, vagy P. shermanii. A propionsav-baktériumok tejsavból is képesek propionsavat erjeszteni. A megtermelt propionsavat takarmány- és élelmiszer-ipari tartósításra, polimerek és peszticidek gyártására, valamint antifungális szerként is használják.



36


5. Butanolos erjedés Butanol fermentációs úton kétféle anyagcserével is keletkezhet: A) hexózok bontásából a glikolízisben piroszőlősav keletkezik, amelynek acetilcsoportját a koenzim-A (CoA) a citrátkörbe szokta vinni, ám két acetil-CoA-ból aceton keletkezhet, illetve háromból butirilCoA, majd abból butanol, és emellett közvetlenül a piroszőlősavból etanol (=ABE), valamint a citrátkörben szén-dioxid; B) izopropil-alkohol képződik egy dehidrogenáz-enzim segítségével az acetonból a butanol és az etanol mellett (=IBE) A technológia nehézsége, hogy a butanol erősebb sejtméreg még az etanolnál is, ezért csak igen kis koncentrációban halmozzák fel a termelő mikroorganizmusok (0,5-1,0% ~10 g/L). Emiatt desztillációs, extrakciós és kihajtásos (strippelés) technológiák szükségesek a feldolgozási műveletek során, amelyek viszonylag magas fajlagos költséget eredményeznek. A legáltalánosabb butanoltermelő mikroba az anaerob mezofil Clostridium acetobutylicum. Ipari butanolos fermentációk az I. világháború utáni német hadiipar számára termeltek butanolt, a későbbiekben a kőolajalapú technológiák alacsonyabb költségei miatt a butanolfermentációs üzemeket bezárták. Napjainkban azonban a „bioetanol” analógiájára szintén energiahordozóként éli reneszánszát „biobutanol” elnevezéssel – immár a genetikai ismeretek kiaknázásával – a butanol fermentációs előállítása. 6. Diolok, triolok, poliolok erjesztéses előállításának áttekintése A) etilénglikol: toxikussága ellenére a borhamisítás kulcsvegyülete, szintetikusan olcsóbb az előállítása B) 1,3-propándiol: (bővebben: 1.1.fejezet 1,3-propándiol előállítás) az enterobakterek, klosztridiumok, egyes tejsavbaktériumok és egyes citrobakterek fajai képesek anaerob körülmények között a glicerinből (a belső redox egyensúly megőrzésének érdekében) 1,3propándiolt előállítani, miközben a redukált NADH2 koenzimet visszaoxidálják. Az 1,3propándiol minden esetben heterofermentatív anyagcserével keletkezik, azonban a melléktermékek a termelő mikrobára jellemzőek (pl.: 2,3-butándiol a Klebsiellákra, vajsav a Clostridiumokra stb.). Glükóz kofermentációja gyakran segíti az 1,3 propándiol képződését (mert több NADH2 keletkezik a glükóz lebontásakor, amit a propándiol útnak kell regenerálni.) C) 2,3-butándiol: az enterobakterek jellegzetes terméke, amely 2 piroszőlősavból keletkezik. Gumigyártásra és metil-etil-keton (MEK) előállítására használják, amely utóbbival az üzemanyagok oktánszámnövelése érhető el. D) Glicerin (triol): élesztők glükózból termelhetik akár főtermékként is. A bor erjedésekor is keletkezik pl.: Saccharomycesek, Pichiák közreműködésével. A glicerin felel a bor testességért, éppen ezért a bor glicerines feljavítása borhamisításnak minősül. A glicerin régen a szappanfőzés mellékterméke volt, napjainkban egyes biodízeltechnológiák (metanollal történő növényolaj átészterezése estén) melléktermékeként keletkezik nagy mennyiségben némileg szennyezett (metanol, katalizátor, lúg stb.) formában. E) Xillit: xilán hidrolízisével xilóz nyerhető, amelyből pl. Pichiák segítségével xillit állítható elő, és édesítőszerként forgalmazható. F) Szorbit(ol): élesztők (pl.: Zymomonas mobilis) képesek glükózból az etanol mellett szorbitot (az „ol” végződés az angolból ered, magyarul enélkül is használatos, ez esetben „szorbit”) előállítani. Fentiekben tehát különböző anaerob fermentációt, erjesztést soroltunk fel. A levegőztetés problematikája a szubmerz (folyadék fázisú, szuszpenziós) fermentációk óta áll fent, és egy másik klasszikus fermentációs technikával – a felületi vagy szilárd fázisú fermentációval – részben kiküszöbölhető.




37

Szubmerz kontra felületi fermentáció Noha a biomérnöki fermentációs tanulmányok során megszoktuk, hogy a mikrobatenyészet az egy adott faj vizes szuszpenziója, és ezzel a természetben is találkozhatunk (aludttej, joghurt stb.), egy adott szubsztrát felszínén történő tenyésztés szintén mindennapos (pl.: penészes kenyér), és ugyanezen folyamat kiaknázható klasszikus technikaként egyes régiókban (főleg Ázsiában). A szilárd fázisú fermentáció (Solid State Fermentation – SSF; amely csak rövidítésében azonos az egyidejű cukrosítás és fermentációval –Simultan Saccharification and Fermentation!) során a biomasszaszaporítás és termékképzés olyan nedves szubsztráton vagy inert hordozón történik, ahol csak kötött víz található (=vízaktivitás). A természetben ilyen folyamat a komposztálás, silózás vagy a talajszemcsék ökoszisztémája. A felületi tenyésztés előnye a szubmerz technikával szemben, hogy egyszerűbb eszközök és tápközegek használatosak, kevesebb szennyvizet termel, és néha a feldolgozási-tisztítási műveletek egyszerűbbek (könnyebb a biomassza-eltávolítás különösen). Ugyanakkor hátránya, hogy nem minden mikrobával végezhető (pl. baktériumok jelentős része), meglehetősen nehezen kontrollálható, inhomogén rendszer, amitől lassabb a metabolizmus (nincs mindenütt optimális körülmény), és a „reakció” ez esetben is a kevés kötött vizes fázisban zajlik. Ezért főleg tradicionális ázsiai (pl.: japán) ételek előállításakor használják. Szubsztrát/hordozó oldalról a következő 3 szempontot kell figyelembe venni: 1) Anyaga: lehet mezőgazdasági hulladék (hidrolízis nélkül is hasznosíthatók, szemben a szubmerz fermentációval), szervetlen, nagy szemcsés őrölt kőzet, szintetikus műanyag (poliuretán). 2) A szubsztrát/hordozó karakterisztikáját megadja a porozitás, vízmegkötő képesség, mechanikai tűrés. 3) Szubsztrát/hordozó előkezelést igényel-e, úgymint fizikai előkezelések (aprítás, sterilezés hővel vagy besugárzással), vagy kémiai módszerek (savas/lúgos hidrolízis, extrakció), vagy e kettő kombinációja. Bioreaktor oldalról a következő megoldások használatosak: 1) Forgódobos bioreaktor citromsav-előállításhoz Aspergillus niger fonalas gombával (1.3.8. ábra) [8]

1.3.8. ábra: Forgódobos bioreaktor



38


2) Tálcás reaktor (Koii, 1.3.9. ábra) [9]

1.3.9. ábra: Koji tálcás reaktor A fenti reaktor előnye, hogy a reaktorban a páratartalmat mérni és szabályozni lehet, a tenyészeteket tartó tálcásmodulok pedig alulról csővezeték segítségével fűthetőek/hűthetőek. 3) Töltött ágyas bioreaktor A töltött ágyas reaktoroknál egy oszlopszerű reaktorba durva apríték (darabos) szubsztrátot helyeznek el, amelyet bepermeteznek a termelő mikrobával, és alulról enyhén levegőztetik. 4) Fluidágyas reaktor Nagyon hasonló a töltött ágyas reaktorhoz, de ebben az esetben könnyű a hordozó/szubsztrát, és magasabb a levegő térfogatárama, így a szilárd szubsztrát lebeg. Az intenzívebb levegőztetés miatt könnyebben kiszárad a tenyészet. 5) Toronyreaktor Az elve hasonlít egy rektifikáló kolonnára: fentről engedik be a szubsztrátot, amely halad lefelé, és eközben érintkezik az alulról bevezetett (szembeáramú) levegővel. 6) Alagúttípusú reaktor Lassú futószalag felett növényházszerűen fóliából készült „reaktor” komposztálási célra.




39

A fenti reaktorokat mind azzal a céllal fejlesztették ki, hogy a lehető legegyenletesebben szolgálják ki a tenyészet igényeit, és ugyanezen célból legyen beavatkozási lehetőség, azaz bizonyos paramétereket szabályozni lehessen. Szabályozni lenne érdemes a páratartalmat, oxigénkoncentrációt, pH-t, hőmérsékletet. Az alábbiakban néhány példát sorolunk fel ipari szilárdfázisú fermentációra. A) Élelmiszerek előállítása: Penicillium camember, Aspergillus sojae B) Enzimek előállítása: α-amilázok, proteázok Aspergillus oryzae-vel, cellulázok, pektinázok Aspergilus niger. C) Növényvédőszerek: bioinszekticid – Beauveria bassiana (ld. később), biopeszticid – Fusariumok- ellen antagonista gomba (Trichoderma harzianum) termelése SSF technikával. D) Csiperke (Agaricus bisporus) és laska (Pleurotus ostreatus) gombák termesztése. E) Komposztálás kevert tenyészettel, szabadban. Fontos a levegő arány és a páratartalom. Önmelegedő folyamat. Alkalmas technika a szennyvíziszapok (veszélyes hulladék) kezelésére.



40

2.


AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA BIOKÉMIAI ÉS FIZIOLÓGIAI HÁTTERE

2.1. Szénforrások hasznosulása, különleges metabolizmusok A mikroorganizmusok anyagcsere-folyamatai rendkívül szerteágazóak ezért célszerű valamilyen rendszerben tárgyalni őket. A legegyszerűbb megoldás a szénforrások szénatomszáma szerinti sorbarendezés. C1-források hasznosulása [19] Az 1 db szénatomot tartalmazó szubsztrátok száma igen csekély, ám a mikrobák szerepe itt sem elhanyagolható. Ide sorolhatók a metán (CH4), metil-halogenidek (CH3X, X: Cl, Br, stb.), metanol (CH3OH), metil-amin (CH3-NH2), hangyasav (HCOOH), metilszulfid ((CH3)2S)) és a szén-dioxid (CO2). A szén-dioxid-hasznosító mikrobákat metanogéneknek, a többi C1 szubsztrátot hasznosítót metilotrófnak szokás nevezni. Előbbiek definíció szerint szén-szén kötés nélküli szubsztrátot használnak, többnyire oxigén segítségével (tehát aerobok), a metanogének jellemzője pedig a metántermelés. A felsorolt szubsztrátok hasznosítására képes mikrobákat a természetes szubsztrátok környezetéből lehet izolálni: metanolt növények felszínéről (metanol=faszesz), metilamin a halak és növények bomlásakor keletkezik, metilhalogenidet és metilszulfidot pedig a tengeri algák termelnek nagyobb mennyiségben. A C1 szubsztrátok hasznosítása olyan előnyökkel jár, mint a csekély verseny (ipari szempontból ez könnyebb containmentet jelent, azaz csökken a fertőzésveszély), és olcsó kőolajalapú nyersanyagok jöhetnek számításba (ez mindig relatív). Metilotrófok a környezetvédelemben A földi élet szempontjából fontos tevékenység, hogy a metilotrófok az üvegházhatást okozó anaerob lebontások végtermékeként keletkező metánt (21x több hőt tart vissza, mint a szén-dioxid) széndioxiddá oxidálják. Másik fontos metilotróf tulajdonság, hogy számos olyan környezetre káros anyagot képesek átalakítani kevésbé toxikus vagy ártalmatlan vegyületté, amelyek nem igazi szubsztrátjai a mikrobának (nem kerülnek be a sejtbe és haladnak végig valamelyik anyagcsereúton), így a metilotrófok talajremediációban is hasznosíthatók szennyezők, illetve hulladékok lebontására. Metilotrófok a biokatalízisben Kissé szokatlannak tűnhet a metanol (és társai) mint szubsztrát (ok), ám a XX. Század közepén az olajárak kedvező szintjén komoly próbálkozások és beruházások történtek, például a brit ICI vállalatnál kőolaj eredetű metanolon történő SCP (single cell protein) gyártásra. Akkor a metilotróf mikroba összetételét találták táplálkozástanilag megfelelőnek (emberi és) állati fogyasztára. A metanolhasznosítás és a „Metanolalapú társadalom” ma reneszánszát éli, és ennek jelentős magyar vonatkozása is van. Az 1994-ben kémiai Nobel-díjjal kitüntetett Oláh György kémikus 2005-ben jelentette meg „A kőolaj és földgáz után: a metanolgazdaság” című értekezését [10]. Ebben 4 érvet sorol fel a metanol mint a gazdaság központi és meghatározó szereplője mellett: 1) a fosszilis készletek (kőolaj, földgáz, szén) fogytán vannak, 2) a légköri CO2-ből és CH4-ből (üvegházhatást okozó gázok) előállítható, 3) egyszerre lehet energia- és nyersanyagforrás, és 4) könnyen tárolható. A Nobeldíjat egy különleges reakciómehanizmus felfedezéséért kapta Oláh György, amely reakcióban „carbocation” keletkezik intermedierként. Ugyanez a köztitermék fordul elő a metánból történő bázikuskatalizátor melletti oxidáció, illetve szén-dioxidból induló redukció során. Az már © Németh Áron, BME


2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere

41

ismert volt, hogy metán oxidációjával hangyasav vagy formaldehid keletkezik, de az új reakciómechanizmussal e két termék reakcióját is lehetett magyarázni, amely reakció viszont metanolt termel (2.1.1. ábra).

2.1.1. ábra: Metanol-előállítás szén-dioxidból és metánból Ezek szerint a metanol a természetben is előfordul, és viszonylag környezet- illetve költségkímélő módon szintetikusan is előállítható, tehát egy állandóan rendelkezésre álló, olcsó, tiszta szubsztrát. Ez alapján a jövő biotechnoógiájának egyik kihívása lehet, hogy a metilotrófokat kiaknázhatóvá tegye, azaz a metabolizmus fő fluxusait a főtermék felé lehessen átirányítani, és ezt a fluxust a költséghatékonysághoz szükséges szintre lehessen emelni, illetve a melléktermékképzést (tárolás során képződő metabolitok vagy bomlástermékek, szekretált fehérjék, védekezőrendszerek ((enzimek, antibiotikumok)) lehessen csökkenteni. Mindehhez azonban a metilotrófok anyagcseréjét kell jól ismerni. A metilotrófok a metanolból és a metilaminból is a toxikus intermediert, a formaldehidet képezik, amelyből szén-dioxidot és energiát termelnek, utóbbit redukált koenzimek (NADH2) formájában, illetve a formaldehid vagy ribulóz 5-foszfáthoz kapcsolódik és a RuMP ciklusba kerül (ehhez kapcsolódnak a bioszintetikus utak), vagy szerint képez, és a szerin-cikluson keresztül kapcsolódik a többi asszimilációs úthoz. A metanogének ugyanezt az elvet követik, de első lépésként metánmonooxigenáz-enzimmel (pMMO) a metánból metanolt képeznek, ahonnan már azonosak az anyagcsereútjaik a metilotrófokéval (2.1.2. hyperpicture)

2.1.2. hyperpicture: Az ipari mikrobiológiában fontos anyagcsereutak összefoglalása C2-metabolizmus Az egyedüli, cukrokhoz kissé hasonló kétszénatomos molekula a glikolaldehid. A legegyszerűbb cukorszerű molekula, ezért „dióznak” is lehet nevezni. A pterin szintézisben játszik szerepet (purinbázis, GTP-ből), és ezen keresztül a fólátok előállításában, amelyek bioszintézisek kofaktorai. A szénhidrátok szintézisének első lépcsője, hogy a formóz reakcióban két formaldehidből glikolaldehid keletkezik, majd újabb formaldehid beépülésével glicerinaldehid, amiből izomerizációval dihidroxiaceton, és ez a glicerinaldehiddel ribulózt, izomerizáció után ribózt eredményez (2.1.3. ábra).



42


2.1.3. ábra: Cukorképződés glikoladldehiden keresztül [11] Ezzel együtt azon tulajdonsága miatt is kutatják, hogy 2 formaldehidből keletkezik egy glikolaldehid, és ezt a reakciót (a saját képződését) a glikolaldehid katalizálja, tehát ez az első önreplikáló mehanizmus. A spontán ribózképzés és az önreplikációs képesség miatt az élet nyomainak világűrbeli keresése során az űrkutatás fókuszában áll, továbbá szerin, triptofán, gyógyszer és agrokemikáliák szintézisében is használatos. Reaktív volta miatt azonban természetben nemigen fordul elő, így klasszikus szénforrásként nem áll a mikrobák rendelkezésére. Előállítható szintetikusan és enzimesen etilén-glikolból (pl.: Pichia pastoris alkohol-oxidáz 1 segítségével, vagy Aspergillus japonicus glicerinoxidáz enzim segítségével) is etilén-glikolból. A kétszénatomos vegyületek közül az etanolt is képesek a mikrobák hasznosítani és ecetsavvá oxidálni. Míg a már említett crabtree effektus esetén a terminális oxidáció enzimjeinek túlterheltsége miatt NADH2-felesleg keletkezik – aminek segítségével az alkohol-dehidrogenáz-enzim (ADH) redukálja az acetaldehidet etanollá –, addig a katabolitrepresszió elmúlásával (azaz a cukor elfogyása után) az etanolt NADH2 (~energia)- termelés mellett ecetsavvá oxidálja a mikrobák egy része szintén ADH segítségével. C3-metabolizmus A három szénatomos cukrok (triózok) az első olyan molekulák, ahol a cukormolekulának aldehid (glicerin-aldehid) és keto formája (1,3-dihidroxiaceton) is létezik. Ezek mellett maga a glicerin is (ami ketocsoport nélküli triol) népszerű három szénatomos szénforrrás. A propionsav-baktériumok pedig a tejsavat is képesek három szénatomos szubsztrátként hasznosítani. A glicerinmetabolizmus útvonalait az 1.1. fejezetben már bemutattuk (1.1.8. ábra) A tejsav mikrobiális előállítását az 1.3. fejezetben már tárgyaltuk. A tejsav felhasználását a propionsav-baktériumok úgy végzik, hogy első lépésben piroszőlősavvá oxidálják (NAD+ független laktát-dehidrogenáz (LDH) segítségével), majd az bekerül a citrát-körbe (oxálecetsavval), és onnan kerül ki propionil-CoA formájában. Általában 3 tejsav molekulából 2 propionsav és 1 ecetsav keletkezik 1 szén-dioxid távozása mellett.




43

A propionsav-baktériumok tejsavfogyasztó tulajdonságát a tejsavtermelő mikrobák keresésekor is kihasználják a screening vizsgálatoknál a következőképpen: a tápagaron kinövesztik az izolátumokat, UV-val elölik azokat, s föléjük újabb agarréteget öntenek, amelyben nincs szénforrás, és amelyet Propionibacterium shermanii-val beoltanak. Ez egyéb metabolizálható szénforrás híján csak azon izolátumok fölött fog kinőni, amelyek termeltek tejsavat. C4-metabolizmus Négy szénatomos cukor- (szerű) molekulák a glicerin (glycerol) analógiájára az eritrittel (másnéven eritritollal) kezdődnek, amelynek mind a 4 szénatomján 1-1 OH-csoport található (2.1.4. ábra). Jelentősége, hogy belőle Gluconobacter sejtek fermentációjával eritrulózt lehet előállítani a kozmetikai ipar számára, mert bőrbarnító szerként (a dihidroxiacetonra érzékenyek részére) forgalmazzák. Az eritrulóz (ketoforma) aldóz formáját eritróznak nevezzük.

2.1.4. ábra: Eritrittől az eritrózig A négy szénatomos cukrok közé tartozik a treóz is, amely az eritróz izomerje. A két középső OHcsoport nem transz, hanem cisz helyzetű a treóz esetében. Az eritróz metabolizmusról keveset lehet tudni (leszámítva, hogy Bertrand már 1900(!)-ban leírta a Gluconobacter suboxydans tenyészet eritrit-ertiróz átalakítóképességét), de nagy valószínűséggel foszforilálódik, majd pedig vagy észterképződik belőle, és szedoheptulóz formájában hasznosul [12], vagy a pentózfoszfát-ciklusba kerül, és energiatermelésre fordítódik [13]. C5-metabolizmus

2.1.5. ábra: Pentóz-foszfát ciklus [14]



44


Az öt szénatomos cukrok javarészt a pentóz-foszfát ciklusban (PFC, angolul: PPP-Penthose phosphate pathway) hasznosulnak (2.1.5. ábra). Ennek funkciója egyrészt, hogy redukált koenzimet (NADH2) termeljen, amelyből a terminális oxidáció energiát raktároz ATP formájában. Ezen felül a ciklusban számos alapvegyület található, amelyek előállítása is a PFC feladata (ribulóz 5-foszfát, szedoheptulóz7-foszfát, Fruktóz-6- foszfát, glicerin-aldehid-3-foszfát stb.). Amint az ábráról is látszik, a ciklus egy oxidatív, és egy nem oxidatív szakaszra bontható. Előbbi feladata a dekarboxilezés, utóbbié a cukrok felépítése, illetve a lebontó anyagcsere számára a glicerin-aldehid-3-foszfát előállítása. C6-metabolizmus A cukorhasznosítás központi útvonala a glikolízis. A hat szénatomszámú cukrok elsősorban ezen keresztül jutnak el a piroszőlősavig, majd a TCA cikluson keresztül szén-dioxidként a légkörbe és NADH2-ként a terminális oxidációba kerülnek aerob körülmények esetén. Egyes esetekben (pl. heterolaktikus erjesztés) egy dekarboxileződés után a pentózfoszfát-ciklusba kerülnek, és azon keresztül jutnak el a piroszőlősavig. C7-metabolizmus A hét szénatomos cukrok kevésbé jellemzőek a mikrobiális anyagcsere-folyamatokban, mint kisebb szénatomszámú társaik. Leggyakoribb képviselőjük a szedoheptulóz (2.1.6. ábra).

OH

OH

OH

HO OH

OH

O

2.1.6. ábra: Szedoheptuloz Nevezéktanuk is eltér a kisebb cukormolekuláktól: a hét szénatomos szerkezetet általában két kisebb szénatomszámú cukor nevéből nevezik el (2.1.7. ábra) Jelentőségük a mikrobiális liposzaharidokban van.

OH

H

OH OH

OH OH D-gluco

OH

OH

D-glicero

2.1.7. ábra: D-glicero-D-gluko-heptulóz Speciális energianyerő metabolizmusok (biometallurgy) A szénforrások gyakran az energiaforrás szerepét is betöltik, az alábbiakban azonban olyan különleges mikrobák kerülnek bemutatásra, amelyek szokatlan reakciókkal nyerik a szükséges energiát. Ilyenkor gyakran különböző fémek redox átalakításának pozitív energiamérlegét aknázzák ki a mikrobák, ezért iparilag is fontos lehetőséget rejtenek ezek a metabolizmusok a biobányászat (biometallurgia) területén. Az érckinyerés és –feldolgozás együttes neve a metallurgia. Ebben tudnak a speciális anyagcseréjű mikrobák segíteni, ezért nevezik ezt biometallurgiának. A metallurgiában az ásványokban kötött fémek kinyerésére vagy a klasszikus olvasztást használják, vagy valamilyen kioldást (=angolul: „leaching”). A leaching során 4-féle eljárás áll rendelkezésre:




45

1) savas kioldás (pl.: Zn), 2) lúgos kioldás (pl.: Al), 3) magas hőmérsékletű kioldás (pl.: S2-), 4) kioldás komplex képzéssel (Au). Ilyen kioldási folyamatot képesek a mikrobák is előidézni („bioleaching”), például a kalkopirit (2.1.8. ábra, legelterjedtebb rézásvány, CuFeS2)-ből a réz kioldására képesek az Acidiphilium-törzsek (A. multivorum, A. cryptum, A. organovorum) a 2.1.1. egyenlet szerint. Az Acidiphiliumok az alfaproteobakterek közé tartozó valódi baktériumok.

2.1.8. ábra: Kalkopirit [15]

CuFeS2  4 Fe3  Cu 2   2 S0  5 Fe2  2 Fe2   2 H   0,5 O2  2 Fe3  H 2O

2.1.1. egyenlet

Ezeket a szokatlan – és nemrégiben felfedezett – mikrobákat Peng és mtsi [16] a következőkkel jellemezte: Gram-negatív spórátlan pálcák, amelyek hőmérsékleti optimuma 40°C, pH optimuma 3,5 (!). A tenyésztésükhöz használható tápközeget a 2.1.1. táblázat mutatja be, amelyen 40 óra alatt lezajlik a fermentáció. 2.1.1. táblázat: Acidiphiliumok tápközege Komponens (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O K2HPO4 KCl Ca(NO3)2 Szerves anyag Élesztő kivonat

Koncentráció (g/L) 3 0,5 0,5 0,1 0,01 2 0,01%

A tenyészetet FTIR-rel vizsgálva megállapították, hogy polihidroxibutyrate-ot termel. Jó növekedést tapasztaltak ramnóz, xilóz, mannit, fruktóz, glutaminsav és glicerin szénforrásokon, de nőtt szaharózon, laktózon, hisztidinen, glutaminon és etanolon is. Tetraciklinnel és ampicillinnel szemben érzékenynek találták ezeket a mikrobákat, míg a sejtfalszintézist gátlókkal (penicillinek cefalosporinok) szemben nem. © Németh Áron, BME


46


Rendszertanilag a valódi baktériumok (Eubaktériumok)\Alfaproteobakterek\Nitrospira csoportba tartoznak közeli rokonaikkal a Leptospirillumokkal együtt. Ez utóbbi baktériumok vasoxidálók, ezért a vaskinyeréshez használják iparszerűen óriási folyamatos üzemű oxidáló tartályokban. Nagy hasonlóságot mutatnak, de a filogenetika szerint nem közeli rokonok a fentiek a szintén acidofil vasoxidáló Ferroplasmákkal. Például a Ferroplasma acidophilum egy 35°C-os hőmérsékleti optimummal rendelkező (mezofil) savkedvelő mikroba 1,7(!) pH optimummal, amely főleg a savas bányameddőben (salak) található meg, különösen a pirit- (FeS) tartalmúban. Általában azért ezekben a savas ércmaradványokban tenyészik, mert itt már más mikrobák (pl.: Leptospirillumok és Acidiphilumok) lesavanyították a pH-t, olyan mértékben, amely az autotróf Ferroplasma számára optimális. Ilyen körülmények között Ferroplasma már tud energiát nyerni a pirit Fe2+ ionjainak oxidálásával, amelyhez O2-t használ terminális akceptorként. A folyamat során melléktermékként kénsav termelődik. Ez tovább savanyítja a tápközeget.

2.2. Primer metabolitok Az életfolyamatok következtében a tápközegbe kikerülő metabolitokat nevezzük elsődleges (primer) metabolitoknak. Az életfolyamatokat a hasznosítandó szubsztrátok szerint csoportosítva már bemutattuk (2.1. fejezet). Általában a különböző erjedések (amelyeket már szintén tárgyaltunk 1.3. fejezet) termékei tartoznak ide, mint etanol, ecetsav, tejsav, propionsav, 1,3-propándiol, aceton, butanol, vajsav. Ezek némlyikét élelmiszer-ipari, de főleg vegyipari célokra, illetve bioüzemanyagként használják. Mindezek azt jelentik, hogy nagy mennyiségben alacsony áron kell ezeket előállítani, ezért igen hatékony anyagcseréjű termelő mikrobákra van szükség, amely képes jó hozammal jó konverziót elérni viszonylag gyorsan (=jó produktivitás). Fiziológiai szempontból általában az energiatermelő folyamatok (NADH2 regenerálás, glikolízis, TCA ciklus stb.) melléktermékei.

2.3. Szekunder metabolitok De novo szekundermetabolit-termelés A primer metabolitokkal szemben a szekunder metabolitok termelése nem a normál életfolyamatok következménye, hanem a speciális környezeti feltételek által kiváltott reakcióé. A szekunder metabolitok funkciója ugyanis előnyszerzés biztosítása megromlott életkörülmények (megváltozott pH, csökkent tápanyag, csökkent élettér) esetén. Ilyen helyzeti előnyök kovácsolásával elősegíthető az egyed és a faj fennmaradása „nehéz időkben” is. Társadalmi szempontból a mikrobiális és növényi szekunder metabolitok játszanak fontos szerepet. A szekunder metabolitokkal kapcsolatban néhány fogalmat illik tisztázni: anti- biosz=élet elleni, tehát az antibiotikum minden élőlény elleni szer inhibítor=gátlószer, ami lassítja, vagy megállítja a növekedést …sztatikum= leállítja a növekedést (pl.: fungisztatikum) …cid=pusztító (bakteriocid, fungicid, viricid) A helyzetielőny-szerzésre különböző stratégiák közül választhat egy adott élőlény: A) Mozgás (baktériumok, protozoák mozgásszervvel rendelkezhetnek, és vizes közegben képesek a helyváltoztatásra, növények pedig helyzetváltoztatásra). B) Terjeszkedő típusú növekedés (pl.. fonalas gombák gyors kolonizációja, mindent beborító penészfonalak, ehhez szükséges a félnedves szubsztrát). C) pH megváltoztatása metabolitokkal: savtermelők (pH-t le), ammonifikálók (pH-t fel) D) Hőmérséklet lokális megváltoztatása a mikrokörnyezetben (pl.: nagy mennyiségű metabolikus hő termelése, ami megemeli a hőmérsékletet (pl.: komposztban, silóban), és ez kedvez a termofileknek. E) Sziderofórok (erős fémkomplexképzők) közegbe bocsátásával az enzimek esszenciális fémkofaktorainak elszívása.




47

F) Antibiotikumok (szekunder metabolitok) termelése, amelyek a többi élőlényre káros hatással vannak (sejtfalszintézist, fehérjeszintézist gátolnak stb.). G) Extracelluláris enzimek termelése több célból is, például a nehezen hozzáférhető szubsztrátok mobilizálására (amilázok, cellulázok stb.), vagy a konkurencia bontására (lizozim, kitináz stb.) Az ipari mikrobiológia szempontjából az F) és G) pontok az érdekesek, ám figyelembe kell venni, hogy a természetben az így kibocsátott anyagok (szekunder metabolitok és extracelluláris enzimek) csak mikrokörnyezetben kell hogy hassanak, ezért a természetből izolált termelő törzsek csak kis koncentrációban termelik ezeket az ágenseket, illetve a túl nagy dózis a termelő mikrobát is károsíthatja. A legfontosabb szekunder metabolitokat foglalja össze 2.3.1. táblázat. 2.3.1. táblázat: A legfontosabb mikrobiális szekunder metabolitok.

A szekunder metabolitok működését hatásuk szerinti csoportosításban mutatjuk be [17]. © Németh Áron, BME


48


Antagonizmusok kialakítása 1A) gomba és baktérium küzdelme során a Cephalosporium gramineaum fonalas gomba a baktérium sejtfalszintézisét gátló antibiotikumot termeli, de csak az őszi búza felszínén (in vitro Petri csészén nem) 1B) mikoparazitizmus: egyik gomba a másik élősködője. Pl.: az északi fenyő parazitája egy rozsdagomba (Monocillin nordinii), amelyen élősködik a Cronartium coleosporioides gomba, és ezt antibiotikum termeléssel éri el. Ezt az antibiotikumot fel lehet használni a fenyőkártevő ellen. 1C) bakteriális predáció áll fenn a Mixobaktériumok és áldozataik között, amely utóbbiakat antibiotikum segítségével ölik el Olykor előfordul olyan is, hogy saját fajtársai ellen termel antibiotikumot egy mikroba, pl.: Pseudomonas phenazinium (fenazin típusú antibiotikumot termel), és az antibiotikumot nem termelő fajtársaikat alaposan túlnőtték. 1D) bakteriális kompetíció: az amőbák általában baktérimokat esznek, de egyes baktériumok (pl.: Serratia marcescens) piros pigmentanyagot termelnek, ami elöli a protzoát (az albino, azaz pigmentmentes fehér baktérium nem váltott ki cisztásodást, spóraképzést pusztulást az amőba részéről) 1E) mikroorganizmus kölcsönhatása magasabb rendű élőlényekkel: gyakran toxintermelés (növény ellen fitotoxin, ami gyakran más mikrobákra is antagonizmussal hat, mintegy antibiotikum), amire a növény fitoalexin (~növényi antibiotikum) kiválasztásával válaszol. 1F) mikrobák inszekticid hatására példa a Beauveria bassiana (fonalas gomba) rovarok ellen, illetve a Bacillus thüringiensis endospórájának ciklikus δ-toxinja a szúnyogok ellen. A kullancsok is rendelkeznek letalitással járó gombás parzitával. A kullancsok természetes ellenségeinek felhasználása a kullancspopuláció visszaszorítása érdekében a „Biokontroll”. Mivel 4 ellenségét ismerjük a kullancsoknak, ők a potenciális jelöltek a biokontroll-funkció betöltéséhez. sisakos guineai madár kullancsokkal táplálkozik, ám ha sikerülne vele kullancslétszámot csökkenteni, akkor a madárpopuláció is csökkenne, ettől megint nőhetne a kullancsok száma, ekkor a madarat újra kellene telepíteni b) kullancsok rovar parazitája az Ixodiphagus, amely a darázsfélékhez tartozik, és 0,1-5 mm-es nagyságú. Petéit a kulllancsba rakja, amelyek kikelésükkor megölik a kullancsot c) fonalféreg- (nematóda) parazitával, de ez csak a vérrel magát jól teleszívott nőstény kullancson hat d) fonalas gombák parazitizmusa: Metarhizium anisopliae (zöld mészkór), Beauveria bassiana (fehér mészkór), Lecanicillium psalliotae, Paecilomyces fumoroseus). A Metharizium anisopliae [18] már rendelezik ipari felhasználással a maláriaszúnyog, kullancs- és termeszirtások során. Az imperfect gombák aszkomiceta csoportjába tartozik. 2007 óta ipari lipáztemelő is, mert az indiai biodízelgyártás során szobahőmérsékleti optimummal rendelkező lipázokra volt szükség. Inszekticid hatásának kifejtésekor megkapaszkodik a konidiospórája a rovar felszínén, és kutikulumbontó enzimekkel hifát növeszt a rovar kültakarójába. Amint átér a rovar páncélján, találkozik annak immunrendszerével, ezért vagy maszkíroznia kell magát, hogy az immunrendszer ne taszítsa ki, vagy immunszupresszánsok termelésével csökkenti az immunrendszer hatékonyságát. A M. anisopliae metabolitjai a destruxinok, amelyek 5 aminosavból és hidroxisavból felépülő cirkuláris fehérjék. Ez lehetőséget teremt a rekombináns biopeszticid termelésre. A destruxinok egyébként citotoxikusak, mert Ca2+ transzportot végeznek, és így az izmokat is blokkolják. Már több mint 30-féle destruxin szerkezetét derítették fel és írták le. a)




49

1G) Mikrobák antagonizmusa magasab rendű álatok (és ember) felé: például a fuzáriumos búza nem alkalmas még takarmányozási célra sem, mert a károsító fuzáriumok mikotoxinokat termelnek, amelyek mind a haszonállatot, mind az embert veszélyeztetik. A ragadozók is a mikrobák temelte mikotoxinok miatt esznek általában friss húst, kivéve a dögevők. A poshadt víz ivásakor a vízben lévő algák termelte toxinok okoznak rosszullétet. 2) Fémionszállító metabolitok A fémionok (főleg kationok) fiziológiai szerepe meghatározó, mivel az enzimkatalízis kofaktorai, ezért egyes esszenciális fémionok elszívása a konkurencia elől komoly előnyhöz juttatja a fémionszállító metabolit termelőjét. A nitrogénfixáló baktériumok esetében például a nitrogenáz- enzim Mo2+ jelenlétében a legaktívabb, más fémionokkal csökkent aktivitású. A fémionszállító metabolitok általában ionofórok, azaz olyan transzmembrán ágensek (többnyire peptidek), amelyek az ionok (elsősorban alkáli, és alkáliföldfém) áramlását a sejtmembránon keresztül meghatározzák vagy aktív transzporttal, vagy csatornaképzéssel. A vasszállító faktorok (=sziderofórok) sok esetben antibiotikus hatásúak. A primer és szekunder metabolitok határán helyezhetők el, mert ugyan nem szükségesek a növekedéshez, de vashiányos körülmények között stimulálják a növekedést. A mikrobasejteknek kétféle fémszállító rendszere van: egy kis és egy nagy affinitású. Utóbbihoz tartoznak a sziderofórok is. Amíg van elegendő fémion jelen, addig a kis affinitású rendszer működik. Ám a fémion csökkenése (pl.: valamilyen kelátképző megjelenése miatt) aktiválja a sziderofórtermelést. Számos Streptomyces, Nocardia és Micromonospora faj termel sziderofór faktorokat. A sziderofórok antibiotikus hatása abban nyilvánul meg, hogy termelőjük kiéhezteti a konkurenciát vas szempontjából, mivel az nem képes a vas-szideramin komplex felvételére, és így nem jut vashoz. A sziderofór termelője pedig komplex formában lévő vasat veszi fel. Ilyen antibiotikum a nocardamin és a desferritriacetilfusigen. Az ionofórok feladata mikrobákban, hogy segítsenek fenntartani a magas intracelluláris K+/Na+ arányt is, azaz a koncentráció gradiens miatt kijutott káliumionokat visszapumpálják a sejtbe, miközben a szintén koncetrációgradiens miatt bejutott nátriumionokat kipumpálják a közegbe. Az ionofór antibiotikumok közé tartoznak az enniatinok is, amelyek a destruxinokhoz hasonlóan ciklikus peptidek és a K+/Na+ transzportban vesznek részt [20]. Piacon lévő ionofór antibiotikumok a calcimycin, ionomycin, lysocellin és a lasalocid, amelyek a Grampozitív mikrobák ellen hatásosak. 3) Mikroba és növény szimbiózisa szekunder metabolitok segítségével 3A) Tipikus példa a növény-fonalas gomba szimbiózisára az ektomikorhiza, ahol a növényi tápanyagfelvételt a gyökér körül elhelyezkedő fonalas gomba segíti. Ilyenkor gyakran (pl.: fenyőféléknél) termelnek a növény védelme céljából antibiotikus hatású szekunder metabolitokat a baktériumok ellen, csökkentve a betegségveszélyt, és előnyhöz juttatva a szimbiózist a tápanyagversenyben. 3B) Sziderofórok segítségével baktériumok is élhetnek növényekkel szimbiózisban, ahol a sziderofórt termelő baktérium segíti a növény növekedését. A pszeudobaktin termelő Pseudomonas fluorescens vagy Pseudomonas putida például elszívja a vasat a kórokozók elől egy lineáris hexapeptid (sziderofór) segítségével. 4) Mikroba -nematóda szimbiózisa szekunder metabolit segítségével Xenorhabdus luminescens baktérium és rokonai a Xenorhabdus fonalférgek endoszimbionitái. Ez a szimbiózis együtt támadja meg a rovarokat, amelyeket a baktérium által termelt antibiotikum pusztít el, és amely antibiotikum a többi baktériumot is távoltartja a rovartetemtől.



50


5) Mikroba-rovar szimbiózist is lehetővé tesznek egyes szekunder metabolitok Erre példa a rizsen élő barna szöcske, amelyben élő Bacillus polymyxin polymyxin antibiotikumot termel (ami egy ciklopeptidből és egy hidrofób farokból áll, és a Gramnegatívak lipopoliszaharid rétegét károsítja), és így védi a szöcskét a rizs flórájától (pl.:Xanthomonas campestris) . 6) Ferromon szerepű szekunder metabolitok 6A) A Mucorales nemzettségnél hím(+) és nőstény(-) ivarú gaméták találkozásakor a heterotallikus (+ és -) hifákból történő zigóta kifejlődéséhez trisporinsav szükséges, de ennek bioszintetkus útvonala részben a +, részben a - ivarú fonalakon van kódolva. 6B) Allomycesek esetében a szirenin nevű szekunder metabolitra a mozgékonyabb hím gaméták a nőstények felé vándorolnak kemotaxissal. 6C) Egy különleges szimbiózis esetében a rovar (poszméh) nemi ferromonját az emésztőcsatornájában élő Aspergillus ochraceus termeli. 7) Morfológiai differenciálódást is befolyásolnak a szekunder metabolitok Az antibiotikum-termelés gyakran a prespora fázisban történik, a vegetatív forma hanyatló fázisában. A spórázás és az antibiotikum-termelés közötti kapcsolatot többféleképpen is bizonyították, például egyes asporogén mikrobák elvesztették antibiotikum-termelő képességüket, illetve a spóraképzés inhibitora gátolta az antibiotikum-termelést is. A Bacillus brevis a spórájának külső felszínére Gramicidin S-t (szekunder metabolitot) választ ki, amely gátolja az elektrontranszport láncot és a kicsírázást. Extracelluláris proteázzal le tudja hasítani, és így a csírázást megindítani. Penicillium brevicompactum mikofenolsavat termel a kondidium tartók kifejlődésekor, aminek hatására a tartó a fény felé fordul. A másodlagos anyagcsere a primer anyagcsere során keletkező metabolitokból építi fel a szükséges szekunder metabolitokat. A főbb útvonalak az acetil-CoA-ból keletkező lipidek, illetve az oxálecetsavból induló szekunder metabolitok, valamint a szintén acetil csoportból induló terpenoidok. A szekunder metabolitok előállítását számos tényező befolyásolja. Mind szén-, mind nitrogénforrás tekintetében a nehezebben hozzáférhető, limitált mennyiségű tápanyag kedvez a másodlagos anyagcseretermékek keletkezésének. Így szénforrásból a különböző poli- és/vagy oligoszacharidok kedvezőbbek az egyszerű cukroknál. Nitrogénforrásként a fehérjék alkalmazása nem javasolt, mert a belőlük keletkező aminosavak negatív visszacsatolással hatnak a saját szintézisükre, és ezen keresztül a szekunder anyagcserére. Foszforforrás tekintetében is a lassúbb növekedés (limitáció) a kedvező. Néha szükséges lehet egy-egy kulcsenzim termelődésének indukciója a hatékony másodlagos anyagcseréhez, mint például Acremonium crysogenum esetében metioninadagolással lehet a cephalosporin-szintézist fokozni, vagy a Claviceps törzseknél az ergot alkaloidok szintéziséhez triptofánadagolást alkalmaznak. További tényezők lehetnek a minor komponensek (fémionok) és az oldottoxigén-koncentráció, amelyek a szubsztrátokhoz hasonlóan hatnak (limitáció a kedvező), illetve a CO2, amely gátolja például a penicillin képződését, vagy a fény, amelyről csak kevés adat áll rendelkezésre. A mikrobaszaporodási fázis (trofofázis) és a termék keletkezésének fázisa (idiofázis) a szekunder anyagcsere sajátosságaként különválik (míg a primer metabolitok termelése általában növekedéshez kapcsolt a termék képződése), és gyakran az idiofázis alatt alkalmazandó hőmérséklet alacsonyabb, mint a trofofázisé. Szteroid- (szekunder metabolit) konverzió A szteroidok közös vonása a kémiai alapváz (2.3.1. ábra), hogy a másodlagos anyagcsere termékei, valamint hogy fontos fiziológiai szerepük van az alacsonyabb rendű és a magasabb rendű élőlények-




51

ben, így az emberben is. Ez utóbbi tulajdonságuknak köszönhetően a gyógyszeripar számára régóta fontos vegyületek, így előállításuk és hasznosításuk számos kutatás tárgya.

2.3.1. ábra: A szteránvázas alapvegyület – a koleszterin– szerkezete Bioszintézisük során a sejtek acetil-CoA-ból építik fel több lépésben az allilpentenil-pirofoszfátot és az izopentenil-pirofoszfátot, amelyek addíciójából szkvalenon keresztül épül fel az alapvegyület, a lanosterin. A szteroidneogenezis során ennek módosításával keletkezik a többi szteránvázas vegyület. A szteroidok csoportosítása a funkció és a bioszintézis, valamint a termelő élőlény szerint történik (2.3.2. ábra), így megkülönböztetünk:

2.3.2. ábra: „Szteroidok családfája” [22] - Állati szteroidokat - ízeltlábúak szteroidjai - gerincesek szteroidjai - hormonok: a kortikoidok olyan hormonok, amelyeket a mellékvesekéreg termel (innen a név cortex – kéreg). Megkülönböztetjük a sóháztartásban szerepet játszó mineralokortikoidokat és © Németh Áron, BME


52


a cukorháztartásban szereplő glükokortikoidokat, valamint a nemi hormonokat (női/férfi nemi szervek termelik, pl.: ösztrogén, progeszteron, tesztoszteron), illetve az anabolikus szteroidokat, amelyek androgénreceptor-stimulátorok, és így az izomnövekedést serkentik. - koleszterin: sejtmembrán-fluiditásért felel - növényi szteroidok – fitoszterinek: általában a szteroidkonverzió ipari alapanyagai (2.3.3. ábra), fiziológiai funkciójuk éppúgy a sejtmembrán befolyásolása, mint az állatok esetében a koleszteriné. - gomba eredetű szteroidok – ergoszterinek

HO

HO

HO Szitoszterin

Sztigmaszterin

Kampeszterin

2.3.3. ábra: Ipari alapanyagként hasznosított fitoszterinek Mint az a fentiekből kitűnik, a humánszervezetben nagyon fontos szabályozó szerepet töltenek be a szteroidok, ezért a gyógyászati célú előállításuk több évtizedes múltra tekint vissza. Ezek kezdetben kizárólag szintetikus vegyipari lépéseket tartalmaztak, ám a környezetvédelmi előírások szigorodásával és a sztereokémia fejlődésével a biokémiai lépések egyre nagyobb teret nyertek. Mivel ilyen vegyületek esetében az optikailag aktív formák több kiralitáscentrummal is rendelkeznek, és a szteránváz egy egy pontján sztereoszelektív védőcsoportok alkalmazásával, majd eltávolításával oldható csak meg a biológiailag aktív vegyület előállítása. Ezért célszerűbb a mikrobák enzimeinek sztereoszelektivitását kihasználva egy-egy specifikus módosítást általuk elvégezetni. Mivel azonban ezek a vegyületek a másodlagos anyagcsere termékei, ezért nem az akívan növekedő sejttenyészet végzi a biokonverziót, hanem a felszaporított nyugvó állapotú sejtek indukciót követően valósítják meg a sztereospecifikus átalakítást. Mivel a szteroid szubsztrát nem a mikroba szénforrása (legfeljebb energiaforrás), ezért szinte veszteség nélkül (nagy hozammal) alakítható át termékké. Technológiai nehézséget általában a szteroidok rossz vízoldhatósága jelent, amelyet gyakran ciklodextrinek alkalmazásával küzdenek le. A ciklodextrinek olyan ciklikus poliszaharidmolekulák, amelyek magukba zárhatnak apoláris hatóanyagokat (a gyűrű közepébe), és mivel a ciklodextrinek vízben oldhatóak, így a „beléjük csomagolt” apoláris hatóanyag is oldhatóvá válik. A ciklodextrin belseje és a folyadékfázis között adszorpciós megoszlás áll fent, azaz ha a csekély mértékben oldott molekulát a mikrobák a folyadékfázisból elfogyasztják, helyükre a ciklodextrinekből újabb molekula fog „kioldódni”. A mikrobiális szteroidkonverziók igen széleskörűen alkalmazhatók, de leggyakrabban a 17-βredukció/17-β-oxidáció, illetve ennek valamelyik másik OH-csoporttal együtt történő szinkrón redukciója/oxidációja (pl.: 3,17-diketoszteroid redukció) fordul elő. A 17-es atomon történő oxidáció/redukció az élő szervezetekben is igen fontos, mivel a nemi hormonok egymásba alakulását jelenti. A redox reakciót a 17-hidroxi-szteroiddehidrogenáz-enzim katalizálja, amelynek aktivitása tehát egyes nemi folyamatok felelőse. Ennek alapján a gyógyszeriparban is gyakran használják ezeket az enzimes (vagy nyugvósejtes) biokonverziókat a terápiás hormonkészítmények előállítására. Az első publikáció 1937-ben Saccaromyces cerevisiae-ről írja le ezt a képességet, azóta azonban számos baktériumról (Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium, Mycobacterium, Streptomyces fajokról), gombáról (Aspergillus, Mucor, Penicillum, Hansenula, Pichia, Saccharomyces), algáról (Chlorella, Chlorococcum) és protozoáról (Pentatrichomonas, Trichomonas) derült ki a 17-OH-SDH aktivitás.




53

2.3.2. gyakori mikrobiális szteroidkonverziók kísérő 17-β-redukció hidroxilezés C5 C6 Bacillus sp., Botryosphaerica obtusa C7 C10 C11 C12 C14 C15

Bacillus sp., Botryosphaerica obtusa, Bacillus sp. Bacillus sp., Phycomyces blakesleeanus,

17-β-oxidáció Penicillium crustosum, P.chrysogenum B. stearothermophilus, B. obtusa, P. blakesleeanus Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer Absidia glauca Cephalosporium aphidicola, R. stolonifer A. glauca, B. obtusa Bacillusok A. glauca, Aspergillus fumigatus, B. obtusa

Az alábbiakban néhány jellemző ipari szteroidkonverziót mutatunk be. Ketoredukció Saccharomyces cerevisiae-vel nemi hormonok előállítására A szitoszterinből előállított androsztén-dionból (AD) ketoredukcióval tesztoszteront lehet előállítani, noha az élő emberi szervezetben a férfi nemi hormon koleszterinből keletkezik. A ketoredukciót egyes S. cerevisiae sejtek képesek elvégezni. A tesztoszteronból a C17 metilezésével előbb metil-tesztoszteront (METESZ) lehet előállítani, majd az Arthrobacter simplex baktériummal ismét C1 dehidrogénezést lehet elvégezni, ami Nerobolt eredményez (roboráló szer), illetve a női nemi hormonok bioszintézise is koleszterinből és/vagy tesztoszterinen keresztül történik (ösztrogén/progeszteron). Actinobacter fajok által végzett szteroidkonverziók [24] Szteroid- (oldallánc) lebontás: Számos Actinobacter faj hasznosítja a szteroidokat, mint egyedüli szénés energiaforrást. A lebontási mehanizmus függ a lebontandó szteroid szerkezetétől és a mikroba fajától. Az esztránokat általában az A gyűrű hasításával bontják le, míg a B gyűrű a leghozzáférhetőbb része a molekulaváznak az androsztének és a pregnánok esetében. A koleszterinnél és az epesavaknál a lebomlás kezdődhet az oldalláncon vagy a B gyűrűn. Nocardia fajok és még néhány Streptomyces ismert A-gyűrű-hasító. Ennek ellenére az Actinobacterek többségét a B gyűrű hasításával jellemzik. Elsődleges figyelmet kapnak a biotechnológiában azok az Actinobacterek, amelyek a szterinek oldalláncait bontják, miközben a szteránvázat érintetlenül hagyják. Nocardia restrictus és más Actinobacterek lehetővé teszik a szélső szubsztituens retroaldol eliminációját a C19-en és ösztrogént képeznek 3,17-dioxo-C19(CO2OH)-androsztánból. Az ösztrogénhozam csupán 8% volt, ám 19hidroxiszitoszterol 3-acetát átalakításával 72%- is elérhető. Az Actinobacterek (Nocardia restrictus, Proactynomyces erythropolis stb.) a szetrinek kólsavvá történő alakítását is elvégzik. A szterin oldalláncának lebontása 14 konszekutív biokémiai reakcióból áll, amelyeket legalább 9 különböző katabolikus enzim katalizál. A főbb megoldandó problémák a 3,17-diketoandrosztanok oldallánc lebontásával történő előállításakor a következők: 1) a szteroidváz lebomlása, 2) a reakciótermékek általi oldallánc-oxidáció, 3) szterinek alacsony oldhatósága a vizes közegben. Az 1) probléma kiküszöbölésére a szubsztrát kémiai módosítása, vagy a 9α-hidroxiláz kémiai inhibíciója, esetleg 3KSD blokkolt mutánsok használata jelenthet megoldást. A szitoszterinből az oldallánc lehasításán keresztül Mycobacterium phlei baktériummal állítanak elő számos üzemben androsztendiont (AD, androst-4-én-3,17-dion), amely több hormonális készítmény intermediere. A 70%-os konverziót követően diklóretánnal vagy szelektíven 85%-os metanollal kiextrahálják a fermentlevet, és az extraktumot bepárolják. Az AD szintézis után acetilént addicionáltatnak, és a progeszteron hatású etiszterint nyerik, amelyet tovább is lehet alakítani spironolaktonná (vízhajtó). A termelő Mycobacterium phlei nevét a mykolsavnak köszönheti, amely egy hosszú szénláncú zsírsav a sejtek membránjához kötve. E különleges sejtfalszerkezet miatt nem működik a Gram-festés sem, illetve különösen ellenállóvá válik a mikroba.



54


A mikrobák életében az oldallánc lebontásnak a fiziológiai szerepe az ATP (energia) generálás [23]. Ehhez a katabolikus enzimek 4 csoportját használják a mikrobák fel: a zsírsavak β-oxidációs lebontó enzmeit, az ω-oxidációs enzimeket, a metil-krotonil-CoA karboxiláló rendszert és a propionilCoA karboxiláz rendszert. Ezek 9 enzime vesz részt a szteroidok oldallánclebontásában 14 konszekutív reakcióban, amelyek a következőképpen összegezhetők: 1 szitoszterin +3FAD++3NAD++3 coA→ 3 FADH2+ 3 prop-CoA +3 NADH2 +1 AcOH 3 prop-CoA+1 AcOH →18 NADH2+ 7 FADH2 + 1 AD A keletkezett redukált koenzimek végső oxidációjakor több mint 80 ATP molekula keletkezik 1 oldallánc lebontásakor. A kapott AD a kiindulási intermediere az etiszterinnek (progeszteron hatású, kémiai úton acetilén addícióval előállított AD) és a progeszteronoknak Hidroxilezés: Az Actinobacterok képesek a szteránváz hidroxilezésére különböző pontokon (1,2,6,7,9,11,12,14,15,16,17). A 9a hidroxilezést a Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus és Mycobacterium nemzetségek egyes fajai végezhetik. Az Actinobacterok ketoszteroid-9-hidroxilázát (9-KSH) eddig nem írták le részletesen, valószínűleg az izolálási és tisztítási nehézségei miatt. Egy ternér 9-KSH komplexet, amely flavoprotein reduktázt és ferredoxint is tartalmaz, izoláltak egy Nocardia fajból. Az Arthrobacter oxydans 9-KSD-a és 3-KSD-a is plazmidon kódolt, de a nukleotid szekvenciájuk még nem ismert. A Rhodococcus 9-KSH-a egy dimer monoxigenáz részt tartalmaz, és a kódoló géneket is azonosították már. Az Actinobacterok 11a és 11b hidroxilálóképessége egy ritka tulajdonság. Reichstein’s szubsztrátot hidroxileztek Streptomyces fradiae segítségével hidrokortizonná, de csak csekély hozammal (1,5%). Az Actinobacterok azon tulajdonsága, hogy képesek a szteroid vegyületeket a 22,23,24, és 26-os pozicióban is hidroxilezni intenzív kutatás alatt áll, ami ahhoz is vezetett, hogy feltárják a szteroidoldallánc lebomlásának mehanizmusát. Mycobacterium fortuitum szitoszterin átalakítása közben találtak 22-es atomon történt hidroxilezés 3-oxo-4én származékait. A további kutatások pedig azt mutatták, hogy a szterinek sorozatos hidroxilezése az oldallánc ezen poziciójában az Actinobacterok által végzett oldallánclebontás egyes lépései. A hidrokortizon-előállítás első lépésében Mycobacterium smegmatisszal a szitoszterin oldalláncát eltávolítják, és a baktérium ugyanazon fermentációban a C9-re OH-csoportot is bevisz (hidroxilez). Az így kapott 9α-hidroxi-androszténdionból kémiai átalakításokkal állítják elő a hidrokortizont (2.3.4. ábra). Ezek első lépése a vízelvonás, majd vízaddició (e kettő következtében az OH csoport átkerül 9-ről a 11-es szénatomra), majd oldallánc-kialakítás következik acetilénnel, végül annak módosítása. A fermentációs lépéshez glicerint adnak szénforrás gyanánt, a szitoszterin oldallánchasítása pedig – az előbbi példához hasonlóan – az energiát szolgáltatja a sejtek számára. Mivel a szitoszterin kristályos formában van jelen, amelynek felszínéhez a mikrobák odatapadnak, valamint a termék is kristályos formában keletkezik, látszólag nem történik semmi, pedig a „kristályfermentáció” nyomán értékes átalakításokra kerül sor a szubsztráton. A fermentációval előállított 9α-hidroxi-AD feldolgozása az AD-előállítással analóg módon történik: először teljes extrakcióval kinyerik a maradék szubsztrátot és a keletkezett terméket (diklórmetánnal), majd szelektív extrakcióban elválasztják a kiindulási és termék szteroidokat (diizopropil éterrel a terméket oldják, metanollal a szitoszterinmaradékot). A kinyert 9a-hidroxi-androszténdiont 85%-os foszforsavval főzik víz kilépés érdekében, majd ismét vizet addicionáltatnak és 11a-hidroxi-androszténdion keletkezik. Erre acetilént addicionáltatnak, majd az így bevitt oldallánckezdeményt alakítják tovább, amíg a hidrokortizonhoz jutnak.




55

O

O

Mycobacterium smegmatis

, 85% H3PO4

HO

+H2O

OH

5-6 nap, 11-12g/L, 70% konverzió, 1-3% inokulumm

HO

HO H2O

Szitoszterin

9-hidroxi-androszténdion

O HO

HO

HO

OH

O CH

CH

HO

HO

Kálium+acetilén HO

HO

-hidroxi-androszténdion

O Hidrokortizon

11-hidroxi-etiszterol

2.3.4. ábra: Szitoszterinalapú hidrokortizon- (bio)szintézis Dehidrogénezés: A C-C kötések dehidrogénezésének képessége egy jellegzetes tulajdonsága az aktionobaktériumoknak, köztük is az Actinoplanes, Arthrobacter, Corynebacterium, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Nocardioides, Rhodococcus és Streptomyces nemzetségek egyes fajainak. Általában a C1, C4, C7, C8, C9, és C16 szén és az azt követő szénatom között alakulnak ki a dehidrogénezés miatt kettős kötések az Actinobacterok aktivitásának köszönhetően. A 3-ketoszteroidok mikrobiológiai 1(2) dehidrogénezése (amit az 1950-es évek óta használnak) a prednizolon- és predniszteroidgyártás alapja. Így az Arthrobacter simplexet használják a pregnánok, androsztánok és szterin, illetve epesavak származékainak előállítására több évtizede. A hidrokortizon hatékony gyulladáscsökkentő hatóanyag, de kedvezőtlenül hat a sóháztartásra, ezért a kevesebb mellékhatással rendelkező rokon vegyületeit (pl.: prednizolon) is forgalmazzák. A prednizolont aerob biokonverzióval az Arthrobacter simplex (más néven Nocardioides simplex vagy Pimelobacter simplex, propionsav baktérium) állítja elő hidrokortizonból (2.1.13. ábra). O HO

OH O

HO HO

OH

N

O

HO HO

N

HO

Arthrobacter simplex O

O Hidrokortizon

O Deperzolon

Prednizolon

OH

O HO

O O

O Triamcinolon-acetenonid (Ftorocort kenõcs)

2.3.5. ábra: Hidrokortizon biokonverziója prednizolonná és származékaivá Hidrogénezés: A szteránváz kettős kötéseinek hidrogénezését gyakran a dehidrogénezésért felelős enzimek végzik. Így a Nocardia opaca és N. corallina 3-ketoszteroid-dehidrogenáza (3-KSD) szteroid- dehidrogénezést és hidrogénezést is végez az 1(2) pozícióban. Ezzel szemben a Mycobacterium globiforme esetében 3-KSD és 1(2)-dehidrogenázok külön enzimek. Mycobacterium törzsek, amelyek a szitoszterinből androszténdiont (AD, androszt-4-én-3,17-dion) és androszt-



56


diéndiont (ADD, androszt-1,4-dién-3,17-dion)-t állítanak elő szintén rendelkeznek külön 1(2) dehidratáló és 1(2) redukáló enzim rendszerrel. A C4 kettőskötés-redukciójára Streptomyces faecalist használnak. A pregnánok C1-es kettős kötésének redukciója gyakran a C20 β-redukciójához kapcsolt, amint az az Arthrobacter simplex és A. globiformis példáján is látszik. Ez utóbbi reakció általában szuboptimális levegőztetés esetén fordul elő; a reakcióelegy levegőztetése az egyensúlyt a C1-én-20ketoszteroid5 felé tolja el. Epoxilálás: Egyes Nocardia és Corynebacterium fajok képesek a 9(11)-dehydroszteroidokat a 9α, 11α-epoxi-analógjaikká alakítani. Az ilyen átalakításoknál a megfelelő 9α-hidroxi szteroid a valószínűsített köztitermék. Alkoholok oxidációja ketonokká vagy aldehidekké: Az Actinobacterok nagyon hatékonyak a 3bhidroxilcsoport oxidációjában a megfelelő keton előállítására. Általában széles a szubsztrátspecifitásuk, és nagy a sztereospecifikusságuk, ami ipari szempontból rendkívül kedvező, mivel szinte bármilyen szteránvázas szubsztrátot optikailag tiszta termékké képesek alakítani. Így a Corynebacterium mediolanum a dehidro-epiandrosteront (DHEA) hatékonyan alakítja tesztoszteronná. A C5-én-3β-hidroxi szteroidok 3β hidroxicsoportjának oxidációját az Actinobacterok a C5->C4 kettős kötés izomerizációjával kapcsoltan végzik. Nocardia erythropolis esetében megállapították, hogy a szteroid C5 kettőskötésének hiánya megakadályozta a 4én-3-oxo forma képződését. Ezek az enzimek, amelyek a 3β-hidroxi-5-én átalakítását 3-oxo-4-énné végzik az oxidázok családjába tartoznak (pl.: koleszterin oxidáz (CO), EC 1.1.3.6.). Az Actinobacterok CO enzimét jelenleg a koleszterin kimutatására analitikai célokra használják. Ilyen CO enzimaktivitást számos Actinobacterban találtak, köztük Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Streptomyces esetében. A génmérnöki módszerek lehetővé tették a hiper- és extracelluláris CO-termelő Actinobacterok létrehozását. Az egyik leggyakoribb oxidáció a 17β-hidroxi-szteroidok 17-oxo származékainak előállítása Mycobacterium phlei segítségével (ld. androszténdion előállítás). Az Actinobacterek további számos hidroxilcsoport oxidációjára képesek (pl.: 3α, 6β, 7α, 11β stb.), azonban ezek a megfelelő kémiai eljáráshoz képest kevésbé hatékonyak egyelőre. Szteroidészter-hidrolízis: A szteroidok acetilszármazékainak hidrolizáló képességét a Corynebacterium, Nocardia, Arthrobacter és Streptomyces fajoknál írták le. A hidrolízis itt is kettőskötés izomerizációhoz kapcsolt: a 3β-acetoxi-C5-én szteroid dezacetilezésekor a 3-hidroxi-C4-én származék keletkezett. Ketonok oxidációja észterekké vagy laktonokká: Szteroid jelenlétében a monoxigenáz-enzim oxigént épített be a C17 és C20 közé progeszteronon Rhodococcus rhodochrous esetében. Az enzim katalizálja a progeszteron és annak 11α/β-hidroxi származékának oxidatív észterezését, viszont az AD laktonizálását nem. Az enzim tulajdonságai meglehetősen különböztek a gomba eredetű monooxigenázokétól. A kódoló gént rhodococcusból rekombináns E. coli-ba klónozva nem tapasztalatak aktivitást progeszteronon. Karboniltartalmú vegyületek redukciója: A 3-karbonil csoport redukciója, amelyet az anaerob mikroorganizmusokra, élesztőkre és egyes fonalas gombákra leírtak, ritka az Actinobacterok között. Ez a reakció gyakran hidrogénezéshez kötött. Koleszt-4-én-3-on redukálható 5-kolesztán-3-ol-lá Nocardia corallina segítségével. A szterinek és a pregnan C17-es karbonilcsoportjának Actinobacteres redukciója az oldallánchasító folyamatokhoz kapcsolt. Így például a Streptomyces levendula által végzett progeszteron – AD-átlakítás melléktermékeként 1-dehidro-tesztoszteron is képződött. Az Actinobacterek oldallánclebontó és egyidejűleg 17β-redukciót eredményező képessége lehetővé teszi az AD intermedier kikerülésével az egylépcsős biotechnológiai tesztoszteron előállítását. Az irodalomban már található olyan publikáció, amely szerint szterinekből egy lépésben kristályos tesztoszteront lehet 98-99%-os tisztasággal előállítani Mycobacterium törzsek segítségével [25].

5

„C1-én” és hasonló kifejezésekkel a C1 szénatom melletti kettős kötést jelöltük.



3. Az ipari mikroorganizmusok és technológiák tárgyalása törzsrendszertanba illesztve

3.

57

AZ IPARI MIKROORGANIZMUSOK ÉS TECHNOLÓGIÁK TÁRGYALÁSA TÖRZSRENDSZERTANBA ILLESZTVE

A jegyzet eddigi fejezeteiben már igen sok mikroorganizmus került megemlítésre, többségükben már ipari használatban lévők, de mint azt már szintén bemutattuk, számos mikroba rejt kiaknázható potenciált, amely realizálódhat az adott mikroba tenyésztésével, illetve napjainkban gyakrabban az adott mikroba génforrásként való felhasználásával. Ezért az ipari mikrobiológia keretein belül mind a már használatban lévő, mind pedig a kiaknázható potenciált rejtő mikrobákat célszerűnek találjuk bemutatni, és mivel így már igen nagyszámú törzs kerülhet szóba, célszerű a rendszertani besorolás szerinti ismertetésük. Ez esetleg olyan összefüggésekre is rávilágít, hogy két különböző technológia alapjait jelentő mikroba milyen rokonsági kapcsolatban áll egymással, és így az egyes technológiáknál szerzett tapasztalat segíthet a másik technológia megértésében, fejlesztésében.

3.1. Mikrobiális rendszertan A tudomány több ezer éves fejlődése során felhalmozott óriási információ halmaz kezelése érdekében minden szakterületen valamilyen rendezési elv mentén az információkat rendszerbe foglalják. A biológia, azaz az élővilág tudományterületén az információk klasszikus rendszerezése a megfigyelt hasonlóságok és az ezek alapján felállított vélt rokonságok alapján történt. Az első ilyen rendszertant Arisztotelész állította fel az élővilág rendszerezésére több mint 2000 éve a Historia Animalium c. írásában [26]. A teremtményeket azok hasonlósága alapján csoportosította: állatok vérrel és vér nélkül, vízi és szárazföldi állatok. Úgy gondolta, hogy a teremtmények hierarchikusan sorbarendezhetők a legalacsonyabbtól a legfejlettebbig (ami az ember). Az élőlények lényegét fixnek és megváltoztathatatlannak gondolta, és ez a nézete fenn is maradt a következő 2000 évben. Amit viszont a mai napig az ő nyomán használunk, az a binomiális (kettős) elnevezése az élőlényeknek. Ő még úgy gondolta, hogy az élőlényeket hasonlóságaik alapján egy „genus”-ba lehet sorolni, ahol az egyes tagokat egy jellemző saját karakter különbözteti meg (=”difference”), ezért a kettős név Arisztotelésznél „genus, difference”-ként nézett ki. Tanait tanítványa, Theophrastus változtatás nélkül kiterjesztette a növényekre, és munkásságával (növények leírása és nevelése) a botanika alapítójává vált. A XVI. sz.-ig nem történt érdemi változás a taxonómia területén, míg Andrea Cesalpino olasz fizikus az általa részletezett növényi leírásokat a növények gyümölcsei és magjai alapján nem kezdte el rendszerezni, amellyel hatást gyakorolt a következő nagy reformerre Carolus Linnaeus-re (1707– 1778). Linné idejére számos leírás gyűjtemény létezett (pl.: az egyik legnagyobb a svájci fizikus, Gaspard Bauhin (1560–1620) által írt illusztrált 6000 növény leírását tartalmazó), amelyek inkoherensek voltak. 1735-ben jelentette meg The system of nature c. művét, amelyben a növényeket és állatokat a királyságok szintjétől a fajokig besorolta. Ezt a művét többször átdolgozta, mígnem a világszerte ismert rendszertan létrejött. Például a bálnákat eredetileg a halak közé sorolta, és ahogyan ő élete végéig javítgatta, frissítgette a rendszertant az újabb és újabb tudományos eredmények alapján, úgy napjainkig is a rendszertan egy folyamatosan fejlődő tudományág (3.1.1. táblázat). 3.1.1. táblázat: A rendszertan fejlődése Linnaeus (1735) Haeckel (1866) Chatton (1937) Copeland (1956) Whittaker (1969) Woese (1977) Woese (1990) "2 ország" "3 ország" "2 birodalom" "4 ország" "5 ország" "6 ország" "3 domén" Eubaktériumok Baktériumok Prokarióták Monera Monera Protiszták Ősbaktériumok Ősbaktériumok Protiszták Protiszták Protiszták Gombák Gombák Növények Növények Növények Eukarióták Eukarióták Növények Növények Állatok Állatok Állatok Állatok Állatok



58


Ez a fejlődés a XX. században az addig csak módosítgatott rendszertant új alapokra helyezte: míg a klasszikus rendszertan célja, hogy a valós rokonságokat megállapítsa, és a hasonló fajokat hasonló rendszertani kategóriákba helyezze, addig a modern rendszertani módszerek rávilágítottak arra a tényre, hogy a valóságban csak vélt rokoni kapcsolatok vannak egyes esetekben a rendszertanilag rokonnak tartott fajok között. A modern „rokonság” tesztek természetesen a genetika eszköztárát használják, és a genetikai állomány azonossága/különbözősége alapján állítják fel a pontos rokonsági fokot (rokoni távolságot), amelyek alapján filogenetikus fa felállítása válik lehetővé. A legelterjedtebben használt mikrobaleírások és rendszertan a Bergey I. kiadásában került publikálásra a ’80-90-es években, majd a modern genetikai alapú II. kiadást megkezdték 2000-ben (jelenleg is tart). Ennek következtében jelenleg egy átmeneti időszakot élünk, amikor a régi már elavult, az új pedig még fejlesztés alatt van. A modern kor talán legnagyobb (ám néha megkérdőjelezhető hitelességű) információhalmaza az internet, amelyen jelenleg is készül a „Tree of Life” webprojekt. Ennek lényege, hogy az interneten elérhető tudományos publikációkat összegyűjtse és felhasználja a mikrobák rendszertanának létrehozásához. Az új rendszertan hátránya, hogy sokkal lexikálisabb, és kevésbé gyakorlatias: azaz egy adott faj rendszertani besorolásából a tulajdonságai nem igazán derülnek ki, míg viszont számos további név igen. Például az Escherichia coli a régi rendszertanban „Gram-negatív\pálca\fakultatív anaerob\ \Escherichia nemzettség” tagjaként került meghatározásra, míg a modern filogenetikus fán „Baktériumok\Proteobacterek\Gammaproteobacter\Enterobacteriales\Enterobactericeae\Escherichia” útvonalon található meg. Nyilván az előbbi leírásból több információ volt nyerhető a mikroba felismerésével kapcsolatban. Éppen ezért célszerűnek tűnik a klasszikus rendszertan rövid ismertetése is. Klasszikus rendszertan A klasszikus mikrobiológiai és biokémiai fenotípizálások segítségével rendszerbe sorolt mikrobák leíró gyűjteménye a Bergey’s Manual of Systematic Microbiology-ban jelent meg több javított kiadásban. Ebben a rendszreben a prokariótákat 4 divízióra osztották a sejtfalszerkezetük alapján: I. Gram-negatív baktériumok (ők egy külső membránréteg miatt nem festhetőek Gram-festéssel), II. Gram-pozitív baktériumok (amelyeknél a festékkel reagáló mureinháló (poliszaharid) szabadon hozzáférhető, tehát festhetőek), III. Merev sejtfallal nem rendelkezők (pl.: csavart baktériumok), illetve IV. Ősbaktériumok (primitívnek látszó, mureint nem (esetleg pszeudomureint) tartalmazó sejtfallal rendelkező mikrobák) (3.1.1. ábra, lásd még a 62. oldalon). Filogenetikus rendszertan A modern – genetikailag támogatott – rendszertan létrehozásához a filogenetikai (phülon: törzs; geneseis: születés) analízisre van szükség. Ennek a tudományterületnek a célja, hogy az evolúció rekonstruálásával állapítsa meg a rokoni/leszármazotti viszonyokat az élőlények között. Ehhez szükséges az elmúlt évtizedek kutatásainak köszönhetően felhalmozódott genomikai és proteomikai ismeretek rendszerezése, azaz fejlett bioinformatikai infrastruktúra. A filogenetikai analízist 3 egymásra épülő szinten kell elvégezni: 1. szint: genomikai adatokból az azonosságok/különbségek feltárásával a rokoni kapcsolat és távolság felmérhető; 2. szint: proteomikai adatok segítségével az egyes fehérjék és változásaik követhetők nyomon, így a rokoni távolság és az evolúciós fa pontosítható; 3. szint: a különböző algoritmusok különböző evolúciós fákat eredményeznek, amelyek közül ki kell választani a legvalószínűbbet. Az egyik sarkalatos pontja a módszernek a megfelelő indikátor génállomány kiválasztása, mivel ezzel szemben támasztott elvárás, hogy stabil legyen (lehetőleg konzervált, normál életfolyamatok alatt nem változó), ugyanakkor a nagyobb evolúciós lépést jelentő behatásokra, mutációkra érzékeny legyen. Ilyen konzervált, de a mutációkat gyűjtő genom található a mitokondriumokban és a riboszómákban, ezért ezek szekvenciájának meghatározásával lehet a genetikai rokonságokat feltérképezni. A másik sarkalatos pontja az analízisnek a megfelelő algoritmus kiválasztása a rokoni távolságok feltérképezésére. Az egyik leggyakrabban alkalmazott módszer a Neighbour joining (NJ – szomszédösszevonó módszer), amelyhez szükséges egy távolságmátrix felírása a vizsgálandó fajok között, majd ennek transzformált változatában kell megkeresni a legkisebb értékeket (legközelebbi szomszédok),




59

megvizsgálni az ő távolságukat a közös ponttól, majd a többi vizsgálandó faj távolságát ugyanettől a ponttól, azután kezdődik elölről, de az előbb felismert szomszédokat egyként kell kezelni az új távolsági mátrix felírásakor. Egy másik algoritmus a maximum likelihood (ML – legnagyobb valószínűség módszere) módszer, amely standard statisztikai megközelítéssel vizsgálja a legvalószínűbb elágazásokat [30]. Egy harmadik széleskörűen használt módszer a maximum parsimony (MP – legnagyobb takarékosság módszere), amely a legkevesebb evolúciós eseményt kereső algoritmus. A filogenetikus analízis eredményeként rajzolható fel a filogenetikus fa, amelyen az elágazások távolsága egyenesen arányos az elágazás végpontjain lévő mikrobák genomazonosságával. Egy filogenetikus fát mutat a 3.1.2. ábra (lásd még a 63. oldalon). Az első fontos lépés a mikrobák törzsfejlődésének megértésében a megfelelően objektív kritériumok keresése a főbb rendszertani csoportok definiálásához. Jelenleg a baktériumokat mintegy 23 főbb csoportba, azaz törzsbe sorolják, a 16S rRNS fáik alapján. Némely ezen törzsek közül csupán néhány fajt tartalmaz (pl.: Thermomicrobia, Chrysiogenetes, Fibrobacteres, Deferribacters), míg mások – mint például a Proteobaktériumok, Bakteroidák, Cianobaktériumok, Actinobacterok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitívak) és a Firmicutes (kis G+C tartalmú Gram-pozitívak) – nagyon nagyok, és fajok ezreit számlálják, ideértve az ismert baktériumok több mint 90-95%-át. A kisebb törzsek (pl.: Fibrobakterek, Chlorobi) valamikor valamelyik nagyobb bakteriális csoport részeként kerültek besorolásra a közös morfológiai/fiziológiai jellemzőiknek megfelelően, de később leválasztották őket a 16S rRNS térkép alapján. Bakteriális filogentika [27] A mikrobiológiai rendszertanban a Woese-féle reformok (1990) óta a besorolásokat a következő csoportokba teszik meg: domén (domén)>kingdom (királyság)>phyla (törzs)>class (osztály) >order (rend)>family (család)>genus (nemzetség)>species (faj). Az ipari mikrobiológiában használatos „törzs” kifejezés gyakran nem a fenti rendszertani csoportra utal, hanem arra, hogy egy adott faj sejtvonaláról van szó (valamely egyed leszármazottai). Minimális eltérések (pl.: termék hozamban) lehetnek egy adott faj sejtvonalai között is. Azoknál a mikrobáknál, amelyeket alaposan tanulmányoztak már, előfordulnak a fajon belül alfajok (v. fajták vagy variánsok), és azoknak is lehetnek különböző sejtvonalaik, törzseik. Azt, hogy milyen tulajdonságok határozzák meg a törzs besorolását alacsonyabb rendű csoportokba, mint például osztályba, rendbe vagy családba, sosem definiálták egyértelműen a tudományos világban. Éppúgy, mint azt a kérdést, hogy mi alkot egy aldivíziót vagy osztályt egy törzsön belül. Például, a Proteobakterek törzsét jelenleg 5 aldivízióra (vagy osztályra) osztják, névszerint α, β, γ, δ és δ proteobakterek. Ezek mindegyike főbb csoportokat alkot a baktériumokon belül, és többségük világosan megkülönböztethető egymástól, illetve más baktériumdivízióktól, mind filogenetikus fájukban, mind számos más forrásban. Az alacsonyabbrendű kategóriákba (alkategóriák) való besorolás objektív feltételei nélkül nem világos, hogy miért pont ezek a főbb bakteriális csoportok kerültek aldivízióként (vagy osztályként) meghatározásra, míg más alig jellemzett csoportok néhány ismert fajjal főbb törzsként kerültek leírásra. Így a rendszertani besorolása a különböző bakteriális csoportoknak jelenleg teljesen önkényes. Az a kérdés, hogy hogyan lehet a legalacsonyabb rendszertani beosztást a baktériumokon belül definiálni, kezdetben egy ideális szempontból közelíthető meg. Egy ideális osztályozó rendszerben a törzs a leszármazás főbb vonalait mutatja be, és a gyökér egy közös bakteriális őst reprezentál. Minden nagyobb elágazás, amely a törzsből ered, a fa főbb csoportjait (vagy (mikrobiális) törzseit) jeleníti meg. Egy ideális osztályozó rendszerben ezen elágazások sorrendje a törzsön belül ismert, és a rendszer relatív nemzedékeken alapszik. Fontos, hogy ezek a törzsek (vagy elágazások) világosan elkülönüljenek egymástól a fán való helyük alapján. Minden szervezetnek, ami egy elágazást alkot, rendelkeznie kell olyan tulajdonságokkal, amelyek alapján más ágak szervezeteitől megkülönböztethető. Kisebb ágak és gallyacskák, amelyek a főbb ágak hajtásai, egyre kisebb rendű rendszertani fokokat reprezentálnak, például kisebb ágak az osztályok, rendek, családok, gallyak a nemzettségek, fajok. Az azonos kisebb ágakon lévő szervezeteknek több közös tulajdonsága is kell legyen egymással, mint a fő ág más ágainak szervezeteivel. Az eddig fő ismertetőjegy alapján meghatározott főbb csoportok száma minimális. Mivel azonban a fajok különböző elkülönített csoportjai, amelyek ugyanazon ponton ágaznak el még akkor is, ha



60


nincs egyedülálló közös tulajdonságuk, jelenleg provizórikus altörzseit képviselik valamely törzsnek. Ugyanakkor, amint további ismertetőjegy vagy más információ (ami elkülöníti ezeket az altörzseket, vagy egyértelművé teszi elágazásuk sorrendjét) elérhetővé válik, ezek az altörzsek egyedi törzsekké lépnek elő, vagy két elkülönített törzsre osztják az eddigit. A legtöbb főbb törzs jelenleg is valamilyen csoportspecifikus ismertetőjegy alapján különíthető el. Ezen kritériumok alapján a Proteobaktériumok legalább 3 fő törzsre oszthatók, mindegyikük jól elkülöníthető a többitől, és az elágazásuk sorrendje is egyértelmű. A δ-proteobakterek távolról rokonai az α-proteobaktereknek, de ez a kapcsolat még további finomításra szorul. A β,γ-proteobakterek számos közös ismertetőjeggyel rendelkeznek. Noha néhány ismertetőjegy a γ-proteobaktereket megkülönbözteti, és későbbi elágazásra utal, a kapcsolat e két aldivízió (vagy altörzs) között további tanulmányozást igényel. Az ismertető szekvenciákon alapuló faábra azt is jelzi, hogy a jelenleg fő törzsként jegyzett Bakteroidák (vagy Citofágok, Flavobakterek Bakteroida csoport), Chlorobi és Fibrobakterek megbízhatóan ugyanazon pontból ágaznak el, és számos megkülönböztető tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek egyedi törzsekké teszik őket. Így a fentiekben kikötött kritériumoknak megfelelően ezeket a csoportokat egy törzsbe kellene helyezni, és vagy osztályokat, vagy rendeket kellene alkossanak ebben a fő törzsben. A relatív elágazásuk ezeknek az alcsoportoknak az FCB törzsön belül szintén jól megállapítható számos alcsoport-specifikus ismertető szekvencia alapján. A baktériumok törzsének elágazási sorrendje A bakteriális filogenetika központi problémája, hogy megértsük, hogy a különböző bakteriális törzsek hogyan kapcsolódnak egymáshoz, és hogyan ágaznak el a közös őstől. A 16S rRNS vagy más fehérje/gén alapú filogenetikus családfák nem tudták megoldani ezeket a kritikus aspektusokat, más jelentős kérdéssel (pl.: fotoszintézis eredete, eukarióta sejt eredete) együtt. Fontos betekintéseket nyújtott ebben a tekintetben a konzervált indelek (=inszerciók és deléciók) felfedezése és analízise számos univerzálisan elterjedt fehérjében. Ezek a konzervált indelek tulajdonképpen a fővonal ismertetőjegyei. Az ezekhez vezető genetikai eseményeket általánosan úgy tekintik, mint fontos evolúciós elágazási pontokat, és ezek eloszlásának mintázata a fajokban értékes információkat szolgáltat a fajok elágazásának sorrendjéről, és a különböző törzsek közötti kapcsolatról. Az indel modell alapján felállított bakteriális filogenetikus fa látható a 3.1.3. ábrán (lásd még a 64. oldalon). Egy ilyen indelmintázat-példa található az RNS-polimeráz β-alegységén (RpoB). Ez a magja az RNS polimeráznak, és minden fajban univerzálisan konzerválódott. Az RpoB homológok a különböző proteobakterekben éppúgy, mint az Aquifex, Klamidiák, Verrucomikrobák, Planctomyceták és BCF esetében egy nagy inszertet tartalmaznak a fenti fajokra jellemző konzervált régióban, amely inszertet a többi törzs (Spirohéták, Deinococcus-Thermusok, Chloroflexik, Fusobaktériumok, Actinobacterok, Thermotogák, Firmicutesek) nem tartalmazza. Az inszert hiánya az archeák (ősbaktériumok) RpoB homológjaiban egyértelműen arra utal, hogy amely baktériumokból hiányzik, azok az ősibbek. Fajok közötti eloszlásmintázata alapján ez az inszert valószínűleg az előbbiek közös ősénél keletkezett, így ezek (proteobakterek, Aquifex, Klamidiák, Verrucomikrobák, Planctomyceszek, és BCF) később ágaztak le a főágról. Hasonlóan ehhez egy másik prominens indelt azonosítottak a DNS-giráz B-alegységén. Ebben az esetben egy konzervált, több mint 150 aminosavból álló inszert található a különböző proteobakterek és Aquifex, Klamidiák, Verrucomikrobák, valamint Planktomiceszek DNS-giráz B alegységén, de nem található meg a többi baktériumtörzs – köztük a BCF – tagjai között. Ez az inszert az archeák homológ fehérjéi között sem található meg. Az Rpo és a giráz fajok közötti eloszlás-mintázatainak összehasonlítása alapján megállapítható, hogy a giráz indelje az evolúció későbbi fázisában keletkezett, a Fibrobakterek-Chlorobi-Bakteroidák elágazása után. A fajok közötti eloszlás-mintázat alapján ez a két indel egyértelművé teszi, hogy a Fibrobakter-Chlorobi-Bakteroidák (BCF) csoportok a Spirohéták, Deinococcus-Thermus, Chloroflexek, Actibobakterek, Thermotogá, és a Firmicutes törzsek után, de a proteobaktériumok, Aqificales, Klamidiák, Verrucomikrobiák és Planktomiceszek előtt ágaztak el. A fenti két indelhez hasonlóan számos más fővonalismertető-jegyet fedeztek fel további univerzálisan elterjedt fehérjékben, amely ismertetők segítik a baktérium- törzsek elágazási sorrendjének megértését. Az indelek fajok közötti eloszlási mintázata alapján majdnem minden baktériumcsoportot egyértelműen el lehet különíteni, és lehetséges logikusan kikövetkeztetni a közös őstől való elágazásaik sorrendjét.




61

Az indelmodell megbízhatósága és prediktív lehetőségei A fővonal indeleinek többsége, amelyeken az elágazási mintázatok alapulnak 1997 előtt kerültek felfedezésre, amikor még a szekvencia adatok igen korlátozottak voltak, és a megszekvenált genomok száma 10 alatt volt. Ennek ellenére ezen indelek mindegyike igen specifikus előrejelzéseket tett (vagy tesz) az előfordulásukkal és hiányukkal kapcsolatban a különböző baktériumtörzsek fajaiban. Ha ezek az elágazási minták megbízhatóak, és ezek az indelek egy ősi vonalban egy adott evolúciós stádiumban jelentkeztek, akkor minden feljebb fekvő bakteriális törzs fajainak tartalmaznia kell az adott indelt, míg minden más csoport fajainak, amelyek az inszerciós pont előtt ágaztak el (azaz az inszerciós pont alatt fekszenek) hiányzik ezen indelje. Ha a megállapított indeleloszlás a különböző genomokban szorosan követi a modell alapján elvártat, akkor a megállapított elágazások megbízhatóak. Ha ezek az indelek függetlenül keletkeztek, vagy az őket tartalmazó gén gyakran került laterális átadásra, akkor az indelek jelenléte vagy hiánya a különböző fajokban nem követi az elvárt mintázatot. A modellt számos indelen tesztelték különböző teljesen feltárt genomokban, és megfelelően követték a modellt az eredmények. A bakteriumtörzsek konzervált indelek alapján származtatott elágazási sorrendje néhány kivétellel megegyezett a 16S rRNS alapú filogenetikus fákkal, akárcsak számos más fehérje/gén alapú filogenetikus fákkal. A leggyakrabban publikált fákon, a Thermotoga, Deinococcus-Thermus, Cianobaktériumok és a Zöld-nem-kén-baktériumok csoportja korai elágazást mutat, míg mások (mint például a Proteobacterek és Chlamydiák, valamint a Bakteroides-Chlorobi csoportok) később ágaznak le. Egy új filogenetikus tanulmány [28] 31 általánosan konzervált fehérje szekvenciájának alapján szintén határozottan állítja, hogy a Firmicutes a legmélyebb (legelső) elágazási vonal (3.1.3. ábra). A Firmicutes és Actinobacterek korai elágazását éppúgy, mint a Thermotogákét, DeinococcusThermusokét is alátámasztják a gének sorrendjének elrendeződései a bakteriális genomokban. Lake és munkatársainak [29] tanulmánya azt is határozottan állítja, hogy a bakteriális fa gyökere nem a Gramnegatív (vagy diderm) baktériumoknál van. Egy figyelemre méltó különbség a jelenlegi és a 16S rRNS alapú filogenetikus fák között az Aquifex-ek késői elágazása az újabb tanulmányokban. Ez az anomália az Aquifex rRNS nagy G+C-tartalma miatt van, ami számos hipertermofil szervezet közös tulajdonsága, így emiatt az Archeák közé csoportosították, és az rRNS- fán korán elágaznak. Az indelanalízis alapján levezetett elágazási sorrend a főbb szerkezeti különbségekkel is összhangban van a baktériumoknál (vagy prokariótáknál). A baktériumokat két csoportra osztják attól függően, hogy egy membránnal burkoltak (monodermák), vagy két különböző, a periplazmás tér által elválasztott membránnal (didermák) rendelkeznek. Ez a két csoport durván megfelel a Gram-pozitív és Gram-negatív csoportosításnak. A konzervált indelek alapján is indokolt ez a szerkezeti elkülönítés, és azt is kimutatta, hogy a monodermák (Gram-pozitívak) az ősibbek. A levezetett elágazási sorrend a Deinococcus-Thermus csoportot egy köztes pozicióba helyezi a Gram-pozitívak és negatívak között. Ez az elhelyezés összhangban van a Deinococcusok egyedülálló szerkezetével, ami egy vékony peptido-glükán-réteget tartalmaz, és így pozitívan festődnek a Gram-festéssel, de belső és külső membránnal is körül vannak véve, hasonlóan a legtöbb Gram-negatív baktériumhoz. Ezek a megállapítások jelzik az evolúciós átmenetet a Gram-pozitívaktól a negatívokig. Így a ritka véletlen genetikai változások (RGCs: Rare Genetic Changes) alapján felállított bakteriális filogenetika képe jó egyezést mutat a genotípus és fenotípus között, ami arra utal, hogy megbízható az indelmodell.



62


Gram (-) baktériumok (1. Divízió)

Gram (+) Baktériumok (2. Divízió)

1. Coccusok

2. Pálcák

1. Gram aerob

1. 2. Pseudomonas Legionella nemzettség nemzettség

Pálcák

Coccusok

2. Gram - Fak. anaerob

1. Enterobacter család

Merev sejtfal nélküli baktériumok (3. Divízió)

3. Gram anaerob

2. Nem enterobacterek

1. Bacteroides nemzettsg

Gram +

4. Gram + endospórás

5. Gram + spórátlan

Ősbaktériumok (4. Divízió)

1. Spirális 2. 3. 4. és hajtott Spirohéták Riketsia Mycoplasma bakt. félék félék

6. Gram + spórátlan szabálytalan alakú

1. 2. 3. Staphylococcus Micrococcus Streptococcus 1. Bacillus 2. Clostridium 1. 2. 1. 2. 3. 4. 5. nemzettség nemzettség nemzettség nemzettség nemzettség Lactobacillus Listeria Corynebacterium Actinomiceták StreptomicetákMycobaktériumokNocardia (aerob) (anaerob) nemzetség nemzetség nemz

1. 2. 7. 1. 2. Escherichia Salmonella Proteus Vibrio Haemophilus nemzetség nemzettség nemzettség nemzettség nemzettség

3.1.1. ábra: Bergey-féle bakteriális rendszertan




63

3.1.2. ábra: Filogenetikus fa a 3 domén elmélet alapján [162]



64


3.1.3. ábra: Bakteriális filogenetikus fa az indelmodell alapján [27]




65

3.2. Ipari szempontból fontos (ős)baktériumok A 3.1.3. ábra sorszámozása szerint tárgyaljuk az egyes ágait a bakteriális filogenetikus fának az alábbiakban. Ennek könnyebb követhetősége érdekében a rendszertant lehet tanulmányozni a 3.2.1. hyperpicture-ön.

3.2.1. hyperpicture: Rendszertan 1. Archeák Az ősbaktériumokat széles körben úgy tekintik, mint az élet 3 fő doménjának egyikét, noha eredetük vita tárgya. Korábban úgy gondolták, hogy csak extrém környezetben élnek, mint extrém forróság vagy forró és savas, extrém sós vagy nagyon savas, illetve lúgos környezetben, de újabb tanulmányok bemutatták, hogy széles körűen elterjedtek különböző környezetekben is. Az archeák metanogéneket is tartalmaznak, amelyek szigorúan anaerob és gyakran termofil környezetben élnek, és amelyek egyedül képesek arra, hogy a metabolikus energiájukat metanogenezisből redukcióval nyerjék. A 16S rRNS-fán (3.1.2. ábra) és számos más gén/fehérje szekvenicán alapuló filogenetikus fán az ősbaktériumfajok ága határozottan elkülönül minden más szervezettől. Ráadásul, számos további tulajdonság (mint például az elágazó láncú éterkötésű membrán lipidek, a sejtfalból hiányzó peptidoglükán, sajátos RNS polimeráz alegység mintázat, módosult bázisok jelenléte a tRNS-ben, egyedi DNS polimeráz) is azt jelzi, hogy szükséges az archeák külön definiálása. Ennek ellenére ezen tulajdonságok némelyike nincs meg mindegyik ősbaktériumban, vagy más eukarióta, illetve termofil szervezetben pedig megtalálható. Az archeák filogenetikus analízise két főcsoportra (vagy törzsre) osztásukhoz vezetett: Crenarchaeota és Euryarchaeota. E két csoport fajai – különösen az Euryarchaeotáknál – igen különböznek metabolizmusukban és fiziológiájukban. A metabolikus és fiziológiai, illetve más egyedi tulajdonságaik alapján az Euryarchaeotáknál 5 funkcionálisan elkülöníthető csoportot határoztak meg: metanogének (3.2.2. ábra), szulfátredukálók, extrém halofilek, sejtfal nélküliek és extrém termofil kénmetabolizáló baktériumok. Némely ezen csoportok közül polifiletikus a különböző filogenetikus családfákon. Ezen különböző csoportoknak unikális gén- vagy fehérjekészlete – ami megkülönböztetné őket minden mástól – még meghatározásra vár. Az utóbbi években számos archea teljes genomját megszekvenálták, és az összehasonlító analízisük értékes információkat szolgáltatott a különböző gének/fehérjék tekintetében, amelyek az Archeákon belül elkülönítik a csoportokat, valamint a baktériumokkal és Eukariótákkal való kapcsolatot is meghatározzák.



66


3.2.2. ábra: Methanosarcina metanogén ősbaktérium [178] Az ősbaktériumok egyik legújabb, 31 jelző fehérje alapján felállított filogenetikus fáját mutatja a 3.2.3. ábra (lásd még a 93. oldalon). Az ősbaktériumok extrém élőhelyeken is előfordulnak, ezért az enzimeik ezen körülmények között is aktívak, így noha eddig csak néhány ősbaktérium enzime jutott el a piaci megjelenésig, hatalmas potenciált rejtenek magukban, ezért intenzíven kutatják őket. A különleges élőhely miatt az enzimeik stabilak magas hőmérsékleten, extrém alacsony/magas pH-n, nagy nyomáson, esetleg mindezt magas sótűréssel, oldószer-toleranciával, fémtoleranciával kombinálva [31]. Az extrémofilek enzimeinek (extremozimok) használatának számos előnye van, például csökkent fertőződésveszély, jobb anyagátadási sebesség, alacsonyabb viszkozitás, magasabb szubsztrátoldhatóság. Néhány érdekes tulajdonságot mutat be a 3.2.1. táblázat. 3.2.1. táblázat: Az ősbaktériumok különleges képességei Tulajdonság nitrátredukáló, kemolitoautotróf, termofil metanogén termoacidofil

termoaalkalofil barofil (nyomáskedvelő) barofil (nyomáskedvelő) Wolfram mint kofaktor tg=37min keményítőtranszport-fehérjék

Tartomány

Faj Pyrolobus fumarii

<113°C <110°C <0°C 60-90°C pH 0-4 aerobok anaerobok (kevésbé savas) 85°C pH 8,5-9 20-30 MPa [32] 20 MPa 103°C

Methanopyrus kandleri Methanogenium frigidum Acidianus, Ferriplasma, Picrophilus, Sulfolobus, Thermoplasma Methanogenium frigidum Thermoproteus, tenax Methanothermus fervidus Thermococcusok Paleococcus ferrophilus Thermococcus barophilus Paleococcus ferrophilus Thermococcus barophilus Pyrococcus furiosus

A leggyakrabban és legintenzívebben a magasabb hőmérsékleten is stabil és aktív enzimeket kutatják. Ezidáig nem találtak olyan faktort, amely egyedül érhetné el az enzimek termostabilitását, ugyanakkor leírtak már néhány jelenséget, amelyek hozzájárulnak az archeák enzimeinek hőstabilitásához: magasabb hidrofóbicitás, és felületi töltöttség, nagyobb számú ionpár és hidrogénkötés, © Németh Áron, BME



67

csökkent rugalmasság és felületi hurokméret, kisebb felszín/térfogat arány, kevesebb hőérzékeny aminosav és csonka amino- és karboxiltermináns. Noha a fenti különleges képességek vagy egy részük a modern genetikai eszközökkel nyilván kiaknázhatók, egyelőre az extrém körülmények között is stabil aktivitást mutató enzimek forrásaiként hasznosítják a (fehér)biotechnológia céljaira az ősbaktériumokat. Erre mutatunk be néhány példát az alábbiakban. [31]. Nagy az ipari érdeklődés a szénhidrát-metabolizmus enzimei – különösen a glikozil hidrolázok – iránt. Mivel minden keményítőbontó technológiában a szokásos fiziológiai hőmérsékletnél magasabbat alkalmaznak, a dextrinek, trehalózok, glükóz és fruktóz gyártói profitálhatnak a termostabil keményítőbontó enzimekből. A Pyrococcus extracelluláris α-amilázai 120°C 4h hőkezelés után is aktívak (vagy 130°C-os kezelés után is), tehát ideális jelöltek a keményítőipar számára. Az archeák pullulanázai is 90-100°C között aktívak, és szubsztrát, valamint Ca2+ ionok hiányában is megőrzik az aktivitásukat. A termoacidofil archeák glükoamilázai 90°C-on és pH=2-n is aktívak (Thermoplasma acidophilum, Picrophilus torridus és P. oshimae) A trehalóz (α,α-1,1-glükóz dimer) fontos enzim, antitest, vakcina, hormonstabilzáló szer, előállításában a Sulfolobus-enzimek 75°C-on jól hasznosíthatók. A ciklodextrinek előállítására a ciklodextrin-glikoziltranszferázokat (CGTáz) használják, amelyek közül kiemeledő a Thermococcus fajoké a 100°C feletti optimális aktivitással (keményítőből különböző ciklikus dextrinek előállítása), így a keményítőbontás és -ciklizálás egylépcsőben megvalósíthatóvá válik. A cellulózbontó enzimkomplex tagjai (endoglükanáz, exoglükanáz, β-glükozidáz) is fellelhetők termostabil formában az archeák enzimkészletében. A Pyrococcus furiosus β-glükozidáza 103°C-on is aktív. A P. horikoshii homológ enzime szerves oldószerben is stabil és aktív, ezért heteroszaharidok előállítására használható. Endo-β-1,4-xilanázok segítségével történik a hemicellulóz xilánfrakciójának lebontása. Míg az archea Pyridictum abyssi xilanáza az egyik legmagasabb hőmérsékleti optimummal (110°C) rendelkező, a Thermococcus ziligii xilanáza igen specifikus magas hőmérsékleten is (cellulózt nem bontja, csak a xilánt), ezért a biobleaching számára rejt nagy lehetőségeket. Hőstabil kitinbontó endo és exo kitinázokat is termelnek az archeák. A Thermococcus chitonophagus kitináza 120°C 1h kezelést is 50%-os veszteséggel kibír, míg a Pyrococcus furiosus termoaktív kitinázainak segítségével képes kolloid kitinen, mint egyedüli szénforráson növekedni. A fehérjebontó enzimek talán a legrégebb óta keresett és piacra dobott biokatalizátorok, mert a mosószer- és detergensipar igen nagy mennyiségben használja őket. A magas hőmérsékleti optimum az alkalmazások szempontjából kedvező, mivel a magasabb hőmérsékletű mosás hatékonyabban tisztít. Ennek elenére az ősbaktériumok számos proteáza közül csak néhányat írtak le eddig részletesen. Többségük az alkalikus szerin-proteázok családjába tatozik (Thermococcus setteri), de találtak már tiol proteázt (Thermococcus kodakarensis) és savas protázt, metalloprotázt is Pyrococcus furiosusban. A biotechnológia fejlődésével egyre elterjedtebbé vált a PCR technika, ahol a magas hőtűrésű DNS- polimerázok preferáltak. Az archeák közül ismét a Thermococcus és Pyrococcus törzseket írták már le hiba nélkül másoló termoaktív DNS-polimeráz-forrásként. Újabban az ősbaktériumok DNSpolimerázaival egészítik ki a Taq aktivitásokat, mert így csökkenthető a hibás amplifikációk száma. Az archeák DNS-függő enzimeit a genom szekvenálásokhoz is gyakran alkalmazzák, DNS-ligázaikat pedig analitikai célokra használják. A vegyipar számára fontos az optikailag tiszta alkoholok mint építőkövek előállítása. Ehhez alkohol-dehidrogenázokat (ADH) használnak, amelyek hőstabil homológjai megtalálhatók az archeákban: Sulfolobus solfataricus (3.2.4. ábra) ADH-a NAD függő és Zn-et is tartalmaz. A legstabilabbak a pyrococcusok ADH-ai (felezési idő ~150h 80°C-on).



68


3.2.4. ábra: Sulfolobusvírus-fertőzéssel Szintén az optikailag tiszta vegyületek szintézisében töltenek be fontos szerpet az észterázok. Némely archea (Aeropyrum pernix, Pyrobaculum calidifontis) eredetű észteráz igen termoaktív, és még vízzel elegyedő oldószerekben (acetonitril, DMSO) is stabil. A legstabilabb észterázok a Pyrococcus furiosusból nyerhetők (felezési idő: 50 min 126°C-on). A vegyipari szintézisek fontos lépései a C-C kötést kialakító reakciók, amelyeket az aldolázok és a transzketolázok is katalizálnak. Az archeák közül a Sulfolobus solfataricus aldolázát írták már le piruvát, illetve glicerinaldehid előállítására. A sztereoszelektív Sulfolobus solfataricus amidáza széles szubsztrát spektrummal rendelkezik, és 95°C-on is még aktív. Az enzimeiken kívűl az archeák további molekulái is rendelkeznek ipari felhasználással vagy potenciállal: az ősbaktériumok lipidjei hőstabil liposzómák előállításához alkalmazhatók; Sulfolobus törzsek antibiotikus hatású fehérjét is termelnek; chaperonjaik a rekombináns fehérjék hajtogatását segítik. Mivel az ősbaktériumok eltérő kodonrendszert használnak a valódi baktériumoktól, ezért a génjeik kifejezése bakteriális gazdaszervezetben igen nehézkes, emiatt az utóbbi időben archeaexpressziós rendszereket is létrehoztak Methanococcus és Sulfolobus fajokból. 2. Firmicutes A csoport neve (=erős bőr) utal a sejtfal jelenlétére, amely a legtöbb nemzetség esetében Gram-pozitív festésű, de némelyek esetében vékony külső membránnal takart, ezért Gram-negatívan festődik. A törzs közös vonásaként – szemben a következő Actinobacterek törzzsel – a DNS-ük kis G+C-tartalmát jelölték ki, ez alapján sorolják ide a nemzettségeket, amelyek között számos ipari jelentőségű akad (Bacillus, Lactobacillus, Clostridium stb. fajok.) A nemzettségek azonban szinte minden más tulajdonságban különböznek, mivel vannak pálcikák, kokkuszok, spirálisak, aerobok/anerobok, endospórásak/spórátlanok is közöttük. Ezek azonban az egyes családokon belül sem eléggé konzervált tulajdonságok, így nem megfelelőek a besoroláskor, ezért is használják ma már a real-time (valós idejű) PCR technikát a DNS-alapú osztályozáshoz. A firmicutes rendszertana azonban eme diverzitás miatt jelentős változásokon ment át és megy át most is. Egyelőre többnyire 3 osztályt különböztetnek meg a Firmicutes törzsön belül: Bacillusok, Clostridiumok és a Mollicutes [27]. (3.2.2. táblázat, lásd még a 93. oldalon) Ipari szempontból a bacilli osztály bacilliales (kataláz pozitívak) rendjének legfontosabb tagja a bacillusok nemzettsége, amelynek fajai között olyan fontosakat találunk, mint a Bacillus subtilis (3.2.5. ábra), amelyet szinte a DNS felfedezése (Watson 1953) óta a Gram-pozitív baktériumok




69

modellszervezeteként használnak fel, és 1959-ben volt az első sikeres géntranszfer egy Bacillus subtilis törzsbe [58].

3.2.5. ábra: Bacillus subtilis [178] A ’90-es évek közepére a biotechnológusok egyik „igáslováról” annyi információ állt rendelkezésre (fiziológiai folyamatok ((transzkripciós, transzlációs szabályozások)), tenyésztési és ipari fermentációs tapasztalatok stb.), hogy érdemesnek tűnt belőle expressziós rendszert készíteni, amely idegen fehérjék (ipari célú, gyógyászati célú, élelmiszercélú stb.) előállítására nagy léptékben alkalmas. Az ilyen expressziós rendszerek olyan módosított mikrobák (jelen esetben ez B. subtilis), amelyek képesek nagy koncentrációban bioaktív formában (helyes elsődleges, másodlagos, harmadlagos szerkezettel) fehérjéket a fermentlébe extracellulárisan kiválasztani, miközben eredeti proteáz aktivitásukat lecsökkentették (és ezáltal a termék lebontás csökkent), persze egyúttal az aminosavmetabolizmust is szükségszerűen kiegészítették. Így mára valóban a legelőnyösebb és talán a legelterjedtebb ipari expressziós rendszerré vált a B. subtilis, és olyan fehérjéket állítanak elő vele, mint a termostabil keményítőbontó enzimek (α-amilázok, glükoamilázok, xilanázok), illetve a humán interleukin-1 (ILE-1), amely az emebri immunválasz egyik központi citokin6 molekulája [59]. A bacillusok további fajai sem szégyenkezhetnek: A Bacillus coagulans (nevét a tej fehérje kicsapásáról kapta) a tejipari túrógyártás oltóanyaga, illetve jó enzim- (pl.: α- és β-amiláz, xilanáz, celluláz, alkalikus proteáz, lipáz stb.) és tejsavtermelő. Előbbiek jelentősége a hőstabilitás és különleges pHtolerancia miatt kiemelkedő, utóbbi képessége pedig azért jelentős, mert az 50-55°C-on végzett tejsavfermentációkat nem kell sterilen vezetni, és így jeletős költségmegtakarítás érhető el, ugyanakkor hozam és végtiter tekintetében a szokásos (és közeli rokon) Lactobacillus törzsekkel is versenyképes [60]. A bacillusok alkalmazásának egyik iskola példája a Bacillus thüringiensis (vagy ékezetek híjján: B. thueringiensis v. B. thuringiensis), amelynek endospórájának felszínéről endotoxikus fehérjét izoláltak és klónoztak, mert a biokontroll során a rovarok ellen hatékony bio-irtószer (ipari szúnyogirtás hatóanyaga). Az 1980-as évektől kezdve alkalmazzák ezt a biopeszticidet, és a ’90-es évektől kezdve a génmódosított növények egyik nagy csoportját a BT (Bacillus thüringiensis Toxin)-t kódoló és expresszáltató lepidoptera (lepkefélék) ellen önvédelemmel felszerelt gabonák adják (Monsanto kukorica stb.) [61]. A Bacillus licheniformis FDA által is elfogadott, GRAS listán szereplő biztonságos ipari és élelmiszer-ipari mikroorganizmus, amellyel számos heterológ génexpressziót megvalósítottak, illetve carbohidráz- (főleg α-amiláz) és proteáz- enzimeket állítanak vele elő [62]. Számos patogén mikroba is található a bacillusok között, mint a Bacillus antraxis (Antrax vagy lépfene) vagy B. cereus. A Bacillialacea mellett két további, főleg egészségügyi vonatkozású család, a

↑ Gilman A, Goodman LS, Hardman JG, Limbird LE. Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill (2001). ISBN 0-07-135469-7 6



70


Staphylococcuceae (pl.: S. aureus) és a Listeriaák találhatóak meg (L. monocytogenes, 3.2.6. ábra) a Bacilliales rendben [64].

3.2.6. ábra: Listeria monocytogenes [178] A bacillusosztály másik fontos rendje a Lactobacilliales, azaz lactobacillusok. Ide tartoznak az elsősorban egészségügyi szempontból érdekes Streptococcusok (pl. S. pyogenes (skarlát), S. pneumoniae, S. bovis), illetve a bélflóra Enterococcusai (pl.: E. faecalis). Mindkét család a tejiparban játszik szerepet. A S. thermophilus a közeli rokon Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricusszal együtt joghurtok mikrobiótáját adja, és így élelmiszer-ipari felhasználása jelentős, emellett tejsavelőállításra is használható [65]. Az Enterococcusok a mediterrán eredetű sajtokban fontos szerepet játszana egyrészt a sajtok kedvező egészségügyi hatásának kifejtésében, valamint a készítés technológiájában is [63]. E két kevésbé jelentős család mellett a Lactobacilliceae család tagjai a Leuconostoc és Lactobacillus (3.2.7.) nemzettségek.

3.2.7. ábra: Lactobacillus acidophilus [178] Ipari szempontból a Leuconostoc mesenteroides almasav (=2-hidroxi-szukcinát) termelési potenciálja, valamint dextránszukráz enzimtermelő képessége figyelemre méltó. Utóbbi különösen divatos a funkcionális élelmiszerek előállítása kapcsán, amely enzim segítségével az © Németh Áron, BME



71

emésztőenzimeknek ellenálló glükooligoszaharidot szintetizál ez a mikroba [66]. A lactobacillusok közé tartoznak a Pediococcusok is. Általában ezen tejsavbaktériumok homolaktikus tejsavas erjesztését használják ki a káposzta savanyításakor. A Pediococcus acidilactici faj a bélflóra tagja, és részben tejsavtermeléssel, részben pediocinek (pediococcusok által termelt baktericinek) segítségével antagonizmussal szorítja vissza a fertőzéseket. Alacsony pH-n és magas hőmérsékleten (65°C) is túlél [71]. Az Oenococcusok (3.2.8. ábra) közé kevés fajt sorolnak, viszont ezek a nevüknek megfelelően a bor(alkohol)készítés (oenology – enológia) „munkalovai”. A borászati jelentőségük az ízek kialakításában jelentkezik (pl.: Oenococcus oeni), mivel a keményebb malonsavas (almasavas) ízt (ami a mustból ered) alakítják a puhább, teltebb, vajasabb tejsavas ízzé (malo-laktikus fermentáció). E vegyületek aránya határozza meg a bor ízét.

3.2.8. ábra: Oenococcus oeni [178] A Lactococcusok a tejgazdaságokban játszanak szerpet a tejtermékek és sajtok előállításánál. A Lactococcus lactis sp. lactis (3.2.9. ábra) és a L. lactis sp. cremoris oltókultúra szerepét tölti be [72]. Általában homolaktikusak, és fő feladatuk a tej gyors lesavanyítása, ami megakadályozza a megromlást okozó mikrobák elszaporodását.

3.2.9. ábra: Lactococcus lactis [178]



72


A Firmicutes 2. nagyosztálya a Clostridium-félék osztálya, amely fajokban és nemzettségekben is igen gazdag [148]. Ipari jelentősége lehet a Sarcina ventriculinak, amely a mikrobiális cellulóztermelés egyik képviselője. A Clostridium nemzetségből ipari jelentősége lehet a C. thermocellumnak, mivel cellulózalapon etanolt fermentál, már iparilag alkalmazzák a C. botulinum-ot (3.2.10. ábra), amelynek endotoxinja idegméreg, de kis koncentrációban botox néven forgalmazzák plasztikai sebészeti céllal.

3.2.10. ábra: Clostridium botulinum Végül a C. acetobutlicum, amellyel óriási méretekben német technológiával aceton-butanol-etanol (ABE) femetnációkat végeztek. A Clostridiumok osztályában szinte minden anyagcserére és életformára találunk példát: vajsavas erjesztő a Butyrivibrio, ecetsavtermelő az Acetobacterium, nitrogénfixáló az Anaerococcus, propionsav termelő a Propionispira, borostyánkősav- (szukcinát) termelő a Succiniclasticum, szulfátredukáló Desulfosporosinus, dehalogenidező (halogenidekkel szubsztituált szennyezések bontása) Desulfitobacteriumok. A Firmicutes 3. csoportja a Mollicutes, ahol ipari potenciál alig található, viszont az eddig ismert legkisebb baktériumokat (Mycoplasma genitalium) idesorolták. 3. Actinobacterek Az Actinobacterek törzsét Gram-pozitív baktériumok alkotják, amelyeknek nagy a G+C-tartalma (>55%). Ez a csoport 39 családot és 130 genust tartalmaz, így ez a legnagyobb törzs a baktériumokon belül. Igen széles morfológiai tartománnyal rendelkeznek a coccusoktól (pl.: Micrococcus) a pálcikagömbökön (pl.: Arthrobacter) keresztül, a töredezett hifán át (pl.: Nocardia) az állandó és erősen differenciált, elágazó micéliumig (pl.: Streptomycesek) bezárólag. Számos Actinobacter spóraképző, amely spórák a mozgó zoospóráktól a különleges propagulákig terjednek. Élettanilag is nagyon különböznek, amint az kitűnik számos extracelluláris enzimeik és több ezer metabolitjuk termeléséből (beleértve az antibiotikumokat is). Az Actinobacterek (különösen a Streptomyces nemzetség) a fő antibiotikum-termelők a gyógyszeriparban. Ennek ellenére néhány Actinobacter fontos humán- és állatpatogén. Például a Mycobacterium tuberculosis tuberkulózist okoz, Corynebacterium diphteriae pedig diftériát, a Propionobacterium acne az akne (bőrhiba) okozója. Az Actinobacter fajok széleskörűen elterjedtek mind a szárazföldi, mind pedig a vizes ökoszisztémákban, és a bioszanyagok (cellulóz, kitin) lebontásában és visszaforgatásában (szénkörforgalom) fontos szerepet játszanak. Noha az Actinobacterek egy elkülönített csoportot képeznek a 16S rRNS-fán, nincs más megbízható biokémiai vagy molekuláris tulajdonságuk, ami saját jellegzetessége lenne a csoport tagjainak. Ennek © Németh Áron, BME



73

ellenére az újabb genomszekvencia-analízisek számos konzervált közös és egyedülálló indelt találtak, amelyek vagy minden Actinobacterra jellemzőek, vagy csak néhány alcsoportjukra, de fontos információkat szolgáltattak a rendszertanuk, leszármazásuk és egyedülálló biokémiai és élettani tulajdonságaik megértéséhez. Az Actinobacterek csoportja igen gazdag fajszámban (3.2.3. ábra). A legnépesebb rend az actinomycetes rendje (ezen kívül még az Actinobacterek osztályába tartoznak a Rubrocacterek, Sphaerobacterek, Cariobacterek, Acidimicrobiae-k, és a Bifidobacterek), amelynek tagjai mind humánegészségügyi, mind ipari szempontból jelentősek. Az actinomycesek rendje további, igen különböző alrendeket tartalmaz: Micrococcineae, Corynebacterineae, Propionibacterineae, Pseudonocardineae, Frankinae, Micromonosporineae, Streptomycineae, Catenulisporinea, Actynomycetaceae és Glycomycetaceae. A Micrococcusok (Micrococcineae) a természetben széleskörűen megtalálhatók (levegőben, talajban, porban, vízben), Gram-pozitív gömb alakú baktériumok, általában tertádként fordulnak elő. Erős sejtfallal rendelkeznek, amely a biomasszatömeg 50%-át is kiteheti. Genomjuk G+C-tartalma nagy, és plazmidot is gyakran hordoznak, amelyek hasznos tulajdonságokat kódolnak. A M. luteus sárga, a M. roseus rózsaszín telepeket képez malátakivonatos agaron. Előbbi a toxikus szerves anyagokon (pl.: piridin) riboflavintermelésre képes. Egyes mikrokokkuszok között csak 50%-os a genomazonosság, ezért valószínűleg újra kell őket osztályozni a 16S rRNS alapján. Többségük mezofil, de pszichrofil is akad köztük (M. antarcticus). Habár nem spóraképző, mégis nagyon túlélő fajta (több 10 000 évet is kibír). Általában szaprofiták vagy kommenzalisták, de opportunista patogének is előfordulnak, amelyek főleg a legyengült immunrendszerű szervezeteket támadják. Nehéz igazolni a patogenitásukat, mivel a normál emberi bőrflóra tagjai. Ipari felhasználásuk többnyire a detoxifikálásra korlátozódik, mivel számos toxikus anyag lebontására képesek, egyes törzsekkel azonban hosszú szénláncú (C21-C34) alifás szénhidrogént állítanak elő. A M. antarcticus faj hidegkedvelő, így 30°C-os hőmérsékleti optimummal rendelkező alfa amliázt izoláltak belőle, amely 12°C-on is aktív. M.flavust eleveniszapos szennyvíztisztítóból izolálták, és aerob, heterotrófként írták le. Glicerint, trehalózt és dextrint hasznosít szénforrásként, de glükózt, fruktózt, laktózt, arabinózt, xilitet, inozitot, ramnózt nem. A M. luteus sárga, obligált aerob, nem patogén baktérium, amely általában egysejtűként (csoportosulás nélküli formában) található meg. Koaguláz negatív, bacitracinérzékeny mikroba. A glutaminázenzime ipari szempontból érdekes (sótűrő) [35] A M. lylae a haltermékek megromlásáért felel, lehet humán patogén is. A M. mucilaginosusról (3.2.12. ábra) 1981-ben kiderült, hogy a Staphylococcusokhoz jobban hasonlít, ezért Staphylococcus salvarius néven szerepelt a kis G+C-tartalmú Gram-pozitív baktériumok között, majd 2000-től a Stomatococcus mucialginosus, később a Rothiák közé került, és a száj mikroflórájának úttörőjeként a plakkok és így a fogszuvasodás kialakulását segíti.



74


3.2.12. ábra: Microccus mucilaginosus [178] A Micrococcus roseus RJ6 törzset szteroidkonverzióban lehet hasznosítani, mivel egy plazmidjának termékei a koleszterin -> ADD és AD átalakítást tudják elvégezni [33] A M. glutamicus törzsnek többféle ipari felhasználása van, a diazo festék eredetű szennyezések lebontásától [35] a lizin termelésen át [36] a koimmobilizált glutaminsav termeléséig [37]. Utóbbi potenciált és a termelőtörzseket napjainkban is kutatják és fejlesztik [38]. A mikrokokkuszok egyik iparban is használatos közeli rokonai az Arthrobacter család tagjai. Jellemzően talajlakók, aerobok, és az exponenciális fázis során pálcikák, a hanyatló fázisban pedig kokkuszok formájában jelennek meg (reverzió: pálcikák osztódása kokkuszokká). Jól tűrik a kiszáradást és táplálékhiányt is. Az Arthrobacter simplex szteroidkonverziós képességeit már tárgyaltuk (2.1. fejezet: Actinobacter-ek által végzett szteroid konverziók), azonban az elmúlt 100 évben többször is új besorolást és nevet kapott (Arthrobacter simplex, Corynebacterium simplex, Pimelobacter simplex). Jelenleg a szintén Actinomiceta Propionibaktériumok Nocardioides családjába sorolják Pimelobacter simplex néven, tehát nem a mikrokkuszok Arthrobacter családjába. Az Arthrobacterek egyik kiemelkedő tagja az A. chlorophenolicus (3.2.13. ábra), amely extrém lebontóképességei révén (piridon, klórofenol, Cr(VI) redukciója Cr(III)-má stb.) bioremediációkban használatos.

3.2.13. ábra: Arthrobacter chlorophenolicus [178] Az A. mobilis savas ureázát fermentált üdítők karbamidtartalmának, amely a karcinogén etilkarbamát prekurzora, csökkentésére lehet használni (pl.: japán rizspálinka, azaz szaké esetében) [44]. Az A. oxydans (újabban A. nicotinovorans [45], neve élőhelyére utal: dohány növényen nikotinlebontó aktivitás) is iparilag fontos szteroidkonverziós képességekkel rendelkezik, mint azt már szintén tárgyaltuk (2.1. fejezet: Actinobacterek által végzett szteroidkonverziók).




75

A mikrokokkuszok másik érdekes és élelmiszeriparban használt családja a brevibaktériumoké, amelyek a lábszagért is felelnek (B. linens), és egyes sajtok (Limburger, Port-du-Salut, pálpusztai) erjesztéséért is. Ezek a mikrobák ugyanis képesek az izzadt lábon az elhalt hámsejtek lebontására metántiol keletkezése közben, és a szintén jelen lévő propionsav-baktériumok termelte ecetsavval+propionsavval együtt alakul ki a kellemtlen szag (erre még izovaleriánsav-termeléssel a Staphylococcus epidermis is rásegít [164]). A sajtaroma kialakításkor pedig a triptofánbontó képességük játszik fontos szerepet [46]. A pálpusztai sajt felszínére (aerob) kenik az oltóflórát, amely rózsaszínes (=rúzsflóra), nyálkás bevonatot képez, és igen erős szagot áraszt. Ez a sajt egy viszonylag fiatal (kicsit több mint 100 éves) hungarikum [47]. A Corynebacteriumok (Corynebacteriaceae) Gram-pozitív, pálca alakú, spórátlan, kataláz pozitív, aerob vagy fakultatív anaerob, csillótlan, egyenes vagy enyhén hajlott baktériumok, széleskörűen elterjedtek a természetben, többségük ártalmatlan. Vannak köztük iparban is alkalmazottak (C. glutamicum) és patogének, mint például a diftéria kórokozója (C. diphteriae (3.2.14. ábra), amely patogenitását (azaz diftériatoxin-termelő képességét) egy baktriofágtól kölcsönzi). Különös ismertetőjük, hogy polifoszfát formájában inclusion-bodyban energiát tárolnak (=metakromatikus granula), amelyeket a metilén-kék festék a szokásos kékfestés helyett rózsaszínűre fest. Az alakjuk változó is lehet a körülményektől függően (=pleomorf).

3.2.14. ábra: Corynebacterium diphteriae A Corynebacteriumok sejtfaluk alapján is jól elkülöníthetőek. Mezo-diaminopimelinsavat tartalmaz a murein hálójuk számos arabinogalaktán ismétlődéssel, csakúgy mint corinemikolsavval (=mikolsav 22-26 szénatommal), amelyeket diszaharid kapcsol össze (mAGP – mikolil-AGpeptidoglikán). Tenyésztésük viszonylag lassú, még kiegészített tápközegen is, és valamennyi törzs biotint (Hvitamin) igényel. Némelyik törzs tiamint (B1 vitamin) és PABA-t (B10 vitamin) is igényel. Viszonylag kicsi, szürkés telepeket képeznek, többnyire átlátszóak, de opálos a közepük. Löffler tápközegen (pepton, glükóz, NaCl, marhahúskivonat, lóvérszérummal (víz helyett) feltöltve) sárgás, fehérbe hajló színűek a telepek. Ipari hasznosításuk kiterjed az aminosavak, nukleotidok és más táplálkozási faktorok előállítására, valamint szénhidrogének lebontására, sajtérlelésre és enzimtermelésre. Egyes törzsek antibiotikus hatású bakteriocint termelnek. A C. glutamicum a nevéből is láthatóan a glutaminsavgyártásra alkalmas, és az anyagcsereutak módosításával lizin és treonin aminosavakat is elő lehet vele állítani. Szintén ezzel a törzzsel sikerült az emberi epidermális növekedési faktort (EGF) aktív formában előállítani, ami megnyitotta az utat további humánfehérje-expresszáltatásához C. glutamicummal. A fehérjeexpressziót vagy az általános kiválasztó úton (Sec –> durva felületű endoplazmotkus retikulum



76


-> Golgi), vagy az iker-aginin (Tat –> aktív formában membránon keresztül) transzlokációs úton lehet elérni. Egyes Corynebacteriumok lipofilek, azaz zsírban szeretnek szaporodni. A nemlipofileket fermentatívakra és nemfermentatívakra szokás osztani. Fermentative Corynebacterium-ok: Corynebacterium diphtheriae group Corynebacterium xerosis and Corynebacterium striatum Corynebacterium minutissimum Corynebacterium amycolatum Corynebacterium glucuronolyticum Corynebacterium argentoratense Corynebacterium matruchotii Nem fermentative Corynebacterium-ok: Corynebacterium afermentans subsp. afermentans Corynebacterium auris Corynebacterium pseudodiphtheriticum Lipofilek: Corynebacterium jeikeium Corynebacterium urealyticum Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum Corynebacterium accolens Corynebacterium macginleyi CDC coryneform groups F-1 and G A Corynebaktériumok legközelebbi rokonai a Mycobacteriumok (Mycobacteriaceae), ideértve a szteroidkonverzióban használt M. phlei és a tuberkulózis kórokozóját (M. tuberculosis), valamint a lepra kórokozóját (M. leprae) is. Egy részük lassan szaporodik (főleg a kórokozók: marhatuberculózis (M. bovis), humán tbc (M. tuberculosis 3.2.15. ábra), lepra M. leprae)), mások pedig gyorsan (M. phlei, M. smegmatis). A mikobaktériumok se nem Gram-pozitívak, se nem negatívak, hanem a Gramfestésre furcsán reagálnak, mivel a festékek savas/alkoholos lemosásának ellenállnak (acid-fast). Ezen képességüket és még további néhányat (pl.: antibiotikumrezisztenciák egy része, csak a makrolid antibiotikumok hatnak) a különleges mikolsavas sejtfaluknak köszönhetik.

3.2.15. ábra: Mycobacterium tuberculosis A Mycobacteriumok közeli rokonai a Nocardiák. A normál szájflórában is előfordulnak, de nokardiózisos tüdőgyulladást (N. asteroides, N. brasiliensis) is okozhatnak. A N. lactamdurans ipari fermentációban termeli a sertéstenyésztés antibiotikumát, az efrotomicint [50]. A nokardiák bioaktív komponensek előállításáról is ismertek, így a nocardicin [55] (β-laktám vázas antibiotikum, N. uniformis termeli), tubelactomicin A [56] (makrolid antibiotikum mikrobaktériumok ellen (=rokonok(!)), N. vinacea termeli) és a brasilicardin A [57] (triciklusos terpenoid immunszupresszáns, N. brasilensis termeli) ipari előállításában részt vesznek [51]. A N. farcinica és N. globerula iparilag értékes amidázok forrása, amelyeket többnyire rekombinánsan állítanak elő, és az akril-amid előállításánál használnak [52]. © Németh Áron, BME



77

A nokardiák legközelebbi rokonai a Rhodococcusok. Néhányuk patogén, de többségük jóindulatú, és szinte mindenhol megtalálható, mint például talajban, vízben és eukaróta sejtekben. 2006-ban készült el a genom megszekveneálása. 9,7Mb hosszúnak és 67% G+C-tartalmúnak találták. A Rhodococcus törzsek alkalmazása fontos, a széles körű vegyületlebontó képességük és a bioaktív szteroid-, akrilamid-, akrilsavtermelésük miatt, illetve a fosszilis üzemanyagok biológiai kénmentesítése végett. Ezt a nagyfokú genetikai és katabolikus változatosságot nemcsak a nagy kromoszómális DNS-ének, hanem 3 nagy, lineáris plazmidjának is köszönheti. A Rhodococcusok kísérleti szempontból is kedvező törzsek gyors növekedési sebességüknek köszönhetően. Ennek ellenére még nincsenek tökéletesen jellemezve, leírva. Egy másik fontos alkalmazásuk a biokonverziók területén van, amelyek biológiai rendszereket használnak olcsó nyersanyagok értékesebb vegyületekké alakításában. A Rhodococcusok (3.2.16. ábra) ezen felhasználása az olyan veszélyes környezetszennyező anyagok lebontásának képességéből született, mint amilyen a toluol, naftalin és herbicidek. Általában az aromás vegyületek hasznosításakor az első lépésben az aromás gyűrűt oxigenálják, és két alkoholcsoport keletkezik a gyűrűn. Ezután belső/külső diolmechanizmus szerint a gyűrű felhasad, és további metabolizmus alá kerül. Mivel ezen folyamatok kémiája igen sztereospecifikus, a keletkezett diolok kiralitása tervezhető. Míg a kémiai reakciók kiralitásának kontrollálása a szintetkus kémikusok számára jelentős kihívás, biológiai folyamatokat lehet használni a királis molekulák előállítására, ha a közvetlen kémiai szintézis megvalósíthatatlan vagy nem hatékony. Erre példa a Rhodococcusok felhasználása az indene előállításában, ami a Crixivan nevű AIDS-gyógyszer prekurzora, egy protáz inhibítor 2 királis centrummal a komplex molekulához szükséges 5-ből.

3.2.16. ábra: Rhodococcus species Kevéssé jelentős, közeli rokonai a Nocardiáknak és Rhodococcusoknak a Tsukamurellák [53]. Ezek talajban előforduló Actinomyceták, amelyek immunszupresszált páciensekben tüdőgyulladást okoznak. Különlegességük, hogy a sejtfalban található mikolsavaik extrém hosszú szénlánccal (~60 szénatom) rendelkeznek. A Tsukamurella paurometabola iparilag megfermentált sejtjeinek liofilezett formáját fitonematódák írtására használják a mezőgazdaságban biokontroll során [54]. Az Actinomyceták következő csoportja a Propionibacteriumok (Propionibacteriaceae), amelyek nem mozgó, spórátlan, anaerob pálcikák, és gyakran kórokozók (pl.: Propionibacterium acne (3.2.17. ábra), bőrpórusokban szaporodik el, eltömve azokat, és aknét létrehozva.).



78


3.2.17. ábra: Propionibacterium acne Nevüket a különleges propionsav-termelő anyagcseréjükről kapták, mint azt már korábban tárgyaltuk (1.3. fejezet, erjedések). A propionsav-baktériumok kereskedelmi érdeklődésre tartanak számot a svájci típusú sajtok íz- és lyukképzése kapcsán, továbbá egyre elterjedtebb az a nézet, hogy a propionsav-baktériumok probiotikumok, egyrészt az általuk termelt propionsav, B12-vitamin, fólacinok, bakterocinek miatt, másrészt a bélflóra tejsvabaktériumai növekedésének stimulálása végett [39]. Ilyen faj a P. freundenreichii subsp. shermanii. Éppen a sajtgyártás során merült fel először, hogy a sajtmátrix kialakulásakor először tejsavas erjedés megy végbe, amelyet az érlelési szakaszban propionsavas erjedés követ, ezért a propionsav-baktériumok alkalmasak a tejsavasan leerjedt fermentlé továbbhasznosítására. Ipari szempontból azonban a propionsav-baktériumok (PAB) tenyésztése jelenleg körülményes, mert lassan növekvő törzsek, amelyek az esetleges bakteriális fertőzésekkel nem tudnak versenyezni. Egyik megoldás lehet a PAB-ok törzsfejlesztéssel történő „felgyorsítása”, egy másik pedig az immobilizált PAB-ok alkalmazása. A Propionibacterium acidipropionici propionsav-termelésre használható 37°C-os optimális hőmérséklet és anaerob körülmények valamint 6-os pH mellett, míg B12-termelésre is alkalmas 40°Cos hőmérsékleti optimumammal és 0,5 vvm levegőztetés mellett 6,5-ös pH-n [40]. Ugyanez a baktérium korábban (XX. sz. közepe) Propionibacterium pentosaceum néven szerepel a szakirodalomban viszonylag nagy terjedelemben, és a baktérium eritritátalakító képességére [41] valamint nitrát-nitrit átalakítására [42] fókuszálva P. pentosaceum képes a borostyánkősavat is propionsavvá alakítani [43], amivel megteremti az átjárás lehetőségét a C4 platformból a C3-ba. A propionibacteriumok egyik iparilag is számottevő csoportja a Nocardioidák családja és azon belül a Pimelobacter simplex (korábban Arthrobacter simplex: széles körű szteroidkonverziós képességek). Az actinomyceták következő családja a Pseudonocardia-k (Pseudonocardiacea), amelyek sejtfala nem tartalmaz mikolsavat. Többynyire lebontóképességüket írták le, így ezek is bioremmediációra lakalmas fajok, mint például a szénhidrogénbontó Pseudonocardia hydrocarbonoxydans (olykor Amylocota hydrocarbonoxydans néven szerepel). A P. sulfidoxydans egyes proteobakterekkel együtt a bioszféra kénkörforgásában játszik szerepet, mivel a kéntartalmú aminosavak (mikrobiális) lebontásakor dimetil-szulfid és dimetil-diszulfid keletkezik, amelyeket néhány proteobakter és pszeudonokardia képes csak szulfáttá alakítani. Ezt a tulajdonságát szagmentesítő biofilmek alkalmazásakor is kiaknázzák [48]. A P. halophobica szintén többszöri átnevezés után (Amylocota autotrophica) került mai filogenetikus helyére, és korábbi nevén antibiotikumkonverziós irodalmak lelhetők fel [49]. Az előbbi Pseudonokardiak viszonylag újonnan felfedezett közeli rokona az 1,4dioxánnal szennyezett ipari szennyvíziszapból izolált dioxánbontó P. dioxanivorans. Tetrahidrofurán és egyéb éterszármazékok lebontására is képes. Az Actinomyceták egyik legismerteb képviselői a Streptomycesek, amelyek másodlagos metobiltjaikról híresek. A Streptomyces griseus (3.2.18. ábra) tenyészetében fedezték fel (1943) az aminoglikozid típusú sztreptomicin antibiotikumot.




79

3.2.18. ábra: Streptomyces griseus A neomycin, klóramfnikol, streptomicinek mellett az utóbbi években új szerepet kaptak a Streptomycesek: heterológ génepresszióra egyre gyakabban használják a Streptomyceseket, mivel az eukarióta fehérjék E. colival történő kifejeztetése nem volt elég hatékony. Másodlagos metabolitjaik között számos antifungális szer is található: nisztatin (Streptomyces noursei), amphotericin B (S. nodosus). A fajokban gazdag nemzetség olyan antibiotikum termelésével rendelezik, mint a klóramfenikol (S. venezuelae), tetraciklin (S. rimosus), Vankomicin (S. orientalis). A penicillinrezisztens mikrobák β-laktamáz enzimeinek gátlásával újra antibiotikum-érzékennyé tehetők. Ehhez klavulánsavat szoktak a penicillinekkel együtt formulázni, amely kiegészítést a S. clavuligerus faj termel [161]. 4. Thermotoga A Thermotogák termofil vagy hipertermofil, leginkább 80°C (legmagasabb optimum a baktériumok között) körül, semleges pH-n növekvő mikrobák. Általában pálca alakú sejtek, külső membránnal (=”toga”) is borítva. Enzimeik a magas hőmérsékleten való aktivitásukról ismertek. Már a ’90-es években ipari szemszögből foglalkoztak a cellulolítikus és xilánbontó enzimeikkel. A sótűrésük nagyon változó, míg egyesek extrém magas sókoncentrációt is elviselnek, mások csak alacsony sókoncentráció mellett növekednek, így olyan változatos élőhelyeken találhatók meg, mint például a sekélyesek vagy a mélytengeri rendszerek és kontinentális olajmezők. Elsőként a T. maritimát izolálták egy vulkánból, majd egy olasz sekélytengeri üledékből, amely geotermikusan fűtve volt. A következő faj a T. neopolitana volt, amelyet egy Nápoly közeli tenger alatti tengeri hőforrásból izoláltak. A legújabb Thermotoga törzs 68°C-os melegvízben 6,8-as pH-n nő Németországban. Ezek az aerob Gram-negatív mikroorganizmusok általában spórátlanok, és számos szénhidrátot metabolizálnak, például glükózt, saccharózt, keményítőt, cellulózt és xilánt. Az L-alanin- termelésük hasonló az ősbaktériumok közé tartozó Thermococcusokéval, ami azt mutatja, hogy a cukorból Lalanin-előállítás egy korábbi ősi metabolizmus jellegzetessége.

3.2.19. ábra: Petrotoga sp.



80


Egy hasonló faj az anaerob Petrotoga (3.2.19. ábra) olajtartályokból izolálható, ami felveti a kérdést mind a mély felszín alatti túlélésükről, mind pedig az őshonosságukról ezen a különleges ökoszisztémában. 5. Fusobacteriumok Anaerob, heterotróf, fonalas szervezetek, noha a humán felsőlégúti (torok, garat) szervek normál flórájához is tartothatnak, számos fertőzés kórokozói (Fusobacterium necrophorum), ezért minden Fusobaktert fertőző ágensként kell kezelni. Ennek ellenére bacteriocineket [73], és β-laktamázt [74] is termeltethetnek velük.

3.2.20. ábra: Fusobacterium novum [178] 6.-7. Deinococcus-Thermus Két rendet (Deinococcales és Thermales) magába foglaló (ezért kettős nevű), kevés fajt tömörítő baktériumtörzs, ahová zömében extrémofilek tartoznak. A Deinococcus radioduranst (3.2.21. ábra) poliextrémofillnek is nevezik, mivel – nevéből adódóan – jól tűri a sugárzásokat, és ezen felül még hidegtűrő, savtűrő, jól viseli a kiszáradást és a vákuumot is (azaz „űrutazásra” is képes). Az ellenálló képességét annak köszönheti, hogy a genomját több példányban is fenntartja, illetve hatékony DNSjavító rendszerrel rendelkezik. [165]

3.2.21. ábra: Deinococcus radiodurans [178] A Thermus thermophilus japán hőforrásból izolált 80°C-os növekedési optimummal és intenzív oxigénigénnyel rendelkezik, noha az oxigén oldhatósága e magas hőmérsékleten meglehetősen kicsi. Ugyanakkor hőstabil enzimek forrás-mikoroorganizmusaként nagy jelentőséggel bír (pl.: rTth-DNS polimeráz [67], α-glükozidáz [75]). A teljes genomját megszekvenálták, így lehetővé téve a termofilexpressziós rendszer kialakítását




81

8. Chloroflexi Zöld, nem kénbaktériumok csoportja, általában fonalas morfológiával. A fényt használják energiaforrásként a zöld pigmentjeik segítségével (nem kloroplaszt!), siklással („gliding”) mozognak. A fényhasznosító rendszerük a magasabb rendű élőlényeknél megszokott II-típusú fotoszintetikus reakcióközpontot használja bakterioklorofillal, a Chlorobi fajaihoz hasonlóan. Míg a magasabb rendű fotoszintetizáló élőlények vizet használnak elektron- donorként, addig a Chloroflex-ek H2S-t (mint a Chlorobi-k) vagy H2-t. A szokásos Calvin-ciklus helyett pedig egy sajátos, 3-hidroxi-propionát ciklust használ a szerves anyagok beépítésére. Szemben a szigorúan anaerob Chlorobi fajokkal, képesek aerob heterotróf anyagcserére vagy anerob fotoheterotróf, illetve anaerob fotoautortóf anyagcserére is [78]. Egy típusfaj a Chloroflexus auranticus (3.2.22. ábra), amely termofil baktérium sötétben, oxigén jelenlétében is szaporodik, és narancsszínű. Fény mellett fotoszintetizál, és zöld színű telepeket alkot [76]. Ipari potenciált speciális amilázai jelentenek, amelyek a keményítőt nem maltózra vagy glükózra, hanem maltotriózra és maltotetraózra (3, illetve 4 tagú oligoszaharidokra) bontja, amelyeknek újabban nagy jelentősége van az élelmiszeripar, gyógyszeripar és a finomvegyipar számára [77]. Ugyanezen mikroba különleges 3-hidroxi-piruvát- termelő képessége szintén ipari potenciált rejt, mivel a 3hidroxipiruvát és származékai egy fontos platformot alkotnak, amelyek előállításához új megközelítést és új enzimeket szolgáltathat a Chloroflexus auranticus [79].

3.2.22. ábra: Chloroflexus auranticus [178] A Chloroflexek másik rendje a Herpetosiphonales, amelynek egyik típus faja a Herpetosiphon aurantiacus [80], ám ezek iparilag még jelentéktelenek. 9. Cyanobacterek Fotoszintetikus baktériumok és a kloroplasztok csoportja. A mikroalgák jelentős része is közéjük tartozik. Poshadt állóvizek lakója, amely vizek az általuk termelt cianotoxinok miatt mérgezőek. Nevüket kékeszöld színüknek köszönhetik. A cianobaktériumok oxigéntermelő fotoszintetikus képessége tette lehetővé a korábbi redukáló légkör oxidatívvá tételét, ami drámaian megváltoztatta az életformákat a Földön, és megnövelte a biodiverzitást, noha ez veszélyeztette az oxigénintoleráns fajok fennmaradását. Az endoszimbionita elmélet szerint a növényi és algakloroplasztok endoszimbionita cianobaktériumokból származtathatók. Biotechnológiai potenciáljukat jelzi, hogy az egysejtű Synechocystis cianobaktérium volt a 3. prokarióta, amelynek teljes genomját feltérképezték. Ez továbbra is fontos modellszervezet maradt. A genomméretük tekintetében igen nagy szórás érzékelhető: Prochlorococcus 1,7Mb, Nostoc punctiforme 9Mb, Calothrix 12-15Mb, ami már az élesztőével azonos nagyságú. Felhasználásuk szempontjából némelyeket élelmiszerként forgalmaznak (pl.: Aphanizomenon flos-aquae), ugynakkor újabban a zöldenergia-termelésben játszhatnak szerepet a napfény közvetlen elektromossággá alakításával. A makroalgákhoz (ld. később) hasonlóan intenzíven kutatják a cianobakter-alapú alternatív üzemanyag előállításának (dízel, benzin, kerozin) lehetőségét [81]. Leggyakoribb felhasználásnak az Arthrospira (3.2.23. ábra) nemzettség fajai örvendenek, amelyeket részletesebben az Algák fejezetben tárgyalunk (ezek elterjedt neve a Spirulina).



82


3.2.23. ábra: Arthrospira (Spirulina) sp. [178] 10. Spirohaeták Általában csavarodott vagy szabálytalan alakú baktériumok, amelyek többsége kórokozó (pl.: Lymekór -kullancsok által is terjesztett), amelyet a Borrelia burgdorferi okoz, vagy a Treponema pallidum, amely a szifilisz kórozója). Szaharolítikus [82] és etanoltermelőkre [83] is találunk példát, de ipari felhasználásuk nincs. A Spirohaeta thermophila fermentatív anyagcserével rendelkezik, és a glükózt tejsavvá, etanollá, szén-dioxiddá, illetve hidrogénné alakítja [84]. 11., 12,. 13. Chlorobik, Fibrobacterek, Bacteroidesek Egyes források szerint [27] a korábbi CFB (Cytophaga, Flavobacter, Bacteroides) csoportot átszervezték Fibrobacterek, Chlorobik, Bacteroidesek számára. A Fibrobacterek többnyire a bendőben találhtaók meg, ezért ipari szempontból cellulázaik figyelemre méltóak. A Fibrobacter succinogenes jó hozammal (Y=83%, bár alacsony produktivitással J=14 mg/lh) képes a cellulózból borostyánkősavat (platformalkotó!) előállítani. A Chlorobi törzs (amelyet zöld kénbaktériumoknak is szokás nevezni) obligát fotolitotrófokat foglal magába, amelyek szigorúan anaerob fotoszintézist végeznek, azaz elektrondonorként H2S-ot használnak. Általában anoxikus vizes közegben találhatók meg, ahová a napfény bejuthat. A fotoszintetkius antennamolekuláikat flexibilesen tudják változtatni, aminek következtében változtatják az elnyelhető fényhullámhosszt, és így olyan rétegekben is életképesek, ahol más fotoszintetizáló szervezet számára nincs vagy nem megfelelő a beérkező fény.

3.2.24. ábra: Bacteroides biacutis A CFB patogén, kommenzalista és szabadon élő mikrobák diverz csoportja. A Bacteroides fragilis toxi termeléséről ismert, de aminok előállítására is használható, valamint a bélbaktériumok között is előfordul [69]. A normál humán mikrobióta mintegy 20%-át a Bacteroides-ek teszik ki (3.2.24. ábra). A bélbaktériumok között különleges szerepük lehet, mivel igen jó cukorlebontó képességgel rendelkeznek. Az emberi emésztőrendszer felső szakaszán (száj, nyelőcső, gyomor és a © Németh Áron, BME



83

vékonybél) a cukrok lebomlanak és felszívódnak, így csak a poliszaharidok (pl.: növényi rostok) szolgálnak a vastagbélben honos mikrobióta számára szén- és energiaforrásul. Az ilyen növényi rostok fogyasztása csökkentheti a vastagbélrák kialakulásának kockázatát. A különböző fajok szubsztrátspecifitása jelentős különbségeket mutatnak, így a belőlük nyerhető degradációs enzimek is eltérőek. A B. fragilis keményítőszármazékok (amilóz és amilopektin) bontásában jeleskedik, a B. ovatusok között pedig xilán, dextrán, pektin, guargumi és alginát bontók is találhatók. 14., 15., 16. Planctomyceta-k, Verrucomicrobiumok, Chlamydiák A Planctomicetákkal kapcsolatban az első felfedezés egy magyar nevéhez fűződik (Gimesi Nándor) 1924-ből [70]. Az általa a Lágymányosi-tóban felfedezett csillag alakú élőlényeket (3.2.25. ábra) planktonikus gombának osztályozta, csak később derült ki, hogy az egyik legfejlettebb prokariótáról van szó. P. gimesii képes cukrokat fermentálni (erjeszteni). Taxonómiai jellmezőjük a peptidoglükánmentes fehérjékkel borított sejtfal, a sarjadzó szaporodás, DNS-t borító membrán, különleges morfológia (nyeles sejtek, többsejtűek, a nyéllel hajlamosak megtapadni) és részleges kompartmentizáció [85]. A Verrucomicrobium és Klamidiák fajai általában eukarióták parazitái.

3.2.25. ábra: Planctomyces bekefii 17. Aquificae Az Aquificae fajok szigorúan hipertermofilek, és jelenleg úgy gondolják, hogy ezek alkotják a baktériumok közötti első elágazást. Az elágazási pont helye a filogenetikus fán változó, és nem tisztázott. Ezt a törzset csak mostanában fedezték fel a 16rRNS-ében tapasztalt eltérés alapján. Azonban ezen kívül nincs más ismert molekula vagy tulajdonság, amely megkülönböztetné őket más baktériumoktól. Kemolito-autotrófok, azaz CO2-t fixálnak, és szervetlen anyagok oxidálásával nyerik energiájukat. A törzs neve is innen ered: hidrogén gáz oxidációjával (akár minimális O2 segítségével) vizet termelnek (Aquifex=vízjelző). Magas hőmérsékleti optimumuk miatt mint genetikai (és proteomikai) potenciált kutatják. Általában 2-6 mikronos hosszúságúak (3.2.26. ábra), nem spóraképző Gramnegatív mikrobák. Az Aquifex pyrophilus anaerob módon is képes növekedni, miközben oxigén helyett nitrogént redukál.

3.2.26. ábra: Aquifex aeolicus



84


18., 19., 20., 21., 22. Proteobacterek A „Proteobakter” gyűjtőnevet újabban a korábban használatos bíbor baktérium helyett vezették be, mivel a nagy diverzitású taxonok között sok nem „bíbor” színű és néhány fotoszintetizáló is található [86]. A név maga a görög Proteus nevéből származik, jelezvén a sokféle idesorolt fajt. A 16S rRNSanalízisek alapján a proteobakterek több száz nemzettségét 5 (egyes források szeint 6) osztályba sorolták, amelyeket a görög ábécé betűivel jelölnek (α, β, γ, δ, ε (δ)). Az rRNS-analízisek szerinti elágazási sorrend más, mint az ábécé szerinti sorrend, e jegyzetben az eddigi koncepcióhoz híven az elágazási sorrend szerint tárgyaljuk a proteobaktereket. Delta-, epszilon-proteobacterek A delta-proteobacterek 3 nagy csoportra oszthatóak: a szulfát/kén redukáló Desulfovibriokra, a predátor fajta Bdellovibriokra és a gombaszerű termőtesteket és spórákat képező Myxobacterekre. A Desulfovibrio fajok a szulfát, nitrit, nitrát, CrVI, UVI redukálóképességük miatt eddig is a (környezetvédelmi) kutatások középpontjában álltak (pl.: Desulfovibrio desulfuricans, D. vulgaris) [144]. Az utóbbi évtizedben olyan különleges fajt (és szintén deltaproteobacter rokonait) fedezték fel, mint a Desulfobacter magneticus, amely magnetotaktikus, és magnetoszómájába magnetit ásványt (FeII és FeIII oxidot) választ ki (biomineralizáció) [143]. A Bdellovibrio fajok általában más Gram-negatív baktériumok predátorai, és azok periplazmás terében élnek (pl.: Bdellovibrio bacteriovorus). E különleges baktériumok 160 μm/s sebességgel (saját hossz 100x-a szekundumonként) nekiütköznek az áldozatnak, és kilyukasztják annak külső membránját, majd a lyukon át beköltöznek a periplazmás térbe, befoltozzák a lyukat, és várnak. (látens állapot). Ezt követően hidrolítikus enzimeikkel feloldják a gazdaszervezetet, és fonalas formában benövik annak belsejét („bdelloplaszt”). Az életciklus végén a fonalak egyedi sejtekké esnek szét. Egy E. coli sejtből, kb 3-6 Bdellovibrio sejt keletkezik, de a nagyobb áldozatokból akár 80 is keletkezhet [145]. Biotechnológiai potenciált a litikus enzimeik jelenthetnek, de egyelőre ezek alkalmazása nem ismert. A Myxococcus tagjai a legnagyobb genomúak, és tápanyaghiány esetén termőtestet (3.2.27. ábra) hoznak létre, amely myxospórákat termel. Ezek rendkívűl ellenállóak. Aktív mozgásra („siklás”) képesek: a temőtestet átrendezik, ezért „nyálkabaktérium”-nak is szokás nevezni őket [146].

3.2.27. ábra: Myxococcus xanthus [178] A Myxococcus xanthust használják modellszervezetként a Myxococcusok változatos, bioaktív, másodlagos anyagcseretemékeinek vizsgálatára. Ezek sajátos új szerkezetű antitumor (pl.: epothilon,




85

hatása, mint a paclitaxelé), antibiotikus (pl.: orangicin), illetve sziderofór (Myxochellin) hatású anyagok [147], amelyek komoly (gyógyszer)ipari lehetőségeket rejtenek. Az epszilon-proteobacterek között a Campylobactereket és a Heliobactereket találjuk. Mindkét nemzettség emésztőrendszeri megbetegedéseket okoz, a Heliobacterekről az utóbbi években derült ki, hogy a gyomorfekély kórokozója (Heliobacter pylori, 3.2.28. ábra), amely fekély után 6x nagyobb a gyomorrák kialakulásának esélye [142]. Ipari alkalmazás vagy annak lehetősége egyiknél sem ismert.

3.2.28. ábra: Heliobacter pylori [178] Alfa-proteobacterek [87] A 16S rRNS-alapú filogenetikus fán az alfa-proteobactereket 5 „cluster”-re osztják. Az első a Caulobakter-féléket tartalmazza három további alcsoportba osztva. Ezek közül ipari potenciállal, illetve felhasználással rendelkezik a Brevundimonas diminuta, amely kis mérete miatt vízszűrők hatékonyságának tesztorganizmusa, valamint restrikciós endonukleázok (PdiI, PdmI) forrása, korábbi neve pedig Pseudomonas diminuta [88]. A Brevundimonas vesicularis pedig a biodegradálható műanyagok alapanyagának a poli-hidroxi-alkanoátoknak előállítására alkalmazható akár fűrészporalapú fermentációban is [89]. A másik alcsoportba tartoznak a Caulobacterek. A Caulobacter crescentust (típus törzs) expressziós rendszerként használják, mivel kisméretű fehérjéket poszttranszlációs glikozilezés nélkül extracellulárisan termel [90]. Felhasználható haszonállatok vakcinálására is, mivel egy különleges „S-layer kit” segítségével a sejtek felszínén jelennek meg a klónozott gének géntermékei, amelyek antigének is lehetnek [91]. Egyes tengeri Cauolbacterek erős antibiotikumot (tiotropocint) termelnek, amely egyszerre gátolja a fitoplankton, algák és baktériumok növekedését [92]. A Caulobakterek 2. csoportjába a Rhodobakter-félék tartoznak, idesorolva a Paracoccus nemzetséget is, amelynek tagjai (pl.: Paracoccus panthotrophus) felhasználhatók poli-hidroxi-butirát (PHB, bioműanyag) előállítására [94], astaxantin (karotinoid) előálítására (P. haeundaensis) [95]. A Paracoccus denitrificans (korábban Micrococcus denitrificans) denitrifikáló (nitrátredukáló) baktérium, tehát fontos szerepe van a nitrogén-körforgalomban, és egyben a mitokondrium őse, azaz egy P. denitrificans endoszimbiózisával jöhetett létre az eukarióták mitokondriuma [96]. A Rhodobacterek alkalmazásának lehetőségére példa a Rhodobacter sphaeroides heterológ génexpressziós rendszere. Emellett széles körű anyagcsere- lehetőségekkel rendelkezik: noha legjobban anaerob fotoszintézis mellett szaporodik, képes fermentatív heterotróf anyagcserére (aerob, illetve anaerob légzéssel is), illetve nitrogénfixálásra is. A Rhodobacter capsulatus PHA- és PHB-termelő képességét széleskörűen kutatják és fejlesztik [97]. Ugyanaezen faj a fotoszintetikus biohidrogén termelésében is jeleskedik [98]. Szintén biotechnológiai potenciált jelent a R. capsulatus esetében a bacteriocintermelés is [99]. Közeli rokonként ide sorolják a Pseudorhodobactereket, Amaricoccusokat, Antarctobactereket, Leisingerákat, Octadecabactereket, is, ám ezek ipari alkalmazása jelenleg nem ismert.



86


A szintén idesorolt Ketogulonicigenium vulgare (3.2.29. ábra) szorbóz dehidrogenázának irodalma viszonylag kiterjedt, különösen, ha a korábbi nevén (Gluconobacter oxydans DSMz4025) keressük. Így arra is fényderül, hogy az egyik legrégebbi (bio)technológia a C-vitamin- gyártás során használatos, amelynek kulcslépése a szorbit-szorbóz átalakítás. Ezt éppen G.oxydans mikrobával végzik, amelyet 2001-ben soroltak át új taxonómiai helyére [100].

3.2.29. ábra: Ketogulonicigenium vulgare A Rhodobacter-félék közé tartoznak a Hyphomonasok, amelyek extracelluláris poliszaharidokat termelnek, és ezekkel mint ragasztóval a biofilmek képződésében játszanak szerepet (pl.: Hyphomonas neptunium) [93]. Az alfaproteobacterek teljes filogenetikus fája ,számos itt fel nem sorolt fajjal, hozzáférhető a http://ijs.sgmjournals.org/cgi/data/55/5/1907/DC1/1 címen. Felhasználási potenciáljuk miatt azonban meg kell még említeni a nitrogén-körforgalomban fontos szerepet játszó alfaproteobaktereket. Az Azospirillium fajok a mezőgazdaságban kerülnek szándékosan (farmerek által), illetve természetes úton felhasználásra, mivel ezek megkötik a légköri nitrogént, és az abból képzett ammóniát glutamin formájában a szimbionita (haszon)növény gyökerének átadják, amiért cserébe az életfolyamataikhoz és a nitrogénfixációhoz szükséges energiatermelésükhöz malonsavat (almasav) kapnak a növénytől (heterotróf szimbiózis). Ezáltal csökkenthető a felhasznált műtrágya mennyisége. A Nitrobacterek szintén az alfaproteobakterek közé tartoznak, és a nitrifikációért felelnek, azaz az ammóniából előbb nitritet, majd nitrátot állítanak elő energianyerés céljából szén-dioxid fixáció közben (kemoautotróf anyagcsere). A hüvelyes növények esetében ez az egymásra utaltság endoszimbiózis formájában mégszorosabb, és ebben az esetben a Nitrobacterek legközelebbi rokonai a Rhizobiumok végzik a nitrogénmegkötést. A Rhizobiumok között található meg újabban (2001) a nagy biotechnológiai múlttal rendelkező Agrobacterium tumefaciens [170] (3.2.30. ábra), amely növény patogénként a növényi géntranszfer eszközévé vált.

3.2.30. ábra: Agrobacterium tumefaciens répaszöveten [178] A Roseobacterek a tengeri mikrobióta leggyakoribb tagjai, amelyek igen változatos másodlagos anyagcseretermékekkel rendelkeznek ezért intenzív (antibiotikum) kutatások tárgyát képezik [101], de találhatóak köztük denitrifikálók is (Roseobacter denitrificans) [102]. Végül meg kell említeni, hogy az alfaproteobacterek között olyan patogéneket is találunk, mint a Rikettsiák és Brucellák. Előbbiek az ízeltlábúak kórokozói, amelyek akár tünetmentes vektorok is




87

lehetnek, és csípésük során vagy székletükkel kerülnek át a paraziták az emberbe, ahol a hajszálereket fertőzik meg, és trombózist, szervi működészavart eredményeznek láz és kiütéses tünetek mellett [103]. Mivel obligált opportunisták, önmagukban nem tenyészhetők mesterséges környezetben (fermentorban), csak szöveteken. A Brucellózis abortív betegség, amely a „szarvasláb” nevű betegséget okozza például teheneken, ahonnan tejjel vagy sérült bőrfelületen kerülhet át az emberbe, és súlyos lázas megbetegedést okoz. A bioetanol-gyártás bakteriális jelöltje a Zymomonas mobilis is alfa-proteobcter. Különlegessége, hogy sejtfalában hopaninsavat tartalmaz, amely az eukarióta szterinekhez hasonlít. Ennek köszönhetően jól tolerálja a magas (13%) etanolkoncentrációt is. Emellett nagyobb etanolhozam és kisebb biomassza-képződés tapasztalható a Z. mobilis etanolos fermentációjában [160]. Beta-proteobacterek A Hydrogenophilaceae család tagjai közé tartoznak a Thiobacillus nemzetség fajai, amelyeket biokontrollra lehet felhasználni (pl.: T.denitrificans), mivel kénporral történő együttes kiszórásuk után a krumpliföldön a kenet kénsavvá oxidálja, melyet a krumplibogarak lárvái nem viselnek el [104]. A Thiobacillus ferrooxidans a piriteloxidálást segíti Acidophilumokkal együtt aerob környezetben (respiráló mikrobák). Néhány Thiobacillust 2000-ben átneveztek Acidithiobacillus, Halothiobacillus és Thermithiobacillus néven a gammaproteobakterek közé sorolták. A Thiobacillusok igazi ipari jelentőségét a szulfit ásványokból történő fémfelszabadítás (=”bioleachig”) adja, amelyre példa az autotróf kemolitotróf Thiobacillus ferrooxidans [105]. A Thiobacillus denitrificans különleges metabolikus repertoárral rendelkezik: szervetlen kén- vegyületek oxidációjával vagy aerob FeIIoxidációval kapcsolja össze a denitrifikációt (NO3->NH4+). Fakultatívan választ az aerob respiráció és a denitrifikáció között, és mezofill, illetve neutrofill hőmérsékleti és pH-tartományokban szaporodik szemben a termo- és acidofil kénoxidáló baktériumokkal. Az a különleges mehanizmus, ahogy az oldhatatlan szilárd ásványt hasznosítani képes még pontosan nem ismert [106]. A Thiobacillusok közvetlen rokonai a Hydrogenophilus nemzetség tagjai, amelyek különlegessége, hogy energiaszükségletüket hidrogén oxidációjával nyerik [171]. A következő csoportot az aerob, fonalas Sphaerotilusok alkotják, típusfajuk a Sphaerotilus natans, ipari alkalmazásuk nem ismert. Őket követik a Neisseriák, amelyek tipikus kórokozók: Neissria gonorrhea (nemi betegség), N. meningitidis (agyhártyagyulladás) [107]. A Spirillumok felhasználásáról nem áll rendelkezésre információ, viszont a Burkholderia nemzettség tagjai alkalmazhatók [108] a mezőgazdaságban biokontroll célokra, rhizobiális adalékként, illetve biodegradációban, valamint xilanáztermelő is található közöttük [109]. A nagyobb felhasználási kör jobban megérthető, ha figyelembe vesszük, hogy szinte valamennyi Burkholderia faj a Pseudomonasok újrabesorolásakor került leírásra, és amelyek vizsgálata nagyobb múltra tekint vissza, így alkalmazásuk is szélesebb körű. Példa erre a Burkholderia cepacia (3.2.31. ábra) és B. gladioli, amelyek rendre a Pseudomonas cepacia és a P. gladioli gamma-proteobacterekhez történő átsorolásakor kerültek először leírásra Yabouchi és munkatársai (1992) munkássága nyomán. Mindkét törzs lipázforrásként használatos [110].

3.2.31. ábra: Burkholderia cepacia [178]



88


A Burkholderia rendbe tartoznak az Alcaligenaceae család fajai is, amelyek között a Bordatella pertusis, vagyis a szamárköhögés kórokozója is megtalálható. Ennek biotechnológiai jelentősége a gyermekkori vakcina (DiPaTe, korábban DiPerTe) előállításában és alkalmazásában van. A korábbi DiPerTe vakcina gyakran váltott ki lázas oltátási mellékreakciókat, mióta azonban a pertusis inaktivált sejtjei helyett antigéneket alkalmaznak (acelluláris azaz sejtmentes készítmény), kevesebb a mellékreakció. Egy másik különleges nemzetség az Alcaligenes, amelyeket ipari aminosav előállítására használnak, illetve az A. eutrophust PHB-termelésre is használják. Korábban szintén a Pseudomonas családba sorolták a Zoogloea fajokat, majd elkülönítették a többi obligát aerob, Gram-negatív spórátlan pálcikától (=Pseudomonasok), mert sajátos zselatinszerű mátrixot képeznek [111]. Ennek megfelelően biotechnológiai alkalmazásra szinte kizárólag a „zoogloea gum”, vagyis a különleges extracelluláris poliszaharid előállítása esetén használják e fajokat, köztük leggyakrabban a Zoogloea ramigerat. A Ferribacterium limneticum szerves savak oxidációjával redukálja a Fe3+-t Fe2+-vé [172]. Ennek közeli rokona számos nitrogénfixáló nemzetség (Azoarcus, Azovibrio, Azospira stb.), amelyek a denitrifikációval együtt számos szennyezőanyag lebontását katalizálják (pl.: aromás szennyezők) [173]. Aerob vagy anaerob heterotróf, nem-szulfát-redukáló, mérsékelten termofildenitrifikáló baktériumok az olajmezők Petrobacter succinatimandens baktériumai, amelyek borostyánkősavon is szaporodnak [174]. Különleges fermentatív mikroba a Propionivibrio limicola), amely sem szénhidrátokon, sem szerves savakon, de mégcsak szerves szennyező anyagokon sem képes nőni, viszont kinik-savon és sikimik-savon propionsavat, szén-dioxidot ecetsavat termel [175]. A Rhodocyclus nemzetség tagkai anoxikus fototrófok, és a nevüket a sejtek gyűrűs alakjáról kapták, aminek következtében a sejt két pólusa közel kerül egymáshoz [176, 177]. Gamma-proteobacterek Fajokban meglehetősen gazdag proteobacter-csoport, amely számos súlyos betegség (pl.: kolera) kórokozója mellett néhány biotechnológiailag jelentős mikrobát (egyes Pseudomonas-okat, Enterobacter-eket) is magába foglal. A Beggiatoak nagyméretű (200 μm!) fehér fonalas szervezetek, amelyek a néhány ”szintetikus” szervezet közé tartoznak. Ezek képesek a légköri szén-dioxidból és a tengervízből szervetlen vegyületek energiájának felhasználásával szénhidrátokat szintetizálni (autotrófok). Noha kataláz negatívak, légköri oxigén felhasználásával heterotróf anyagcserére is képesek, mivel az oxigén okozta nem kívánatos oxidációs folyamatokat kén segítségével közömbösíteni tudják [112]. Tengeri szennyeződések eltávolításakor megjelennek (indikátor), és nagy méretük miatt szabad szemmel is láthatóan megjelölik a szennyezést. A másik autotróf gamma-proteobacter csoport a bíborkén-baktériumok csoportja. Fotoszintézisükhöz nem vizet használnak, mint a legtöbb fotoszintetizáló szervezet (cianobaktériumok, algák, növények), hanem kénhidrogént, így oxigén helyett kenet szabadítanak fel [113]. Két családra oszthatóak aszerint, hogy a kenet extracellulárisan (Ectothiorhodospiraceae) vagy intracellulárisan (Chromaticeae) választják ki. A Chromaticae család legjobban leírt tagja a Thiocapsa roseopersicina, amely által termelt hidrogenázenzim biotechnológiai (biogáz-termelési) potenciállal rendelkezik, mivel a Thiocapsa alacsony növekedési hőmérsékleti optimuma (20-25°C, északi-tengeri izolátum(!)) ellenére a hidrogenáza hőstabil (>80°C), proteázoknak ellenáll, és jól tolerálja az oxigént (a Thiocapsa roseopercicina fakultatív anaerob) [114]. A gamma-proteobacterek speciális alkalmazással bíró nemzettsége az Alcanivorax (pl.: A. borkumensis, 3.2.32. ábra), amely tengeri olajszennyezések eltávolításánál hasznosítható, amennyiben kén és nitrogén is rendelkezésére áll [115].




89

3.2.32. ábra: Alcanivorax borkumensis Hasonló képességekkel rendelkeznek a Marinobacterek. A M. hydrocarbonoclasticus (korábban Pseudomonas nautica) azonban még extrém halotoleráns is [117] Hidegtűrő gamma-proteobacterek a Glaciecolak (pl.: G. polaris, G. agarilytica), amelyek a sarkvidéki jeges, oligotróp élőhelyeken is megélnek [116]. Nagy biotechnológiai potenciált rejt a Microbulbifer (újabban Saccharophagus) degradans enzimkészlete, amely cellulóz, alginát és kitinbontásra is alkalmas enzimeket foglal magába [118]. Ezek segítségével a xilóz- és cellulózalapú etanolgyártás jelöltje. A gamma-proteobacterek között olyan kórokozók és rokonaik is megtalálhatóak, mint a Legionellak (pl.: L. pneumophila), Francisellak, Vibriok. A Legionellák halálos légúti fertőzést okoznak, és a szovjet időkben 100% mortalitásúra mutáltatott fajt is kifejlesztettek belőle (=biológiai fegyver) [119]. A Francisella tularensis a tularemia kórokozója, amely vadnyulakról kerülhet kullancsfertőzés vagy vadászat közben az emberekre, és fekélyes lázzal jár, és akár agyhártyagyulladásba is torkollhat. Az USA-ban biológiai fegyverként is rendszeresítették. Többször átnevezték, előbb Bacterium tularensis, majd Pasturealla tularensisként került besorolásra [120, 121]. A patogén Vibriók által okozott egyik legsúlyosabb fertőzés a kolera (Vibrio cholerae), amely szennyezett vízzel terjed. Ugyanakkor a Vibriók fermentálnak (erjesztenek) is, illetve tetrodotoxint termelnek (Vibrio alginolyticus), amely egy neurtoxikus (nátriumcsatorna szelektív blokkolójaként blokkolja az akciós potenciál kialakulását) ősi tengeri alkaloid, és a szimbiotikus baktériumok ezzel nyújtanak védelmet a gazdaszervezeteiknek (hal) a ragadozók ellen, amiért cserébe bőséges táplálékot kapnak. [122]. A Vibriók különleges rokonai a Photobacteriumok, amelyek biolumineszkálnak (csakúgy, mint a szintén közeli rokon Lucibacteriumok), azaz fényt bocsátanak ki, és szintén szimbionták, továbbá pszichrofilek (hidegkedvelők) és piezophilek (másnéven barofilek vagy nyomáskedvelők) [123]. A Vibrio fisheri további különlegessége, hogy csak egy adott sejtkoncentráció elérése után bocsátanak ki a sejtek fényt, amely koncentrációt a tengerben szabadon élve nem tudnak elérni, csak a halak endoszimbiózisában. Ehhez a szervezett válaszreakcióhoz sejt-sejt közötti kommunikáció szükséges [124].

3.2.33. ábra: Escherichia coli



90


Ipari szempontból talán a legjelentősebb gamma-proteobacter csoport az Enterobactereké. Köztük olyan fajok találhatóak, mint a legtöbbet vizsgált és iparszerűen is alkalamzott heterológ expressziós rendszer, az Esherichia coli, amelynek patogén fajtái is léteznek (3.2.33. ábra). A glicerin – 1,3-propándiol-átalakítás enzimeit is főleg az Enterobacteriaceae között (pl.: Enterobacter, Citrobacter Klebsiella stb.) találhatjuk meg. Ide sorolták a mezőgazdasági jelentősséggel bíró Erwina amylovora fajt is, amely az almafélék tűzelhalásos betegségét okozza. A Proteus nemzettség tagjai igen változatos formában jelennek meg, ennek köszönhetik nevüket is. Általában talajlakók és humán patogének (Proteus vulgaris, P. mirabilis, P. penneri) [125]. Talán a legismertebb humánpatogén enterobakterek a Salmonellák, közülük is a Salmonella enterica sp enterica alfajai, amelyek az ételmérgezések jellegzetes kórokozói: typhi (hastífusz), choleraesuis (szepszis) enteriditis (heveny gyomorrontás)) [126, 127]. A Salmonellák közeli rokonai az általában húgyuti fertőzést okozó Serratiák (pl.: Serratia marcescens). Emellett azonban biotechnológiai potenciált is rejtenek, mivel egy értékes gyógyszerhatóanyagot, a prodigiosint lehet velük hatékonyan ipari hulladékon előállítani. A prodigiosin egy antifungicid, immunszupresszív és antiproliferatív pigment- molekula [128]. A Shigellak szintén közeli, főemlősöket fertőző rokonai a fenti enterobaktereknek [129]. A normál bélflóra ecetsav és hangyasav termelésével szorítja vissza a shigellózis (S. flexnerii) kialakulásának lehetőségeit. Végül egy szintén komoly, járványos megbetegedés, a pestis kórokozója (Yersinia pestis) és rokonai is az enterobakterek közé sorolandók. Újabban antibiotikum (v. baktericid) termelését is bizonyították olyan kórokozók ellen, mint pl.: Pseudomonas aeruginosa vagy Klebsiella pneumoniae, vagy éppen Staphylococcus aureus [130]. A gamma-proteobacterek másik fontos csoportja a Pseodomonasoké. A típusnemzettség (Pseudomonas 3.2.34. ábra) fajai a mikrobiológia hőskora óta ismertek, és számos kórokozó tartozik közéjük (P. putida, P. aeruginosa, P. fluorescens), de olyan hasznos nemzettségek is, mint az Azotobacterek, Rhizobacterek, Cellvibriók.

3.2.34. ábra: Pseudomonas sp. Az Azotobacter vinelandii különleges aerob nitrogénfixáló metabolizmussal rendelkezik, amelynek nitrogenázenzimei eltérnek a szokásos (pl.: Azospirillium) molibdenát központú mehanizmustól. Életformájában is más a megszokott nitrogénfixálókhoz képest: nem növényi szimbionita, hanem szabadon élő [131]. Több fajuk is (A. vinelandii, A. chroccocum) alginát biopolimert termel, a barna algákhoz hasonlóan [132]. A Rhizobacterek a Rhizobiumokhoz hasonlóan a hüvelyes növények gyökérszöveteinek endoszimbionitája, segítve a növény növekedését megfelelő nitrogéntartalmú tápanyagok ellátása révén (Nfixálók). Ugyanakkor ezeket a baktériumokat szokás Plant-Growth-Promoting-Rhizobacteriának (PGPR-növényi növekedést serkentő rhizobaktereknek) nevezni, ahol a pontos támogató mehanizmus




91

még nem teljesen ismert, de valószínűleg sziderofórok, fitohormonok segítségével és az ásványianyagfelvétellel segítik a növény növekedését [133]. A Cellvibrio nemzettség fajai a nevükből is láthatóan cellulózbontók. Köztük a legintenzívebben vizsgált faj a Cellvibrio japonicus, amelyet japán talajmintából izoláltak 1952-ben. Ennek megfelelően különböző – a megszokottaktól valamiben eltérő – enzimeiket vizsgálják (arabináz [134], xilanáz [135] stb.), ezek jelentős alkalmazási potenciállal rendelkeznek a bioipar számára. A gamma-proteobacterek következő csoportja a Pasteurella-félék, ahová a humánpatogén Haemophilus influenzae és a házi baromfit fertőző Pasteurella multocida került többek között besorolásra. Utóbbi biotechnológiai jelentősége, hogy az állattenyésztők számára vakcinaként inaktivált Pasteurella-sejteket vagy azok antigénjeit forgalmazzák. Hasonló a helyzet az Actinobacillus pleuropneumoniae esetében, amely a sertésállományt fertőzi, és véres habzó száj/orr, valamint magas láz mellett az állatok elhullását okozza [136]. A C1-metabolizmusnál már bemutattunk olyan mikrobákat, amelyek a metanol, metán hasznosítására képesek. A gamma-proteobacterek ezen csoportja a Methylococcus-félék. A csoport valamennyi nemzetsége metilotróf, metánhasznosító. A névadó nemzettség, amely a metilotróf kutatások középpontjában áll néhány archeával együtt, a termofil Methylococcus capsulatus [137]. Iparilag több évtizede használt mikrobák a gamma-proteobacterek következő csoportjába sorolt Xanthomonas-félék, köztük a Xanthomonas campestris, amellyel a széleskörűen (főleg azonban élelmiszer-ipari célra) hasznosított xantán gumi fermentációs előállítását valósítják meg [141]. A jelen jegyzetben tárgyalt utolsó gamma-proteobacter csoport a Succinivibrio-félék csoportja. Az idesorolt Anaerobiospirillum succiniproducens okozhat megbetegedéseket (bakterémia) [138], de a platformalkotó borostyánkősav előállítására is felhasználható [139]. A Succinimonas amylolytica szintén nagy mennyiségű borostyánkősav előállítására képes, közvetlenül keményítőből kiindulva [140]. A névadó Succinivibrio dextrinosolvens segítségével heterofementatív tulajdonságának köszönhetően glükózalapon állíthatók elő borostyánkősav- és tejsav- stb. metabolitok.



92


3.2.3. ábra: Az ősbaktériumok „családfája” a rokonsági távolságokkal (NJ/ML/MP algoritmussal is) [163]




93

3.2.2. táblázat: Bacillusok osztálya

Bacilliales rendje (kataláz pozitív)

Bacillusok családja

B.subtilis, B.licheniformis, B.thüringiensis, B.coagulans B. antraxis

Staphylococcusok családja

S. aureus

Listériák családja

Baktériumok doménje

Firmicutes törzs (alacsony G+C tart.)

Bacillusok osztálya

Lactobacillusok családja Lactobacilliales rend (kataláz negatív)

Pediococcus nemzetség Leuconostoc nemzetsége Strpetococcus nemzetsége Enterococcus nemzetsége

Clostridiumok osztálya Mollicutes osztály


Lactobacillus nemzetség


Listeria monocytogenes L. casei L. rhamnosus L. delbrueckii L. helveticus L. coryneformis Pediococccus acidilactici L. mesenteroides S. bovis, S. pyogenes, S. thermophilus E. faecalis

94


3.2.11. ábra: Az Actinobacterek családfája (Az NCBI taxonomia adatfile alapján generálva)




95

3.3. Ipari szempontból fontos gombák A gombák rendszertana a szaporodási formák alapján sorolja be a nemzetségeket, fajokat, ezért az alábbiakban röviden összefoglaljuk a gombák szaporodási folyamatait [149].

3.3.1. animáció: Gombák életciklusai A gombák ivartalan szaporodása történhet sarjadzással, hifatöréssel, és ivartalan szaporító képletek (spórák) segítségével, azaz spórázással. Az életciklusuk folyamán ivaros szaporodásra is képesek, amely során egymástól időben jelentősen elválasztva valósul meg a plazmogámia, kariogámia és a meiózis (3.3.1. animáció), így a haploid dikarion és a diploid állapot is stabilan megtalálható forma. Mindhárom esetben van lehetőség ivartalan esetenként spórás szaporodásra, amely spórák fenotípusa meglehetősen hasonló, ezért ugyanazon faj különböző állapotú formáit (ivarosan, v. ivartalanul szaporodó) külön-külön is besorolták a rendszertanba. Ennek következményeként a korábban elkülönített ivaros (perfect) és ivartalan (imperfect) szaporodású fajok között azonosságokra derült fény, azaz egy adott fajnak létezik perfect (más néven teleomorph) és imperfect (anamorph) formája is (legfeljebb még nem ismerjük). Például az anamorph Brettanomyces anomalus teleomorph formája a Dekkara anomala [150]. A gombák morfológiája is igen változatos, ugyanazon faj különböző állapotai morfológiájukban is eltérnek: a Saccharomyces cerevisiae pékélesztő egysejtes formában szaporodik szubmerz körülmények mellett, ám a körülmények megváltozása esetén (szilárd tápközeg, kevés N-forrás) fonalas növekedésre vált [151]. Mindezeknek köszönhetően a gombák rendszertana morfológiai megfigyeléseken alapult és nem rokonsági távolságokon, ám az utóbbi évtizedek teljes genomszekvenáló programjainak köszönhetően fényderült a DNS-alapú rokonságokra, és ezek alapján új rendszertan felállítása kezdődött meg 2007től, amely munka a mai napig tart. Ezek alapján a még nem általánosan elfogadott, de legújabb rendszertan a következők szerint alakul [153] (3.3.2. ábra). A 3.3.2. ábrán pirossal kiemeltük az iparilag fontos gombákat tömörítő csoportokat, amelyek a következőkben kerülnek tárgyalásra.



96


3.3.2. ábra: A legújabb gombarendszertan




97

Basidomycotak A basidomycota-k az ascomycotákkal együtt alkotják a Dikarya alkirályságot, amelynek neve a stabil dikarion állapotra utal, amelyben e két törzs tagjai általában előfordulnak. A basidomycoták legismertebb formái a kalapos gombák, amelyek felépítését mutatja a 3.3.3. ábra.

3.3.3. ábra: Bazidomiceták felépítése [154] Nevüket onnan kapták, hogy a termőtestté tömörülő hifák a kalap alján elhelyezkedő lemezeken bazidiumokat növesztenek, amelyekről rendszerint 4-4 spóra fűződik le. A kalapos gombák általában az élelmiszeriparban kerülnek piacra, a biotechnológiában ritkábban hasznosítják őket. Az Agaricomycotina csoportjukba tartozik azonban a Ganoderma lucidum (pecsétviaszgomba), amely számos alkalmazással és nagy lehetőségekkel rendelkezik, mivel immunerősítő, vérnyomáscsökkentő, koleszterincsökkentő hatása van, továbbá javallott vesegyulladás, asztma, gyomorbántalmak esetén is. Újabban az AIDS és a rák ellenei küzdelemben is sikerrel alkalmazzák. A széles körű alkalmazását a mintegy 150 féle triterpén és 50 poliszaharid molekulájának köszönheti [155]. A pecsétviaszgombához hasonlóan a Shii Take gomba (Lentinus v. Lentinula edodes) is az Agaricomycotak közé tartozik, és az ázsiai hagyományok szerint fogyasztása igen kedvező, mivel antitumor szaharidokat tartalmaz nagy mennyiségben [156]. Az Agaricus brasiliensis fenti rokonaihoz hasonló egészségvédő hatással rendelkezik, és szokásos biotechnológiai módszerekkel tenyészthető. További példákat foglal össze a 3.3.1. táblázat a kalapos gombák fermentációs (szubmerz, bioreaktoros) felhasználására. Amint az a táblázatból is látható, a kalapos gombák fermentációjával előállított termékek az alábbiak szerint csoportosíthatók. 1) poliszaharidok Elsősorban az USA-ban, Japánban és Oroszországban nyerik ki vagy a termőtestből, vagy tenyésztett micélimból, vagy a tenyésztett micélium fermentlevéből. Az így előállított poliszaharidok antitumorhatással rendelkeznek, azaz kemotrerápiával kombinálva akadályozzák a rák előrehaladását, és csökkentik az áttétek kialakulásának esélyét. Nem közvetlen hatást fejtenek ki, hanem a T-sejtes immunválaszt stimulálják ezek a poliszaharidok. Szerkezetüket tekintve általában β(1-3) kapcsolódású glükánok, 1-6 elágazással, ami szükséges az antitumorális hatás kiváltásához. A nagy molekulatömegűek hatékonyabbak a kisebbeknél. Kereskedelmi forgalomban kapható a lentinán (Lentinus edodes), PoliSzaharidKrestin (PSK) (Ganoderma lucidum) és a schizophyllan (Schizophyllum commune).



98


2) terpenoidok A terpenoidok izoprénszármazékok. Nevüket a terpénről kapták, amely tulajdonképpen izoprén dimer. A(z) (bio) izoprén új perspektvákat kapott az utóbbi évtizedben, mivel a hagyományos kőolajkrakkolás mellett rekombináns technikával biológiailag is előállítható polimerizációs és üzemanyagcélra is [158]! Mivel biológiailag előállítható, megújuló nyersanyagokból is lehet gyártani, és platformvegyület, tehát származékait egyszerű, konvencionális módszerekkel lehet szintén előállítani. Ha megfelelő technológiával olcsón elő lehet állítani, üzemanyagcélra is kiváló lehet, mert magasabb energiatartalommal bír mind a dízelolajnál, mind a benzinnél. A polimer- és üzemanyagcélú felhasználásán kívül is nagy volumenű alkalmazásnak örvend a gumiipar elasztomerjei, illetve a ragasztók körében. Az izoprénszármazék terpenoidokat a szénlánc hossza és az azzal arányos fizikai tulajdonságaik alapján csoportosítják: illékony mono és szeszkviterpének (sesquiterpenoids, C10-15, esszenciális olajok), kevésbé illékony triterpének (C20), nem illékony terpenoidok és szterolok (C30), illetve karotenoid pigmentek (C40). A pecsétviaszgomba (Ganoderma lucidum) által termelt terpéneket szintén ebben a csoportosításban tárgyaljuk. A ganodermasav A, B, C1, és C2 molekulái az emberi májsejtek növekedését gátolják, illetve antioxidánsként védik az eritrocitákat és a májsejteket. A termőtest többi triterpénjével együtt (ganoderiol B, ganodermanontriol) Anti-HIV1 és Anti-HIV1proteáz aktivitásúak (előbbi a burokfehérje kötődésének gátlását, utóbbi pedig a virion fehérje proteolitikus aktiválásának gátlását jelenti). A diterpének között a ciatánokat – amelyek nevüket a Cyathus helenae madártollról izolált parazita gombáról kapták – számos gomba termőtestjéből kimutatták, a sphaeroane típusúak pedig algákban is előfordulnak. Idetartozik még a Drosophyla subatratból előállított antimikrobiális hatású tintinnadiol. A diterépnekre általában is jellemző, hogy antimikrobiális hatásúak, idegsejt-növekedési faktort indukálnak (NGF), és opioid receptor agonsiták, aminek a fájdalomcsillapításban van szerepe. A szeszkviterpenoidok és monoterpenoidok szintén NGF induktorok, inszekticidek és nematicidek. 3) ergoszterol Az ergoszterol a D-vitamin prekurzora, UV hatására kortizon és progeszteron keletkezik belőle. A gombáknál a funkciója, hogy a sejtmembrán részeként segítse az integritást és a membrán fehérjék aktivitását, illetve a sejt energiaháztartását. A kereskedelmi forgalomba kerülő termékeket élesztőből vagy hulladékmicélium extrakciójával állítják elő. 4) ceramid Kozmetikumokban nedvesítő ágensként alkalmazzák, de étrend-kiegészítőnek is kitűnő (élelmiszeripar), mivel immunerősítő, rákmegelőző hatást is tulajdonítanak neki. A bazidomiceták (magasabb rendű gombák) fermentációjának célja, hogy a termőtestekben megtalálható értékes anyagokat hatékonyan állítsák elő. Ehhez általában talajtenyészeteket alkalmaznak, ami azonban 60-70 napig is eltart, és kevéssé kontrollált. A szubmerz fermentáció fonalas gombák esetén (kalapos!) a megnövekedő viszkozitás miatt nehézségekbe ütközik, mert oxigénátadási problémák és magasabb nyíróerő lép fel. A Ganoderma lucidum esetén 50 g/L alatti (szubsztrát inhibíció miatt) laktózzal vagy szaharózzal végzik a szekundermetabolit- (termék)előállítást, amely szénforrások azonban a növekedésnek nem kedveznek. Eközben az oldott oxigén szintjét 20-30% körül célszerű tartani, és így a végső sejt szárazanyagtartalom 22 g/L, az elérhető EPS(extracelluláris-poliszaharid) 0,87 g/L, IPS (intracellulárispoliszaharid) 2,5 g/L, amely mellett mintegy 300 mg/L GA (ganodermasav) keletkezik. Az optimális Kla értékét 781/h-ban állapították meg. A 10% körüli oxigénszint az aggregátumokban oxigénlimithez vezet, ami kisebb mértékű biomassza-képződést, ám magasabb EPS-, IPS-, GA- koncentrációkat eredményez gyenge produktivitással. Már 20% oxigénszintnél mindez megfordul. A nyíróerő hatását 0,5-1 m/s csúcssebesség tartományban írták le, és megállapították, hogy a pelletméret gyorsabban nő az alacsonyabb keverés esetén, és ez az IPS-képződésnek kedvez, míg a magasabb keverősebesség hatására a végső sejt-szárazanyagtartalom (tehát a biomasszahozam is) lecsökent (14->10 g/L-re).




99

3.3.1. táblázat: Kalapos gombák fermentációs felhasználása [157] Gomba Agaricus brasiliensis

Termék Poliszaharid Ergosterol

Agrocybe cylindracea

Extracelluláris poliszaharid (EPS) __________EPS_______ Poliszaharid Teljes polifenol tiszta triterpenoid

Antrodia camphorata

Auricularia polytricha Collibybia maculate Cordyceps militaris

Exobiopolimer EPS Cordycepin

Cordyceps sinensis

Cordycepin Adenozin

Grifola frondosa

EPS

Inonotus obliquus

Exopolimer Endopoliszaharid és EPS

Phellinus sp

EPS

Sarcodon aspratus

EPS

Schizophyllum commune

Almasa (L-malonsav)

Lépték 5 L kevert reaktor, 2 db 6 lapátú turbinakeverővel 3 L/5 L fermentáció

Eredmény 1,67 g/L 25 mg/g sz.a.

_5 L BBraun fermentor__

_______148 mg/L______ 23,3% hozam 71 mg/g 108 mg/g 3,1 g/L 3,94 g/L 188,3 mg/L

350/500 L fermentor 3L/5 L fermentor 3L/5 L fermentor 21/30 L centrifugál keverő

3g/L

3L/5 L fermentor 5 L kevert reaktor 5 L air lift reaktor 15 L BBraun reaktor 300 L kevert bioreaktor 3 L/5 L kevert fermentor 3L/5 L kevert fermentor 10/12 L buborlkkolonna 7,2/8 L hurokreaktor 5 L airlift

5,3 g/L 4,53 g/L 1,252 g/L 0,495 g/L 3,59-5,3 g/L 2,68 g/L Y<20% Y>40% 3,05 g/L

Ascomycotak Az Ascomycota osztály nevét a szaporodás közben képződő aszkusz után kapta (magyarul: tömlő, azaz tömlősgombák, 3.3.4. ábra.) Az aszkuszos gombák esetében a dikarion állapot rövid ideig tart, így nincs dikarion állapotban ivartalan szaporodásuk. Az ivartalan szaporodás során a hifán képződik konidiumtartó, abban konidiospóra, amely mitózissal keletkezik, így mitospórának is hívják. Ha azonban 2 heterotallikus (azaz különböző ivarú) hifa vége összeolvad (plazmogámia), létrejön a dikarion, amelyben a magok előbb mitózissal osztódnak, kiválasztódik az anyasejt, és a magok egyesülnek (kariogámia), ami diploid állapothoz vezet, majd előbb meiózissal, majd mitózissal osztódnak, és elrendeződnek a tömlőben, míg kialakul a jellemző 8 haploid aszkospóra a tömlőben. A legtöbb iparilag is használt gomba az aszkuszos gombák közé tartozik.



100


3.3.4. ábra: Aszkuszos gombák spóraképzése [159] Az Aspergillusokat (pl.: A. niger) és Penicilliumokat (pl.: P. notatum) széleskörűen alkalmazzák évtizedek óta. Az előbbieket a citromsavgyártásra az utóbbiakat antibiotikum-termelésre használják. A Pichiák különleges lebontó enzimekkel rendelkeznek (P. stipitis: xilanázok), és a P. pastoris még metilotróf is, valamint kiváló gazdaszervezet heterológ fehérjék kifejeztetésre (expressziós rendszer). Itt található a kenyérsütéshez és az alkoholgyártáshoz használatos pékélesztő (Saccharomyces cerevisiae, 3.3.5. videó). Az idesorolt candida fajok általában megtalálhatók a normál humán flórában, de opportunista patogénekis.

3.3.5. videó: Élesztőtenyészet Zygomycotak A zygomiceták esetében csak a haploid alak képes ivartalanul spórákkal szaporodni (konidiospórák). A 3.3.2. ábrán látható, hogy a rendszertani csoportjuk ipari alkalmazással bíró tagjai a Mucor és Rhizopus nemzetségek. A 3.3.6. videomikroszkópos felvételen mutatja be a Rhizopus oryzae micéliumát, konidiumait és konidiospóráit.

3.3.6. videó: Fonalas gomba sporangium © Németh Áron, BME


3. Az ipari mikroorganizmusok és technológiák tárgyalása törzsrendszertanba illesztve 101

3.4. Iparilag jelentős algák Az alga mint gyűjtőnév nem fed rendszertani kategóriát. A prokarióták közül a cianobaktériumok tartoznak a mikroalgák közé, illetve az eukarióták között mikro- és makroalgákat is találunk. Előbbiek lebegnek a vízben, utóbbiak többméteresre is megnővén szilárd aljzathoz rögzülnek. Algasajátosságok közé tartozik a fotoszintetikus képesség, valamint a fotoszintetikus és segédpigmentek. Közös tulajdonságuk továbbá az egysejtű életforma, de különböző szerveződésű szinten állnak az egyes algák (fonalas, telepes stb.). A különböző pigmentek közös proplasztiszból fejlődnek ki a környezeti igényeknek megfelelően (algasejt genomja szabályozza), ugyanakkor saját DNS-ük is van. Megkülönböztetnek kloroplasziszt, amiloplasztot, elaioplasztot (olaj), etioplasztot és kromoplasztot. Rendszerezésük szintén sokáig morfológiai alapon történt (fotoszintetikus pigmentek összetétele, tartaléktápanyagok, sejtfal szerkezete, ostorok szerkezete és elrendeződése, szemfolt), napjainkban azonban itt is a DNS-alapú újrarendszerezés zajlik. Ipari alkalmazásra a cianobacterek közül (prokarióta algák) a már említett Spirullina (pl.: Spirullina maxima) fajok alkalmasak, részben funkcionális élelmiszerként, részben a biodízeltechnológia nyersanyagának, a lipideknek („növényolaj”) termelőjeként.

3.4.1. ábra: Vörös alga [178] Az eukarióta algák iparilag is alkalmazott nemzetsége a Chlorella (pl.: Chlorella vulgaris). A Glaucophyták, amelyek iparilag kevéssé jelentősek, a bizonyítékai a kloroplaszt endoszimbiózissal magyarázott eredetének, mivel bennük a kloroplaszt még a fagocitózisos membránnal is határolt, így jelentőségük nem ipari, hanem evolúciótörténeti. A Rhodopyták (vörös algák, 3.4.1. ábra), már rendelkeznek ipari felhasználással is, például az agar-agart belőlük (Gellidium amansi) nyerik ki. Karragének gyártására használják a Chondrus crispust, ír moszatot. A klasszikus zöld algák a felszín közelében szeretnek lebegni, ezért különböző felületnagyobbító képletet alakítottak ki, amitől igen változatos morfológia jellemzi őket. A Chlorophyta szintén zöld moszatokat takar, amelyek tömlősgombákkal zuzmót képeznek. Különleges jelenség a „görögdinnyehó”, amikor enyhén rózsaszínű foltok jelenek meg a hóban a lábnyomokban. A havon élni (Chlamydomonas nivalis) csak különleges lipidekből álló membránnal lehet, amely folyékonyabb hidegben, mint melegben. A rózsaszínű pigmenteket az UV sugárzás kiszűrésére termelik. Astaxantin termelésére lehetne használni a Haematococcus pluvialis fajt, amely szaporodási fázisban zöld színű, astaxantin termelésekor pedig vöröses. A Botriococcus braunii olaj temelése miatt bioüzemanyag-gyártásra lesz felhasználható. Ezt manapság kétféle rendszerben lehet megoldani: vagy nyitott medencékben, kiszolgáltatva az időjárásnak, vagy zárt fotobioreaktorokban. Jelenleg még kevés alkalmazással rendelkenek az igen fejlett csillárkamoszatok (Charophyta). A sárgás és barnás mosztaok (Ascophyllum nodosum) viszont alginát előállításra használhatók. Végül az Euglenidek azaz ostoros moszatok (Euglenia viridis) a vízvirágzás leggyakoribb okozói.



102


3.5. Vegyes tenyészetek alkalmazása A bioszféra minden részén társulások formájában élnek a mikroorganizmusok, és az eddig tárgyalt alkalmazásokhoz a mikrobilógusok/biotechnológusok erőfeszítések árán jutnak el a színtenyészethez. Egyes speciális felhasználások esetén – általában olyankor, amikor már van egy specializálódott vegyes tenyészet – célszerűbb a vegyes mikrobapopulációk használata. Ilyen esetre példa a talajremediáció, bioenergia és zöldkémia egyes területei, szennyvízkezelés, illetve a különböző élelmiszeripari termékek. A bioremediáció során ex situ vagy in situ távolítják el a talajt ért szennyezéseket azok lebontásával vagy kevésbé toxikus formába alakítással. A talajok rendelkeznek (a helyi mikrobiótának köszönhetően) öntisztulással, ám ez igen lassú folyamat, amelyet optimális körülmények megteremtésével, esetleg hatékonyabb mikroba (vagy más élőlény) kijuttatásával fel lehet gyorsítani. A bioremediációra Pseudomonas, Acinetobacter, Citrobacter, Flavobacterium vagy Chromobacter törzseket, illetve ezek keverékét szokás alkalmazni, miközben biztosítják a megfelelő levegőztetést, N- és P-forrásokat. Cr(VI) detoxifikációjára, redukciójára, akkumulációjára képes az Arthrobacter oxydans. Különösen jelentős az urán foszfor komplex formájában történő megkötése, amelyet különböző Citrobacter fajok (C. frendii, C. koseri) képesek elvégezni. Az Acinetobacterek az aromás szénhidrogének lebontására képesek. A bioremediációk során gyakran alkalmaznak kometabolizmust. Így a sokáig bonthatatlannak hitt anyagok is biodegradálhatóak. Ilyenkor általában nem tudják a mikrobák energiatermelésre használni a bontandó xenobiotkumot (környezetidegen anyag), ezért energiahordozó szubsztrátot kell a szennyezett területre kijuttatni. A zöldenergia/vegyipar területén MCB (mixed culture biotechnology) alkalmazására is van lehetőség, mivel olyan előnyökkel rendelkeznek, mint sterilizálás nélküli termelés, jó alkalmazkodóképesség, vegyes szubsztrátok hasznosítása és folyamatosítható eljárás. A biogáz termelés olyan többlépcsős folyamat, ahol célszerű lehet az MCB-alkalmazás, mivel az egyes lépcsőket (szubsztrát hidrolízise primer metabolitokig, acetogenezis (H2+CO2ecetsav), illetve metanogenezis (H2+CO2=>metán (biogáz) <=ecetsav)) más-más mikroba tudja ugyanazon körülmények mellett leghatékonyabban véghez vinni. A kulcslépés a metán (biogáz) kibocsátása, amely metanogenesisben ősbaktériumok is részt vehetnek, mint például a Methanococcus jannashi és Methanosarcina acetivorans. Az eleveniszapos szennyvíztisztítás során szintén inhomogén kevert kultúra végzi a szennyezések eltávolítását. Ezek között található habképző Nocardia sp és Microthrix parvicella is. Technológiai szempontból kényes a populáció egyensúlya, mert ha a fonalas mikrobák szaporodnak el, amelyek nyálkát is képeznek, akkor megváltoznak az ülepedési tulajdonságok, és kimosódhatnak a mikrobák. Ostorosok, amőbák is részt vesznek a tisztításban, valamint zsákmánybaktériumok elfogyasztásában. Fémszennyeződések eltávolítása esetén Klebsiell,a Pseudomonas, Zooglea és Penicillium nemzetségek alkalmasak, vagy felületi adszorpcióval, vagy citoplazmás felvétellel, olykor illékony formába alakítással, vagy komplexált kicsapással. Az élelmiszeriparban szintén gyakran lehet vegyes mikrobatenyészetekkel találkozni. Ezek jelenléte lehet előnyös (fermentált élelmiszerek), de akár hátrányos (élelmiszerek romlása) is. Utóbbi oka, hogy az emberi fogyasztásra szánt élelmiszerek a mikrobák számára is ideális tápközegek, ezért az élelmiszerek közvetítő szerepet játszhatnak a patogén mikrobák terjesztésében is. Egyes mikrobák jelenléte az élelmiszereken toxintermelésük miatt fokozott veszélyforrás. A romlást okozó mikrobák jelenléte anyagcseretermékeik folytán jellegzetes szag- és ízanyagokat eredményez. Ugyanakkor szintén bizonyos (kellemes) szag- és íz anyagok elérése érdekében fogyasztunk fermentált élelmiszereket is. Ilyen eljárások a savanyítások (káposzta, aludtej stb.), alkoholos erjedések (szeszes italok), egyes páclevek alkalmazása (szalámi, sonka), illetve érlelési eljárások, például sajtok esetén. Az ALKOHOLOS ERJEDÉSEK egyik legrégebben kiaknázott folyamata a borok készítése. Ezeket az alkoholos erjedéseket a szőlőbogyóról a mustba kerülő vadélesztők keveréke okozza, köztük apiculatus élesztők (Kloeckera apiculata, Hanseniaspora sp., Brettanomyces sp.), virágélesztők (Candida sp., Pichia sp.) és nyálkaélesztők (Debaromyces sp., Rhodotorula sp.). A vadélesztők aránya és aktivitása évről évre változó lehet, így nem lehetne mindig ugyanolyan kiváló minőséget előállítani,




ezért a nagyobb márkák a vadélesztőket visszaszorítják (kénessav, szeparálás, esetleg pasztőrözéssel), és saját oltókultúrát (gyakran színtenyészetet) alkalmaznak, amelyek között a Saccharomyces fajok dominálnak. Különleges folyamat az aszúsodás a boroknál, amelyet a nemes rothasztó Botrytis cinerea végez úgy, hogy a bogyó behálózásával jelentős vízveszteséget okoz. Érdekesség, hogy a nemkívánatos szürkerothadást is ugyanez a mikroba okozza. A húsipari PÁCLEVEK alkalmazásakor általában nitrátos páclevet alkalmaznak (NaCl+KNO3), amelyekben egyrészt kedvező tejsavbaktériumok (Lactobacillusok), másrészt nitrátbontó mikrobák szaporodtak el. A minőségi követelményeknek köszönhetően a napjainkban működő nagyüzemek starter kultúrákat használnak a spontán folyamatok helyett. A SAVANYÍTÁS-ok egyik fő élelmiszer-ipari területe a tejtermékek gyártása. A frissen fejt tejben ideális esetben 103-104 db/ml élőcsíra található, amelyek között sem patogének, sem enterális mikrobák nem lehetnek. A normál tejflóra (Micrococcusok, Lactobacillusok, Streptococcusok) a fejéskor az állat kültakarójáról és a levegőből kerülhet a tejbe, mivel a mirigyállományban steril tej képződik. A savanyításért a tejsavbaktériumok felelnek (ld. Firmicutes, C3-metabolizmus) Az aludtejet a Streptococcus lactis (v. újabban Lactococcus) alvasztja meg, a S. lactis spp aromaticust pedig acetoin és más ízanyagok termelése miatt vajkutlúrákban alkalmazzák. A S. cremoris a tejföl jellegzetes tejsavbaktériuma. Magasabb hőmérsékletű érleléseknél (sajtok, joghurtok) S. thermophilus törzset használnak kevert kultúrában (pl.: sajt: Lactobacillus lactis vagy joghurtok esetében Lactobacillus bulgaricusszal). A tejtermékek mikrobiotáját foglalja össze a 3.5.1. táblázat. 3.5.1. táblázat: Tejtermékek mikrobiotája

Megnevezés

Mikrobák

Vajkultúra Str. lactis Str. cremoris Str. diacetilactis Leuc. citrovorum

Joghurtkultúra

Kefírkultúra

Str. thermophilus Lb. bulgaricus

Str. lactis Str. cremoris Lb. casei Lb. caucasicus Saccharomyces fragilis Torula kefyr

Tenyésztési T

20-25 oC

42-45 oC

18-22 oC

Alvadási idő

12-18 óra

2-3 óra

14-20 óra

Kultúra savfoka

36-38 SHo

40-45 SHo

38-40 SHo

Felhasználási terület

aludttej, tejföl

joghurt

kefír

3.6. A vakcinagyártás mikrobiológiája A kórokozókkal való találkozás túlnyomórészt a gasztroenterális és a légzőszervi szöveteket érinti, amelyek egészséges élőlényekben átlagos fertőző csíraszám mellet képesek megvédeni a szervezetet egy fertőzés kialakulásától. Ha azonban valamilyen legyengült állapot vagy sérülés következtében a szervezet más, belső részeibe kerülnek mikrobák, azaz az első védelmi vonal, a kültakaró mögé, akkor a második védelmi vonal a vérárammal mindenhol jelen lévő immunrendszer veszi fel a küzdelmet a kórokozóval szemben. Az immunrendszer egyik részét öröklik az egyedek (veleszületett), a másik részét pedig az átesett fertőzések során szerzik be (adaptív immunrendszer). Az előbbit makrofágok, granulociták, „natural-killer” (NK) sejtek és B-sejtes limfociták, utóbit T és B-sejtes limfociták alkotják. Az immunválasz alapja, hogy a bekerült kórokozó egy speciális, csak rá jellemző molekuláját



104


(antigének: sejtfelszíni fehérje, liposzaharid stb.) érzékelik az immunrendszer fehérvérsejtjei, és aspecifikus módon megpróbálják likvidáni, vagy legalább izolálni a fertőzést, amíg a specifikus válasszal elkészül a szervezet. A specifikus választ antitesttermelés formájában valósítja meg az immunrendszer. A kórokozók elleni védelem lehet passzív, ha kész antitesteket juttatnak be az oltóanyaggal, illetve aktív, ha az antitesteket hordozó ágenst (elölt, elgyengített, inaktivált sejt vagy csak az antigén fehérje) juttatják be az élőszervezetbe. Az utóbbi megoldás hosszú távon hatékonyabb, mert az érzékelt antigénre a szervezet saját maga tanulja meg az antitest előállítását, így bármikor újra elő tudja állítani, és egy esetleges újrafertőződést gyorsan kiküszöbölni. Az immunrendszer két részét a 3.6.1. táblázat hasonlítja össze. 3.6.1. táblázat Az immunrendszer felépítése

Funkció

evolúciós háttér: antigénspecifitás előzetes aktiválás reakció memória

Emlős immunrendszere Adaptív (szerzett) Veleszületett A védelem első vonala, A védelem második vonala főleg: patogén érzékelés főleg: patogén eltávolítása, (Antigén feldolgozása, antigén eltávolítása a prezentálása, az adaptív válasz veleszületett rendszer indukciója) segítségével mellesleg: patogén eltávolítása mellesleg: patogén felismerés ősi, konzervatív fiatalabb kevéssé specifikus nagyon specifikus nem szükséges szükséges azonnali késleltetett nincs van

A magyarországi kötelező védőoltásokat a 3.6.2. táblázat foglalja össze. 3.6.2. táblázat: A magyarországi kötelező védőoltások Beadandó kor

vakcina neve

betegség

kórokozó

baktérium /vírus

0-6 hét

BCG

gümőkór, tuberkulózis

Bacillus Calmette-Guérin Mycobacterium tuberculosis

baktérium

Corynebacterium diphteriae Clostridium tetani Bordatella pertusis H. influenzae polio vírus

bakt. bakt. bakt. bakt. vírus





2 hónap

DTPa +Hib +IPV

3 hónap

DTPa +Hib +IPV

4 hónap

DTPa +Hib +IPV


torokgyík(diftéria), merevgörcs (tetanusz), szamárköhögés (pertusis) +Haemophilus influenzae +inaktivált poliomyelitis vírus torokgyík(diftéria), merevgörcs (tetanusz), szamárköhögés (pertusis) +Haemophilus influenzae +inaktivált poliomyelitis vírus torokgyík(diftéria), merevgörcs (tetanusz), szamárköhögés (pertusis) +Haemophilus influenzae +inaktivált poliomyelitis vírus



15 hónap

MMR I.

18 hónap

DTPa +Hib +IPV

6 év

DTPa +IPV

11 év

DT

11 év 14 év

MMR revakcináció

Hepatitis B

kanyaró (morbili) mumpsz (paroitis) rózsahimlő (rubeola) torokgyík(diftéria), merevgörcs (tetanusz), szamárköhögés (pertusis) +Haemophilus influenzae +inaktivált poliomyelitis vírus torokgyík(diftéria), merevgörcs (tetanusz), szamárköhögés (pertusis) +inaktivált poliomyelitis vírus torokgyík(diftéria), merevgörcs (tetanusz), kanyaró (morbili) mumpsz (paroitis) rózsahimlő (rubeola) májgyulladás

Morbili virus (Paramyxo) Mumps vírus Measles virus (Paramyxo)

vírus vírus vírus



Corynebacterium diphteriae Clostridium tetani Bordatella pertusis polio vírus

bakt. bakt. bakt. vírus

Corynebacterium diphteriae Clostridium tetani Morbili virus (Paramyxo) Mumps vírus Measles virus (Paramyxo) Hepatitis B virus

bakt. bakt. vírus vírus vírus vírus

Az aktív immunizáláskor alkalmazott vakcinák készítésekor nagyon fontos, hogy a kórokozó megfelelő molekulája kerüljön kiválasztásra és alkalmazásra. Ugyanazon faj különböző geográfiai előfordulásai is hordozhatnak különböző antigén molekulákat, ezért különböző szerotípusokba szokás sorolni a különböző antigénekkel rendelkező, de azonos fajhoz tartozó kórokozókat. A szerotípus-meghatározás azonban nem olyan hierarchikus, mint a taxonómia, mert például aVibrio cholerae estében 139 különböző szerotípusú sejtvonal közül csak 2 termelt enterotoxint (ezek az igazán problémás kórokozók). Ugyanakkor az Actinobacillus pleuropneumoniae esetében 15 szerotípust találtak, amelyek 4-féle toxint termelnek különböző elosztásban. A 15-ös szerotípus lipopoliszaharidjának O antigénje közös a 3-as és 8-as szerotípuséval, tehát részleges keresztvédettséget lehet elérni. Mivel az Actinobacillus pleuropneumoniae toxin (Apx) esetében a IV-es toxint valamennyi szerotípus termelte, ennek vakcinákban történő alkalmazás indokolt. Megvizsgálva, hogy milyen védettséget biztosít az Apx IV vakcina, azt tapasztalták, hogy 100%-os védettséget eredményezett (a baktérium használata 80% körüli védettséget okozott), ugyanakkor a garatmandula kolonizációját nem tudta megakadályozni, ami továbbfertőzés lehetőségét rejti magában. Ha a toxin helyett kapszuláris (tok) poliszaharidok kerültek kipróbálásra, csak 70%-os védettség alakult ki, ami a lipopoliszaharidok esetében tovább csökkent. Ezek alapján belátható, hogy milyen körültekintően kell kiválasztani a vakcináláshoz megfelelő stratégiát. Az oltóanyagokat szokás csoportosítani a hatóanyaguk szerint. Így léteznek holt anyagot tartalmazók (elölt sejt/vírus, inaktivált toxin, transzgenikus/szintetikus antigén), élő, azaz attenuált (passzált vagy genetikailag deléciós mutáns), élő vektoros (élő vektor pl.: normál flóra tagjai, úgymint Lactobacillus sp termeli a szükséges antigént a védendő szervezetben), immunkomplex (antitesthez kötött kórokozó, gyors kolonizáció akadályozva). Az oltóanyagok lehetnek ún. subunit vakcinák, amelyekben a kórokozó antigéntartalmú részét használják csupán fel. Általában egyre gyakoribb a transzgénikus subunit oltóanyagok alkalmazása. Konjugált oltóanyagokat készítenek akkor, ha az antigén nagyon gyenge immunválasz kiváltására képes csupán. Ilyenkor erős választ kiváltó komponensekhez kötik (pl.:Streptococcus pneumoniae szerotípus specifikus poliszaharidokat diftériatoxinhoz kötve alkalmazzák). A vakcinagyártás egyik nagy kihívása a kórokozók előállítása, a másik pedig azok megbízható inaktiválása. Ez utóbbira szokás kemikáliákat (pl.: formaldehid) vagy fiziko-kémiai kezeléseket (γsugár, β-sugár), esetleg molekuláris biológiai módszereket alkalmazni (pl.: indukálható fág gének bevitelével lízist idéznek elő).



106

4.


A MIKROORGANIZMUSOK IPARI FELHASZNÁLÁSÁNAK ETIKAI ÉS KOCKÁZATI KÉRDÉSEI

A biológiai ágensek használatának kockázata két nagy területre osztható: 1) patogén mikrobákkal való munkavégzés (elsősorban egészségügyi és egyes kutatólaboratóriumok esetében), 2) rekombináns élőlények használatával kapcsolatos kockázatok. Előbbi esetben közvetlen egészségkárosító kockázatról beszélünk, míg a transzgenikus szervezetek (GMO) alkalmazásakor a közvetett (ökológiai) kockázat dominál. A kockázatok felmérése és minimálisra csökkentése mellett mindkét terület számos etikai kérdést is felvet (fertőzött humán minták kezelése, megbízható GMO termelő farmerek stb.). Általánosan elfogadott az az elv, hogy „minden mikroorganizmust potenciális patogénként kell kezelni”. Ennek oka az, hogy még a legártalmatlanabb ehető mikrobák is a vérbe kerülve szepszist okozhatnak. A mikrobákat az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 4 Biosafety Class-be (BsC Level 1-4) sorolta, és a besorolást külön-külön felállították a vírusokra, gombákra és a baktériumokra is. Az 1-es szintű mikrobák közé az élelmiszer-ipari mikrobák és a normálflóra mikrobái tartoznak (Lactobacillu-sok, influenzavakcina), a 2-es szintű mikrobák (Clostridium tetani, Candida albicans, Hepatitis) már patogének, de hatékony védekezési eszköz van ellenük, illetve nem terjednek járványszerűen; a 3-as jelzésű mikrobák (Bacillus anthracis, Paracoccoidioides brasilensis, HIV) már komoly megbetegedést okozhatnak, és terjedni is képesek, de a járvány hatékonyan megelőzhető. A 4. szintre sorolt mikrobák (Myoplasma mycoides, Ebola vírus) a legveszélyesebbek, mivel gyógyíthatatlan betegséget okoznak, és járványszerűen terjednek. A besorolásból rögtön kitűnik, hogy időről időre felül kell vizsgálni a besorolást, mivel a tudományos ismertek bővülésével előfordulhat, hogy a korábban kezelhetetlennek mondott betegség ellen időközben kidolgoztak hatékony védekezést. Tipikus példa erre a HIV vírus, amely ma már nem a legveszélyesebb 4., hanem a 3. osztályba tartozik. A mikrobák kockázatával párhuzamosan a velük dolgozó laboratórimokat is hasonló elvek alapján osztályokba sorolják. A 4.1.1. táblázatban a javasolt és előírt kockázatcsökkentő feltételeket foglaltuk össze. 4.1.1. táblázat: A különböző BsC szintre sorolt laboratóriumokkal szembeni követelmények BsC szint: labor izolálása hermetikus lezárás lehetősége szellőztetés be szellőztetés az épület rendszerével szellőztetés elkülönítve kimenő HEPAszűrő duplaajtós bejárat (zsilip) légzárzuhany előtér, öltöző előtér zuhannyal elfolyó anyagok kezelése


1. -

2. -

3. ~

4. +

-

-

+

+

-

~

+

+

-

~

+

-

-

~

+

+

-

-

~

+

-

-

+

+

-

-

+ ~

+ -

-

-

~

+


4. A mikroorganizmusok ipari felhasználásának etikai és kockázati kérdései

107

A laboratóriumok második védelmi vonalként működnek, feladatuk a környezet megóvása a kockázatot jelentő élőlények kijutásától. Az első védelmi vonal a steril fülke vagy a biztonsági fülke, mivel ezek vannak legközelebb a veszélyforráshoz. Előbbi feladata, hogy a steril munkavégzést lehetővé tegye, azaz a munkaanyag befertőződését megakadályozza. A biztonsági fülke már nemcsak az anyagot védi, hanem főleg a felhasználót. A 2. védelmi vonalhoz hasonlóan a lamináris fülkéket is osztályokba sorolják, amely besorolás nagyjából korrelál a mikrobákkal: I.o. fülkében csak BsC1 mikrobával szabad dolgozni, a II.o. (főleg II/A2-től felfelé) fülke már alkalmas a BsC2 és 3. mikrobák kezelésére, a III.o.-ba már csak biztonsági fülkék vannak, amelyek BsC3 és 4 mikrobák kezelésére alkalmasak. Az ipari mikrobiológia szempontjából a patogén mikrobákra vonatkozó előírások kevésbé mértékadónak tűnhetnek, mivel a vakcinagyártáson kívül ritkán (vagy egyáltalán nem) használnak virulens patogén mikrobákat termelési célra. Ugyanakkor az egyre nagyobb méretekben megvalósuló transzgenikus mikrobát alkalmazó technológiák esetére nagyon hasonló előírások vonatkoznak számos megfontolás miatt. A génmódosítás terjedésével a GMO (génmódosított organizmusok) élőlények száma és mennyisége dinamikusan nő. Igaz ez a haszonnövényekre is, ahol a GMO növényekkel szemben talán a legnagyobb a társadalmi ellenállás, annak ellenére, hogy a korábbi nemesítési eljárások szintén új génállományú haszonnövényeket eredményeztek, a pontos genetikai változások ismerete nélkül. Ezzel szemben a transzgenikus növények létrehozásakor pontosan ismert génátvitelt valósítanak meg egy adott kedvező tulajdonság megjelenésének érdekében. Meg kell azonban jegyezni azt is, hogy míg a nemesítés során csak fajon belüli (esetleg rokon fajok közötti) visszakeresztezés (=nemesítés) történhetett, a modern technológia egészen távoli élőlények közötti géntranszfert is lehetővé tesz (pl.: hidegtolerancia gén az északi-tengeri lepényhalból búzába), amely miatt a szokatlan gének kölcsönhatásának eredményeképpen akár váratlan (esetleg káros) folyamatok is létrejöhetnek. Fenti megfontolásokon felül a GMO élőlények gyakran nagyobb fittséggel rendelkeznek épp a génmódosítás következtében, amely fittség evolúciós előnyt jelenthet, és így kikerülve a természetbe a természetes (honos) populációkat visszaszoríthatják7. Ezen jelenségek váltották ki a világ számos országában azt a törekedést, hogy nemzetközi egyezményt hozzanak létre a bioszféra diverzitásának megőrzésére (Cartagenai jegyzőkönyv, 2000.01.29), illetve ennek érdekében a transzgénikus szervezetek előállításáról, piacra kerüléséről, határokon átívelő mozgásáról kölcsönös tájékoztatás megvalósítására. Hasonló okokból az amerikai Élelmiszer és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA) bevezette a GRAS(„Gegnerally Recognised As Save”) listát, amelyre csak olyan élelmiszer-ipari és gyógyszeripari adalékok, hatóanyagok kerülhettek föl, amelyeket: vagy 1) 1958.01.01. óta használnak (tehát kellően régóta, ahhoz, hogy legyen elegendően nagy fogyasztói létszám), vagy 2) tudományos kísérletekkel igazolták az ártalmatlanságát, vagy 3) a szakértők egyetértenek a biztonságosságában, általánosan biztonságosnak ismert. A mikrobiológiai eredetű adalékok GRAS-listájának egy részét mutatja a 4.1.2. táblázat. Összefoglalva megállapítható, hogy a mikroorganizmusok ipari alkalmazásakor a lehetséges kockázatok mérlegelése után a vonatkozó biztonsági előírások betartásával kell eljárni.

Szerencsére a piacorientált társadalom túlnyomórészt olyan génmódosításokat végzett eddig, amelyek a termék minőségét és/vagy hozamát növelték. Ez azonban a termelő szervezet számára plusz teher, azaz inkább evolúciós hátrány, semmint előny. 7



108


4.1.2. táblázat: Mikrobiológiai eredetű élelmiszer-adalékok GRAS-listája §172.155

Streptomyces natalensis és Streptomyces chattanoogensis eredetű Natamycin

§172.325

Saccharomyces cerevisiae eredetű pékélesztő-fehérje

§172.590

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis, Candida utilis eredetű élesztő-malátakivonat

§172.620

A Rodophycea osztály Gigartinaceae és Soliericeae családjainak alábbi tagjaiból előállított karragén (hidrokolloid): Chondrus crispus, Chondrus ocellatus, Eucheuma cottonii, Eucheuma spinosum, Gigartina acicularis, Gigartina pistillata, Gigartina radula, Gigartina stellata

§172.655

Furcelleran, a Furcellaria fastigiata finomított hidrokolloidja

§172.695

Xanthomonas campestriseredetű xantán gumi

§172.725

Fusarium moniliforme fermetnációjából származó Gibberellin sav

§172.896

száraz élesztő: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis; és szárított torula élesztő, Candida utilis

§172.898

Saccharomyces cerevisiae eredetű pékélesztő glikán

§173.110

Rhizopus niveus eredetű amiloglikozidáz a gélesített keményítő cukorrá történő hidrolíziséhez

§173.120

Aspergillus niger eredetű karbohidrázok és cellulázok kagylók, rákok feldolgozásához

§173.130

Rhizopus oryzae eredetű szénhidrázok a keményítőalapú dextróz előállításához

§173.135

Micrococcus lysodeikticus eredetű kataláz a sajtgyártáshoz

§173.140

Mucor miehei var. Cooney et Emerson eredetű lipázok mint sajtok, zsírok, olajok és tejtermékek ízfokozói

§173.145

Morteirella vinaceae szaharózgyártáshoz

§173.150

Mikrobiális tejalvasztó enzimek a sajtgyártáshoz (Endothia parasitica, Bacillus cereus, Mucor pusillus Lindt illetve módosított Mucor miehei és Aspergillus oryzae, amelyek Rhizomucor miehei var Cooney et Emerson eredetű aszparaginsav-protáz génjét tartalmazzák

§173.160

Candida guilliermondii mint fermentatív citromsav-előállító mikroba

§173.165

Candida lipolytica mint fermentatív citromsav-előállító mikroba

§173.280

oldószeres extrakciós módszer az Aspergillus niger fermetnlevéből történő citromsav kinyerésére


var.

raffinoseutilizer

alfa-galaktozidáza

a

cukorrépa-alapú


5. Kitekintés

5.

109

KITEKINTÉS

Talán nem szükséges tovább bizonygatni, hogy a biotechnológia egy interdiszciplináris, szerteágazó, intenzíven kutatott tudományterületből napjainkra a mindennapokat is meghatározó fogalommá vált. Azt is bemutattuk e jegyzet elején, hogy a biotechnológia szerteágazó területeinek közös pontja a mikroorganizmus, így az ipari mikrobiológia szorosan összefügg a biotechnológiával. E két terület jövőjéről is csak egymásra utaltságuk mellett lehet gondolkodni, azaz az ipari mikrobiológia jövője a biotechnológiai területek és irányok által determinált, ugyanakkor a biotechnológia lehetőségeit a mikroorganizmusok világa határozza meg. Közös jövőjük még mindig két szálon fut, hiszen a természetben megtalálható mikrobák és azok különleges tulajdonságainak felkutatása még évtizedekig eltarthat, figyelembe véve az ismert és a vélt mikrobák számát a Földön, ugyanakkor a rekombináns termelő törzsek nyújtotta flexibilis és kényelmes lehetőségek nyilván egyre nagyobb teret fognak hódítani. Azt gondolhatnánk, hogy a „biotechnológiai forradalom” végét fogja jelenteni, ha a természetben található összes tulajdonságot és enzimet (azaz az összes létező mikrobát és azok genomját) feltérképezzük, és a kapott információkészletből gazdálkodva azok végtelen kombinációjával véges számú tulajdonságból szinte végtelen kombinációjú rekombináns fajt lehet létrehozni, amelyekkel minden fontos vegyipari eljárás kiválthatóvá válna. Ugyanakkor a protein engineering több évtizedes gyakorlata jelzi, hogy van lehetőség meglévő tulajdonságok átalakítására, és új tulajdonságok (új enzimek) létrehozására, ma még főleg meglévő peptidek teljes átszerkesztésével, de idővel talán de novo előállításával is. Az a kérdés, hogy a fenti nagy lehetőségekből mi valósul meg a jövőben, aligha válaszolható meg, hiszen javában tart egy olyan biotechnológiai húzóágazat keresése, amely fenn tudná tartani az eddigi fejlődést, és további fejlesztéseket generálni. Ilyen potenciális húzóágazat lehet a gyógyszergyártás, a bioüzemanyagok előállítása, a fehér biotechnológia, hogy néhány példát említsünk. A biotechnológia szkeptikusai napjainkban még könnyen találnak fogást a fejlesztési törekvéseken, hiszen a kőolajalapú energiaszektor és a vegyipar energia- és anyagigényeinek megújuló alapokon történő kiváltásához az egész Föld felszínének megművelése is kevés lenne. Az is biztos azonban, hogy a kőolajkészletek majdani elfogyása után szükség lesz az alternatív lehetőségekre mind az energia-, mind a nyersanyag-felhasználás területén. Szerencsés esetben az energiaigényt más további alternatív utakon is ki lehet elégíteni (szél, víz, nap, geotermikus stb.), tehát „csak” a nyersanyagigényre kell más biomassza-alapú megoldást találni. A jövő érdekes kérdése, hogy a fényhasznosító tengeri algák az eddig ki nem használt tengerek felszínén mennyi biomassza-alapú nyersanyagot, illetve üzemanyagot tudnak majd előállítani. Az algákkal kapcsolatban is hallani olyan kritikákat, hogy nem elég hatékonyak, ezért a Föld összes tengere is kevés a jelenlegi és a növekvő energiaigények algákkal történő kielégítéséhez. Ma még csak remélhetjük, hogy a korlátlannak látszó lehetőségek kiaknázásával sikerül olyan fejlesztéseket realizálni, amelyekkel elérhetőek az emberiség nagy volumenű igényeinek kielégítéséhez szükséges termelésihatékonyság-növelés, és a szkeptikusok bánatára hozzájárul majd a biotechnológia – és a vele szorosan összekapcsolódó ipari mikrobiológia – az emberiség energia- és nyersanyag-problémáinak megoldásához.



110

6.


SZÓSZEDET

acid-fast

„saválló”

aerob

Oxigénigényes faj.

anaerob

Levegőkizárást igénylő anyagcsere vagy faj.

anaerob légzés

Olyan respirációs folyamat, ahol a terminális oxidációban a végső elektron akceptor nem a légköri oxigén, hanem valamilyen más szervetlen molekula (pl.: szulfát)

anaplerotikus

=feltöltő, egyes reakcióutak ciklikusan működnek, és ha a ciklus tagjai a termékvonal felé mozdultak, akkor pótolni kell őket a ciklus számára.

antimetabolit rezisztencia

Az antimetabolit egy olyan molekula, amely egy adott metabolitot specifikusan megköt, így az nem áll rendelkezésre a sejt számára. Amely sejtek erre rezisztensek, feltehetően több metabolitot termelnek, mint amennyi antimetabolit a rendszerben van, tehát lehetnek jobb termelők.

Arisztotelész

Ókori görög filozófus (Kr. e. 384–322), kiemelkedő tudós, több tudomány és az európai kultúra atyja, az első „rendszertan” megalkotója.

Bakteriocin

Baktériumok által termelt fehérjeszerű (peptid) toxin, amely hasonló baktériumok növekedését gátolja

biobányászat

A bányászat célja a fémek kinyerése ásványaikból. Egyes kőzetek fémtartalma, illetve keverék volta nem teszi lehetővé a hatékony fémkinyerést, ám mikrobiális folyamatok következtében egyes fémek kioldhatók, és a híg oldatból kinyerhetők gazdaságosan.

biokontroll

Agrárkifejezés, amely a kártevők szabályozását (csökkentését) jelenti természetes ellenségük (valamilyen más biológiai rendszer) segítségével.

citokin

A citokin név polipeptid regulátorok nagy és vegyes családját takarja, amelyet a szervezetben különböző embriológiai eredetű sejtek termelnek (nem csak az immunrendszer sejtjei).

COSY-NMR

=Correlation spectroscopy, molekula- szerkezet felderítésére használatos két- dimenziós NMR spektroszkópia. Egy két- dimenziós NMR-mérés egy sorozat egydimenziósból áll, amelyek rádió frekvenciás pulzusok sorozatából állnak késleltetési periódussal a pulzusok között. Ezeket az egydimenziós sorozatokat az időzítés, a frekvencia és az intenzitás különbözteti meg egymástól. Némely késleltetés alatt, az atommag



6. Szószedet

111

spinek foroghatnak egy adott ideig, amit evolúciós időnek hívnak. Az utolsó pulzus után a magok a frekvenciát meghatározzák. Az evolúciós idő léptetésével kétdimenziós adatok generálhatók az egydimenziós adat- sorozatokból.

crabtree effektus

Egyes mikrobák (főleg élesztők) estében jellemző, hogy a túl magas cukor (C/E-forrás) mennyisége a korlátozott oxidációs kapacitású sejtekben megfelelő levegőztetés ellenére is anaerob anyagcserére vált ki.

destruxinok

Ciklikus gomba (pl.: Metharisium anisopliae) eredetű toxinok, amelyek depsipeptidekből állnak (peptid kötés helyett helyenként észter kötés van), és a gerinctelenekben elnyomják az immunválaszt.

diszaharidok

Két monomercukor-egységből felépülő cukormolekulák, pl.: laktóz (1db glükóz+ 1db galaktóz), maltóz, cellobióz, szaharóz stb.

diszproporció

egyidejű oxidációsszám-növekedés és -csökkenés egy adott reakció következményeként.

diverzitás

=sokféleség

ektomikoriza

Fonalas gombák növényi gyökerekkel alkotott szimbiózisa.

előre/vissza csatolás

szabályozási mehanizmus, amikor egy hálózat előbbi elemei valamelyik későbbi tagra hatnak (=előre), például egy metabolit gátolja az őt tovább alakító enzimek egyikét. A visszacsatolás esetén az előbbi elem egy még korábbira van (pl.: gátló) hatással.

enniatinok

Olyan ionofór antibiotikumok, amelyeket fonalas gombák (pl.: Fusariumok) termelnek, és depsipeptidből (peptid kötés helyett nelyenként észter kötés van) állnak.

epidermális növekedési faktor

Az emberi sejtek növekedését, proliferációját, differenciálódását segítő 53 aminosavból álló oligopeptid.

expressziószintű szabályozás

Egy adott reakcióútvonalat vagy funkciót katalizáló enzim(ek) génjének ki/be kapcsolásával történő szabályozás

expressziós rendszer

Az expressziós rendszerek olyan módosított mikrobák, amelyek képesek nagy koncentrációban bioaktív formában (helyes elsődleges, másodlagos, harmadlagos szerkezettel) idegen fehérjéket a fermentlébe extracellulárisan kifejezni, miközben eredeti proteáz aktivitásukat lecsökkentették (és ezáltal a termék lebontás csökkent).

extrém termofil

Extra magas hőmérsékletet kedvelő.

Extrémofilek

Extrém körülmények (pH, hőmérséklet, sókoncentráció, nyomás) mellett növekvő



112


mikroorganizmusok. Extrémozim

Extrém körülmények (pH, hőmérséklet, sókoncentráció, nyomás) mellett aktív enzimek, fehérjék.

fakultatív anaerob

Az anaerob/aerob körülményeket kb. egyformán szeretik.

fehér biotechnológia

Vagy másnéven "ipari biotechnológia" a biotechnológia azon ága, amely valamely vegyipari technológiát képes bioipari eljárással (enzimes, mikrobiális) technológia szinten kiváltani.

fehérjeszintű szabályozás

Fehérjék kölcsönhatása révén történő szabályozása egy reakcióútnak (pl.: egyik fehérje a másik kofaktora vagy inhibítora, esetleg aktivátora stb.)

Fenotipizálás

Fenotípus (a genetikai információ alapján megjelenő tulajdonság) megállapítása.

fermentatív anyagcsere

Olyan metabolizmus, amelyben az elektrondonor és az elektronakceptor-molekula is szerves molekula (pl.: cukorból alkohol erjesztése).

fermentatív faj

Erjedést végző faj

filogenetika

Rokonságon alapuló leszármazással foglalkozó tudomány, amelynek modern formája genetikai eszközök (génazonosság, mutációs mintázat alapján) segítségével deríti fel a rokoni kapcsolatokat.

fitoalexinek

Növények által (baktériumok ellen) termelt antibiotikus hatású molekulák.

fitonematódák

növényi fonálférgek, élősködők

fitotoxin

Növények ellen termelt mikrobiális méreg.

fittség

A transzgénikus élőlények rátermetségének jelzésére használatos fogalom, amely az új tulajdonság evolúciós előnyét méri, és így a kockázatelemzés első lépése.

formózreakció

A cukorszintézis első lépése, amelyben 2 formaldehidből formóz jön létre, majd erre újabb formaldehidet addicionáltatva glicerin-aldehid keletkezik.

foszfotranszferáz rendszer (PTS)

A szubsztrát szintű foszforilációt végző enzimrendszer, amely foszforcsoportot addicionáltat a szubsztrátmolekulára (aktiválja azt) a fszfoenol-piruvátról. Ennek következtében válik lehetővé a szubsztrát transzportja sejt belsejébe.

GC, HPLC

Analitikai (kromatográfiás) módszerek.

halotoleráns

=sótűrő, általában a fiziológiás sókoncentrációnál magasabb, ozmotikusan veszélyes sókoncentrációkat elviselők gyűjtőneve



6. Szószedet

113

heterofermentatív

Egy erjesztés vagy fermentáció akkor heterofermentatív, ha több fajta termék keletkezik (heterogén termékprofil).

hexózok

Hat szénatomból álló cukorvegyületek (szaharidok), például glükóz, fruktóz, galaktóz stb.

hifa

Fonalas gombák többsejtű, differenciálatlan sejtlánca (fonala).

homofermentatív

Egy erjesztés vagy ferementáció akkor homofermentatív, ha egyfajta termék keletkezik (homogén termékprofil).

hozam

hatásfok jellegű mennyiség, amely azt mondja meg, hogy a szubsztrát mekkora hányada került be a biomasszába (biomassza-hozam), vagy a termékbe (termékhozam). Mértékegysége % vagy g/g. Ha a szubsztrát- fogyás helyett a bemért szubsztrát mennyiségével számolunk, a hozamhoz hasonló, azonban értékileg eltérő mennyiséget, a kihozatalt vagy kitermelést kapjuk.

idiofázis

A mikrobiálistermék-előállítás hanyatló sejtnövekedéssel, és növekedéshez nem kapcsolt termékképzéssel jellemezhető szakasza.

Inclusion body

A prokarióták zárvány testje, ahová a használhatatlan (pl.: heterogén fehérje), illetve a későbbi használathoz elraktározott anyagokat a sejtek kiválasztják.

Indel

=in(szert)+del(éció), azaz inszercióval, vagy delécióval létrejövő mutáció.

inszekticid

=rovarölő

ionofór

Általában zsíroldható molekula, amelynek funkciója az ionok szállítása a sejtmembránon keresztül.

izotopomer

Olyan izomerek, amelyek az izotóp atom helyében különböznek egymástól.

katabolit represszió

Biológiai szabályozási mehanizmus, amely lehetővé teszi az anyagcsereenzimek szintézisének gátlásával, hogy mindig a legkedvezőbb szubsztrátot fogyasszák el előbb a mikroorganizmusok. (A másika(ka)t hasznosító enzimek szintézise gátolt.)

kemolito-autotrófok

Szénforrásként légköri CO2-t használnak, energia forrásként szervetlen vegyületek oxidációját aknázzák ki.

kenet

„kenet” a kén (mint anyag) tárgyragozott (régies) formája, cserélhető „ként”-re

kofermentáció

"=együtt fermentáció", két mikroba vagy két szubsztrát egyidejű alkalmazása egy tenyészetben.

kólsav

Vízoldhatatlan szteránvázas epesav, sói a kólátok.



114


kommenzalista

olyan kapcsolat más (gazda) élőszervezettel, amely kapcsolat a gazda számára semleges, a kommenzalista számára pedig előnyös (pl.: a bőrflóra egyes tagjai)

kompetitív receptor antagonista

Olyan molekula, amely kapcsolódni képes a receptorhoz, de nem aktiválja azt.

leaky mutáns

Olyan mutáns, amely csökkent növekedésű, de nem hiánymutáns. Ennek oka valamely fiziológiailag igényelt enzimes reakció csökkent aktivitása.

magnetotaktikus

Mágneses teret magnetit ásványok füzérének segítségével érzékelni képes mikroba.

makrolid antibiotikum

14, 15, vagy 16 tagú makrolid laktongyűrűt tartalmazó hatóanyagok, jellemzően fehérje szintézist gátló antibiotikumok.

malo-laktikus fermentáció

A tejsavbaktériumok által végzett olyan erjedés, amely során az erősen savas almasav (=malonsav) az enyhébb tejsavvá és széndioxiddá alakul.

Maximum likelihood (ML) módszer Maximum parsimony (MP) módszer

A filogenetikus analízis egyik módszere, amely standard statisztikai módszerekkel keresi a legvalószínűbb leszármazási variációt. A filogenetikus analízis egyik módszere, amely a legkevesebb evolúciós variációt keresi, és fogadja el.

metabolit

Anyagcsere következtében keletkező molekula.

metanogének

A szén-dioxidot (nem fotoszintézis útján) hasznosító mikrobákat nevezik így.

metilotrófok

A szén-dioxidon kívüli összes egy szénatomú szénforrást hasznosító mikrobákat nevezik így.

mezofill

Közepes (általában hőmérsékleti) tartományt kedvelő élőlény.

mezofill

Hőmérsékleti optimuma 15–40°C esik.

MIC

=MinimalInhibitoryConcentration az a dózis, ami már hatékony inhibíciót okoz.

microarray technika

Nagyszámú kísérletek végzésére alkalmas módszer, amely egy furatokkal ellátott lemez gyors leolvasásán és kiértékelésén (mikroplate reader) alapul.

mikolsav

A mycobacteriumok sejtfalában található hosszú szénláncú zsírsav, tehát nem a miko=gomba elnevezésből származik, noha az actinomyceták közé sorolt Mycobacterium fonalakat képes növeszteni.

mutagének

Mutációt előidéző hatások, ágensek (lehetnek kémiaiak (vegyszerek), fizikaiak (pl.: sugárzások).

Neigbhour-joined (NJ) módszer

A filogenetikus analízis egyik módszere, amely



6. Szószedet

115

genetikaitávolság-mátrix alapján az egymáshoz legközelebbi rokonokat keresi meg, majd a közös elágazási pontjukat helyezi el a többi, távolabbi rokon között. objektív függvény

Az optimálások során egy "legjobb" értéket keresünk. Az a függvény, amelynek értékei között keressük a legjobbat (optimálisat), az objektív függvény.

obligált anaerob

Szigorúan anaerob körülmények mellett növekvő.

oligotróp

Tápanyagszegény élőhely

opportunista patogén

Olyan életforma, amely átlagos gazdaszervezetekben nem okoz megbetedegedést, csak annak legyengülése esetén.

Pasteur-effektus

Olyan mikrobiális jelenség, amely során az elégtelen levegőztetés miatt a mikroba anaerob anyagcserére vált oxigén jelenlétében is.

pentózok

Öt szénatomból álló cukorvegyületek (szaharidok), például xilóz, arabinóz stb.

peszticid

=„kártevőírtó szer”

platformalkotó vegyület (platform kemikália)

Olyan vegyületekre használjuk, amelyeknek egy sor piacképes, értékes származékát konvencionális vegyipari folyamatokkal elő lehet állítani.

poliextrémofil

Nemcsak egy paraméter extrém értékeit, hannem többét is elviseli. Pl.: nemcsak acidofil, hanem emellett halofil, termofil is egy adott élőlény.

polifilatikus

Nem egy közös őstől, hanem több őstől származtatható törzs, faj.

porozitás

A porozitás vagy hézagtérfogat az üreges szilárd anyagok jellemzője, amely megadja a hézag térfogatok arányát az össztérfogathoz képest (pl.: porszemcsék közötti légtérfogat a porhalom térfogatához képest, vagy porszemcsében a hézagtérfogat a porszemcse térfogatához képest.)

Pregnánok

Szteroidok egy csoportja, amelyek a C1-en és C21en szubsztituáltak. Pregnánokra (telített pregnán származékok) és pregnadiénekre (telítettlen pregnánszármazékok) oszthatók , utóbbiak kettős kötést is tartalmaznak. Előbbiekhez tartoznak a kortizon, hidrokortizon, progeszteron.

primer metabolit

a mikrobák normál életfolyamatainak következtében keletkező, általában szerves molekula, amely tehát általában növekedéshez kapcsolt termékképzés.

prodigiosin

Pyrrolylpyrromethane vázú vöröspigmentmolekula, antifungicid, antiproliferatív, immunszupresszáns, Serratiák termelik.



116


produktivitás

Az adott eljárás termelékenységét méri. A volumetrikus produktivitás (g/l/h) megadja, hogy térfogategységenként (L) és időegységenként (h) hány g termék (termékproduktivitás), illetve hány g biomassza (biomassza produktivitás) keletkezik.

propagula

Szaporítóképlet, elsősorban a növényeknél használják.

proteinogén aminosav

Fehérjefelépítő aminosav.

Proteus

Homéroszi hős, aki Posseidon fókáit nevelte, és a végtelen átalakulás képességét kapta ajándékba.

random mutagenezis+screening

Törzsfejlesztési módszer, amely a hatékonyabb törzs „készítése” érdekében mesterséges véletlenszerű mutáltatást végez a szülői generáción (random mutagenezis), majd a leánysejteket szűrővizsgálattal minősíti, és kiválogatja (screening).

Reichstein szubsztrát

= 17,21-dihidroxi-progeszteron

rendszertan (taxonómia)

Az élőlények rendszerezésével foglalkozó tudományág. Újabban nem a fenotípusos hasonlóság, hanem a genotípusos azonosság/különbözőség alapján (az evolúció rekonstruálásával) állapít meg rokoni kapcsolatokat fajok között, és helyezi el őket egymástól függő távolságok alapján.

replika módszer

„Petri-csésze-másolás”: a másolandó petrit, fejjel lefelé ráfordítják egy bársonnyal borított fabakra, finoman megnyomják, majd leveszik, és egy másik, steril agarlemezt tesznek fel. Így pont oda és pont ugyanolyan mikroba kerül , mint ahogy a master petrin volt.

respiráció

Légzés, amely során a megelőző anyagcsereutakon felhalmozott redukált koenzim (pl.: NADH2) regenerálódik, miközben egy szervetlen molekula (aerob esetben a légköri oxigén) redukálódik.

retroaldol elimináció

Az aldol (C-C kötést kialakító) reakció visszafelé, azaz C-C kötést bontó reakció.

reverzió

Pálcikák osztódása kokkuszokká (Micrococcusok).

RGCs

„Rare Genetic Changes” – ritka genetikai változások.

SCP

Single Cell Protein, azaz Egysejtfehérje. Humán és állati táplálékkiegészítő, a fehérjeszegény táplálékok feljavítására.

szaprofita

Elhalt szerves anyagot lebontó életforma

szekunder metabolit

Kedvezőtlen körülmények esetén a mikrobák a konkurencia elnyomásával probálnak előnyre szert tenni, és ehhez a másodlagos (szekunder)



6. Szószedet

117

anyagcsere-termékeket állítják elő, és bocsátják ki a fermentlébe. Anyagcsere szempontjából a primer metabolitokból épülnek fel a szekunder metabolitok is. szelekciós nyomás

A tenyésztési körülmények olyan megválasztása, amely mellett csak a kívánt célmikroba nő ki, a többi mikroba visszaszorítás alatt van, viszont a célmikrobák kinöesztése maximálisan elősegített.

szigmafaktor

Genetikai generális szabályozó fehérje, amely a prokarióták transzkripcióját képes elindítani vagy megakadályozni.

szubsztrát/termék inhibíció

Nagy termék/szubsztrát koncentráció okozta lassulás a növekedésben.

TCA

TriCarboxilic Acid, vagy citrá kör. (ld. 1.1.4. ábra, 2.1.2. hyperpicture)

termofil

Hőmérsékleti optimuma >55°C

termotoleráns

Alacsonyabb hőmérsékleti optimum, de képes magasabb hőmérsékleten is nőni.

tetrád

Egyes gömb alakú baktériumok (coccusok) 4esével összeállnak és tetrádot alkotnak.

trofofázis

A mikrobiálistermék-előállítás sejtszaporodással, növekedéssel jellemezhető tenyésztési szakasza.

ubiquiter

Széles körű előfordulás.

vegetatív sejt

Aktív metabolizmussal és életfolyamatokkal rendelkező sejt.

végtiter

A folyamat végére elért koncentráció.



118

7.


ÖNELLENŐRZŐ KÉRDÉSEK AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA CÍMŰ JEGYZETHEZ (A vastaggal szedett kérdések esszék, a kérdés alatt javasolt szempontok segítik a válaszolást. A tesztkérdéseknél mindig 1 helyes válasz található) 1. fejezet 1. Mi a kapcsolat a biotechnológia és az ipari mikrobiológia között? A) B) C) D)

Az alkalmazott színkódrendszer A technológia, mivel mindkettő e fogalomra fókuszál A két területen alkalmazható műveletek halmaza. A mikroorganizmus, amelynek ipari alkalmazásaival az ipari mikrobiológia foglalkozik.

2. Mely tudományok határterülete az ipari mikrobiológia? A) B) C) D)

Biokémia, mikrobiológia, mérnöki tudományok Biokémia, mikrobiológia, biológia Fiziológia, mikrobiológia, kémia Anatómia, mérnöki tudományok, kémia

3. Milyen szerepe van a biofinomítóknak az ipari mikrobiológiában? A) Az ipari mikrobiológia a biológia finomított ága, ezért az maga a biofinomító B) A biofinomító olyan létesítmény, ahol finomkémiai kutatások mellett mikrobiológiai fejlesztéseket végeznek C) A biofinomítókat a fehér biotechnológiában alkalmazzák, általában mikrobiális fermentációkon alapulnak (=ipari mikrobiológia) D) E két kifejezés egymás anagrammája 4. Mutassa be a biofinomítók 3 generációját! A) Ókori (borászatok), középkori (sörfőzés), újkori (pálinkafőzés) B) 1-fix paraméterű (nyersanyag, technológia, termék); 2-változó termékpaletta (többi fix); 3változtatható alapanyag, technológia, termékpaletta C) 1-bioetanol-üzem; 2-biodízel-üzem; 3-Biogáz-üzem D) 1-szénkörforgalomra neutrális; 2-nitrogén körforgalomra neutrális; 3-foszfor körforgalomra neutrális 5. Részletesen mutasson be egy sikeres példát az ipari mikrobiológia történetéből! (termék, termelő törzs (izolálása), klasszikus és modern törzsfejlesztés) 6. Miért kellett leaky mutánsokat fejleszteni a lizintermeléshez? A) Hogy „kicsurogjon” a termék lizin. B) Hogy „áteresszen” a kiütött gén terméke (enzim), és minimális aktivitással megakadályozza a letalitást. C) Hogy „áteresszen” a kiütött gén terméke (enzim), és minimális aktivitással elősegítse a letalitást. D) Mert a melléktermékek „elfolyatásával” javul a termékhozam.



7. Önellenőrző kérdések az Ipari mikrobiológia című jegyzethez

119

7. Milyen géntechnológiai törzsfejlesztés vezetett a fermentációs az 1,3-propándiol előállításhoz? A) B) C) D)

Rekombináns glicerin előállítása fermentációval. A glicerin- és propándiol-termelő útvonalak egy gazdaszervezetbe integrálása. A propándiol-termeléshez szükséges gének glicerintermelőkbe klónozása. A glicerintermeléshez szükséges gének propándiol-termelőkbe klónozása.

8. Mutassa be és magyarázza el az izolálási művelet lépéseit! (Például antibiotikum-termelők esetében az élőhelytől a profitig vezető utat!) 9. Hasonlítsa össze a sugárgombák, fonalasgombák és az élesztő(gombá)k izolálását (Élőhely, azaz izolálás forrása, mintavétel, előkészítés, szelektív adalékolás, inkubálás szempontjából.) 10. Mi az a screening, és milyen szempontokat kell figyelembe venni a végzésekor? A) A képernyőn „screen” való megjelenítése a videomikroszkópnak, amely során a felbontást kell szem előtt tartani. B) Szűrővizsgálat, amely során minden potenciális pozitív választ (keresett tulajdonságú), de egyetlen negatívválaszt sem szabad figyelembe venni. C) Szűrővizsgálat, amely során a szűrők integritását vizsgáljuk. D) Olyan mikrobiológiai művelet, amellyel a használhatatlan mikrobákat kiválasztjuk és megsemmisítjük. 11. Ismertessen 3 olyan screeninget, ahol tisztulási zóna az indikáció! A) B) C) D)

Inzulintermelők, citromsavtermelők, antibiotikum-termelők koleszterintermelők, lipáztermelők, proteáztermelők DNS-polimeráz-termelők, tejsav-termelők, propionsavtermelők celluláztermelők, tejsavtermelők, antibiotikum-termelők

12. Ismertesse a HighThroughputSystem működését egy kitalált példán keresztül! (Scale down, mikrotenyésztés és –mérés elve, indikációs lehetőségek) 13. Mutasson be 3 ipari példát sikeres szűrővizsgálatra! A) Hialuronsav-, epesav-, húgysav-előállítása B) 7-aminocephalosporánsav, compactin-pravastatin előállítása C) Kapronsav-, linolénsav-, aszkorbinsav-előállítás D) eritróz-, glicerin-, oktanolgyártása

biokonverzió,

β-laktamáz-inhibítor

14. Hasonlítsa össze a klasszikus és modern identifikációt! (vizsgálat elve, alapja, leírások pontossága, felállított rendszertan diszkrepanciái) 15. Magyarázza el a törzsfejlesztés lényegét és lépeseit! (Miért kell és mit kell megváltoztatni, illetve hogyan kell kivitelezni? Klasszikus és modern módszerek.) 16. Milyen alapanyagokból érdemes Magyarországon tejsavat előállítani? Mi a különbség köztük fermentációs (mikrobiológiai) műveleti és technológiai szempontból? (A nyersanyag szénhidrátja és a szénhidrát-hidrolízisek kapcsolata a fermentációval.)



120


17. Milyen kísérleteket célszerű elvégezni tápközeg-optimálás során? Mutassa be a tejsav példáján! A) Törzskiválasztás → nyersanyagelőkészítés-vizsgálat → tápközeg-otpimálás → fermentációs paraméterek optimálása→léptéknövelés B) Törzskiválasztás → nyersanyagelőkészítés-vizsgálat → tápközeg-otpimálás → → folyamattervezés szimulációval → fermentációs paraméterek optimálása→léptéknövelés C) Törzskiválasztás → nyersanyagelőkészítés-vizsgálat → fermentációs paraméterek optimálása→léptéknövelés D) Törzskiválasztás → nyersanyagelőkészítés-vizsgálat → tápközeg-otpimálás → fermentációs paraméterek optimálása→folyamattervezés szimulációval 18. Mi a biokémiai funkciója az elsődleges anyagcseretermékek előállításának anaerob mikrobák tenyésztése során? A) B) C) D)

NADH2-termelés a glikolízis során. A terminális oxidáció hiányában redukált koenzim regenerálása. CO2-kibocsátás a citrátkör segítségével. Pentózok lebontása a pentóz-foszfát ciklus segítségével.

19. Melyik szubsztrát kedvezőbb az etanolos erjedéseknél: hexózok v. pentózok? Miért? A) B) C) D)

A hexózok, mert esetükben 1:2 arányban képződik az etanol és a CO2. A pentózok, mert esetükben 1:2 arányban képződik az etanol és a CO2. A hexózok, mert esetükben 1:1 arányban képződik az etanol és a CO2. A pentózok, mert esetükben 1:1 arányban képződik az etanol és a CO2.

20. Mi a Pasteur- és a Crabtree-effektus? A) B) C) D)

sok oxigén és kevés cukor esetén anaerob anyagcserére vált az élesztő kevés oxigén és sok cukor esetén anaerob anyagcserére vált az élesztő sok oxigén és kevés cukor esetén aerob anyagcserére vált az élesztő kevés oxigén és sok cukor esetén aerob anyagcserére vált az élesztő

21. Mitől függ, hogy a tejsavas erjedés során a termelő mikroba melyik enantiomert termeli? A) B) C) D)

A felhasznált szubsztrát szénatomszámától. A felhasznált szubsztrát kiralitásától A laktát dehidrogenáz sztereospecifitásától A Lactobacillus sztereospecifitásától

22. Milyen morfológiákkal tenyészthető a Rhizopus oryzae, és melyik mit termel? A) B) C) D)

egysejtű(tejsav), fonalas(alkohol), pelletes(biomassza) egysejtű(alkohol), fonalas(biomassza), pelletes(tejsav) telepes(alkohol), micéliális(tejsav), álszövetes(biomassza) telepes(biomassza), micéliális(alkohol), álszövetes(tejsav)

23. Mely metabolitok a propionsavas erjedés melléktermékei? A) B) C) D)

Almasav, csersav, tejsav Ecetsav, borostyánkősav, tejsav Huminsav, ecetsav, széndioxid Hangyasav, zsírsav, borostyánkősav




121

24. Soroljon fel 3 nehézséget a butanoloserjedés-alapú technológiák kapcsán! A) B) C) D)

Kis szénatomszám, erősen savas karakter, nem illékony termék. Nehezen szűrhető termék, nagy molsúly, alacsony hozam. A termék erős sejtméreg, kis koncentrációban keletkezik, heterofermentatív eljárás. Lassan szaporodó, patogén mikrobák termelik, kis produktivitással.

25. Mutasson be 2 poliol-előállítást mikrobiológiai/fiziológiai/biokémiai szempontból! A) propándiol előállítása Clostridiummal, xilit(ol)-előállítás Gluconobacterrel B) szorbit-előállítás Z.mobilis-szal arabinózból, és glicerin(glicerol)-előállítás S.cerevisiaevel glükózból. C) Xilit(ol)-előállítás Pichiával xilózból, és szorbit előállítása Z. mobilisszal glükózból. D) Xilit(ol)-előállítás Z. mobilisszal xilózból, és szorbit előállítása Pichiával glükózból. 26. Hasonlítsa össze a felületi és szumberz fermentációs eljárást! (előnyök; hátrányok; alkalmazható szubsztrátok, mikrobák és reaktorok; szabályozható paraméterek)

2. fejezet 27. Írjon példát C1-szubsztrátra! A) metanol B) mentol C) metil-acetát D) metil-akrilát 28. Ismertesse a metanolgazdaság működését! Mi lehet a biotechnológia és ipari mikrobiológia szerepe benne? (szintetikus lehetőségek, szénkörforgás, metabolikus lehetőségek) 29. Jellemezze a 2 leggyakoribb C2 szubsztrátot! A) B) C) D)

Ecetsav: oxidálhatóenergia-nyeréskor; etil-karbonát: gyakori ásvány. Szénsav: vízben oldható; etilbenzoát: „sejtüzemanyag”. Glikolaldehid: önreplikálódó, etanol: ecetsavvá oxidálható energia nyerésekor. Glikolaktid: tejsav-előállítás; etanol: „sejtüzemanyag”.

30. Hogyan tudják egyes mikrobák a tejsavat szubsztrátként hasznosítani? A) B) C) D)

Piroszőlősavon keresztül propándiollá alakítják Piroszőlősavon keresztül propionsavvá alakítják. Foszfoenol-piruváton keresztül tejcukorrá redukálják. Foszfoenol-piruváton keresztül ATP-vé alakítják.

31. Melyik mikroba rendelkezik széles specifitással a cukoroxidáció területén? (Példa!) A) B) C) D)

Sorbobacter suboxydans (pl.: szorbit-szorbóz átalakítás) Gluconobacter suboxydans (pl.: szorbit-szorbóz átalakítás) Gluconobacter suboxydans (pl.: glükóz-szorbóz átalakítás) Corynebacterium pentosum (pentóz-tejsav átalakítás)

32. Részletesen mutasson be egy példát a bioleaching területéről! (ásvány, mikroba, energianyerés sztöhiometriája)



122


33. Mit jelent a fungisztatikum és a bakteriocid fogalom? Mely termékcsoportba tartoznak? A) B) C) D)

gombaölő, baktérium növekedést gátló, primer metabolitok gomba növekedést gátló, baktériumölő, primer metabolitok gombaölő, baktérium növekedést gátló, szekunder metabolitok gombanövekedést gátló, baktériumölő, szekunder metabolitok

34. Röviden mutasson be 2 másodlagos anyagcsereterméket az antibiotikus hatás nélküliek közül! A) B) C) D)

Ciklosporin A: ciklikus spóraölő; Aflatoxin: gombaméreg Ciklosporin A: imunszupresszáns; Aflatoxin: gomba termelte méreg Ergot alkaloidok: mellékvesehormonok, Klavulánsav: antibiotikum-rezisztencia Ergot alkaloidok: nemihormonok, Klavulánsav: telítetlen zsírsav

35. Mit takar az enniatin és a destruxin? A) B) C) D)

mikrobiális „ennivalót” és „lebontó”-szert növényi „ennivalót” és „lebontó”-szert ionofór antibiotikumot és ionfór gomba metabolitot. kromofór antibiotikumot és kromofór gomba metabolitot.

36. Mutassa be részletesen a kullancsok ellen használható (mikro)biológiai védekezési eljárást! (Kullancsok ellenségei, mikroba hatásmechanizmusa, ) 37. Sorolja fel a másodlagos anyagcseretermékek funkcióit, egyet részletesen is ismertessen! (pl.: termelő mikroba kapcsolata a másik élőlénnyel) 38. Ismertesse a másodlagos anyagcseretermék előállításnak kedvező paramétereket! A) B) C) D)

Lassú keverés, szubsztrát-(Zn, Fe, Mg) inhibíció szubsztrát-(Zn, Fe, Mg) limitáció, magasabb hőmérséklet szubsztrát-(C, N, O) limitáció, magasabb hőmérséklet szubsztrát-(C, N, O) inhibíció, magasabb hőmérséklet

39. Definiálja a következő fogalmakat: Metabolic Engineering, Metabolic Fluxus Analysis, Metabolic Controll Analysis, Metabolic Network Analysis, Systems Biology, Functional genomics, (Mi a hasonló fogalmak közötti különbség? Az adja meg a definíciót.) 40. Miért volt szükség a penicillintermelés fejlesztésekor MCA és MNA-ra? Mik azok? A) MCA: Metabolic Coefficient Analyisis, MNA: Microbial Network Anal.; Mikroba átirányítása Penicillin V. felé. B) MCA: Metabolic Controll Analyisis, MNA: Metabol.Network Anal.; fluxusok átirányítása Penicillin V. felé. C) MCA: Microbial Controll Analyisis, MNA: Metabol.Neutral Anal.; Mikroba átirányítása a Penicillin V. felé. D) MCA: Mezophilic Controll Analyisis, MNA: Metabol.Network Anal.; fluxusok átirányítása Penicillin V. felé.




123

41. Írja fel a sztöhiometriai mátrixot és a sebességvektort egy olyan „reakcióhálóra”, ahol A-ból keletkezik B (1. reakció), B-ből keletkezik C (2. r.), és C-ből keletkezik A (3. reakció). Milyen vektort lehet ezekkel kiszámolni?  1

1 v A   r1       0 , v  vB   r  r2  reakciosebességekvektora  0 1  1 vC   r3   1 0 1   v1  rA        T   1  1 0 , v  v2   r   rB  reakciosebességekvektora  0 1  1 v3  rC  0  1 1  v1  rA        T   0  1 1 , v  v2   r  rB  képzodesisebességekvektora  1 v3   rc  0  1  1 0 1   v1  rA        T   1  1 0 , v  v2   r   rB  képzodesisebességekvektora  0 1  1 v3  rC 

A) T   1

B)

C)

D)

0

1

42. Rajzoljon fel a koleszterint! Mutassa meg a mikrobiálisan leggyakrabban módosított pontokat!

A)

B)

C)

D)

43. Ismertesse a β-redukciót a szteroidok konverziójánál! (Mely pozícióban gyakori, a reakció élettani jelentősége, példa konverziókra) 44. Miért van szükség ciklodextrinre a szteroidkonverziók során? A) B) C) D)

Hogy az alkaloidok szintézise nagyobb hozammal történjen. Hogy ciklikus dextrinek keletkezzenek a maradék cukorból a feldolgozást könnyítendő. Hogy ciklizálja a dextrineket a könnyebb feldolgozás érdekében. Hogy oldatba vigye a vízben rosszul oldódó szteroidszubsztrátot

45. Soroljon fel 2 Mycobacteriumot, amelyek a szteroidkonverziókban részt vesznek! A) B) C) D)

M. phlei, M. smegmatis M. cholesterus, M. tuberculosis M. pelli, M. smaragdus M. bovis, M. leprae



124


46. Soroljon fel 3 alapanyagot a szteroidkonverziók végzéséhez! A) B) C) D)

Prednizolon, kortizon, progeszteron Sztigmaszetrin, szitoszterin, kampeszterin Ösztron, koleszterin, tesztoszteron METESZ, fitoszterin, kampesztrin

3. fejezet 47. Ismertesse a klasszikus mikrobiális rendszertan legutolsó csoportosításait! (Hogyan nevezik az egyes csoportokat, melyik redszertan hány csoportra oszt stb.) 48. Miért nem lehet az ősbaktériumokat a Gram-festés szerint egyértelműen besorolni? A) B) C) D)

Mert nincs mureinhálójuk, mégis pozitívan festődnek. Mert van mureinhálójuk, de negatívan festődnek. Mert pszeudomurein-hálójuk van, amely néha pozitívan festődik. Mert külső membrán takarja el a pszeudomurein-hálót, ezért mindig negatívan festődnek.

49. Sorolja fel a klasszikus rendszertani besorolás szempontjait! A) B) C) D)

Makro(sejt)morfológia, mikro(telep)morfológia, szag, szín, csillók száma Makro(telep)morfológia, mikro(sejt)morfológia, szag, szín, biokémiai sajátságok Makro(telep)morfológia, mikro(sejt)morfológia, szag, szín, biokémiai sajátságok Makro(telep)morfológia, mikro(sejt)morfológia, szag, szín, fizikokémiai sajátságok

50. Mutassa be a modern filogenetikai kutatások 3 szintjét! A) B) C) D)

Fajszintű, nemzetségszintű, rendszintű Törzsszintű, osztályszintű, fajszintű Lokális, regionális, kontinentális adatelemzések Genomikai adatelemzés; proteomikai adatelemzés; evolúciós fák összevetése

51. Mutasson be 3 baktériumot a Proteobacterek közül! (Lehet azonos osztályból (α-ε) vagy különbözőből is.) 52. Melyik rendszertani csoportba (törzsbe) tartoznak a következő, iparilag is használt fontos fajok: Corynebacterium sp., Clostridium sp., Aspergillus sp. és Rhizopus sp.? Rendre: A) Actinomyces; Firmicutes, Ascomyceta, Zygomyceta B) Archea; Firmicutes, Microsporida, Zygomyceta C) Actinomyces; Fibrobacter, Microsporida, Saccharomicotina D) Archea; Fibrobacter, Ascomyceta, Sacharomycotina 53. Ismertesse a gombák szaporodási folyamatait! (Ivaros, ivartalan, örökítőanyag kópia szám szerint) 54. Mutasson be egy bazidomiceták közé tartozó, iparilag is jelentős gombát! A) B) C) D)

Lentinus edodes: shi take gomba, terpének, immunerősítők előállítása Aspergillus niger: aszkorbinsav előállítása, pelletes morfológia Pichia stipitis: egysejtű eukarióta, C5-hasznosító Ganoderma lucidum: pecsétviaszgomba, terpének termelésére




125

55. Mutasson be 2 ipari terméket, amelyet „kalapos gombák fermentációjával” is elő lehet állítani! A) B) C) D)

ergoszterin (D-vitamin prekurzora); ceramid (kozmetikumokhoz) streptomycin (antibiotikum); lizin (aminosav) kloramfenikol (antibiotikum); ganodermasav (terpenoid) ciklosporin (immunszupresszáns); Anttraciklin (antitumor ágens)

56. Ismertesse a bioizoprént a bazidomicetákkal kapcsolatban! (izoprén platform, biológiai előálítás, származékai és azok termelői) 57. Mik azok a terpenoidok? A) Aromás benzolszármazékok B) Aromás naftalinszármazékok C) Heteroatomos ciklikus vegyületek D) Izoprén dimer származékai 58. Hasonlítsa össze az aszkomiceták, bazidomiceták és zygomiceták szaporodási ciklusait! (Ivaros és ivartalan reprodukció, génállomány száma, az egyes állapotok megléte/hiánya alapján.) 59. Milyen tulajdonságok alapján sorolták az algákat be a rendszertanba? A) B) C) D)

színük és levélnagyságuk szerint leveleik mintázata alapján méret (morfológia) és tartaléktápanyagaik alapján Biokémiai tulajdonságaik alapján (fermentál, respirál stb.)

60. Soroljon fel 3 különleges plasztiszt az algák sejtfelépítése kapcsán! A) B) C) D)

glükoplaszt, kromoplaszt, protoplaszt amiloplaszt, elaioplaszt, kromoplaszt celluplaszt, protoplaszt, amiloplaszt elaioplaszt, celluplaszt, protoplaszt

61. Hol fordulnak elő a kékmoszatok? A) B) C) D)

mélytengerekben hőforrásokban, lúgos-sós vizekben tengeri üledékben talajvízben

62. Sorolja fel, mire használják a vörös moszatokat! A) B) C) D)

festékiparban (vízfesték) indikátor növénynek (környzetvédelem) agar-agar, karragén, (élelmiszer-előállítás) szennyvíztisztítás (környezetvédelem)

63. Ismertesse a zöld moszatok csoportját! (Hol találhatók, mire és hogyan használhatók stb.) 64. Hogyan alkalmazhatóak az algák a megújuló energiaforrások terén? (Mit termelnek, zárt/nyitott rendszerek stb.)



126


65. Sorolja fel, hogy a biotechnológia mely területein használnak mikrobakonzorciumokat! A) B) C) D)

Környezetvédelem, zöld vegyipar, élelmiszeripar Környezetvédelem, gyógyszergyártás, fehér biotechnológia Élelmiszeripar, gyógyszergyártás, műanyagipar Élelmiszeripar, biobányászat, műanyagipar

66. Mutasson be egy remediációban használatos mikrobát! A) B) C) D)

Corynebacterium diphteriae (diftéria megkötése) Arthrobacter simplex (egyszerű szennyezések megkötése) Citrobacter freundi (urán megkötése) Leuconostoc mesenteroides (PLA lebontása)

67. Milyen előnyökkel jár a kevert tenyészetek alkalmazása? A) B) C) D)

sterilezés nélküli technológia, vegyes szubsztráthasznosítás, alkalmazkodó képesség kevesebb reaktor, gyorsabb biokonverzió, nagyobb produktivitás homogén rendszer, nagy hozam, tiszta termék sterilezés nélküli, optikailag aktív technológia

68. Ismertesse, hogy milyen anyagcseréjű mikrobák építik fel a szennyvíziszap-alapú biogázelőállító mikrobapopulációt! (szerves savak→ecetsav→metán→stb.)) 69. Soroljon fel 2 kártékony és 2 hasznos mikrobát a szőlő mikroflórájából! A) B) C) D)

Cephalosporangium sp., Botrytis cinerea; Aspergillus niger, Oenococcus sp. Penicillium crysogenum, Anaerobacter; Schizosaccahromyces pombe Penicillium expansum, Acetobacter sp.; Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces sp. Citrobacter freundii, Clostridium botulinum; Lactococcus lactis, Bacillus fragilis

70. Miért használnak a húsiparban kevert tenyészeteket? A) B) C) D)

tartósítás, ízesítés savanyítás, pácolás, erjedések sózás, füstölt íz aroma, savanyítás

71. Hogyan működik az emberi immunrendszer első védelmi vonala? A) B) C) D)

immunválasz megtanulása, antigének azonosítása patogének likvidálása, védelmi hormonok indukálása fehévérsejtek folyamatos „járőrözése” patogén érzékelése és eltávolítása, vagy antigén-prezentálás, adaptív válasz előidézése

72. Hogyan működik az emberi immunrendszer második védelmi vonala? A) B) C) D)

patogén eltávolítása az első védelmi vonal felülbírálása az első védelmi vonal értesítése vörösvértestek indukciója

73. Ismertesse a vakcinák szempontjából fontos antigéneket (virális, bakteriális)! (pl.: fehérje- és más molekulatípusok funkciók alapján)




127

74. Mi az a szerotípus, és mi a jelentősége az oltóanyagok szempontjából? A) B) C) D)

Egy törzs felszíni Ag szerinti besorolása, immunológiailag különböznek. Egy törzs felszíni membrán szerinti besorolása, immunológiailag különböznek. Egy törzs felszíni Ag szerinti besorolása, immunológiailag azonosak. Egy törzs felszíni membrán szerinti besorolása, immunológiailag azonosak.

75. Hogyan csoportosíthatóak az oltóanyagok a bennük lévő „hatóanyag” alapján? A) B) C) D)

Bakteriális, virális stb. Lipid, protein, szaharid Aktív, passzív hatóanyag Holt anyag, attenuált, immunkomplex, élő vektoros

76. Röviden ismertessen egy inaktiválási eljárást oltóanyag készítése során! A) besugárzás, (foly. kromatográfia), növekedési teszt B) vegyszer hozzáadása, mintavételekkel csíraszám-ellenőrzés, vegyszer-eltávolítás (foly. krom.), növekedési teszt C) sterilezés, vegyszerezés, növekedési teszt D) kisózás, renaturálás, szűrés, növekedési teszt

4. fejezet 77. Mi az elsődleges védelmi vonal a biológiai biztonságtechnika területén? A) B) C) D)

steril fülke laboratórium gumikesztyű+munkaruha védőszemüveg

78. Mi a másodlagos védelmi vonal a biológiai biztonságtechnika területén? A) B) C) D)

steril fülke laboratórium gumikesztyű+munkaruha védőszemüveg

79. Milyen osztályokba soroljuk a WHO ajánlásának megfelelően a mikrobákat? A) B) C) D)

A-D-ig felhasználásuk szerint A-D-ig előfordulásuk szerint 1-4-ig előállításuk szerint 1-4-ig veszélyességük szerint

80. Mi az a Cartagenai jegyzőkönyv? A) Cartagenai konferencia absztrakt könyve B) Az aláírók csökentik a CO2-kibocsátásukat C) Az aláírók kölcsönösen információt cserélnek a GMO-k áramlásáról. D) Az aláírók növelik a környezetvédelmi kiadásaikat E) 81. Ismertesse a „biológiai containment” fogalmát és lehetőségeit! (GMOk kockázata és programozhatósága)



128


Tesztmegoldó kulcs

1.D

2.A

3.C

4.B

6.B

7.B

10.B

11.D

13.B

17.A

18.B

19.C

20.B

21.C

22.B

23.B

24.C

25.D

27.A

29.C

30.B

31.B

33.D

34.B

35.C

38.C

40.B

41.C

42.D

44.D

45.A

46.B

48.C

49.B

50.D

52.A

54.D

55.A

57.D

59.C

60.B

61.B

62.C

65.A

66.C

67.A

69.C

70.B

71.D

72.A

74.A

75.D

76.B

77.A

78.B

79.D

80.C



8. Hivatkozások

129

8.

HIVATKOZÁSOK

[1] [2] [3] [4]

M.Koffas és G. Stephanopoulus (review, 2005) W. Leuchtenberger Appl Microbiol Biotechnol (2005) 69: 1–8 S. Udaka J Bacteriol. 1960 May; 79(5): 754–755 Microbial production of 1,3-propanediol: Recent developments and emerging opportunities Biotechnology Advances 27 (2009) 895–913 Biebl H, Menzel K, Zeng A-P, Deckwer W-D. Microbial production of 1,3-propanediol. Applied Microbiology and Biotechnology 1999,52:289-297. Chao-Chen et. al. Screening of Compactin Resistant microorganism capable of converting compactin to pravastatin Current Microbiology 2006,53:108-112 Vásárhelyi Miklós: Tejsavtermelés fonalas gombával, Diplomamunka, BME, 2010. PRADO, F. C. et al. Citric acid production by solid-state fermentation on a semi-pilot scale using different percentages of treated cassava bagasse. Braz. J. Chem. Eng. [online]. 2005, vol.22, n.4, pp. 547555. ISSN 0104-6632. Lüth et al (2003) USP 6,620,614 B1 http://www.mta.hu/index.php?id=634&no_cache=1&backPid=390&tt_news=5151&cHash=71cfcfb769 Wikipedia the online ecyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/File:FormoseReaction.png D-ERYTHROSE METABOLISM IN A STRAIN OF ALCALIGENES FAECALIS J.Bact. 1956,71(6), 649-654 http://jb.asm.org/content/vol71/issue6/index.dtl http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00030.png Wikipedia the online ecyclopedia: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/archive/5/5e/20061120074006!Ppp.svg Wikipedia the online ecyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Min_chalcopyrite.jpg Peng et al Trans. Nonferrous.Met.Soc.China (2008)18, 1443-1449 http://www.ysxbcn.com/upfile/soft/200916/23-p1443.pdf Arnold L. Demain,Aiqi Fang: The Natural Functions of Secondary Metabolites, (2000) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Vol. 69, http://www.springerlink.com/content/eand70p6w3ntnhwn/ Nature Reviews Microbiology 5, 377-383 (May 2007) http://www.nature.com/nrmicro/journal/v5/n5/abs/nrmicro1638.html Greg Crowther: Alcohol consumption as a way of life: the metabolism of methylotrophic bacteria Metabolic modelers' group meeting, November 2004, Division of Allergy and Infectious Diseases within the Department of Medicine at the University of Washington. http://faculty.washington.edu/crowther/Research/methylo_intro_Nov2004.ppt Martyn Ford: Mode of Action of Destruxin, Centre for Molecular Design, University of Portsmouth, http://www.port.ac.uk/research/cmd/slideshows/filetodownload,43809,en.ppt Kazuyuki Shimizu: Toward systematic metabolic engineering based on the analysis of metabolic regulation by the integration of different levels of information, review, Biochemical Engineering Journal 46 (2009) 235–251 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6V5N-4WKK1T61&_user=303407&_coverDate=11%2F01%2F2009&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=searc h&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000016619&_version=1&_urlVersion=0&_userid=303407 &md5=ce39df0bd5e33986e88c26bde68cee6b&searchtype=a Wikipedia – The free encyclopedia – Steroids. http://en.wikipedia.org/wiki/Steroid#Steroidogenesis Szentirmai A. Microbial physiology of sidechain degradation of sterols, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology Volume 6, Number 2, 101-115, DOI: 10.1007/BF01576429 (1990) M. V. Donova: Transformation of Steroids by Actinobacteria: A Review, Applied Biochemistry and Microbiology, 2007, Vol. 43, No. 1, pp. 1–14. http://www.springerlink.com/content/j75176573642n780/ Egorova, O., Nikolayeva, V., and Donova, M., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2002, vol. 81, no. 3, pp. 273–279.

[5] [6] [7] [8]

[9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17]

[18] [19]

[20] [21]

[22] [23] [24] [25]



130


[26] [27]

http://davesgarden.com/guides/articles/view/2051/ Bacterial (Prokaryotic) Phylogeny Webpage (March 2007). http://www.bacterialphylogeny.com/index.html Ciccarelli, F. D., Doerks, T., von Mering, C., Creevey, C. J., Snel, B., and Bork, P. (2006). Toward automatic reconstruction of a highly resolved tree of life. Science 311, 1283-1287. Lake, J. A., Herbold, C. W., Rivera, M. C., Servin, J. A., and Skophammer, R. G. (2007). Rooting the tree of life using nonubiquitous genes. Mol.Biol.Evol.24, 130-136. Computational phylogenetics, Wikipedia, the free encyclopedia http://en.wikipedia.org/wiki/Computational_phylogenetics 2010. október 26. Ksenia Egorova and Garabed Antranikian: Industrial relevance of thermophilic Archaea, Current Opinion in Microbiology 2005, 8:649–655 COSTANZO BERTOLDO AND GARABED ANTRANIKIAN: The Order Thermococcales, Prokaryotes (2006) 3:69–81, Chapter 5. DOI: 10.1007/0-387-30743-5_5 http://www.springerlink.com/content/v20wq8765k62167x/fulltext.pdf N. Dogra and G.N. Qazi: Biotransformation of cholesterol by Micrococcus species mediated by plasmid DNA, World Journal of Microbiology & Biotechnology 15: 411±415, 1999. http://www.springerlink.com/content/u5546k47448h4p36/ Kazuaki Yoshimune, Yasuo Shirakihara, Mamoru Wakayama, Isao Yumoto: Crystal structure of salttolerant glutaminase from Micrococcus luteus K-3 in the presence and absence of its product lglutamate and its activator Tris, FEBS Journal, Volume 277, Issue 3, pages 738–748, February 2010 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1742-4658.2009.07523.x/abstract R.G. Saratale, G.D. Saratale, J.S. Chang, and S.P. Govindwar, Ecofriendly degradation of sulfonated diazo dye C.I. Reactive Green 19A using Micrococcus glutamicus NCIM-2168, Bioresource Technology Volume 100, Issue 17, September 2009, Pages 3897-3905 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6V24-4W386XT3&_user=10&_coverDate=09%2F30%2F2009&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_s ort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1521854297&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_ version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=f333166c8a0e4b58df8db08291149fef&searchtype=a MEENA LAKSHMAN and M.R. RAGHAVENDRA RAO: Excretion of lysine by Micrococcus glutamicus J. Biosci., Vol. 3 Number 1, March 1981, pp. 51-55 http://www.ias.ac.in/jarch/jbiosci/3/51-55.pdf I. Sunitha, K. Jagannadha Rao and C. Ayyanna: Coimmobilized whole cells of Pseudomonas reptilivora and Micrococcus glutamicus in calcium alginate gel for the production of L-glutamic acid. Bioprocess and Biosystems Engineering, Volume 18, Number 1, 55-58, DOI: 10.1007/PL00008974 (1997) http://www.springerlink.com/content/b32gujlh4pj7l2rl/ GANGULY S. ; BANIK A. K. ; Induced mutation and selection of High Yielding Strain of Micrococcus glutamicus for glutamic acid production, Journal of the Indian Chemical Society, 2010, vol. 87, no6, pp. 717-721 http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=22991226 N. Gardner, C.P. Champagne: Production of Propionibacterium shermanii biomass and vitamin B12 on spent media, Journal of Applied Microbiology, Volume 99, Issue 5, pages 1236–1245, November 2005 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2672.2005.02696.x/full A. Quesada-Chanto, A. S. Afschar and F. Wagner: Optimization of a Propionibacterium acidipropionici continuous culture utilizing sucrose, Applied Microbiology and Biotechnology Volume 42, Number 1, 1621, (1994) DOI: 10.1007/BF00170217 http://www.springerlink.com/content/jj4124461174p833/ Edward J. Wawszkiewicz: Erythritol metabolism by Propionibacterium pentosaceum. Role of Lerythrulose 1-phosphate, Biochemistry, 1968, 7 (2), pp 683–687, DOI: 10.1021/bi00842a025, http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi00842a025 Maria L. W. Gent-Ruijters, Francisca A. Meijere, Wijtske Vries and A. H. Stouthamer: Lactate metabolism in Propionibacterium pentosaceum growing with nitrate or oxygen as hydrogen acceptor, Antonie van Leeuwenhoek Volume 42, Number 3, 217-228, (1976) DOI: 10.1007/BF00394118 http://www.springerlink.com/content/lk3j875h85v44244/

[28] [29] [30] [31] [32]

[33]

[34]

[35]

[36]

[37]

[38]

[39]

[40]

[41]

[42]



8. Hivatkozások

[43]

[44]

[45]

[46]

[47] [48]

[49]

[50]

[51]

[52]

[53]

[54]

[55] [56] [57]

[58] [59]

131

E. A. DELWICHE', E. F. PHARES, AND S. F. CARSON: SUCCINIC ACID DECARBOXYLATION SYSTEM IN PROPIONIBACTERIUM PENTOSACEUM AND VEILLONELLA GAZOGENES, J. Bacteriol..(1956); 71: 503-625 http://jb.asm.org/cgi/reprint/71/5/598.pdf Miyagawa K, Sumida M, Nakao M, Harada M, Yamamoto H, Kusumi T, Yoshizawa K, Amachi T, Nakayama T.: Purification, characterization, and application of an acid urease from Arthrobacter mobilis, J Biotechnol. 1999 Feb 19;68(2-3):227-36. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10194859 Yukiko Kodama*, Hiroshi Yamamoto, Norihide Amano and Teruo Amachi: Reclassification of Two Strains of Arthrobacter oxydans and Proposal of Arthrobacter nicotinovorans sp. nov., Int J Syst Bacteriol 42 (1992), 234-239; DOI 10.1099/00207713-42-2-234 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/42/2/234 Ummadi, M.; Weimer, B. C., Tryptophan Catabolism in Brevibacterium linens as a Potential Cheese Flavor Adjunct. Journal of Dairy Science 2001, 84, (8), 1773-1782. http://www.dfrc.wisc.edu/DFRCWebPDFs/2001-Ummadi-JDS-84-1773.pdf Wikepedia a szabad enciklopédia http://hu.wikipedia.org/wiki/P%C3%A1lpusztai_sajt Reichert, K.; Lipski, A.; Pradella, S.; Stackebrandt, E.; Altendorf, K., Pseudonocardia asaccharolytica sp. nov. and Pseudonocardia sulfidoxydans sp. nov., two new dimethyl disulfide-degrading actinomycetes and emended description of the genus Pseudonocardia Int J Syst Bacteriol 1998, 48, (2), 441-449. doi: 10.1099/00207713-48-2-441. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/48/2/441 KEIKO NAKAGAWA, KAZUO SATO, YOSHIHISA TSUKAMOTO and AKIO TORIKATA: MICROBIAL CONVERSION OF MILBEMYCINS: 28-HYDROXYLATION OF MILBEMYCINS BY Amycolata autotrophica, The Journal of Antibiotics Vol.46 , No.3(1993)pp.518-519 http://www.journalarchive.jst.go.jp/english/jnlabstract_en.php?cdjournal=antibiotics1968&cdvol=46&noi ssue=3&startpage=518 Cover, W. H.; Kirpekar, A. C.; George, H.; Stieber, R. W., Calcium inhibition of efrotomycin production by Nocardia lactamdurans Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, (1991) Vol. 7, pp 4144. Yamamura, H.; Tamura, T.; Sakiyama, Y.; Harayama, S., Nocardia amamiensis sp. nov., isolated from a sugar-cane field in Japan, Int J Syst Evol Microbiol 2007, 57, (7), 1599-1602. doi: 10.1099/ijs.0.64829-0. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/57/7/1599 Xu M, Yu HM, Tan TW, Zhu YQ, Shen ZY: Molecular cloning of an amidase gene from Nocardia sp. and its expressionin Escherichia coli Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. (2006) Jul; 22(4):682-5. article in chineese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16894910 COLLINS, M. D.; SMIDA, J.; DORSCH, M.; STACKEBRANDT, E., Tsukamurella gen. nov. Harboring Corynebacterium paurometabolum and Rhodococcus aurantiacus. Int J Syst Bacteriol 1988, 38, (4), 385391. doi: 10.1099/00207713-38-4-385 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/38/4/385 Hernández, A.; Weekers, F. d.; Mena, J. s.; Borroto, C.; Thonart, P., Freeze-drying of the biocontrol agent Tsukamurella paurometabola C-924 Predicted stability of formulated powders. Industrial Biotechnology 2006, 2, (3), 209-212. doi:10.1089/ind.2006.2.209. http://www.liebertonline.com/doi/pdf/10.1089/ind.2006.2.209 Wikipedia 2010. november 23. http://en.wikipedia.org/wiki/Nocardicin_A Kinoshita, N.; Homma, Y.; Igarashi, M.; Ikeno, S.; Hori, M.; Hamada, M., Nocardia vinacea sp. nov. Actinomycetologica 2001, 15, (1), 1-5. Shigemori, H.; Komaki, H.; Yazawa, K.; Mikami, Y.; Nemoto, A.; Tanaka, Y.; Sasaki, T.; In, Y.; Ishida, T.; Kobayashi, J. i., Brasilicardin A. A Novel Tricyclic Metabolite with Potent Immunosuppressive Activity from Actinomycete Nocardia brasiliensis. The Journal of Organic Chemistry 1998, 63, (20), 6900-6904. Colin R. Harwood: Bacillus subtilis and its relatives: molecular biological and industrial workhorses, Trends in Biotechnology, Volume 10, 1992, Pages 247-256 Sui Lam Wong: Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins, Current Opinion in Biotechnology, Volume 6, Issue 5, 1995, Pages 517-522 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=MImg&_imagekey=B6VRV-45765YH-4R1&_cdi=6244&_user=303407&_pii=0958166995800859&_origin=search&_zone=rslt_list_item&_cover Date=12%2F31%2F1995&_sk=999939994&wchp=dGLbVzzzSkzS&md5=849ab35125b5f838beb157d724845d6f&ie=/sdarticle.pdf



132


[60]

T. Payot, Z. Chemaly and M. Fick Lactic acid production by Bacillus coagulans—kinetic studies and optimization of culture medium for batch and continuous fermentations , Enzyme and Microbial Technology, Volume 24, Issues 3-4, 3 February 1999, Pages 191-199[61] Vaughan A. Hilder and Donald Boulter: Genetic engineering of crop plants for insect resistance – a critical review (1999), Crop Protection, 18, 177-191 http://www.cib.espol.edu.ec/Digipath/D_Papers/42684.pdf Boer, A. S.; Priest, F.; Diderichsen, B. r., On the industrial use of Bacillus licheniformis: a review. In Applied Microbiology and Biotechnology, ed.; 'Ed.'^'Eds.' Springer Berlin / Heidelberg: 1994; 'Vol.' 40, p^pp 595-598. http://www.springerlink.com/content/n6t3p7112042v146/fulltext.pdf ENTerococci Industrial Platform http://imol.vub.ac.be/IMDO/projects/ENTIP.html Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus Garbayo, I.; VÃlchez, C.; Vega, J.; Nava-Saucedo, J.; Barbotin, J., Influence of immobilization parameters on growth and lactic acid production by Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus co-immobilized in calcium alginate gel beads. In Biotechnology Letters, ed.; 'Ed.'^'Eds.' Springer Netherlands: 2004; 'Vol.' 26, p^pp 1825-1827. http://www.springerlink.com/content/kj81u15234j1g452/fulltext.pdf Application of Leuconostoc Mesenteroides Strains Isolated from Chinese Food Sources to Produce Oligosaccharides to Be Used as Prebiotics (2009) web article, (2011. január 4.) http://www.latestscience-articles.com/Basic_Sciences/Application-of-Leuconostoc-Mesenteroides-Strains-Isolatedfrom-Chinese-Food-Sour-763.html Henne A. et al.: The genome sequence of the extreme termofil Thermus thermophilus, Nat. Biotechnol. 22 (5), 547-553, 2004 Nature Biotechnology (2004), 22(5), p.547 http://www.nature.com/nbt/journal/v22/n5/full/nbt956.html A. A. SALYERS,* J. R. VERCELLOTTI, S. E. H. WEST, AND T. D. WILKINS: Fermentation of Mucin and Plant Polysaccharides by Strains of Bacteroides from the Human Colon, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, (1977), Vol. 33, No. 2, p. 319-322, Zs. Langó: Who has first observed Planctomycetes, (2005), Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 52(1), p.73-84 http://www.akademiai.com/content/qu476r5626227075/ Wikipedia, the onlyne Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Pediococcus_acidilactici (2010.12.31) Wikipedia, the onlyne Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Lactococcus (2010.12.31) A.A.E Oliveira, L.M. Farias, J.R. Nicoli, J.E. Costa and M.A.R. Carvalho: Bacteriocin production by Fusebacterium isolates recovered from the oral cavity of human subjects with and without periodontal disease and of marmosets Res. Microbiol. (1998), 149, 585-594 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VN3-3XXDWSF6&_user=303407&_coverDate=09%2F30%2F1998&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=searc h&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000016619&_version=1&_urlVersion=0&_userid=303407 &md5=8c40601af3e32d2b2165cdecca539853&searchtype=a Kononen, E.; Kanervo, A.; Salminen, K.; Jousimies-Somer, H., beta -Lactamase Production and Antimicrobial Susceptibility of Oral Heterogeneous Fusobacterium nucleatum Populations in Young Children. Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43, (5), 1270-1273. http://aac.asm.org/cgi/reprint/43/5/1270 Anna Zdzieb_o, Jo´ zef Synowiecki : New source of the thermostable a-glucosidase suitable for single step starch processing Food Chemistry 79 (2002) 485–491 Wikipedia, the online Encyclopedia http://en.wikipedia.org/wiki/Chloroflexus (2010.12.31) Khanok Ratanakhanokchai,† Jun Kaneko, Yoshiyuki Kamio, and Kazuo Izaki: Purification and Properties of a Maltotetraose- and Maltotriose-Producing Amylase from Chloroflexus aurantiacus, Appl Environ Microbiol. 1992; 58(8): 2490–2494 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC195809/pdf/aem00049-0158.pdf M T Madigan and T D Brock: Photosynthetic sulfide oxidation by Chloroflexus aurantiacus, a filamentous, photosynthetic, gliding bacterium. J Bacteriol. 1975 May; 122(2): 782–784. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC246117/?tool=pmcentrez Hugler, M.; Menendez, C.; Schagger, H.; Fuchs, G., Malonyl-Coenzyme A Reductase from Chloroflexus aurantiacus, a Key Enzyme of the 3-Hydroxypropionate Cycle for Autotrophic CO2 Fixation, DOI: 10.1128/JB.184.9.2404-2410.2002. J. Bacteriol. 2002, 184, (9), 2404-2410. http://jb.asm.org/cgi/content/short/184/9/2404

[61]

[62]

[63] [64] [65]

[66]

[67] [68] [69]

[70] [71] [72] [73]

[74]

[75] [76] [77]

[78]

[79]



8. Hivatkozások

[80]

[81] [82] [83]

[84]

[85]

[86]

[87]

[88] [89]

[90] [91] [92]

[93] [94]

[95]

[96] [97]

133

J G Holt and R A Lewin: Herpetosiphon aurantiacus gen. et sp. n., a new filamentous gliding organism. J Bacteriol. 1968; 95(6): 2407–2408. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC315177/pdf/jbacter00588-0459.pdf Wikipedia, the online Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Cyanobacteria Prokaryotes (2006), Chapter 4.1, 7:195-210: Free living saccharolytic Spirohetes: The genus Spirohaeta http://resources.metapress.com/pdf-preview.axd?code=g50hph505208ltu1&size=largest Ghasem D Najafpour, Lim Jit Kang: Evaluation and isolation of ethanol producer strain SMP-6, The Proceedings of RSCE and 16th SOMChE, 28-30 Oct 2002 Malaysia http://www.andrew.cmu.edu/user/jitkangl/Fermentation%20of%20Ethanol/Fermentation%20of%20Ethan ol.htm Peter H. Janssen and Hugh W. Morgan: Glucose Catabolism by Spirochaeta thermophila RI 19.B1, JOURNAL OF BACTERIOLOGY,(1992), Vol. 174, No. 8 p. 2449-2453 http://jb.asm.org/cgi/reprint/174/8/2449.pdf The Prokaryotes: Handbook of Microorganism (2006) 7:757-793 Chapter 8.1.: The order Planctomycetales including the genera Planctomyces, Pirellula, Gemmata, and Isosphaera, and the candidatus genera Brocadia, Kuenenia, and Scalindua http://books.google.hu/books?id=LcCqW4IVj0C&pg=PA757&dq=The+prokaryotes+chapter+8.1&hl=hu&ei=7RAjTdDhJsqZOqjbyPsI&sa =X&oi=book_result&ct=result&resnum=2&ved=0CC0Q6AEwAQ#v=onepage&q=The%20prokaryotes %20chapter%208.1&f=false Stackebrandt, E.; Murray, R. G. E.; Truper, H. G., Proteobacteria classis nov., a Name for the Phylogenetic Taxon That Includes the "Purple Bacteria and Their Relatives" Int J Syst Bacteriol 1988, 38, (3), 321-325. DOI: 10.1099/00207713-38-3-321. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/38/3/321 Lee, K.-B.; Liu, C.-T.; Anzai, Y.; Kim, H.; Aono, T.; Oyaizu, H., The hierarchical system of the 'Alphaproteobacteria': description of Hyphomonadaceae fam. nov., Xanthobacteraceae fam. nov. and Erythrobacteraceae fam. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2005, 55, (5), 1907-1919. DOI: 10.1099/ijs.0.63663-0. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/55/5/1907 Labrat.com: http://www.thelabrat.com/restriction/sources/Brevundimonasdiminuta.shtml Silva, J. A.; Tobella, L. M.; Becerra, J.; Godoy, F.; Martínez, M. A., Biosynthesis of poly-[beta]hydroxyalkanoate by Brevundimonas vesicularis LMG P-23615 and Sphingopyxis macrogoltabida LMG 17324 using acid-hydrolyzed sawdust as carbon source. Journal of Bioscience and Bioengineering 2007, 103, (6), 542-546. http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VSD-4P5RTMP7&_user=10&_coverDate=06%2F30%2F2007&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_s ort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1598408746&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_ version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c09ab5dd7a8153a8d705eccf4490a012&searchtype=a Production of heterologous polypeptides from freshwater caulobacter, United States Patent 6861245 http://www.freepatentsonline.com/6861245.html CAULOBACTER S-LAYER KITS: For Recombinant Protein Secretion AND Peptide/Protein Display http://www.flintbox.com/public/project/1487/ Yasuhiro et al.:Production of thiotropocin by a marine bacterium, Caulobacter sp. and its antimicroalgal activities. Journal of Marine Biotechnology, (1997); 'Vol.' 5, pp 225-229. http://www.springerlink.com/content/0hja15c5dgc3ew1l/ Microbe wiki: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Hyphomonas_neptunium van Aalst-van Leeuwen, M. A.; Pot, M. A.; van Loosdrecht, M. C. M.; Heijnen, J. J., Kinetic modeling of poly(Î²-hydroxybutyrate) production and consumption by Paracoccus pantotrophus under dynamic substrate supply. Biotechnology and Bioengineering 1997, 55, (5), 773-782. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1097-0290(19970905)55:5%3C773::AIDBIT7%3E3.0.CO;2-8/abstract Young Tae Kim, Keunho Ji and Tae Hyug Jeong: Improved production of astaxanthin of the Paracoccus haeundaensis by mutagenesis FASEB J. April 2010 24 (Meeting Abstract Supplement) 682.3 http://www.fasebj.org/cgi/content/meeting_abstract/24/1_MeetingAbstracts/682.3 Wikipedia, the online Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Paracoccus_denitrificans Kranz, R.; Gabbert, K.; Locke, T.; Madigan, M., Polyhydroxyalkanoate production in Rhodobacter capsulatus: genes, mutants, expression, and physiology. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, (8), 30033009. http://aem.asm.org/cgi/content/short/63/8/3003



134


[98]

Uyar, B.; Schumacher, M.; Gebicki, J.; Modigell, M., Photoproduction of hydrogen by Rhodobacter capsulatus from thermophilic fermentation effluent. In Bioprocess and Biosystems Engineering, ed.; 'Ed.'^'Eds.' Springer Berlin / Heidelberg: 2009; 'Vol.' 32, p^pp 603-606. http://www.springerlink.com/content/r628k6535t8kw72g/ Sang Seo Lib et al: Bacteriocin from Purple Nonsulfur Phototrophic Bacteria, Rhodobacter capsulatus, Journal of Bacteriology and Virology 2009. Vol. 39, No. 4 p.269 – 276, DOI 10.4167/jbv.2009.39.4.269 http://synapse.koreamed.org/Synapse/Data/PDFData/0079JBV/jbv-39-269.pdf Taro Miyazaki,* Teruhide Sugisawa,‡ and Tatsuo Hoshino§ : Pyrroloquinoline Quinone-Dependent Dehydrogenases from Ketogulonicigenium vulgare Catalyze the Direct Conversion of l-Sorbosone to lAscorbic Acid† Appl Environ Microbiol. 2006; 72(2): 1487–1495. doi: 10.1128/AEM.72.2.14871495.2006. Galata 3 : „Roseobacter bacteria – the ocean’s stars” project, Dánia http://130.226.56.246/uk/Menu/Science/Roseobacter+bacteria+%E2%80%93+the+ocean%E2%80%99s+ stars Roseobase, Genomic resource for marine Roseobacters: http://www.roseobase.org/roseo/och114.html Sulinet, Digitális tudástár: http://sdt.sulinet.hu/Player/Default.aspx?g=954cccbf-ed5b-47dd-bb7328761eae299b&cid=ad91047e-4823-4393-b137-5f3cb2b945e9 Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrogenophilaceae Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Acidithiobacillus Joint Genom Institute – Genom portal: http://genome.jgi-psf.org/thide/thide.home.html Wikipedia, the online encyclopedia: http://de.wikipedia.org/wiki/Neisseria#Neisseria_meningitidis Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Burkholderia Mohana, S.; Shah, A.; Divecha, J.; Madamwar, D., Xylanase production by Burkholderia sp. DMAX strain under solid state fermentation using distillery spent wash. Bioresource Technology 2008, 99, (16), 7553-7564. Anke Baselin: Optimization of lipase production in Burkholderia glumae, PhD-disszertáció (2005), Ruhr Universitaet (Bochum).http://deposit.ddb.de/cgibin/dokserv?idn=978412117&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=978412117.pdf Dugan, P.; Stoner, D.; Pickrum, H., The Genus Zoogloea. In The Prokaryotes, ed.; Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H.; Stackebrandt, E., Springer New York: 2006; 'Vol.' p^pp 960-970. http://www.springerlink.com/content/m202714852322t01/ MicrobeWiki: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Beggiatoa Wikipedia, the online Ecyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Purple_sulfur_bacteria Fodor Barna: Hidrogenáz érés a Thiocapsa roseopersicina baktériumban, PhD disszertáció (2003), Szegedi Tudományegyetem, http://doktori.bibl.u-szeged.hu/37/3/tz_hu937.pdf Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Alcanivorax Van Trappen, S.; Tan, T.-L.; Yang, J.; Mergaert, J.; Swings, J., Glaciecola polaris sp. nov., a novel budding and prosthecate bacterium from the Arctic Ocean, and emended description of the genus Glaciecola Int J Syst Evol Microbiol 2004, 54, (5), 1765-1771. DOI: 10.1099/ijs.0.63123-0. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/citmgr?gca=ijs;54/5/1765 Gauthier, M. J.; Lafay, B.; Christen, R.; Fernandez, L.; Acquaviva, M.; Bonin, P.; Bertrand, J.-C., Marinobacter hydrocarbonoclasticus gen. nov., sp. nov., a New, Extremely Halotolerant, HydrocarbonDegrading Marine Bacterium, Int J Syst Bacteriol 1992, 42, (4), 568-576. DOI: 10.1099/00207713-42-4568 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/42/4/568 Joint Genome Institute: http://genome.jgi-psf.org/micde/micde.home.html Assyrian International News Agency (2008): http://www.aina.org/news/20081201063837.htm Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Francisella Wikipedia, the online Encyclopedia: http://hu.wikipedia.org/wiki/Tular%C3%A9mia Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Tetrodotoxin Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Photobacterium

[99]

[100]

[101]

[102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109]

[110]

[111]

[112] [113] [114] [115] [116]

[117]

[118] [119] [120] [121] [122] [123]



8. Hivatkozások

135

[124] Carnegie Melon University (Pittsburgh), „Molecular Biology of Prokaryotes” course: http://www.bio.cmu.edu/courses/03441/TermPapers/97TermPapers/lux/communication.html [125] Phage Therapy Center (The Republic of Georgia): http://www.phagetherapycenter.com/pii/PatientServlet?command=static_proteus [126] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Salmonella_enterica [127] Hazipatika.com: http://www.hazipatika.com/services/betegseglexikon/view/Salmonellozis?id=236 [128] Casullo de AraÃºjo, H. W.; Fukushima, K.; Takaki, G. M. C., Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-Resources as a Low Cost Substrate. Molecules 2010, 15, (10), 6931-6940. http://www.mdpi.com/1420-3049/15/10/6931/pdf [129] Baross Rezső: A hangyasav és a propionsav hatása, Országos mezőgazdasági szakfolyóirat - X. évfolyam - 2006/09 ISSN 2061-552 http://www.agronaplo.hu/szakfolyoirat/2006/09/pr/2369 [130] Amjad Khalil, B., Z. Musa Abu and A. Mohammad, 2006. Production of antimicrobial agents from thermophilic Yersinia sp.1 and Aeromonas hydrophila isolated from hot spring in Jordan valley. Biotechnology, 5: 252-256. http://scialert.net/abstract/?doi=biotech.2006.252.256 [131] John Innes Center (Norwich, UK): http://www.jic.ac.uk/SCIENCE/molmicro/Azot.html [132] A. Khanafari; A. Akhavan Sepahei: Alginate biopolymer production by Azotobacter chroococcum from whey degradation, Int. J. Environ. Sci. Tech., 4 (4): 427-432, 2007 [133] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Rhizobacter [134] Nurizzo, D.; Turkenburg, J. P.; Charnock, S. J.; Roberts, S. M.; Dodson, E. J.; McKie, V. A.; Taylor, E. J.; Gilbert, H. J.; Davies, G. J., Cellvibrio japonicus [alpha]-L-arabinanase 43A has a novel five-blade [beta]-propeller fold. 2002, 9, (9), 665-668. http://www.nature.com/nsmb/journal/v9/n9/full/nsb835.html [135] Pell, G.; Szabo, L. r. n.; Charnock, S. J.; Xie, H.; Gloster, T. M.; Davies, G. J.; Gilbert, H. J., Structural and Biochemical Analysis of Cellvibrio japonicus Xylanase 10C Journal of Biological Chemistry 2004 279 (12 ), 11777-11788 DOI: 10.1074/jbc.M311947200 http://www.jbc.org/content/279/12/11777.full.pdf+html [136] Tenyészsertés-állomány mentesítése Actinobacillus pleuropneumoniae fertőzéstől, Magyar Állatorvosok lapja 2010(7) (2010.08.17.) http://www.magyarallatorvosoklapja.hu/node/79 [137] MicrobeWiki: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Methylococcus_capsulatus [138] McNell, M. M.; Martone, W. J.; Dowell, V. R., Bacteremia with Anaerobiospirillum succiniciproducens Review of Infectious Diseases 1987 9 (4 ), 737-742 DOI: 10.1093/clinids/9.4.737 http://cid.oxfordjournals.org/content/9/4/737.full.pdf+html [139] Nghiem, N.; Davison, B.; Suttle, B.; Richardson, G., Production of succinic acid by anaerobiospirillum succiniciproducens. In Applied Biochemistry and Biotechnology, ed.; 'Ed.'^'Eds.' Humana Press Inc.: 1997; 'Vol.' 63-65, p^pp 565-576. http://www.springerlink.com/content/f86w142j30883u64/ [140] M. P. Bryant, Nola Small, Cecelia Bouma, and Hilda Chu: BACTEROIDES RUMINICOLA N. SP. AND SUCCINIMONAS AMYLOLYTICA THE NEW GENUS AND SPECIES, J Bacteriol. 1958 July; 76(1): 15–23. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC290147/pdf/jbacter00504-0033.pdf [141] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Xanthomonas_campestris [142] The Merck Manuals: http://www.merckmanuals.com/professional/sec02/ch013/ch013b.html [143] Sakaguchi, T.; Arakaki, A.; Matsunaga, T., Desulfovibrio magneticus sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium that produces intracellular single-domain-sized magnetite particles. Int J Syst Evol Microbiol 2002, 52, (1), 215-221. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/52/1/215 [144] MicrobeWiki: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Desulfovibrio [145] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Bdellovibrio [146] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Myxobacteria [147] Peter Meiser: Myxococcus xanthus – a myxobacterial model strain as multiproducer of secondary metabolites, PhD disszertáció (2008), niversitaet des Saarlandes. http://scidok.sulb.unisaarland.de/volltexte/2008/1683/pdf/Dissertation_PeterMeiser_Internetversion.pdf [148] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Clostridiaceae [149] Sveiczer Ákos: Mikrobiológia – II. Részletes Mikrobiológia jegyzet, BME 2005 http://bmekornyesz.hu/sqlatm/index.php?a=dl&f=silo/4.%20f%C3%A9l%C3%A9v/Mikrobiol%C3%B3g ia/elojegyzet2.pdf



136


[150] Smith MT, van Grinsven AM. Dekkera anomala sp. nov., the teleomorph of Brettanomyces anomalus, recovered from spoiled soft drinks. Antonie Van Leeuwenhoek 1984,50:143-148 http://www.springerlink.com/content/q62764570q553565/ [151] Susanne Prinz,1 Iliana Avila-Campillo,1 Christine Aldridge,1 Ajitha Srinivasan,1 Krassen Dimitrov,1 Andrew F. Siegel,1,2 and Timothy Galitski1,3: Control of Yeast Filamentous-Form Growth by Modules in an Integrated Molecular Network, Genome Res. 2004, 14(3): 380–390. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC353223/pdf/0140380.pdf [152] Wikipedia, the online Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Fungus#Taxonomy [153] Hibbett DS, et al. (2007). "A higher level phylogenetic classification of the Fungi". Mycological Research 111 (5): 509–47 http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/AFTOL/documents/AFTOL%20class%20mss%2023,%2024/AFT OL%20CLASS%20MS%20resub.pdf [154] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Basidiomycota [155] Maszlavér Petra: A PECSÉTVIASZ GOMBA, GANODERMA LUCIDUM (CURT.: FR.) KARST HAZAI TERMESZTEHETŐSÉGÉNEK LEHETŐSÉGEI, PhD disszertáció, Budapesti Corvinus Egyetem (2008) http://phd.lib.uni-corvinus.hu/319/ [156] M. Zhang, S.W. Cui, P.C.K. Cheung and Q. Wang: Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity, Trends in Food Science & Technology 18 (2007) 4-19 [157] Ya-Jie Tang*, Li-Wen Zhu, Hong-Mei Li and Dong-Sheng Li: Submerged Culture of Mushrooms in Bioreactors – Challenges, Current State-of-the-Art, and Future Prospects, Food Technol. Biotechnol. 45 (3) 221–229 (2007) http://www.ftb.com.hr/45/45-221.pdf [158] World Congress on Industrial Biotechnology and Bioprocessing, 2009.07.22, Montreál, Kanada [159] BIODIDAC -A bank of digital resources for teaching biology: http://biodidac.bio.uottawa.ca/thumbnails/filedet.htm?File_name=ASCO005B&File_type=GIF [160] Wikipedia, the online encyclopedia: http://www.albertschatzphd.com/?cat=articles&subcat=streptomycin&itemnum=001 [161] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces#Biotechnology [162] Wikipedia, the online encyclopedia: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phylogenetic_tree_hu.svg [163] Beile Gao and Radhey S Gupta: Phylogenomic analysis of proteins that are distinctive of Archaea and its main subgroups and the origin of methanogenesis, BMC Genomics 2007, 8:86, pp1-23, http://www.biomedcentral.com/1471-2164/8/86 [164] Discovery Health Webpage: http://health.howstuffworks.com/wellness/men/how-to-get-rid-of-foot-odor1.htm [165] Wikipedia, the online Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Deinococcus_radiodurans [166] Michael R. Tansey and Thomas D. Brock: The Upper Temperature Limit for Eukaryotic Organisms, Proc Natl Acad Sci U S A. 1972 September; 69(9): 2426–2428. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC426956/ [167] Singh, S.; Madlala, A. M.; Prior, B. A., Thermomyces lanuginosus: properties of strains and their hemicellulases. FEMS Microbiology Reviews 2003, 27, (1), 3-16 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T37-481FWG31&_user=303407&_coverDate=04%2F30%2F2003&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=searc h&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1619039986&_rerunOrigin=google&_acct=C0000166 19&_version=1&_urlVersion=0&_userid=303407&md5=0002c9fee56e661909a8dfdc0572ce0b&searcht ype=a [168] Joint Genom Institute – Genom portal: http://genome.jgi-psf.org/Spoth1/Spoth1.home.html [169] Rezessy Sz. J.: Thermomyces lanuginosus -galaktozidáz enzim előállítása és jellemzése, PhD disszertáció (2003), Budapesti Corvinus Egyetem http://phd.lib.uni-corvinus.hu/478/1/de_1612.pdf [170] Young, J.; Kuykendall, L.; Martinez-Romero, E.; Kerr, A.; Sawada, H., A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R. vitis. Int J Syst Evol Microbiol 2001, 51, (1), 89-103. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/51/1/89?maxtoshow=&hits=10&RESULTFORMAT=&author1=Yo ung&fulltext=A+revision+of+Rhizobium+Frank+1889&andorexactfulltext=and&searchid=1&FIRSTIN DEX=0&sortspec=relevance&resourcetype=HWCIT



8. Hivatkozások

137

[171] Wikipedia, the online encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Thiobacillusű [172] Cummings, D. E.; Caccavo Jr., F.; Spring, S.; Rosenzweig, R. F., Ferribacterium limneticum, gen. nov., sp. nov., an Fe(III)-reducing microorganism isolated from mining-impacted freshwater lake sediments. In Archives of Microbiology, ed.; 'Ed.'^'Eds.' Springer Berlin / Heidelberg: 1999; 'Vol.' 171, p^pp 183-188. http://resources.metapress.com/pdf-preview.axd?code=7hb3yc6qjwmd6h29&size=largest [173] Reinhold-Hurek, B.; Hurek, T., The Genera Azoarcus, Azovibrio, Azospira and Azonexus. In The Prokaryotes, ed.; Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H.; Stackebrandt, E., 'Ed.'^'Eds.' Springer New York: 2006; 'Vol.' p^pp 873-891. http://www.springerlink.com/content/l3g777m801tl215j/ [174] Salinas, M. B.; Fardeau, M.-L.; Cayol, J.-L.; Casalot, L.; Patel, B. K. C.; Thomas, P.; Garcia, J.-L.; Ollivier, B., Petrobacter succinatimandens gen. nov., sp. nov., a moderately thermophilic, nitrate-reducing bacterium isolated from an Australian oil well, Int J Syst Evol Microbiol 2004, 54, (3), 645-649.DOI: 10.1099/ijs.0.02732-0. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/54/3/645 [175] Brune, A.; Ludwig, W.; Schink, B., Propionivibrio limicola sp. nov., a fermentative bacterium specialized in the degradation of hydroaromatic compounds, reclassification of Propionibacter pelophilus as Propionivibrio pelophilus comb. nov. and amended description of the genus Propionivibrio. Int J Syst Evol Microbiol 2002, 52, (2), 441-444. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/52/2/441 [176] Wikipedia, the online enyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae [177] PFENNIG, N., Rhodocyclus purpureus gen. nov. and sp. nov., a Ring-Shaped, Vitamin B12-Requiring Member of the Family Rhodospirillaceae, Int J Syst Bacteriol 1978, 28, (2), 283-288. DOI: 10.1099/00207713-28-2-283., http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/28/2/283 [178] A rendszertani (III.) fejezetben bemutatott mikroszkópos képek mindegyike a Wikipedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Main_Page) szabad felhasználású képei.



138


ÁBRÁK, ANIMÁCIÓK, VIDEÓK, TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE Ábrák, animációk, videók 1.1.1. ábra: Az ipari mikrobiológia helye a tudományban ................................................................. 7 1.1.2. ábra: A lizin képlete ................................................................................................................. 7 1.1.3. animáció: A bioautográf módszer ............................................................................................ 8 1.1.4. ábra: Glutaminsav- és lizinmetabolizmus ................................................................................ 9 1.1.5. ábra: Az 1,3-propándiol-előállítás alakulása az utóbbi két évtizedben .................................. 10 1.1.6. ábra: A propándiol okozta különleges szerkezetű PTT polimer (PET: polietilén-tereftalát, PTT: poli-trimetilén-tereftalát, PBT: polibutilén-tereftalát, ET: etilén, PR: propilén, BU: butilén, TFS: tereftálsav) ............................................................................................................................... 10 1.1.7. animáció: 1,3-PD különleges szerkezete ................................................................................ 10 1.1.8. ábra: az 1,3-propándiol-előállító technológiák ....................................................................... 11 1.1.9. ábra: Az anaerob glicerin metabolizmus ................................................................................ 12 1.1.10. ábra: A glicerinmetabolizmus enzimei: GDH, GDHt, PDOR, (DHA: dihidroxiaceton, HPA: hidroxipropionaldehid, PD: 1,3-propándiol) .......................................................................... 13 1.1.11. hyperpicture: A rekombináns PD fermentációs technológia ................................................ 13 1.2.1. ábra: Izolálás szilárd mintáról ................................................................................................ 15 1.2.1. videó: Izolálás......................................................................................................................... 15 1.2.2. ábra: Anaerob tenyésztőrendszerek ........................................................................................ 17 1.2.3. videó: Törzsfenntartás aktív formában ................................................................................... 20 1.2.4. ábra: Ferdeagaros, anaerob és szúrt tenyészetek, Petri-csészék és oltókacsok....................... 21 1.2.5. ábra: Microplate reader – HTS szűrővizsgálathoz ................................................................. 22 1.2.6. ábra: Antibiotikum-termelők szűrővizsgálati tesztje .............................................................. 24 1.2.7. videó: Klasszikus törzsfejlesztés ............................................................................................ 26 1.2.8. ábra: A modern törzsfejlesztés vázlata ................................................................................... 27 1.2.9. ábra: E. coli ecetsav képzésének eliminációja: A) glükóz transzfer deficiens mutáns, B) aceBAK génekkel megnövelt glioxalát- és citrátkör- aktivitás. .................................................. 30 1.3.1. ábra: A mikrobák centrális anyagcseréje ................................................................................ 31 1.3.2. ábra: A pelletképződést befolyásoló tényezők ....................................................................... 34 1.3.3. Pelletes morfológia ................................................................................................................. 34 1.3.4. ábra: Bolyhos pellet (1-2mm)................................................................................................. 35 1.3.5. ábra: Óriás (1cm) pellet és szabálytalan alakú pellet ............................................................ 35 1.3.6. ábra: Amorf és óriás (2-3 cm) pellet....................................................................................... 35 1.3.7. ábra: Pelletfelszín mikroszkópos képe (400-szoros nagyítás) ............................................... 35 1.3.8. ábra: Forgódobos bioreaktor .................................................................................................. 37 1.3.9. ábra: Koji tálcás reaktor ......................................................................................................... 38 2.1.1. ábra: Metanol-előállítás szén-dioxidból és metánból ............................................................. 41 2.1.2. hyperpicture: Az ipari mikrobiológiában fontos anyagcsereutak összefoglalása ................... 41 2.1.3. ábra: Cukorképződés glikoladldehiden keresztül .................................................................. 42 2.1.4. ábra: Eritrittől az eritrózig ...................................................................................................... 43 2.1.5. ábra: Pentóz-foszfát ciklus .................................................................................................... 43 2.1.6. ábra: Szedoheptuloz ............................................................................................................... 44 2.1.7. ábra: D-glicero-D-gluko-heptulóz .......................................................................................... 44 2.1.8. ábra: Kalkopirit ...................................................................................................................... 45 2.3.1. ábra: A szteránvázas alapvegyület – a koleszterin– szerkezete .............................................. 51 2.3.2. ábra: „Szteroidok családfája” ................................................................................................ 51 2.3.3. ábra: Ipari alapanyagként hasznosított fitoszterinek .............................................................. 52 2.3.4. ábra: Szitoszterinalapú hidrokortizon- (bio)szintézis ............................................................. 55 2.3.5. ábra: Hidrokortizon biokonverziója prednizolonná és származékaivá ................................... 55 3.1.1. ábra: Bergey-féle bakteriális rendszertan ............................................................................... 62 3.1.2. ábra: Filogenetikus fa a 3 domén elmélet alapján ................................................................. 63



Ábrák, animációk, videók, táblázatok jegyzéke

139

3.1.3. ábra: Bakteriális filogenetikus fa az indelmodell alapján ...................................................... 64 3.2.1. hyperpicture: Rendszertan ...................................................................................................... 65 3.2.2. ábra: Methanosarcina metanogén ősbaktérium ..................................................................... 66 3.2.4. ábra: Sulfolobusvírus-fertőzéssel ........................................................................................... 68 3.2.5. ábra: Bacillus subtilis ............................................................................................................ 69 3.2.6. ábra: Listeria monocytogenes ................................................................................................ 70 3.2.7. ábra: Lactobacillus acidophilus ............................................................................................. 70 3.2.8. ábra: Oenococcus oeni ........................................................................................................... 71 3.2.9. ábra: Lactococcus lactis ......................................................................................................... 71 3.2.10. ábra: Clostridium botulinum ................................................................................................ 72 3.2.12. ábra: Microccus mucilaginosus ........................................................................................... 74 3.2.13. ábra: Arthrobacter chlorophenolicus ................................................................................... 74 3.2.14. ábra: Corynebacterium diphteriae ........................................................................................ 75 3.2.15. ábra: Mycobacterium tuberculosis ....................................................................................... 76 3.2.16. ábra: Rhodococcus species ................................................................................................... 77 3.2.17. ábra: Propionibacterium acne ............................................................................................... 78 3.2.18. ábra: Streptomyces griseus ................................................................................................... 79 3.2.19. ábra: Petrotoga sp. ................................................................................................................ 79 3.2.20. ábra: Fusobacterium novum ................................................................................................ 80 3.2.21. ábra: Deinococcus radiodurans ............................................................................................ 80 3.2.22. ábra: Chloroflexus auranticus .............................................................................................. 81 3.2.23. ábra: Arthrospira (Spirulina) sp. .......................................................................................... 82 3.2.24. ábra: Bacteroides biacutis ..................................................................................................... 82 3.2.25. ábra: Planctomyces bekefii ................................................................................................... 83 3.2.26. ábra: Aquifex aeolicus .......................................................................................................... 83 3.2.27. ábra: Myxococcus xanthus .................................................................................................. 84 3.2.28. ábra: Heliobacter pylori ....................................................................................................... 85 3.2.29. ábra: Ketogulonicigenium vulgare ....................................................................................... 86 3.2.30. ábra: Agrobacterium tumefaciens répaszöveten .................................................................. 86 3.2.31. ábra: Burkholderia cepacia .................................................................................................. 87 3.2.32. ábra: Alcanivorax borkumensis ............................................................................................ 89 3.2.33. ábra: Escherichia coli ........................................................................................................... 89 3.2.34. ábra: Pseudomonas sp. ......................................................................................................... 90 3.2.3. ábra: Az ősbaktériumok „családfája” a rokonsági távolságokkal (NJ/ML/MP algoritmussal is) .......................................................................................................... 92 3.2.11. ábra: Az Actinobacterek családfája (Az NCBI taxonomia adatfile alapján generálva) ....... 94 3.3.1. animáció: Gombák életciklusai .............................................................................................. 95 3.3.2. ábra: A legújabb gombarendszertan ....................................................................................... 96 3.3.3. ábra: Bazidomiceták felépítése .............................................................................................. 97 3.3.4. ábra: Aszkuszos gombák spóraképzése ............................................................................... 100 3.3.5. videó: Élesztőtenyészet ........................................................................................................ 100 3.3.6. videó: Fonalas gomba sporangium ....................................................................................... 100 3.4.1. ábra: Vörös alga ................................................................................................................... 101

Táblázatok 1.1.1. táblázat: Színkódrendszer a Biotechnológiai területek jelölésére ............................................ 5 1.2.1. táblázat: Fonalas gombák ipari felhasználása ......................................................................... 18 1.2.2. táblázat: Termofil mikroorganizmusok lelőhelyei ................................................................. 20 2.1.1. táblázat: Acidiphiliumok tápközege ....................................................................................... 45 2.3.1. táblázat: A legfontosabb mikrobiális szekunder metabolitok. ................................................ 47 2.3.2. gyakori mikrobiális szteroidkonverziók ................................................................................. 53 3.1.1. táblázat: A rendszertan fejlődése ............................................................................................ 57 3.2.1. táblázat: Az ősbaktériumok különleges képességei................................................................ 66 3.2.2. táblázat: Bacillusok osztálya .................................................................................................. 93



140


3.3.1. táblázat: Kalapos gombák fermentációs felhasználása .......................................................... 99 3.5.1. táblázat: Tejtermékek mikrobiotája ...................................................................................... 103 3.6.1. táblázat Az immunrendszer felépítése .................................................................................. 104 3.6.2. táblázat: A magyarországi kötelező védőoltások ................................................................. 104 4.1.1. táblázat: A különböző BsC szintre sorolt laboratóriumokkal szembeni követelmények ..... 106 4.1.2. táblázat: Mikrobiológiai eredetű élelmiszer-adalékok GRAS-listája ................................... 108



Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Recommend Documents