Bronopsporing bij meldingen van voedsel-gerelateerde virusinfecties, 2003-2008
Voedsel en Waren Autoriteit Afdeling Microteam 2 Regio Oost Rapport over de projecten: OT04H006, OT05L006, OT06C1, OT0713I1 en OT0815I1 Projectnummer OT0915_1
November 2009
Pagina 1 van 23
INHOUDSOPGAVE Samenvatting................................................................................................................. 3 Summary ....................................................................................................................... 3 Inleiding ......................................................................................................................... 4 Norovirus ................................................................................................................... 4 Transmissie van norovirus via voedsel....................................................................... 5 Bronopsporing na meldingen van buikgriep ............................................................... 5 Figuur 1 Relatie tussen VWA, GGD en RIVM-LIS.......................................................... 6 Figuur 2 Beslisboom ...................................................................................................... 7 Virusdetectie in voedsel ............................................................................................. 8 Productgroep afhankelijke virusextractie.................................................................... 8 Extractiecontrole ........................................................................................................ 9 Virusdetectie.............................................................................................................. 9 Figuur 3 Nested PCRs NVI en NVII ............................................................................... 9 Oppervlakte bemonstering ....................................................................................... 10 Figuur 4. Bemonstering met Sodibox veegdoekjes Diffchamb Biocontrol. Na elke monstername worden de handschoenen uitgetrokken vóór het beschrijven van de etiketten ...................................................................................................................... 10 Relatie met humane diagnostiek .............................................................................. 11 Materiaal en methoden ................................................................................................ 11 Bemonstering en transport....................................................................................... 11 Selectie en analyse.................................................................................................. 11 Linking ..................................................................................................................... 12 Resultaten ................................................................................................................... 12 Meldingen van voedsel-gerelateerde virusinfecties (2003- 2005)............................. 12 Meldingen van (voedsel-gerelateerde) norovirusinfecties (2006-2008) .................... 12 Veegdoekjes............................................................................................................ 13 Niet voedsel-gerelateerde meldingen....................................................................... 13 Vergelijking van norovirus sequenties...................................................................... 14 Discussie ..................................................................................................................... 14 Eindconclusie .............................................................................................................. 16 Vervolgonderzoek........................................................................................................ 17 Referenties .................................................................................................................. 18 Tabellen....................................................................................................................... 19 Tabel 1 Ontwikkelingen van de virale bronopsporing bij de VWA............................. 19 Tabel 2a Bronopsporing 2006 t/m 2008 per melding................................................ 20 Tabel 2b Bronopsporing 2006 t/m 2008 per onderzocht monster ............................. 20 Tabel 3 Norovirus op voedsel anders dan schelpdieren........................................... 21 Tabel 4 Norovirus in oesters gerelateerd aan meldingen van buikgriep ................... 21 Tabel 5 Norovirus op omgevingsmonsters na meldingen op cruiseships a ............... 22 Tabel 6 Norovirus op omgevingsmonsters na meldingen in instellingen a ................ 22
Pagina 2 van 23
Samenvatting Norovirussen zijn de belangrijkste virale verwekkers van niet-bacteriële buikgriep zowel bij uitbraken van buikgriep in groepen personen, als bij sporadische gevallen van buikgriep. Transmissie van norovirus verloopt zeer efficiënt persoon-op-persoon, maar kan ook verlopen via besmette oppervlakten, voedsel of water. Dit rapport beschrijft het onderzoek dat de VWA heeft gedaan in de periode 2003-2008 naar de betrokkenheid van norovirus bij meldingen van buikgriep gerelateerd aan voedsel, maar ook bij meldingen van buikgriep onder opvarenden op cruiseschepen of bewoners van instellingen. Norovirus kon worden aangetoond in voedsel bij 12 van de 77 (16%) meldingen. Daarbij werd norovirus aangetoond op vleeswaren of bereid vlees (5 meldingen), in bakkerswaren (2 meldingen) en in oesters (5 meldingen). Detectie van norovirus in oesters leidde tweemaal tot het opstellen van een Rapid Alert (RASFF). Daarnaast kon norovirus aangetoond worden op 147/371 (40%) omgevingsmonsters van diverse oppervlakten genomen bij 44 van de 72 meldingen (61%). Bij 25 van de 63 (40%) meldingen (59/202 monsters (29%)) werd daarbij norovirus aangetroffen op oppervlakten in de keuken, suggestief voor de belangrijke rol die geïnfecteerde voedsel-bereiders of medewerkers in de horeca hebben bij de transmissie van norovirus. Analyse van oppervlaktemonsters genomen op cruiseschepen en instellingen op norovirus gaf een beeld hoe verspreid dit virus tijdens uitbraken in deze settings voorkomt. In combinatie met het VWA rapport ‘Prevalentie en bekendheid van norovirus (NoV) in de horeca, 2008-2009”, levert dit rapport relevante informatie om de komende jaren, naast lopende activiteiten, te werken aan voorlichting over en preventie van norovirus besmetting van voedsel in de horeca. Summary Noroviruses (NoV) have emerged as the most common cause of outbreaks as well as of sporadic cases of acute non-bacterial gastroenteritis in children and adults. These viruses are easily transmitted from person-to-person by the fecal-oral route, either directly or indirectly via contaminated surfaces, food or water. This report describes outbreak investigations performed by the Food and Consumer Product Safety Authority in the period between 2003 until 2008 in response to reported outbreaks of food-borne gastroenteritis as well as outbreaks of gastroenteritis on cruise ships and in institutions. Norovirus was detected in food items investigated for 12 out of 77 (16%) of the outbreaks for which food samples had been collected. Food products that tested positive were deli meat samples (5 outbreaks), food from the bakery’s (2 outbreaks) and oysters (5 outbreaks). Twice, an international rapid alert (RASFF) was posted in reaction to contaminated oysters. Using environmental swabs, norovirus was detected on 147/370 environmental swabs (40%) taken from 44 out of 72 outbreaks (61%). Fifty-nine of 202 (29%) environmental samples taken from kitchen surfaces tested positive for norovirus and were taken for 25 out of 63 (40%) investigated outbreaks, suggestive for an important role of infectious food handlers in the transmission of norovirus. Detection of norovirus on many environmental samples taken on cruise ships and at institutions was indicative for the widespread contamination of surfaces with norovirus during outbreaks in these settings. These results in combination with the forthcoming report “Prevalence and knowledge on norovirus (NoV) in the catering industry, 2008-2009”, should lead to activities to raise the education level of employees in the catering industry and lead to prevention of food to become contaminated with norovirus.
Pagina 3 van 23
Inleiding Lang kon een deel van de ziektegevallen na een bezoek aan een restaurant niet verklaard worden aan de hand van resultaten van bacteriologisch onderzoek aan voedselrestanten. Diagnostiek aan ontlastingmonsters van patiënten wees uit dat het norovirus één van de belangrijkste ziekteverwekkers is van voedselinfecties. Geschat wordt dat 500.000 mensen per jaar in Nederland buikgriep krijgen als gevolg van norovirus en dat 22% van de uitbraken van norovirus-gerelateerde buikgriep in Europa voedsel-gerelateerd zijn (Verhoef et al., 2008c). Onderzoek aan voedselrestanten op de aanwezigheid van norovirus, was, met uitzondering van schelpdieren, nog niet mogelijk tot 2003. Eind 2003 is op het laboratorium van de VWA in Zutphen begonnen met de ontwikkeling van de methodiek ten behoeve van de detectie van norovirus in voedselmonsters anders dan schelpdieren. Tegelijkertijd werd gestart met de bemonstering van voedselrestanten door VWA controleurs na melding van voedsel-gerelateerde infecties. Op deze wijze werd ervaring opgedaan met verschillende aspecten van het virale klachtenonderzoek en konden de protocollen op het laboratorium uitgetest worden. Dit rapport bespreekt de ontwikkelingen, inzichten en resultaten verkregen in de afgelopen 5 jaar, 2003 tot en met 2008. In combinatie met het VWA rapport “Prevalentie en bekendheid van norovirus (NoV) in de horeca, 2008-2009”, levert dit rapport relevante informatie om de komende jaren, naast lopende activiteiten, te werken aan voorlichting over en preventie van norovirus besmetting van voedsel. Norovirus Norovirussen zijn de belangrijkste virale verwekkers van niet-bacteriële buikgriep zowel bij uitbraken van buikgriep in groepen personen, als bij sporadische gevallen van buikgriep. Norovirussen zijn vernoemd naar het ‘Norwalk’ virus dat in 1968 een uitbraak van buikgriep veroorzaakte op een school in Norwalk, Ohio. Er zijn inmiddels 5 verschillende genogroepen geïdentificeerd, GGI t/m GGV, waarvan alleen GGI, GGII en GGIV, ziekteverwekkend zijn bij de mens. Alle genogroepen zijn onder te verdelen in clusters van genotypen gebaseerd op genetische verschillen in het genoom, wat bestaat uit enkelstrengs RNA. Verder hebben norovirussen, net als andere enterale virussen geen ‘virus-envelop’, wat maakt dat de virussen zeer omgevingsstabiel zijn. In het milieu blijven ze lang infectieus, en zijn relatief goed bestand tegen droogte, lage en hoge pH, koude en warmte. Ziekteverschijnselen Ziekteverschijnselen treden op na een incubatietijd, die normaal tussen de 24 en 48 uur ligt, met een mediaan tussen de 33-en 36 uur. De ziekteverschijnselen kunnen ook eerder optreden, met een minimale tijd van ongeveer 12 uur, en beginnen vaak acuut met explosief braken, en/of verschillende episoden van waterdunne diarree, soms gepaard gaande met buikkrampen, misselijkheid, en lage koorts. Bij ouderen en bij kinderen kan uitdroging als complicatie optreden. De symptomen duren meestal 24 tot 60 uur en verdwijnen daarna zonder restverschijnselen. Studies waarbij vrijwilligers werden blootgesteld aan norovirus lieten zien dat a-symptomatische infecties en uitscheiding, dus infectie en uitscheiding zonder merkbare ziekteverschijnselen, bij ongeveer 30% van de blootgestelde personen voorkomt. Uitscheiding Norovirus wordt uitgescheiden in feces, maar ook braaksel bevat infectieuze partikels, welke na explosief braken in de wijde omgeving tot besmetting van oppervlakten of producten kan leiden. Slechts 10 virusdeeltjes zijn voldoende om ziek te worden, terwijl diarree en braaksel meer dan 106 virusdeeltjes per gram bevatten. Uitscheiding van virusdeeltjes komt voor in de tijd tussen blootstelling en ziekteverschijnselen, maar vindt in ieder geval plaats tijdens de symptomatische periode, en kan doorgaan tot wel drie weken na herstel, ook in immunocompetente gezonde personen. Immuniteit tegen norovirus lijkt genotype afhankelijk
Pagina 4 van 23
en is daarnaast maar van korte duur. Daardoor ligt het percentage van zieken binnen een blootgestelde groep personen vaak rond of boven de 50%. Op dit moment is er geen vaccin beschikbaar ter voorkoming van norovirus infecties. Transmissie van norovirus via voedsel Besmetting tijdens primaire productie Contaminatie van voedsel kan op meerdere momenten in de voedselproductieketen plaatsvinden. Er wordt vaak een onderscheid gemaakt in besmetting tijdens de primaire productie aan het begin van de keten en besmetting door geïnfecteerde voedselbereiders en/of verwerkers aan het einde van de keten. Besmetting in de primaire fase is vaak het gevolg van contact van voedsel met fecaal verontreinigd water. Een voorbeeld is de contaminatie van twee-kleppige schelpdieren, zoals mosselen, oesters, en kokkels, die water filteren om aan voedingstoffen te komen en daarmee enterale virussen in hun maag-darmkanaal concentreren. Ook bij de productie van bladgroenten of zacht fruit, kunnen producten in contact komen met fecaal verontreinigd water. Dit kan tijdens de groei, irrigatie (met of zonder bestrijdingsmiddel of meststoffen) of het wassen van de producten. Besmetting met fecaal verontreinigd water in de primaire fase gaat vaak gepaard met besmetting met meerdere virussen. Daarnaast kunnen tuinbouwproducten ook besmet raken door contact met fecaal besmette handen van geïnfecteerde plukkers of wanneer in het veld overgegeven wordt. Door (inter-)nationale handel kunnen de producten verspreid worden over een groot gebied. Worden besmette producten bevroren verhandeld, zoals frambozen of kokkels, dan kunnen uitbraken ook over meerdere jaren verspreid plaatsvinden. Meerdere uitbraken van buikgriep als gevolg van consumptie van deze besmette producten zijn dan moeilijk aan elkaar te relateren. Dit zijn de zogenaamde diffuse uitbraken. Met moleculair biologische technieken en databases kunnen soms verschillende diffuse uitbraken wel aan elkaar gerelateerd worden. Besmetting tijdens bereiding Besmetting aan het einde van de voedselproductieketen, bijvoorbeeld door personeel in de keuken van een restaurant, gaat meestal gepaard met besmetting met ‘slechts’ één virustype, waarbij ziekteverschijnselen binnen een groep personen vaak snel terug te herleiden zijn tot dezelfde (locale) puntbesmetting. Ziekte door consumptie van voedsel dat besmet is aan het einde van de keten kan voedsel betreffen uit allerlei productgroepen zolang die maar handmatig bewerkt worden en voor consumptie niet meer afdoende verhit zijn, zoals bakkerswaren, vleeswaren, belegde broodjes, en diverse handgesneden salades. Overleving van norovirus op voedsel Norovirussen zijn zeer omgevingsstabiel. Dit betekent dat ze langdurig infectieus blijven, vaak langer dan de houdbaarheidsdatum van de producten zelf, onafhankelijk van het gegeven of de producten gekoeld, bevroren of gezuurd bewaard worden. Afdoende verhitting leidt wel tot reductie van het aantal viruspartikels. Industrieel wordt bijvoorbeeld voor schelpdieren 1,5 minuut bij 90°C aangehouden (Anony mous, 1993). In het onderzoek naar virusbesmet voedsel zijn daarom langdurig gekookte aardappelen of rijst geen geschikte producten voor analyse op de aanwezigheid van norovirus, maar restanten van salami gebruikt voor het beleggen van broodjes, handgesneden salades, ingevroren zacht fruit of (rauwe) oesters wel. Bronopsporing na meldingen van buikgriep Brononderzoek door de VWA n.a.v. potentieel voedsel-gerelateerde ziekteverschijnselen start met een melding bij de VWA meldkamer (0800-0488) gemaakt door de direct betrokkene (consument), de GGD of een medicus, zoals een huisarts. Dit geldt voor zowel microbiële voedsel-infecties of -vergiftigingen als ziekteverschijnselen na een chemische verontreiniging. Na melding, wordt de melding doorgezet naar één van de vijf regionale VWA
Pagina 5 van 23
diensten, die zorgdragen voor inspectie van de verdachte locatie en bemonstering van voedselproducten. Na toestemming van de klager, wordt de GGD in de betreffende regio op de hoogte gebracht, die ontlastingsonderzoek en interviews met de betrokkenen coördineert. Bij grotere uitbraken (≥6 personen) en/of ernstige ziekte of ziekenhuisopname wordt de regionale GGD altijd op de hoogte gebracht. In alle gevallen wordt ook het VWA Expertise centrum voor voedselinfectie/vergiftigingen geïnformeerd. Dit centrum kan benaderd worden voor informatie maar het kan ook sturend optreden. Deze procedures zijn vastgelegd in de richtlijn VWA ALG05-WV004. Figuur 1 Relatie tussen VWA, GGD en RIVM-LIS
0800-0488
VWA : Meldkamer
VWA Expertisecentrum
Uitbraken > 5 personen
VWA: Regionale teams
GGD feces samples & interviews
Routine labs
bacteriële pathogenen.
RIVM
norovirus
voedsel samples & inspectie
Voedsel analyse VWA lab(s)
norovirus & bacteriële pathogenen.
Epidemiologisch onderzoek door de GGD Bij epidemiologisch onderzoek kan, om te bepalen of een virale verwekker de waarschijnlijke veroorzaker is van een uitbraak van buikgriep in een groep individuen, gewerkt worden met de door Kaplan opgestelde criteria. Deze criteria houden in: 1) een gemiddelde (of mediane) ziekteduur van 12 tot 60 uur, 2) een gemiddelde (of mediane) incubatietijd tussen de 24 en 48 uur, 3) meer dan 50% van de groep heeft klachten van overgeven en diarree, en 4) er is geen sprake van een bacteriële ziekteverwekker van buikgriep. De criteria zijn specifiek, maar niet erg gevoelig, waardoor meldingen van buikgriep die niet voldoen aan deze criteria nog steeds een virale verwekker kunnen hebben. Daarnaast zijn ze alleen toepasbaar als de uitbraak zo goed als voorbij is, terwijl juist aan het begin van de uitbraak snel gehandeld moet worden om ontlastingmonsters en/of voedselrestanten en/of omgevingsmonsters voor analyse veilig te stellen. Laboratorium diagnostiek ontlastingsmonsters Laboratorium diagnostiek naar de aanwezigheid van norovirus in ontlastingsmonsters wordt uitgevoerd met moleculair biologische methoden, voorheen met klassieke reversetranscripase- polymerase chain reactie (RT-PCR), maar tegenwoordig met real-time RTPCR. Ontlastingsmonsters worden meestal op het RIVM-LIS onderzocht en getypeerd, of in enkele gevallen ook in streeklaboratoria middels ELISA’s en/of RT-PCR technieken. Voor een betrouwbare diagnostiek moeten ontlastingsmonsters binnen een week na optreden van de ziekteverschijnselen verkregen worden vanwege de afname van de hoeveelheid virusdeeltjes in de ontlasting na herstel.
Pagina 6 van 23
Instellen inspectie door de VWA en aanscherping selectiecriteria Bij de aanname van de melding zijn een aantal vragen essentieel om het onderzoek in de goede richting te sturen. Belangrijk is om te weten welke producten gegeten zijn, of deze alleen of in gezelschap gegeten zijn, hoeveel personen ziek zijn geworden, na welk tijdsperiode en met welke klachten. Wanneer het gezelschap meerdere maaltijden samen heeft gebruikt moet nagegaan worden of de geïndiceerde maaltijd wel de enige verdachte maaltijd is. Om transmissie via persoon-op-persoon te kunnen onderscheiden van transmissie via voedsel is de vraag of er voor aanvang of tijdens de maaltijd bij het gezelschap al mensen waren die klachten hadden belangrijk. Antwoorden die wijzen dat het gaat om een o buikgriep zijn klinische symptomen van (waterdunne) diarree en of (projectiel) braken, mogelijk gepaard gaand met buikpijn, misselijkheid en geringe koorts. o voedsel- (bereider)gerelateerde melding zijn dat meerdere mensen met vergelijkbare incubatietijd ziek worden van dezelfde producten/maaltijd, zonder dat vooraf al mensen ziek waren uit de groep. Wanneer personeelsleden of hun directe huisgenoten (kinderen) een recente buikgriep (< 7dagen) hebben meegemaakt wijst dat in de richting van een voedselbereider-gerelateerde-melding. o virale infectie is de periode van tenminste 12 uur tot 72 uur (gemiddeld 24-30 uur) tussen de bewuste maaltijd en het optreden van de ziekteverschijnselen. Verder zijn secundaire infecties, bij andere personen dan uit de groep, een aanwijzing dat het gaat om een overdraagbare (virale) ziekteverwekker.
Gastroenteritis ?
Diarree en/of overgeven?
Ja
Voedsel-(bereider) gerelateerd ?
Personen ± gelijktijdig ziek na consumptie van gezamenlijke maaltijd ?
Nee, geen voedselmonsters voor NoV onderzoek nemen Informeer óók of er al zieken (in keuken of getroffen groep) waren voor begin van de uitbraak?
Nee, geen voedselmonsters voor NoV onderzoek nemen, waarschijnlijk uitbraak van persoon-tot-persoon of besmetting niet via één voedselbron
Ja
Incubatietijd ?
Per maaltijd: tijd tot ziekte 12-48 h?
Ja
Bereidingswijze ?
bij consumptie schelpdieren kan deze tijd korter zijn !!! Nee, deze maaltijden niet beschouwen als bron
Geconsumeerde producten waren schelpdieren, of onverhit groenten, fruit, water, of na bereiding met de hand bewerkt, nogmaals opgewarmd of open gepresenteerd op of in toonbank/vitrine?
GGD inschakelen om Ja, bemonsteren voor virusonderzoek fecesmonsters te verzamelen voor norovirus detectie als deelmonster en bevroren opsturen Veegmonsters nemen en gekoeld opsturen (RIVM-LIS)
Nee, geen verhitte producten bemonsteren; NB: uitzondering schelpdieren altijd bemonsteren
Figuur 2 Beslisboom
Pagina 7 van 23
Producten die relevant zijn voor bemonstering, liefst als restant, zijn items met een verhoogd risico tijdens de primaire productie zoals oesters of mosselen, van dezelfde batch of tenminste uit hetzelfde kweekgebied, zacht fruit (evt. bevroren), of verse bladgroenten, maar ook alle producten die na bereiding/verhitting nog manueel zijn bewerkt en/of gepresenteerd in vitrine (beenham, diverse salades). Ten behoeve van het brononderzoek naar virale infecties in voedsel is een beslisboom opgesteld (Boxman et al., 2004), welke later ook in een tabel internationaal is gepubliceerd (Boxman et al., 2009a). In deze beslisboom zijn bovenstaande criteria opgenomen, op basis waarvan een weloverwogen beslissing genomen kan worden om de melding of monsters wel of niet in behandeling te nemen voor norovirus onderzoek (Figuur 2). De beslisboom leidde tot een sterke vermindering van bemonstering van niet relevante monsters en was daardoor kostenbesparend. Na invoering van de beslisboom werden juist meer relevante producten bemonsterd waardoor de kans op detectie van norovirus toenam.
Virusdetectie in voedsel Een virale besmetting van voedsel leidt niet tot bederf, is niet organoleptisch merkbaar en zal daarom aangetoond moeten worden. Meerdere aspecten bemoeilijken de detectie van norovirus in voedsel. In de eerste plaats moet de techniek in staat zijn heel kleine hoeveelheden virusdeeltjes(10-100) aan te tonen in voedsel omdat deze hoeveelheid al tot ziekte kan leiden. Omdat virussen zich niet buiten de gastheer (de mens) vermeerderen zal het aantal virusdeeltjes op voedsel niet toenemen. Het aantal virusdeeltjes op voedsel is duizenden malen lager dan het aantal virusdeeltjes wat zich in een klinisch monster bevindt. Om deze reden moeten virussen eerst geëxtraheerd worden uit het voedsel. Dit virusextract wordt afhankelijk van het type voedsel onderworpen aan concentratie technieken en/of directe nucleïnezuur extractie om het genetisch materiaal van de virussen te isoleren. Het genomisch RNA kan daarna gedetecteerd worden met moleculair biologische technieken. Een probleem is dat tijdens de virusextractie substanties uit het voedsel kunnen worden mee-geïsoleerd die remmend werken op de detectie van het virale RNA. Daarnaast hangt de uitkomst van de virusdetectie af of er voedselrestanten aanwezig zijn voor analyse. De virusbesmetting van het voedsel kan ongelijk verdeeld zijn over het oppervlak. Verder is het tot op heden niet gelukt norovirus in vitro te kweken waardoor niet bepaald kan worden of het geïsoleerde virus infectieus is. De huidige analysemethoden voor virusonderzoek bij de VWA zijn sedert 2003 tot heden stapsgewijs met voortschrijdend inzicht ontwikkeld (Tabel 1) en worden hieronder kort beschreven. Samenwerking met andere internationale laboratoria vertegenwoordigd in de Taskgroep CEN/WG6/TAG4 ‘Detection of viruses in food’ heeft hieraan bijgedragen.
Productgroep afhankelijke virusextractie Bij aanvang van het bronopsporingsonderzoek in 2003 was slechts één protocol voor de extractie en detectie van virus in voedsel aanwezig, te weten die voor norovirus in schelpdieren. Voor andere typen voedsel waren, ook internationaal, nauwelijks protocollen aanwezig om virus uit voedsel te extraheren. Er is voor de extractie van virus van het oppervlak van zacht fruit of bladgroenten of van het oppervlak van restanten vleeswaren zoals salami en ham een andere aanpak nodig dan voor de extractie van virus uit het weefsel van het maagdarmkanaal van een schelpdier. Daarom is begonnen met de producten in verschillende productgroepen in te delen (zie materiaal methoden), waarna per productgroep een virusextractie en concentratie protocol is ontwikkeld en (deels) gevalideerd. De verschillende productgroepen waarvoor op dit moment protocollen beschikbaar zijn, zijn schelpdieren, zacht fruit, bladgroenten, vette salades, vette vissoorten, deeg- of cakeachtige producten, vleeswaren/bereid vlees, vijgen en dadels.
Pagina 8 van 23
Extractiecontrole Om een indruk te krijgen van de extractie en detectie efficiëntie van de toegepaste methode is een extractiecontrole ingevoerd. Een extractiecontrole is een virus, verwant aan norovirus, dat vooraf aan het monster wordt toegevoegd. Het monster doorloopt de volledige analyse, waarna het toegevoegde virus aantoonbaar moet zijn op een vooraf vastgesteld niveau (terugvinding). Wanneer dit niet het geval is, dan moet geconcludeerd worden dat de toegepaste methode op het betreffende monster waarschijnlijk ook niet efficiënt genoeg was om norovirus betrouwbaar aan te kunnen tonen. Bij een goede terugvinding van het toegevoegde virus kan meer waarde worden gehecht aan een negatief test resultaat voor norovirus. Op het laboratorium van de VWA is als extractie controle gekozen voor toevoeging van het feline calicivirus, (FCV), een animaal virus dat verwant is aan het humane norovirus. Uitkomsten van de FCV terugvinding zijn aanleiding om extractie protocollen aan te passen, zoals recentelijk voor de extractie van norovirus uit restanten vette vis, zoals paling en haring, die frequent geserveerd worden op recepties.
Virusdetectie Eenmaal geëxtraheerd uit voedsel, wordt het virusextract onderworpen aan een DNA/RNA nucleïnezuur extractie. Dit nucleïnezuur extract wordt gebruikt als input van moleculaire detectie technieken. In 2003 werd hiervoor nog gebruik gemaakt van een zogenaamde klassieke nested reverse-transcriptase-polymerase-chainreacktie (RT-PCR). Bij RT-PCR wordt het RNA eerst omgezet in cDNA, vervolgens wordt tijdens de eerste amplificatie PCR een klein gedeelte van het norovirus genoom vermeerderd (amplificatie). Bij de nested PCR, wordt dit amplificatieproduct nog verder vermeerderd, waarna het resultaat zichtbaar gemaakt kan worden m.b.v. gel-elektroforese. De analyse wordt afgerond met een sequentie analyse, waarmee het amplificatieproduct op nucleotideniveau afgelezen kan worden en daarmee bevestigd en getypeerd. In eerste instantie konden de verkregen sequenties van norovirus geïsoleerd uit voedsel niet vergeleken worden met sequenties afkomstig uit de routine humane diagnostiek op het RIVM omdat de gebruikte methoden gericht waren op verschillende delen van het humane norovirus. Met de ontwikkeling van een nested RT-PCR (Boxman et al., 2006) gericht op het deel van het genoom dat gebruikt wordt bij de humane diagnostiek (Figuur 3) werd dit wel mogelijk. Een oester-gerelateerde melding was het eerste voorbeeld (Boxman et al., 2006).
NVII (GGII)
NVI (GGI) JV12
JV13
4878
4552
G1
JV13I
JV12
JV13
4279
JV12
4605
NoroII-R
Figuur 3 Nested PCRs NVI en NVII Nested PCRs NVI en NVII voor de detectie van norovirus genorgroep GGI en GGII ontwikkeld op het amplimeer van de JV12/JV13 RT-PCR welke gebruikt werd voor humane diagnostiek anno 2004. De arcering geeft aan welk gedeelte van de amplimeren gebruikt kan worden voor de vergelijking van de sequenties (Boxman et al., 2006).
Na de opkomst van de real-time PCR machines werd in 2004 overgestapt van klassieke PCR op nested real time PCR methoden (Boxman et al., 2009a). Voordelen van real time
Pagina 9 van 23
PCR testen zijn o.a. de hoge snelheid, de grote reproduceerbaarheid, een verhoging van specificiteit van de test doordat een derde specifiek stukje DNA (probe) gebruikt wordt, en een kleinere kans op contaminatie doordat amplificatieproducten niet op gel geanalyseerd hoeven te worden. Met het op de markt komen van betere enzymen, is in 2007 geleidelijk overgestapt van de nested real time PCR naar een two-step RT-PCR. Daarbij wordt het RNA eerst omgezet in cDNA (RT-reactie), waarna een enkelvoudige real time amplificatie volgt. Met deze overstap werd de detectie van positieve controles bij een test kwantificeerbaar. Daardoor kon de efficiëntie van analyses onderling vergeleken worden aan de hand van Shewart controle kaarten. Met deze aanpassingen werd accreditatie verkregen voor de bepaling van norovirus genogroep I en II en hepatitis A virus in schelpdieren in september 2008 (L-235).
Oppervlakte bemonstering Na inventarisatie van de ingezonden producten voor virusonderzoek bleek dat de bekende ‘risicoproducten’, zoals schelpdieren of zacht fruit, nauwelijks voorkwamen. Dit leidde tot de veronderstelling dat niet deze risicoproducten maar geïnfecteerde personen een belangrijke rol spelen bij de transmissie van het virus op de onderzochte locatie. Deze veronderstelling werd gesterkt doordat personeelsleden soms achteraf aangaven recent klachten van buikgriep te hebben gehad. Na onvoldoende of onjuiste persoonlijke hygiëne, kan norovirus namelijk gemakkelijk via de handen van een geïnfecteerd persoon overgebracht worden op zowel voedsel als op oppervlakten in voedselbereidingsruimten. Bekend is ook dat norovirus zeer omgevingsstabiel is op diverse oppervlakten. In afwezigheid van voedselrestanten, zou daarom alsnog met veegproeven de aanwezigheid van norovirus in de omgeving van de voedselbereider vastgesteld kunnen worden. Om deze veronderstelling te toetsen werd eerst op het laboratorium een methode opgezet om norovirus op veegdoekjes aan te tonen. Eind 2005 is begonnen met de inzet van veegdoekjes bij de bemonstering van voedselbereidingsruimten.
Figuur 4. Bemonstering met Sodibox veegdoekjes Diffchamb Biocontrol. Na elke monstername worden de handschoenen uitgetrokken vóór het beschrijven van de etiketten .
Met behulp van een rondgestuurde diapresentatie werden de controleurs van de VWA landelijk geïnstrueerd hoe en in welke volgorde, van welke oppervlakten in de keuken en bij welk type meldingen er veegdoekmonsters genomen moesten worden. Daarnaast werd gevraagd om veegdoekmonsters van het (personeels-)toilet te nemen, om daarmee een aanwijzing te krijgen van de recente aanwezigheid van norovirus-verspreidende personen. Wordt norovirus op veegdoekjes uit de keuken aangetoond, dan duidt dit op de aanwezigheid van een virus-verspreidend persoon in deze ruimte, en mogelijk daarmee dus een relatie met de gemelde voedselinfectie. Wordt norovirus op een doekje van de toiletruimte aangetoond, dan hoeft dit niet direct te duiden op oorzakelijk verband met de voedselinfectie, bijvoorbeeld omdat de toiletruimte ook besmet kan zijn door een klant. Ter voorkoming van eventuele kruisbesmetting tussen de doekjes, werd gevraagd te beginnen in de keuken, zoals koelkast grepen, heften van messen, handgrepen van snijmachines, peperen zoutvaatjes, en daarna pas met de bemonstering van het doortrekmechanisme en de boven en onderkant van de toiletbril op het (personeels-) toilet. Bij elk veegdoekje werd een
Pagina 10 van 23
nieuw paar steriele handschoenen aangetrokken. Bij de invoering van de veegdoekjes is benadrukt dat bemonstering van relevante producten belangrijk blijft, omdat de detectie van norovirus in het voedsel zelf de meest directe aanwijzing oplevert over de oorzakelijke rol van norovirus. In geval dat voedsel besmet is geraakt tijdens de primaire productie, is onderzoek aan voedsel zelfs essentieel.
Relatie met humane diagnostiek Bij meldingen van voedselinfecties hebben onderzoekers van de VWA een sterke interesse om data verkregen uit levensmiddelenonderzoek te vergelijken met data verkregen uit de humane diagnostiek, zowel voor bacteriële als virale verwekkers. Voor virale verwekkers is het daarvoor noodzakelijk sequentie analyse uit te voeren op de amplificatieproducten en de gevonden sequenties uit voedsel en/of omgevingsmonsters (VWA) en uit ontlastingmonsters (RIVM-LIS) te vergelijken. Overeenkomende sequenties in de context van de sequenties van de op dat moment heersende norovirus typen verschaffen informatie over de waarschijnlijkheid dat de (voedsel)infectie veroorzaakt is door norovirus in de voedselbereidingsruimten of voedsel. Deze waarschijnlijkheid wordt vergroot wanneer het gaat om unieke norovirus typen, of sequenties met unieke mutaties. Helaas zijn ontlastingsmonsters van patiënten of voedselbereiders en/of restanten uit de keuken niet altijd beschikbaar voor analyse.
Materiaal en methoden
Bemonstering en transport Direct na een melding van een mogelijk (voedsel)-gerelateerde buikgriep met verdenking op betrokkenheid van norovirus bij de VWA meldkamer werd een team van controleurs uit betreffende regio ingeschakeld. Daarop bezochten controleurs de betrokken locatie (restaurant, instelling etc.) voor inspectie en monstername. Monstername bestond uit nemen van relevante restanten van de verdachte producten, basisbestanddelen van deze producten of vergelijkbare producten maar van een andere bereidingsdatum. Vanaf oktober 2005 zijn ook veegdoekmonsters van oppervlakten (1-10 stuks per melding) genomen. Alle voedselproducten werden bevroren aangeleverd in Zutphen m.u.v. van verse sla-of salades en veegdoekmonsters die gekoeld werden vervoerd. Na aankomst, werden alle producten direct verwerkt, m.n. slaproducten, of bewaard bij de vervoerstemperatuur tot analyse.
Selectie en analyse. Selectie: Op grond van de klachtbeschrijving en de criteria benoemd in de beslisboom (Figuur 2), werden producten geselecteerd voor onderzoek op de aanwezigheid van norovirus. Virus extractie: Elk geselecteerd monster werd opgewerkt volgens de, op dat moment meest geschikte, productafhankelijke extractie methode (VWA SOP WV510v2005 en MOL01OT007, Boxman et al, 2007, Boxman et al., 2009a). RNA-extractie: RNA isolatie werd uitgevoerd m.b.v. normale -of magnetische silica (Boom, et al, 1990, resp. VWA SOP MOL01-OT010) afhankelijk van de matrix van het te onderzoeken product. Detectie: Voor de detectie van norovirus RNA zijn achtereenvolgens de klassieke nested RTPCR (Boxman et al., 2006), de nested real time PCR (Boxman et al., 2009a) en de two-step real time RT-PCR (VWA SOPs VIR01-OT001/MOL01-OT021) gebruikt. Sequentie analyse: Een positieve uitslag, werd altijd gevolgd door sequentie analyse (Boxman et., 2006, Boxman et al., 2009a) voor genotypering.
Pagina 11 van 23
Linking Handmatig zijn meldingen en sequentie uitslagen zo mogelijk aan elkaar gerelateerd op basis van consumptiedatum, eerste ziektedag, locatie/setting en/of grootte van de groep m.b.v. de gescheiden databanken van de VWA (Meldkamersysteem) en RIVM-GGD (Osiris, FBVE).
Resultaten
Meldingen van voedsel-gerelateerde virusinfecties (2003- 2005) In de eerste maanden tot een jaar na het initiatief om voedsel(restanten) te gaan bemonsteren voor analyse op norovirus, werden veel monsters van zeer uiteenlopende aard opgestuurd. In de periode oktober 2003- augustus 2005 werden slechts vijf van de 200 onderzochte monsters (2,5%) afkomstig van vier van de 38 meldingen (11%) positief getest voor norovirus (Boxman et al., 2004; Boxman et al., 2007a; Boxman et al, 2007b). Deze producten hadden als overeenkomst dat het 1) restanten van de verdachte maaltijden waren, 2) dat het vaak om producten ging met een relatief gemakkelijke virusextractie en 3) dat de producten zeer waarschijnlijk besmet waren als eindproduct door een geïnfecteerd persoon. Voortschrijdend inzicht in het virale bronopsporingonderzoek, te weten de lage detectiescore bij een toch relatief grote laboratorium inspanning, het vaak ontbreken van bijbehorende ontlastingsmonsters, het ontbreken van passende extractie protocollen bij de ingezonden monsters en het moeilijke onderscheid tussen transmissie via persoon-op-persoon of via voedsel, leidde tot een andere aanpak. Deze bestond uit uitgebreidere informatievertrekking over norovirus aan medewerkers van de meldkamer, aan controleurs en hun teamleiders in de regio’s, naast de ingebruikname van de beslisboom, de virus extractiecontrole en de bemonstering van oppervlakten met veegdoekjes. Om deze reden worden de resultaten van de periode vanaf 2006 tot en met 2008 apart weergegeven (Tabel 2).
Meldingen van (voedsel-gerelateerde) norovirusinfecties (2006-2008) In de periode tussen van 2006 tot en met 2008 werden voor 82 meldingen monsters op aanwezigheid van norovirus onderzocht. De resultaten zijn per jaar weergegeven per melding (Tabel 2a) of per onderzocht aantal monsters (Tabel 2b).
Fecesmonsters Wanneer ontlastingsonderzoek bij patiënten uitgevoerd werd leidde dit vaak tot positieve resultaten per melding (80-100%) (Tabel 2a) of per monster (59-83%) (Tabel 2b). Voedselmonsters Het aantal meldingen waarbij norovirus kon worden aangetoond in voedselproducten verschilde sterk per jaar (6,7-50%). In 2006 en 2008 was dit percentage hoger dan in 2007. Dit lijkt afhankelijk van het aantal oester-gerelateerde meldingen, en daarmee samenhangend het aantal positief geteste oestermonsters. In 2006 en 2008 werd norovirus aangetoond bij 15 van de 19 oestermonsters (79%) (Tabel 4). In 2007 waren er geen meldingen die geassocieerd waren met de consumptie van oesters en zijn er dus ook geen oesters gerelateerd aan meldingen onderzocht. Alle meldingen waarbij norovirus direct kon worden aangetoond in voedsel in deze periode (n=8), maar ook in voorafgaande periode (n=4), zijn verder uitgewerkt in Tabellen 3 en 4 en worden hieronder per type voedsel besproken. Vlees- en bakkerswaren Van de twaalf meldingen waarbij norovirus direct werd aangetoond in voedsel, werd zevenmaal norovirus aangetoond in vlees en (banket-) bakkersproducten die zeer
Pagina 12 van 23
waarschijnlijk door contact met een geïnfecteerd persoon zijn besmet (Tabel 3). De tijdsperiode tussen consumptie van deze producten en de eerste ziekte verschijnselen was minimaal 12 uur, maar was vaker tussen de 24 en 30 uur, overeenkomstig de beslisboom (Zie Figuur 2). De ziekteverschijnselen werden gezien bij zo’n 50% van de blootgestelde personen, wat overeenkomstig is met de Kaplan kriteria voor een norovirus uitbraak. Vijf van deze zeven meldingen vonden plaats in de wintermaanden november tot en met februari. Bij 2 van de meldingen werd een norovirus gevonden dat relatief vaak voorkwam in de populatie in de periode rond de melding, nml. GGII.4.2004 en GGII.4.2006b. Beiden waren nieuwe varianten van het GGII.4 genotype die opkwamen in 2004 respectievelijk 2006.
Oesters Bij 5 van de twaalf meldingen (42%) waarbij norovirus direct werd aangetoond in voedsel, werd norovirus aangetoond in oesters (20/24, 83%) (Tabel 4). Bij bijna alle oestergerelateerde meldingen werden de oesters geconsumeerd in een restaurant gelegen in de randstad. Meestal betrof het zeer kleine gezelschappen (<8 personen), waarbinnen wel een hoog percentage zieken gemeld werd, maar waarbij ontlastingsonderzoek nauwelijks is uitgevoerd. In de onderzochte oesters konden vaak meerdere norovirustypen worden aangetoond. Bij 2 meldingen betrof het o.a. eenzelfde type als was aangetoond in de ontlastingsmonsters van de patiënten (Boxman et al., 2009a). In 2006 en 2008 werden naar aanleiding van deze gegevens internationale rapid alerts (RASFF) opgesteld, RASFF 20060211- en RASFF 2008-0086 en werden specifieke partijen oesters van de Nederlandse markt geweerd. Bij één melding in 2007 was de tijdsperiode tussen consumptie en eerste ziekte verschijnselen (diarree) maar 3 uur, zodat niet aan een norovirus infectie werd gedacht maar aan een vergiftiging met de chemische stof ‘diurrhetic shellfish poisoning’ toxine (DSP). Met onderzoek op het chemisch laboratorium in Zutphen werd DSP aangetoond in het verdachte monster. Veegdoekjes Naast voedselproducten zijn er vanaf 2006 ook veegdoekjes genomen van oppervlakten geanalyseerd op de aanwezigheid van norovirus. De aanvoer van de veegdoekjes was in de jaren 2006 tot en met 2008 relatief constant, tussen de 22-27 meldingen per jaar (Tabel 2a), net als het percentage meldingen waarbij norovirus werd gevonden m.b.v. veegdoekjes (5268%), als het percentage positieve oppervlakte monsters (alle locaties samen, Tabel 2b) (3742%) en het percentage positieve oppervlakte monsters bemonsterd in de keuken apart (2830%). Het percentage van de positieve oppervlaktemonsters genomen in de toilet omgeving lag beduidend hoger dan dat van de doekjes genomen in de keuken, 54/102 (64%) vs. 59/201 (29%) zoals onlangs ook al beschreven is (Boxman et al., 2009a).
Veegdoekjes van besmette handen De resultaten behaald met de veegdoekjes wijzen op een grote rol van de geïnfecteerde – verspreidende voedselbereider bij het ontstaan van het merendeel van de gemelde voedselgerelateerde virale infecties. Dit werd op zeer directe wijze aangetoond door middel van oppervlaktemonsters genomen van de handen van een voedselbereider, die, nog maar net hersteld van buikgriep, toch het stokbrood aan te snijden was voor de gasten in het restaurant. De veegdoekjes waren positief voor een uniek norovirus type, overeenkomend met het type van de omgevingsmonsters en de ontlastingmonsters van de klagers (Boxman et al., 2009b). Niet voedsel-gerelateerde meldingen Op verzoek van verschillende regionale GGD instanties hebben controleurs VWA in 2006 en 2007 omgevingsmonsters genomen voor onderzoek naar de aanwezigheid van norovirus op cruiseschepen en in zorginstellingen.
Pagina 13 van 23
Cruiseschepen In april 2006 werd de VWA gevraagd om omgevingsonderzoek te verrichten op een cruiseschip op de Rijn dat vanuit Basel via Nederland naar België voer en al te maken had gehad met veel patiënten met buikgriep. Snel daarna volgden meer meldingen van zieken met buikgriep op diverse cruiseschepen, zowel nationaal als internationaal. Op verzoek is daarop in samenwerking met VWA onderzocht of deze boten een gezamenlijke (internationale) toeleverancier van voedsel hadden. Dit bleek niet het geval. Voor het omgevingsonderzoek werden in totaal 28 omgevingsmonsters genomen van oppervlakten in de cabine van zieke personen maar ook van oppervlakten in gemeenschappelijke ruimten op vier boten. Dit waren drie riviercruiseschepen (Rijn) en één internationale veerboot (Nederland-Engeland) (Tabel 5). Norovirus kon op een groot aantal oppervlakten worden aangetoond, waarbij het gevonden type meestal overeenkwam met de typen en sequenties gevonden in de ontlastingsmonsters. Het bleek hier te gaan om twee nieuwe (uitbraak)varianten, GGII4.2006a en GGII.4.2006b. Resultaten van deze monsters en monsters genomen op andere Europese cruiseschepen werden onlangs gepubliceerd (Verhoef, et al., 2008a; Verhoef et al., 2008b). Zorginstellingen In 2007 werd omgevingsonderzoek verricht bij instellingen in het Zuid-Westen van het land vanwege buikgriep onder bewoners en personeel van instellingen. Ondanks dat bij twee van de drie instellingen direct duidelijk was uit de epidemiologische gegevens dat het niet om een voedsel-gerelateerde uitbraak handelde, zijn op verzoek de omgevingsmonsters onderzocht. Bij de derde uitbraak, buiten het winterseizoen, was er wel initiële verdenking op producten uit een sapautomaat. Uit nader onderzoek bleek het bij alle drie de meldingen om persoonop-persoon transmissie van norovirus te gaan en kon norovirus op diverse locaties in de instellingen aangetoond worden (Tabel 6), zoals op 95% van de monsters genomen in gemeenschappelijke ruimten of de zusterposten en 82% van de monsters van sanitaire voorzieningen. Opvallend was dat norovirus aantoonbaar bleef gedurende een lange periode, ook nadat de meeste patiënten alweer hersteld waren en de schoonmaak en desinfecteer procedures steeds beter werden uitgevoerd (Boxman et al., 2009c). De constatering dat de sterkte van het PCR signaal van de kwantitatieve two-step RT-PCR van veegdoekjes genomen na schoonmaak soms weer toenam in de tijd, was indicatief voor herbesmetting van deze oppervlakten in de tijd door nieuwe zieken. Bij alle drie de instellingen was een GGII.4 type betrokken, eenmaal een oudere variant uit 2001 en tweemaal de twee relatief nieuwe varianten uit 2006. Vergelijking van norovirus sequenties Wanneer na sequentieanalyse van de norovirustypen in het voedsel, in de ontlasting van de geïnfecteerde voedselbereider of klagers, èn omgevingsmonsters een unieke sequentie wordt gevonden, dan is de waarschijnlijkheid zeer groot dat het betreffende norovirus de veroorzaker was van de gemelde ziekteverschijnselen. Vaker wordt een veel voorkomend uitbraaktype gevonden. Dan is voor de juiste interpretatie van de resultaten kennis nodig van de heersende norovirus typen in de populatie en de epidemiologie van de uitbraak. Toch is het in de afgelopen periode drie maal gelukt norovirus sequenties uit voedsel- en klinische monsters te matchen en ook drie maal gelukt norovirus sequenties uit voedsel- met omgevingsmonsters te matchen (Tabel 3). Het matchen schelpdiermonsters met ontlastingsmonsters was ingewikkelder omdat deze vaak besmet zijn met meerdere norovirus typen en er ook omdat minder vaak ontlastingsmonsters beschikbaar zijn (Tabel 4).
Discussie De afgelopen 5 jaar is geïnvesteerd in gerichte bemonstering door de VWA na voedselgerelateerde infecties van buikgriep en in laboratorium technieken om te onderzoeken in hoeverre norovirus een rol speelt bij voedselinfecties in Nederland. In dit rapport komt naar
Pagina 14 van 23
voren dat norovirus zeer frequent aanwezig is op oppervlakten in voedselbereidingsruimten en nog vaker op oppervlakten in sanitaire voorzieningen in een horecagelegenheid na melding van een voedselinfectie. Het verband tussen deze bevindingen en de gemelde klachten wordt versterkt door verschillende aanwijzingen. Deze aanwijzingen zijn bijvoorbeeld voedselbereiders die aangeven recent een episode van buikgriep te hebben doorgemaakt, òf aangeven directe familieleden met buikgriep (verzorgd) te hebben. Andere aanwijzingen zijn wanneer norovirus direct in het voedsel kan worden aangetoond, zoals 12 maal het geval was in deze onderzoeksperiode. De beste aanwijzing is de vondst van dezelfde, liefst unieke, norovirus sequentie in zowel ontlasting van patiënten en/of voedselbereiders als omgevingsmonsters en/of voedselproducten. Het merendeel van de onderzochte meldingen waarbij norovirus werd aangetoond in deze studie, lijkt te wijten aan verspreiding van norovirus door geïnfecteerde personen, zoals personeel werkend als voedselbereider, in de bediening of door gasten van de gelegenheid (Boxman et al., 2009a). In één van de cases was norovirus zelfs direct aantoonbaar op de handen van de barman die het stokbrood sneed voor de gasten (Boxman et al., 2009b). Afwezigheid van personeel tijdens buikgriep èn tijdens de twee daaropvolgende symptoomloze dagen (48 uur), gevolgd door een goede persoonlijke hygiëne na toiletgebruik, zoals handwashygiëne met zeep, stromend water en papieren afdroogdoekjes, is essentieel om het aantal virusdeeltjes op handen te verminderen. In Warenwetbesluit hygiëne van levensmiddelen staat dat personen met symptomen van diarree niet in contact mogen komen met voedsel of zelfs maar aanwezig mogen zijn in voedselbereidingsruimten1. Daarin wordt echter niet beschreven dat een herstelperiode van tenminste 48 uur na verdwijnen van de symptomen van buikgriep met daarnaast strikte toepassing van de handhygiëne, nodig is om de kans op virustransmissie te verminderen. Een dergelijke aanwijzing is wel opgenomen in de code van het Landelijk Coördinatiestructuur Infectieziekten2. Deze maatregelen zijn nodig omdat zelfs immunocompetente personen nog gedurende 3 weken virusdeeltjes kunnen blijven uitscheiden na een norovirusinfectie. Daarnaast kunnen ook a-symptomatische infecties voorkomen, waarbij er geen symptomen zijn maar wel virus wordt uitgescheiden. Personen in de voedselbereiding met een zieke collega met symptomen van buikgriep zouden daarom bedacht moeten zijn dat zijzelf mogelijk symptoomloos virus kunnen uitscheiden en moeten extra letten op strikte handhygiëne. Maar natuurlijk moet altijd goede handhygiëne betracht worden. Informatie over het bestaan van norovirus, de besmettelijkheid van norovirus en over methoden van desinfectie na contaminatie zijn nu onbekend bij de meeste ondernemers in de horeca, zoals beschreven staat in het VWA rapport: “Prevalentie en bekendheid van norovirus (NoV) in de horeca, 2008-2009”. Dit is niet alleen zo in Nederland maar ook in andere landen. Om deze reden is onlangs een conceptdocument voor de Codex Alimentarius getiteld, “Guidelines on the application of general principles of food hygiene to the control of viruses in food” mede door de VWA uitgewerkt in een internationale ad-hoc advies groep. Er zijn maar beperkte mogelijkheden om op grond van de huidige 1
-
Het in de handel brengen van levensmiddelen die onveilig zijn is in strijd met het bepaalde in artikel 14, eerste lid, gelet op het bepaalde in artikel 14, tweede lid van Verordening (EG) Nr. 178/2002, hetgeen een overtreding is van artikel 2, tiende lid, van het Warenwetbesluit Bereiding en behandeling van levensmiddelen. Als artikelen, uitrustingsstukken en apparatuur verontreinigd zijn of bedrijfsruimten niet schoon zijn, is dat in strijd met artikel 4, tweede lid, juncto bijlage II, hoofdstuk V, punt 1, onder a, van de Verordening (EG) 852/2004, hetgeen een overtreding is van artikel 2, eerste lid, van het Warenwetbesluit hygiëne van levensmiddelen of artikel 4, tweede lid, juncto bijlage II, hoofdstuk I, punt 1, van de Verordening (EG) 852/2004, hetgeen een overtreding is van artikel 2, eerste lid, van het Warenwetbesluit hygiëne van levensmiddelen. Als aangetoond kan worden dat met of zonder medeweten en instemming van de exploitant van een levensmiddelenbedrijf een ziek (b.v. diarree) personeelslid het verdachte voedsel gehanteerd heeft of aanwezig geweest is in een ruimte waar dit voedsel werd gehanteerd, is er sprake van een overtreding. Hiermee wordt gehandeld in strijd met het bepaalde in artikel 4, tweede lid, juncto bijlage II, hoofdstuk VIII, onder 2, van de Verordening (EG) 852/2004, hetgeen een overtreding is van artikel 2, eerste lid, van het Warenwetbesluit hygiëne van levensmiddelen.
2
http://www.rivm.nl/cib/infectieziekten-A-Z/infectieziekten/calicivirus/index.jsp http://www.rivm.nl/cib/infectieziekten-A-Z/infectieziekten/calicivirus/index.jsp#index_12
Pagina 15 van 23
Warenwetbesluit artikel 14 of artikel 41 handhavend op te treden vanwege de mogelijkheid dat contaminatie van oppervlakten of voedsel met norovirus het gevolg is van asymptomatische uitscheiding. Het is daarom aan te bevelen de informatie uit het Codex concept document zo spoedig mogelijk over te nemen in de diverse nationale hygiënecodes ter bevordering van de kennis over norovirus in de horeca en andere levensmiddelen producerende bedrijven om de ziektelast a.g.v. norovirusbesmetting na consumptie van voedsel te verminderen. De oester-gerelateerde voedselinfecties vormden maar een klein gedeelte van het totaal aan onderzochte meldingen in de afgelopen onderzoeksperiode. Bij alle oester-gerelateerde meldingen kon norovirus aangetoond worden in de verdachte batches, en/of batches van een latere datum. Er is n.a.v. de resultaten tweemaal een Internationale Rapid Alert (RASFF) opgesteld. Ook zijn partijen oesters op last van de VWA vernietigd of tegengehouden aan de grens. De huidige werkwijze van de VWA is dat een RASFF voor internationale berichtgeving alleen wordt opgemaakt, indien norovirus wordt aangetoond in oesters die zijn bemonsterd in relatie tot verschijnselen van buikgriep èn in oesters die zijn bemonsterd van de meest recent verkrijgbare batch. Op grond van artikel 14, eerste lid, gelet op het bepaalde in artikel 14, tweede lid van Verordening (EG) Nr. 178/20022 kan dan een boeterapport worden opgemaakt richting de verstrekker van de geconsumeerde oesters, het restaurant of de importeur. Het is aannemelijk dat er onderrapportage is van ziekteverschijnselen na consumptie van oesters in kleine gezelschappen in de horeca of in huishoudens thuis. Naast norovirus, is hepatitis A virus (HAV) een voedsel-overdraagbaar virus. HAV wordt net als norovirus ook fecaal-oraal overgedragen, direct van person-op-persoon, of indirect via besmette oppervlakten, water of voedsel en is zeer omgevingsstabiel. De incubatietijd van HAV tot het optreden van de verschijnselen van geelzucht, is echter veel langer dan van norovirus, namelijk tenminste 2 weken, waardoor het vaststellen van een relatie met de consumptie van een bepaald type voedsel moeilijker is dan voor norovirus. Het ziektebeeld duurt langer dan voor norovirus, met ernstiger klachten vooral in de Westerse wereld waar men nauwelijks meer immuun is tegen dit HAV. De belangstelling voor de mogelijkheid dat een HAV infectie veroorzaakt kan worden door het eten van HAV gecontamineerd voedsel is groeiende, wat blijkt uit de opname van vragen in de GGD vragenlijst naar consumptie van risicoproducten. Ook bij de meldkamer van de VWA zijn in de afgelopen jaren enkele meldingen in deze richting gedaan. Daarbij lag de verdenking op de consumptie van (gekookte) mosselen (viermaal), dadels (eenmaal) of aardbeienjam meegenomen uit Turkije (eenmaal). Tot nu toe kon HAV nog niet worden aangetoond bij deze meldingen. Wel werden bevroren kokkels uit Peru, geïmporteerd via Spanje, in Nederland uit de handel gehaald na een RASFF 2008-1979. Deze kokkels werden wel positief getest op HAV. De sequentie van het geisoleerde RNA uit de kokkels vertoonde grote gelijkenis (190/192 nt) met die van een HAV patiënt die in een vragenlijst aangegeven had schelpdieren te hebben gegeten.
Eindconclusie Het is mogelijk gebleken norovirus aan te tonen in restanten van maaltijden die ervan verdacht werden de oorzaak te zijn van een uitbraak van buikgriep. Helaas zijn voedselrestanten vaak niet meer aanwezig voor onderzoek. Analyse van oppervlaktemonsters is een goed alternatief gebleken, mits uitslagen zorgvuldig geïnterpreteerd worden. In 40% van de meldingen van een voedselinfectie kon norovirus op oppervlaktemonsters in de voeselbereidingsruimten worden aangetoond. Concluderend kan gezegd worden dat de meeste voedsel-gerelateerde meldingen van virale buikgriep in Nederland geassocieerd waren met geïnfecteerde medewerkers in de keuken. Goede voorlichting van alle betrokkenen hoe te handelen bij optreden van buikgriep bij personeel betrokken bij de voedselbereiding voor derden is daarom zeer gewenst. Daarnaast blijven meldingen die geassocieerd zijn met producten die besmet zijn in de primaire sector, zoals oesters, belangrijk, omdat na onderzoek eventuele besmette batches nog uit de handel gehaald kunnen worden.
Pagina 16 van 23
Vervolgonderzoek Bronopsporing heeft inzicht gegeven hoe vaak geïnfecteerde personen een rol spelen bij de transmissie van norovirus na voedsel-gerelateerde virale infecties. Het is belangrijk om personen die werken aan voedselbereiding voor derden informatie te geven over de besmettelijkheid, transmissie en desinfectie van norovirus. In hoeverre deze personen daarvan nu al op de hoogte zijn en hoe vaak norovirus aantoonbaar is in voedselbereidingsruimten in de horeca in Nederland is onderzocht in 2008-2009. De resultaten zijn beschreven in VWA rapport: “Prevalentie en bekendheid van norovirus (NoV) in de horeca, 2008-2009” (Boxman et al.,2009d).
Pagina 17 van 23
Referenties Anonymous. Council Decision of 11th December 1992 approving certain heat treatments to inhibit the development of pathogenic micro-organisms in bivalve molluscs and marine gastropods (93/25/EEC). Official Journal European Communities. 16, 22-23. 1993. Anonymous. Viruses in Food: Scientific advice to support risk management activities, Expert Meeting report, WHO/FAO. Nr. 13. 2008. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 28:495-503, 1990. Boxman, I., te Loeke, N., Tilburg, J. Norovirus in voedsel geassocieerd met uitbraken van gastro-enteritis. Rapport Voedsel en Waren Autoriteit / Keuringsdienst van Waren Oost. OT04H006-2. September 2004. Boxman ILA, Tilburg JJHC, te Loeke NAJM, Vennema H, Jonker K, de Boer E, Koopmans M. Detection of noroviruses in shellfish in the Netherlands. International Journal of Food Microbiology. 108:391-396, 2006. Boxman ILA, Hägele, G, te Loeke, N. Onderzoek aan monsters n.a.v. norovirus-gerelateerde meldingen, September 2005-december 2006. Factsheet Voedsel en Waren Autoriteit. OT06C100, februari 2007a. Boxman ILA, Tilburg JJHC, te Loeke NAJM, Vennema H, de Boer E, Koopmans M. An efficient and rapid method for recovery of norovirus from food associated with outbreaks of gastroenteritis. Journal of Food Protection. 70: 504-508, 2007b. Boxman, ILA, Dijkman, R, te Loeke, NAJM, Hägele, G, Tilburg, JJHC, Vennema, H., Koopmans, M. Environmental swabs as a tool in outbreak investigation, including outbreaks on cruise ships. Journal of Food Protection. 72:111-119, 2009a. Boxman, ILA, Dijkman, R, Verhoef, L, Maat, A, van Dijk G, Vennema, H, Koopmans, M, Norovirus on swabs taken from hands illustrate route of transmission, a case study. Journal of Food Protection, 72: 1753-1755, 2009b. Boxman, ILA, van Agteren, R, Hägele, G, te Loeke, N, Dijkman, R. Norovirus besmette contactoppervlakken. Veegmonsters voor het aantonen van norovirus in instellingen. Tijdschrift van Hygiëne en Infectiepreventie. 1:7-9, 2009c. Boxman, ILA, te Loeke, NAJM, Hagele , H, Dijkman, R. Prevalentie en bekendheid van norovirus (NoV) in de horeca, 2008-2009. Rapport Voedsel en Waren Autoriteit, OT0815I6/OT0915I6, Augustus, 2009d. Van de Kerkhof, H, te Loeke, N., Vennema, H., Boxman ILA. Wederom een taartje met een staartje. Infectieziekten Bulletin. 18: 201- 205, 2007. Van Dijk G, Maat ATJ, van den Bogaard N, te Loeke NAJM, Boxman ILA. Gastro-enteritis na nieuwjaarslunch. Infectieziekten Bulletin. 5: 176-177, 2006. Verhoef, L., Depoortere, E, Boxman, ILA, Duizer, E. et al. Emergence of new norovirus variants on spring cruise ships and prediction of winter epidemics., Emerging Infectious Diseases. 14:238-243, 2008a. Verhoef, L., Boxman, ILA, Duizer, E., Rutjes, SA, Vennema, H, Friesema, IH, de Roda Husman, AM., Koopmans, M, Multiple exposures during a norovirus outbreak on a rivercruise sailing through Europe 2006. Eurosurveillance. 13, 2008b Verhoef, L., Boxman, IL., Koopmans, M. Viruses transmitted through the food-chain: a review of latest developments. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources, No. 078, 15 pp. 2008c
Pagina 18 van 23
Tabellen
Tabel 1 Ontwikkelingen van de virale bronopsporing bij de VWA Jaar 2003 2004
2005 2006 2007
2008 2009
Verbeterpunten en/of ontwikkelingen Start brononderzoek norovirus in voedselmonsters, start bemonstering Invoering Beslisboom, Presentatie over NoV in ISI-helpmenu Uittesten diverse extractie procedures voor productgroepen Uitbreiding nested RT-PCR op fragment overeenkomstig humane diagnostiek Ontwikkeling en invoering nested real time PCRs norovirus Invoering FCV extractiecontrole en FCV two-step RT-PCR Ontwikkeling bepaling van norovirus op veegdoekjes Invoering two-step RT PCR voor hepatitis A virus Invoering externe HAV RNA inhibitie standaard Invoering veegdoekjes bij monstername brononderzoek Ontwikkeling two-step real time detectie, invoering bij analyse Invoering Shewart card en Checklisten Invoering 2e lijnscontroles Modulaire SOPs voor extractie en detectie van virussen in monsters beschikbaar Invoering 3e lijns controle (georganiseerd door CRL, Cefas, UK ) Accreditatie van de bepaling van norovirus en hepatitis A virus in schelpdieren Start achtergrondstudie naar kennis en voorkomen van norovirus in keukens Afronding achtergrondstudie naar kennis en voorkomen van norovirus de horeca
Pagina 19 van 23
Tabel 2a Bronopsporing 2006 t/m 2008 per melding
Jaar 2006 (n=27) 2007 (n=30) 2008 (n=25) Totaal (n=82)
Aantal meldingen pos voor norovirus/ totaal aantal meldingen (%) Feces % Voedsel % Swabs % Swabs % Swabs % (alle) (keuken) (wc) 12/14 86 4/18 22 14/27 52 7/23 30 11/14 79 9/9
100
1/15
6,7
15/22
68
11/20
55
10/16
63
4/5
80
3/6
50
15/23
65
7/20
35
12/19
63
25/28
89
8/39
21
44/72
61
25/63
40
33/49
67
Tabel 2b Bronopsporing 2006 t/m 2008 per onderzocht monster
Jaara 2006 (n=209) 2007 (n=166) 2008 (n=144) Totaal ( (n=519) a b
Aantal monsters positief voor norovirus / totaal aantal monsters onderzocht (%) Feces % Voedsel % Swabs % Swabs % Swabs % (alle) (keuken) (wc) 51/86 59 13/90 b 14 48/119 40 19/69 28 14/22 64 50/60
83
11/18 112/164
61 68
1/45
2,2
51/121
42
22/72
30
17/33
52
8/14
57
48/130
37
18/60
30
23/47
49
22/149
15
147/370
40
59/201
29
54/102 64
aantal voedsel en swabs (veegdoekjes) onderzocht door VWA per jaar voor 2006 oesters, vleeswaar en bakkersproducten, voor 2007 salami, voor 2008 alleen oesters
Pagina 20 van 23
Tabel 3 Norovirus op voedsel anders dan schelpdieren Melding Regio Maand, Aantal Incubatie jaar ziek/ tijd groep 49061 a NW 01/04 6/6 16-30 h 50113 a ND 02/04 >40 24-40 h 55765 a ZD 11/04 12/21 26-48 h 62105 ND 09/05 13/16 30 h 01/06 60/150 30 h 64099 b ZD c 67265 ZW 07/06 47/60 34 h 77018
NW
12/07
24/30 12 h
Voedsel type
norovirus type norovirus in feces GGIIb n.d. GGIIb 4/4 GGII.4.2004 n.d Niet bepaald n.d. GGII.7 4/7 GGII.4.2006b 11/13
Sparerib Salami/ham Beenham Taart crème Fricandeau Moorkop, aardbeientaart Salami GGI.3
n.d.
Match met feces n.d. d Ja n.d. n.d. Ja Ja
Match Met swabs n.d. n.d. n.d. n.d. Ja Ja
n.d.
Ja
a
beschreven in Boxman et al., 2007 b beschreven in van Dijk et al., 2006. c beschreven in van der Kerkhof et al., 2007 d n.d. niet onderzocht
Tabel 4 Norovirus in oesters gerelateerd aan meldingen van buikgriep
64317
Incubatie tijd 2001 Februari Niet bekend 2006 Januari 36 uur
64815
2006 Februari
32 uur
3/3
1/1
6/8
75416 77351
2007 Oktober 2008 Januari
3 uur 16-43 uur
1/2 6/6
n.c. 3/3
nvt c 5/6
77578 77918
2008 Januari 2008 Februari totaal
15 uur 44 uur
8/8 2/2 34/47 (72%)
n.c n.c. 12/13 (92%)
1/1 2/2 20/24 (83%)
Melding -
a
Jaar
Maand
Aantal ziek v/d groep 13/24
Norovirus in feces 8/9
Norovirus in oesters 5/5
2/4
n.c. b
1/2
match met sequenties in ontlastingsmonsters patiënten n.c. niet verzameld c niet van toepassing d diurrhetic shellfish poisoning toxin b
Pagina 21 van 23
Norovirus type GGI.4 a, GGII7 GGII.2, GGII.4 GGII.b, GGII.7 DSP d GGI.2, GGI.4 a, GGIIb GGI.2 GGI.2
Tabel 5 Norovirus op omgevingsmonsters na meldingen op cruiseships a Melding
a
65902 66430 66842 67071 Totaal
Maand in 2006 April Mei Juni Juli
Aantal ziek/ groep 15/130 62/158 33/1000 61/137 171/1425
NoV in feces 0/1 4/5 4/11 6/7 14/24
NoV op swabs 5/7 6/6 1/10 3/5 15/28
NoV type GGII.4.2006a GGII.4.2006a GGII.4.2006a b GGII.4.2006
Resultaten beschreven in Boxman, et al., 2009a. Meldingen behoren tot een cluster van Europese meldingen op cruiseschepen beschreven in Verhoef,.et al., 2008a b Deze sequentie bevatte een unieke mutatie, waardoor hij anders was van de andere gemelde GGII.4.2006a, en de match tussen ontlastingmonsters en omgevingsmonsters nog beter is.
Tabel 6 Norovirus op omgevingsmonsters na meldingen in instellingen a
Melding 72907 75368
76909 totaal (%)
Mnd 2007 5 10
12
feces 2/3 5/5
nce) 7/8 (87,5%)
aantal swabs positief/ aantal swabs per locatie keuken toilet divers totaal 0/1 4/4 d) 2/2 0/1 1/2 1/1 0/2 8/13 (61,5%)
2/2 3/3 3/3 2/2 2/2 3/4 3/6 18/22 (81,8%)
2/2 c) 6/6 2/2 2/2 3/3 2/2 1/2 18/19 (94,7%)
4/5 13/13 7/7 4/5 6/7 6/7 4/10 44/54 (81,5%)
type b) GII.4.2006a GII.4.2006b
GII.4.2001
a
Resultaten beschreven in Boxman, et al., 2009b identiek voor het overlappende deel van de sequenties afkomstig uit ontlastingsmonsters en veegmonsters, 145 nt voor GII.4.2006a en 285nt voor GII.4.2006b c twee monsters van de sapautomaat op de afdeling d data (her)-bemonsteringen: 9, 22, 25, en 31 oktober en 7 november e nc niet bemonsterd b
Pagina 22 van 23
