BIOSZENZORFEJLESZTÉS L-ASZKORBINSAV ÉS AFLATOXIN M 1 MÉRÉSÉRE

DE TTK

1949

BIOSZENZORFEJLESZTÉS L-ASZKORBINSAV ÉS AFLATOXIN M1 MÉRÉSÉRE Egyetemi doktori (PhD) értekezés Szerző: Víg Attila Témavezető: Dr. Gyémánt Gyöngyi Egyetemi adjunktus

DEBRECENI EGYETEM Természettudományi Doktori Tanács Kémia Doktori Iskola Debrecen, 2011

Ezen értekezést a Debreceni Egyetem TTK Kémiai Doktori Iskola Környezeti és Műszeres Analitikai Kémia programja keretében készítettem a Debreceni Egyetem TTK Doktori (Ph.D.) fokozatának megszerzése céljából. Debrecen, 2011. Víg Attila

Tanúsítom, hogy Víg Attila doktorjelölt 2006-2011 között a fent megnevezett Doktori Iskola Környezeti és Műszeres Analitikai Kémia programjának keretében irányításommal végezte munkáját. Az értekezésben foglalt eredményekhez a Jelölt önálló alkotó tevékenységével meghatározóan hozzájárult. Az értekezés elfogadását javaslom. Debrecen, 2011. Dr. Gyémánt Gyöngyi Egyetemi adjunktus

-2-

BIOSZENZORFEJLESZTÉS L-ASZKORBINSAV ÉS AFLATOXIN M1 MÉRÉSÉRE

Értekezés a doktori (Ph.D.) fokozat megszerzése érdekében a Kémia tudományágban

Írta: Víg Attila okleveles vegyész Készült a Debreceni Egyetem kémia doktori programja (Környezeti és Műszeres Analitikai Kémia alprogramja) keretében

Témavezető: Dr. Gyémánt Gyöngyi Egyetemi adjunktus A Doktori Szigorlati Bizottság: elnök:

Dr. .......................................

tagok:

Dr. ....................................... Dr. .......................................

A doktori szigorlat időpontja: Az értekezés bírálói: Dr. ......................................

........................................

Dr. ......................................

........................................

elnök:

Dr. ......................................

........................................

tagok:

Dr. ......................................

........................................

Dr. ......................................

........................................

Dr. ......................................

........................................

Dr. ......................................

.......................................

A Bírálóbizottság:

Az értekezés védésének időpontja: ...........................................

-3-

Tartalomjegyzék I.

Bevezetés ................................................................................................................................ - 8 -

II.

Irodalmi áttekintés ................................................................................................................ - 10 -

II.1

Bioszenzorokról általában .................................................................................................... - 11 -

II.1.1

Biokatalitikus receptorok...................................................................................................... - 12 -

II.1.2

Bioaffinitás alapú szenzorok ................................................................................................ - 13 -

II.1.3

Hibridizációs szenzorok ....................................................................................................... - 13 -

II.2

Rögzítési módszerek ............................................................................................................. - 14 -

II.3

Jelátvivők .............................................................................................................................. - 16 -

II.3.1

Elektrokémiai jelátvivők....................................................................................................... - 16 -

II.3.2

Optikai jelátvivők ................................................................................................................. - 19 -

II.3.3

Termikus és akusztikus hullám alapú jelátvivők .................................................................. - 21 -

II.4

Jövőbeli fejlesztési irányvonalak .......................................................................................... - 22 -

III.

Saját eredmények.................................................................................................................. - 23 -

III.1

Az aszkorbinsav mérésére alkalmas bioszenzor fejlesztése ................................................. - 23 -

III.1.1 Bioszenzorral történő aszkorbinsav mérés előzményei ........................................................ - 23 III.1.2 Célkitűzés ............................................................................................................................. - 24 III.1.3 Enzim: Aszkorbát oxidáz...................................................................................................... - 25 III.1.4 Mérőrendszer: FIA (Flow Injection Analysis) rendszer ....................................................... - 26 III.1.5 Anyagok és módszerek ......................................................................................................... - 28 III.1.6 A készülék összeállítása ....................................................................................................... - 29 III.1.7 Elektród előkezelési protokoll .............................................................................................. - 31 III.1.8 Enzimcella készítés............................................................................................................... - 31 III.1.9 Előzetes vizsgálatok ............................................................................................................. - 33 III.1.10 Aszkorbinsav oldat stabilitásának vizsgálata........................................................................ - 34 III.1.11 Rézionok hatása a regenerálódásra ....................................................................................... - 35 III.1.12 Aszkorbinsav mérő bioszenzor optimalizálása ..................................................................... - 37 III.1.14 Reális minták vizsgálata ....................................................................................................... - 46 III.2

Aflatoxin M1 mérésére alkalmas bioszenzor fejlesztése....................................................... - 51 -

III.2.1 Irodalmi háttér ...................................................................................................................... - 51 III.2.2 Célkitűzés ............................................................................................................................. - 52 III.2.3 Elektrokémiai Impedancia Spektroszkópia .......................................................................... - 52 -

-4-

III.2.4 Aflatoxinok ........................................................................................................................... - 56 III.2.5 Immunoszenzorok ................................................................................................................ - 59 III.2.6 Anyagok és módszerek ......................................................................................................... - 61 III.2.7 Jelerősítés kolloidális arany és mágneses nanorészecskék alkalmazásával .......................... - 63 III.2.8 Arany nanorészecskék mérése az elektród felszínen ............................................................ - 66 III.2.9 Jelerősítés ezüsttel hidrokinon felhasználásával ................................................................... - 67 III.2.10 A kifejlesztett mérési módszer – Jelerősítés ezüst elektromos ülepítésével ......................... - 71 IV.

Összefoglalás ........................................................................................................................ - 78 -

V.

Summary............................................................................................................................... - 80 -

VI.

Irodalomjegyzék ................................................................................................................... - 82 -

VII.

Tudományos közlemények és publikációk ........................................................................... - 89 -

-5-

Köszönetnyílvánítás Köszönetemet fejezem ki Iglói Attilának és Kozák Imre Olivérnek az EgerFood Regionális Tudásközpontban végzett munka során nyújtott szakmai és emberi támogatást. Köszönöm Antonio Radoi-nak és Xavier Munoz Berbel-nek a franciaországi Université de Perpignan volt poszt-doktorandusz hallgatóinak a szakmai és baráti támogatást, és a mindig segítőkész hozzáállást. Köszönöm Dr. Adányi Nórának a Központi Élelmiszerkutató Intézet kutatójának az amperometriás fejlesztésben biztosított támogatását. Köszönöm professzor Jean-Louis Marty-nak a Centre de Phytopharmacie, Université de Perpignan kutatóközpont vezetőjének a sikeres Állami Eötvös Ösztöndíj megvalósulását. Köszönöm Dr. Kiss Attilának az EgerFood Regionális Tudásközpont menedzser igazgatójának a kutatási feltételek és lehetőségek biztosítását. Köszönöm témavezetőmnek Dr. Gyémánt Gyöngyinek a mindig támogató és iránymutató segítséget, mellyel valamennyi holtponton sikeresen továbblendített. Külön köszönöm feleségemnek Vígné Dr. Baji Ritának és családomnak a nyugodt, támogató családi légkört. Hálával

tartozom

minden

olyan

munkatársnak,

aki

az

EgerFood

Regionális

Tudásközpontnál ill. az Université de Perpignan-on eltöltött idő során valamilyen szinten hozzájárult a dolgozat létrejöttéhez Köszönöm a munkám során nyújtott anyagi segítséget az EgerFood Regionális Tudásközpont 9/2005 pályázatának és a Magyar Állami Eötvös Ösztöndíjnak (2008).

-6-

Rövidítés jegyzék AFB1 AFM1 AFG AMPSO BSA DPV EIS ELISA FIA HRP IgG ISE ISFET LOD LSV LWR OTA PBS QCM SPR TELISA TIR

-Aflatoxin B1 -Aflatoxin M1 -Aflatoxin G - nátrium (3-[(1,1-dimetil-2-hidroxietil) amino] 2-hidroxipropánszulfon sav) só -Bovine Serum Albumin - Marha szérum albumin -Differential Pulse Voltametry -Electro Impedance Spectroscopy - Elektro impedancia spektroszkópia -Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Enzim csatolt immunkötődés vizsgálat -Flow Injection Analysis - Átfolyó befecskendezéses elemzés -Horse Radish Peroxidase –Fekete retek peroxidáz -Imunoglobulin G - Ion Sensitive Electrode - Ionérzékeny elektród - Ion Sensitive Field Effect Transistor - Ionérzékeny térvezérlésű tranzisztor -Limit Of Detection - Kimutatási határ -Linear Sweep Voltametry – Lineáris pásztázó voltametria -Linear Working Range - Lineáris tartomány -Ochratoxin A - Phosphate Buffered Saline- fiziológiás alapú foszfát puffer -Quartz Crystal Microbalance - Quartz kristály mikromérleg -Surface Plasmon Resonance - Felületi plazmon rezonancia -Thermometric Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Hőméréses enzim csatolt immunkötődés vizsgálat -Total Internal Reflection - Teljes első visszaverődés

-7-

I.

Bevezetés

A kémiai és biológiai folyamatok követése, megértése szempontjából az analitikai kémia fejlődésének kiemelt szerepe van. Ennek a fejlődésnek három irányvonala az automatizálás, miniatürizálás és egyszerűsítés, melyben fontos szerep jut a gyors, megbízható érzékelők (szenzorok) fejlesztésének. A szenzor egy olyan technológiai eszköz vagy biológiai alapú egység, ami detektálja/érzékeli a jelet vagy fizikai változást. A szenzorok fejlesztését az elmúlt században a szelektivitásnövelés motiválta, s ennek egyik legismertebb eredménye a pH mérésre használatos hidrogén szelektív üvegelektród. A szenzorfejlesztés az analitikai kémián belül egy olyan dinamikusan fejlődő terület, melyet elsősorban a környezeti és egészségügyi előírások igényei irányítanak. A kémiai összetételt mérő kémiai szenzorok a kémiai információ (koncentráció, szerkezet) fizikai-kémiai jellé való átalakítását végzik. A kémiai szenzor két részegységből áll: egy molekuláris felismerést biztosító anyagot (például receptort) tartalmazó felismerő részből és egy fizikai-kémiai jelátvivő egységből. A felismerő egység funkciója kettős: szelektív kölcsönhatás révén a szenzor szelektivitásának biztosítása, és a kémiai paraméter (általában koncentráció) analitikailag mérhető, hasznos jellé való átalakítása, amelyre a jelátvivő egység reagál. Jellemző módon a kémiai felismerést végző elem és a jelátalakító egység egy analitikai eszközben található meg. A bioszenzorok (biológiai szenzorok) a kémiai szenzorok alcsoportját alkotják, amelyeknél a felismerő anyag biológiai eredetű, és a szelektív felismerési lépés biológiai folyamatra épül, így lehet enzim-szubsztrát, antigén-antitest, receptor-agonista kölcsönhatás vagy nukleinsav hibridizáció. A különböző biológiai anyagok közül legáltalánosabban az enzimeket használják. A jelátvitel lehet elektrokémiai (amperometriás, potenciometriás), optikai vagy reakcióhő mérésén alapuló. Készítenek felületi plazmon-rezonancia detektáláson vagy tömegváltozás mérésén alapuló (kvarckristály mikromérleg alapú) és felületi akusztikus hullám detektáláson alapuló kémiai és bioszenzorokat is. Fontos megemlíteni, hogy a szenzorok működését megszabó folyamatok általában reverzibilisek, ami biztosítja a szenzorok ismételt felhasználhatóságát, folyamatos üzemmódú alkalmazását. A 2006 óta az Eszterházy Károly Főiskola keretein belül indított egri Regionális Tudásközpont egyik kutatócsoportja az élelmiszeripari bioszenzor fejlesztésekre összpontosít, melyen belül főbb élelmiszer összetevők (antioxidánsok, biogén aminok) ellenőrzése a cél. A kutató laboratórium főként elektrokémiai módszereket (amperometria) alkalmaz munkájában. A kutatási tevékenységek során elengedhetetlen a hazai és nemzetközi csoportokkal (Lund-8-

Svédország, Perpignan- Franciaország) történő együttműködés. Egy ilyen együtműködés keretein belül sikerült a magyar állami Eötvös ösztöndíj segítségével, fél éves kutatómunkát végeznem a dél-francia perpignan-i egyetemen, ahol jelentősebb immunoszenzor fejlesztések is folynak. Jelen disszertáció az egri főiskolán végzett, L-aszkorbinsav mérésére alkalmas bioszenzor fejlesztés és a francia kutatócsoportban végzett aflatoxin M1 vizsgálatára alkalmas mérőmódszer kifejlesztésének eredményeit foglalja össze. Az első rész tehát L-aszkorbinsav (antioxidás) mérésére alkalmas rendszer fejlesztését taglalja, mivel az antioxidánsok szerepe jelentős többek között az élelmiszertartósításban, minőség megőrzésben, s mennyiségük meghatározása fontos visszajelzés lehet a termék élettartamára vonatkozóan. A második rész az aflatoxin M1 mérésére használható módszer elemzését tartalmazza, melyben egy olyan élelmiszer szennyezőt vettünk górcső alá, ami az emlősök tejében mutatható ki, s a táplálékkal elfogyasztott aflatoxin B1 metabolikus változata. Mennyiségének meghatározása fontos a tej minőségének, emberi fogyaszthatóságának megállapításában.

-9-

II.

Irodalmi áttekintés

Az ipari folyamatokban előállított termékek minőségbiztosítása egyre nagyobb gazdasági jelentőséggel bír a rohamosan fejlődő társadalmakban. Ezen belül az élelmiszer minőség és frissesség egyre inkább a figyelem középpontjába kerül mind a fogyasztók, mind az élelmiszeripar szempontjából, melyeknek ellenőrzésére időszakos kémiai és mikrobiológiai elemzéseknek vetik alá a termékeket. Az említett vizsgálatok olyan módszereket sorakoztatnak fel, mint kromatográfia, spektrofotometria, elektroforézis, titrálás, amelyek azonban nem teszik lehetővé az egyszerű, folyamatos elemzést. Többségük drága, lassú és amellett, hogy minta előkészítésük összetett lehet, jól képzett személyzetet is igényelnek. Az élelmiszeripar gyors és költséghatékony megoldásokat igényel a régi és újabb kritikus összetevők főként ellenőrző jellegű meghatározására. Az olcsó és folyamatos nyomon követés mellett a roncsolásmentes és gyors válaszidejű módszerek további előnyt élveznek. Az előbbiekben felvázolt ipari rutin mérések teljesítésére kínál alternatív megoldást a bioszenzor fejlesztés [1]. A bioszenzorok a kémiai szenzorok közé tartoznak, melyekben egy biológiai alapú felismerő egység (enzim, antitest, receptor, mikroorganizmus) egy kémiai vagy fizikai jellegű jeltovábbítóval történő kombinációja nyújt az élelmiszer analízisben is használható mérőeszközt. A bioszenzor technológia egyedi tulajdonságai miatt valós mintákra alkalmazható eljárások lehetőségét ajánlja, s számos előnye (magasfokú szelektivitás és specifitás, megvalósíthatóság és tárolás relatív alacsony költsége, miniatürizálás lehetősége, automatizálhatóvá és hordozhatóvá tétel) alapanyag és minőségügyi laborok ellenőrző rendszereinek részévé teheti. A bioszenzor fejlesztések a legkülönfélébb felhasználási területekre

koncentrálnak,

mint

pl.:

klinikai,

környezetvédelmi,

mezőgazdasági,

biotechnológiai [2,3]. Bioszenzorra alapozott fejlesztések ugyanakkor használhatóak lehetnek élelmiszertermékeknél is, főleg összetétel meghatározás, nyersanyag és késztermék szennyezettsége, ill. fermentációs folyamatok beépített (on-line) ellenőrzése terén. Az élelmiszeripar által gerjesztett nagy változatosságot mutató bioszenzor kutatások ennek ellenére még korlátozott alkalmazhatóságot mutatnak. Másrészről a valós minták mérésére alkalmas prototípusok teszteléseiben olyan kritikusnak mondható fázisok találhatók, mint a biokomponens rögzítése gyártás során és az elemzés mintaelőkészítése. A bioszenzorok megfelelő hőmérséklet és pH igénye a biológiai aktivitását biztosításáért szükséges, továbbá egyes esetekben a minta előkezelése is ajánlott bizonyos zavaró összetevők eltávolítására,

- 10 -

mint pl.: aszkorbinsav, tirozin stb., illetve semlegesítési, hígítási és extrakciós eljárások is szükségesek lehetnek az élelmiszer savassága vagy hidrofób tulajdonságai esetén. Az élelmiszerek esetén használt, elemzési időt csökkentő, feltáró módszerek többek között a savas vagy lúgos hidrolízis, mikrohullámos emésztés, szuperkritikus folyadék extrakció, párologtatás és szűrés. Élelmiszeripari

területen

fontos

bioszenzor

alkalmazás

a

peszticidek,

patogének,

mikroorganizmusok és toxinok kimutatása. Ezen szennyezők kimutatására alkalmazott hagyományos módszerek fizikokémiai, biológiai és szerológiai teszteket foglalnak magukban, melyek legtöbbje hosszú mintaelőkészítést, elemzési időt igényel, nem megfelelő a szelektivitása és érzékenysége, s összességében az elemzés néha napokat vehet igénybe. Éppen ezért az immunoanalitikai módszerek jó alternatívát biztosítanak, mivel antitesteket nemcsak fehérjék felismerésére lehet kifejleszteni, hanem mikroorganizmusok felszíni antigénjeire és kis molekulatömegű összetevőkre is. A bioszenzorok vagy immunoszenzorok csökkentik az analízis időt és költséget, s növelik a termék biztonságot. Ezek a módszerek felhasználhatóak továbbá beépített (on-line) rendszerű kontroll

meghatározásra

és

mérésre

olyan

folyamatellenőrző

minőségbiztosítási

rendszerekben is mint a HACCP (Hazard analysis and critical control points- Kockázat elemzés és kritikus ellenőrzési pontok). Továbbá az enzim alapú bioszenzorok és immunoszenzorok mikroorganizmusok (E. Coli, Salmonella, S. Aureus), peszticidek, herbicidek órák ill. percek alatt történő meghatározását tették lehetővé [4,25].

II.1 Bioszenzorokról általában Megegyezés alapján a bioszenzorok a felhasznált biológiai komponens típusa, a jelátvitel módja vagy ezek kombinációja alapján csoportosíthatók. A célmolekula kimutatására számos biológiai komponens és jelátvivő eljárás áll rendelkezésre (1. ábra), azonban a tényleges módszert a vizsgálandó minta és a mérési tartomány határozza meg. Mivel a biológiai felismerő egység különböző szelektivitási és specifitási fokkal rendelkezhet, ezért ezt három csoportra osztják: biokatalitikus, bioaffinitás és hibridizációs receptor alapú.

- 11 -

Dupla v. többcsatornás jelfeldolgozás kalibrációt követő összehasonlítással v. kivonással 1. ábra: A bioszenzorok általános működése és csoportosítása a generált jel alapján [1]

II.1.1 Biokatalitikus receptorok A biokatalitikus felismerő egység enzim (mono vagy multi enzim), egész sejt (mikroorganizmus: baktérium, gomba, eukarióta sejt, élesztő), sejt organellum és növényi vagy állati szövet tartalmú rendszer lehet. Azok a bioszenzorok, amik mikroorganizmusokat, állati vagy növényi szövetet tartalmaznak, azzal az előnnyel bírnak, hogy kialakításukhoz nem szükséges a biokomponens bonyolult kivonási és tisztítási folyamata [5,6,7]. A mikrobiális szenzorok továbbá kevésbé érzékenyek a különböző egyéb összetevők inhibíciós hatására, sokkal jobban tűrik a pH és hőmérsékletváltozásokat, valamint általában hosszabb életidővel is rendelkeznek. Ezek az eszközök az elektród és annak felszínén megkötött egész sejtek

- 12 -

kapcsolatán alapulnak, s könnyen regenerálhatók tápanyagokban dús oldatba mártással. Ugyanakkor az ilyen tulajdonságú szenzorok lassabb válaszidővel és alacsonyabb szelektivitással rendelkeznek az egyszerű enzimes megoldásokhoz képest, mivel egy élő sejtben számos metabolikus folyamat játszódik egyszerre. Ezek a szenzorok általában szerves összetevők beépülésén vagy metabolikus légzés aktivitás változásainak a nyomon követésén alapulnak.

Néhány mikrobiális

bioszenzort már eddig is

alkalmaztak

élelmiszer

vizsgálatokban, de elsősorban Biológiai Oxigén Igény (BOI) meghatározásra. A mikrobiális szenzorokban tapasztalható szelektivitás és lassú válaszidő okozta problémák az enzimes rendszerekben már kiküszöbölhetők, s ezért is lehetséges, hogy ez utóbbi jelenti a leggyakoribb érzékelő részt a bioszenzorokban. Az enzim szenzorok számos típusáról számoltak

be

potenciometriás,

amperometriás,

optoelektromos,

kalorimetriás

és

piezoelektromos alapokon. Alapvetően minden enzimszenzor azon alapszik, hogy az enzimet megkötjük egy jelátvivő felszínén. A kereskedelmi forgalomban kapható enzimek közül az oxidázok a legnépszerűbbek [8], mivel nagy stabilitást mutatnak, és bizonyos esetekben nem igényelnek koenzimet vagy kofaktort.

II.1.2 Bioaffinitás alapú szenzorok Az affinitáson alapuló bioszenzorok kemoreceptorok, antitestek lehetnek. Ezek a szenzorok szelektív kölcsönhatásba lépnek egy adott ligandummal, amivel termodinamikailag stabil komplexet

képeznek.

Az

immunoszenzorok

reális

felhasználhatósága

általános

alkalmazhatóságukban rejlik, mivel bármilyen komponens kimutatható, ha kifejleszthető ellene specifikus antitest [9], s mindez úgy kivitelezhető, hogy specifitással, szelektivitással és magas érzékenységgel párosul. Bár a tapasztalható kapcsolódás nem képez elektrokémiai jelet, az antigén-antitest komplex mindenféle szenzorban felhasználható, mivel enzimmel, fluoreszcens komponenssel, elektrokémiailag aktív szubsztráttal, radionukliddal vagy avidinbiotin kapcsolódással címkézhető az antigén vagy az antitest. A leggyakoribb immunoszenzor jelátvivők akusztikus és optikai rendszerek.

II.1.3 Hibridizációs szenzorok Az olyan hibridizációs receptorok, mint a DNS és RNS szondák ígéretes alkalmazásoknak bizonyultak az élelmiszerekben található mikroorganizmusok kimutatására [10,11]. A szelektív vizsgálat biztosítéka a hibridizáción keresztül történő egyedi nukleinsav szekvencia

- 13 -

azonosítás. A bázispárosodási tulajdonság lehetővé teszi egyetlen DNS szálnak is, hogy „felismerje” a kiegészítő párját és duplexet alkosson. A DNS szenzorokban egy jól meghatározott bázissorrendű DNS szál alkotja a biológiai felismerő egységet, amit valamilyen módszerrel egy adott felülethez rögzítenek. A szondát egy ismeretlen DNS-t vagy RNS-t tartalmazó mintába juttatják, s ha a rögzített szál kombinálódik valamelyik ismeretlen örökítőanyag résszel, akkor lehetővé válik a meghatározás és azonosítás. A DNS alapú módszerek tűnnek az egyetlen módszernek, mellyel genetikai módosulások kimutathatók, ez a legérzékenyebb módszer mikroorganizmusok kimutatására is. Kereskedelmi forgalomban olyan élelmiszerekben található patogén baktériumok kimutatására alkalmas DNS szondák kaphatók, mint a Salmonella, a Listeria, az E. Coli és a S. Aureus [12,13].

II.2 Rögzítési módszerek A biológiai alapú szenzor alapanyagok valamilyen szilárd felszínen történő rögzítése számos módon történhet [14]. Ezen rögzítési módszerek között szerepel az adszorpció, keresztkötés, kovalens kötés, valamilyen hordozóba zárás vagy kapszulázás, szilárd kötést segítő mátrix. A rögzítő mátrix szerepet játszhat csak és kizárólag a kötésben, de akár a jelátalakításban is (mediátor). Mindegy, hogy milyen rögzítési módszerről beszélünk, mivel minden esetben a cél a biológiai komponens lehető legmagasabb aktivitása, hosszú stabilitás ideje és a jelátviteli egységhez mért kis távolsága a rögzítés után. Meghatározó része a rögzítés hatékonyságának, hogy a vizsgálandó anyag tudjon ki- és bevándorolni a létrehozott rétegben. A megfelelő rögzítési módszer kiválasztása függ magától az alkalmazandó biológiai anyagtól, a jelátalakítás módjától, a célmolekula fizikai-kémiai tulajdonságaitól és a bioszenzor működési feltételeitől (2. ábra). A leggyakrabban rögzítés céljából az adszorpció és a kovalens kötés módszerét alkalmazzák. A van der Waals erők vonzásán alapuló fizikai adszorpció a legegyszerűbb és legrégebben használt módszer. Ebben az esetben általában az enzimoldat, sejt szuszpenzió vagy szövet metszet úgy kerül a jelátalakító felszínére, hogy egy a célmolekulára féligáteresztő membrán lefedi. Ezen módszer esetén nem szükséges a biológiai komponens kémiai módosítása, lehetőség van a membrán mátrix regenerálására. Főként az egyszerűség a nagy előnye ennek a megoldásnak, illetve, hogy egyszerre akár többféle biológiai komponens is használható, azonban jelentős aktivitás csökkenés tapasztalható, ha pH, ionerősség és hőmérsékletváltozás lép fel mérés közben. A gélekbe, polimerekbe, pasztákba vagy tintákba történő bezárás

- 14 -

jelentősen növelheti a stabilitást, s hasonló teljesítményhez vezethet, mint a kovalens kapcsolás esetén.

2. ábra: Enzim megkötésekre alkalmazott módszerek összefoglalása [14]

Kovalens kötés során a biológiai komponens közvetlen a jelátalakító felszínéhez vagy a membrán mátrixához kapcsolható. Ezek a módszerek a fehérje terminális funkciós csoportjainak (a katalitikus aktivitást nem befolyásoló) és a felszín szabad funkciós csoportjainak reakcióin alapszanak. Enzimekben és fehérjékben ezek a lehetséges funkciós csoportok az aminosav oldalláncokon találhatóak (pl.: a lizin ε-amino, az aszpartát és glutamát karboxil, a cisztein szulfhidrid és a tirozin fenil-hidroxil csoportja). A különböző aktív funkciós csoportokat tartalmazó membránok nagy hatékonysággal képesek a biokomponensek megkötésére. Emellett arra is lehetőség van, hogy az enzimet például vízoldható részecskékhez kötjük és két szelektíven áteresztő membrán közé zárjuk. Enzimek vagy fehérjék esetén ugyancsak használnak bifunkciós (homo vagy hetero funkciós) reagenseket, mely során makroszkópikus részecskék és térhálós szerkezet keletkezik a kovalens kötések kialakulása során a hordozó felszínén. A leggyakrabban használt homofunkciós vegyületek a glutáraldehid, karbodiimid, míg heterofunkciósakból a trikloro triazin és a 3-metoxidifenil metán-4,4' diizocianát. - 15 -

Egyéb a jelátvivő felszínének átalakítására irányuló módszerek között szerepel például a biokatalitikus molekula szén kompozit mátrixba ágyazása. Az ilyenfajta módosított bioszenzorok többek között olyan jelentős előnyökkel rendelkeznek, mint a biokatalitikus vagy érzékelő rész szoros közelsége, esetleges kofaktorok, segédanyagok beágyazása, a felszín könnyű megújulása, alacsony költség és nagy stabilitás a biokatalitikus fehérjére nézve. Az előbbiekben felsorolt tulajdonságokkal rendelkeznek a szén paszta elektródok, a nyomtatott elektródok és a meghatározott molekuláris szerkezetű szilárd rögzítő mátrixok. Az elektrokémiai polimerizációval történő rögzítés is gyakran használatos szerves molekulák esetén, s számos előnye közzé tartozik a mikroléptékű kivitelezés, film vastagság befolyásolása, homogenitás és ismételhetőség.

II.3 Jelátvivők A biológiai komponens vizsgált szubsztrátra mutatott aktivitása figyelemmel kísérhető oxigénfogyasztás, hidrogén peroxid képződés, NADH koncentráció változás, fluoreszcencia, abszorpció, pH-, vezetőképesség-, hőmérséklet- vagy tömegváltozás követésével. Így a bioszenzorok a következő különböző osztályokba sorolhatók: potenciometriás (ionszelektív elektródok, ISE), ion érzékeny térvezérlésű tranzisztoros (ISFET), amperometriás, impedimetriás, kalorimetriás, optikai és piezoelektromos. Sok az élelmiszervizsgálatokban használt bioszenzor valamilyen oxidáz rendszerre alapoz, mintha egy aerob mikroorganizmust elektrokémiai jelátalakítóval kombinálnánk.

II.3.1 Elektrokémiai jelátvivők Az elektrokémiai bioszenzor az IUPAC definíciója szerint az az önálló, integrált szerkezet, amely képes kvantitatív vagy fél-kvantitatív analitikai információt szolgáltatni biológiai felismerő egység segítségével (biokémiai receptor), mely egység közvetlen és térbeli kapcsolatban van a jelátalakító egységgel. Az elektrokémiai jelátalakítóval kiépített bioszenzorok gazdaságosak és gyors válaszidejűek, s az automatizálási lehetőségük sorozatmérésre is alkalmassá teheti őket [14]. Az elektrokémiai bioszenzorok különböző osztályai a vezetőképesség, impedimetria, potenciometria és amperometria.

- 16 -

Vezetőképesség és impedimetria alapú jelátvivők A vezetőképesség változásokat követő bioszenzorok a mikroorganizmusok által fogyasztott vagy termelt szubsztrátok/köztitermékek koncentrációit vizsgálják (pl: szénhidrát-tejsav átalakulás) az adott közegben, ami lényegben 2 elektród között bekövetkező kis vezetőképesség változás kimutatását jelenti. A töltéssel rendelkező molekulák mennyisége egyenes

arányban

számszerűsíthető.

van

Számos

az

organizmus

biológiai

növekedésének

membrán

receptora

mértékével, figyelhető

egyszerűen

meg

beültetett

mikroelektródokkal ion vezetőképesség [15,16], kapacitás [17] vagy impedimetria [18] változásokon keresztül. A vezetőképesség bioszenzorokat nem szívesen használják a gyakorlatban, mivel általában nem specifikusak és nem megfelelő a jel/zaj arányuk. Az impedancia alapelvét a Hivatalos Analitikai Kémikusok Egyesülete (AOAC) is elfogadta, s elsősorban minőségi megfigyelésre és élelmiszer patogének (baktériumok) specifikus meghatározására használják [19]. Ezek a bioszenzorok arra alapoznak, hogy a mikrobiális anyagcsere folyamatok vezetőképesség és kapacitásnövekedést is okoznak, s így az impedancia csökkenését idézik elő. Az impedanciát általában egy híd áramkörrel mérik, amiben gyakran egy referencia egység is található a nem specifikus változások mérésére és kivonására. A referencia egység ugyancsak figyeli a hőmérsékletváltozásokat, párolgást, oldott gázok mennyiségi változásait és a sejtállomány változásait inkubáció során. Kereskedelmi forgalomban is kaphatóak, mikroorganizmusok meghatározására alkalmas impedancia alapú technológiák. Potenciometriás jelátvivők A potenciometriás bioszenzorokban egy adott anyagra érzékeny membrán vagy érzékelő felszín ad a koncentrációval logaritmusos arányba hozható jelet referencia elektród jelenlétében [20,21]. A potenciometriás készülékek pH és ion koncentráció változásainak mérésére alkalmas. Lehetőség van jelerősítőként tranzisztor használatára, amit az ionszelektív elektródhoz (ISE) kapcsolnak, s ezért Ion Érzékeny Térvezérlésű Tranzisztornak (ISFET) hívnak [22]. Ezekben a bioszenzorokban a biológiailag aktív anyag (enzim, antitest) egy az ionszelektív elektród felszínét beburkoló membránon kerül megkötésre, s az enzimreakció vagy antigén-antitest komplexképződés során bekövetkező változásokat a jelátalakító regisztrálja. Jelenlegi kutatások az ionszelektív elektródok jobb detektálási határa és

- 17 -

szelektivitása felé mutatnak, hogy jobban megfeleljenek az ipari igényeknek (elektród rendszerek, újfajta ionofórok, új miniatürizálásra alkalmas elektródok). Az ISFET nagy jelentősége a folyamatok mikroelektronikai kivitelezésében és a miniatürizálásban rejlik. Az enzim alapú potenciometriás szenzorok alkalmazási lehetőségei közül jelentős az ipari folyamat figyelés és a higiéniai-egészségügyi minőség ellenőrzés területe.

Amperometriás jelátvivők Az amperometriás bioszenzorok azt az áramot mérik, amit az elektródon egy elektroaktív anyag képez egy adott potenciálon. Ez a mért áram egyenes arányban áll a kérdéses anyag oldatbeli koncentrációjával. Az amperometriás bioszenzorok gyorsak, hiszen nem kell várni a termodinamikus egyensúly beállásáig, s érzékenyebbek, pontosabbak, mint a potenciometriás képviselőik. Ugyanakkor azonban szelektivitás terén a rendszerben jelenlévő elektroaktív anyagok redox potenciálja a meghatározó, ami ahhoz vezet, hogy a mért áram több anyag együttes, különböző arányú jeléből tevődik össze. Az amperometriás bioszenzorok jelentik egyenlőre a legsikeresebb osztályt a bioszenzorok történetében (3. ábra). Az első glükóz mérésére alkalmas amperometriás bioszenzor glükóz oxidáz és Clark oxigén elektród felhasználásával készült [23], s a rendszerben bekövetkező oxigén fogyását követte nyomon. A termék keletkezésének vagy a reakciópartner (oxigén) fogyásának figyelemmel követésével következtethetünk a vizsgálandó anyag koncentrációjára. Ezek a bioszenzorok az úgy nevezett első generációsak. A mediátorral módosított amperometriás bioszenzorok jelentik a bioszenzorok második generációját, hiszen itt a mediátor redox tulajdonságai segítik az elektron transzfert az enzim és az elektród felszíne között. Direkt elektrontranszfert tesznek lehetővé a direkt enzimelektród kapcsolatos vagy mediátormentes bioszenzorok, melyek a szenzorok harmadik generációját jelentik. Ez utóbbi esetben az elektron közvetlenül jut el az elektródtól az enzimig, s onnan a szubsztrát molekulához (vagy fordítva). Ebben a mechanizmusban az elektron egyfajta másodlagos szubsztrátként van jelen, s katalitikus áram képződését eredményezi. A szubsztrát átalakítása alapvetően egy katalitikus folyamat [24]. Az élelmiszerelemzések esetében a bioszenzorok többsége az amperometrián és valamilyen oxidáz kombinációján alapszik. Ezek a típusú szenzorok annak köszönhetik népszerűségüket, hogy az enzim általában jó aktivitást mutat, magas érzékenység érhető el velük, s könnyű a

- 18 -

reakció nyomon követése. Jelentős különbség ugyanakkor, hogy bár a hidrogén peroxid jelenlétét kimutató jelátalakítók érzékenyebbek az oxigén fogyását követőknél, az utóbbiak alkalmasabbak a biológiai eredetű anyagokon (sejtek, növényi- vagy állati szövetek) alapuló szenzorok esetében. Más esetekben amperometriás bioszenzorokat is alkalmaznak a mikrobiális szennyeződések indirekt kimutatására, hiszen számos mikroorganizmus kimutatható amperometriásan, enzimkatalizált oxidáció, redukció vagy bioaffinitási reakcióban történő részvételük alapján. Ezekben a rendszerekben enzimcsatolt amperometriás immunoszenzort alkalmaznak a baktérium kimutatására. Ilyen például mikor hővel elölt baktériumot (pl.: S. Typhimurium) ágyazunk antitesttel borított mágneses részecske és enzimmel kapcsolt antitest közzé. Továbbá

élelmiszer

szerek

is

szennyzőként

mérhetőek

növényvédő

amperometriásan

enziminhibíción keresztül [25].

3. ábra: A kereskedelmi forgalomban is kapható egyik glükóz oxidáz enzim alapú amperometriás vércukorszint mérő. Tesztcsíkokkal történik a mérés, a készülék tárolja és átalakítja a mért eredményeket.

II.3.2 Optikai jelátvivők Az optikai szálak és lézerek fejlődésével ezek a típusú bioszenzorok nagy figyelmet kapnak, továbbá az analitikai spektrofotometrián belül is jelentős előrelépést jelentenek főleg a miniatürizálás terén. Az optikai bioszenzorok azon alapulnak, hogy a biokatalitikus kölcsönhatás során UV-VIS abszorpció, bio/kemilumineszcencia, fluor/foszforeszcencia, visszaverődés, szóródás és refraktív indexben változás történik [26]. Az optikai szenzorokat kezdetben oxigénre, széndioxidra és pH-ra fejlesztették ki sav-bázis indikátorok felhasználásával, azonban mára fluoreszcens és lumineszcens optrodokká nőtték ki magukat. Az optrod nem más, mint az optikai szál egyik végén rögzített szelektív biokomponens és a szál másik végén található gerjesztő és érzékelő egység együttese. Az elnyelt vagy kibocsájtott fény intenzitás változása, ami a közegben jelátvivő szerepet játszó indikátor változásaihoz köthető, egyenes arányba hozható a vizsgálandó anyag mennyiségével. Bizonyos száloptikás szondák alapja a teljes belső visszaverődés (Total Internal Reflection- TIR) jelensége a fényvezetőben, ahol azokat a - 19 -

gyengülő elektromágneses hullámokat használják, melyek az optikai határfelületen jelentkeznek, s információval szolgálnak a felszín refraktív index változásairól. A TIR szenzorok alapja, hogy az elektromágneses hullámokból csak egy bizonyos hullámhossz tartomány jut vissza az optikailag ritkább közegbe, ha a kapcsolódó közegből beeső fény a kritikus szögnél nagyobb szögben érkezik. Tehát a felszín refraktív indexében vagy abszorpciós képességében bekövetkező változás csökkenti a vezető fénytovábbító képességét. NAD(P)+/NAD(P)H rendszertől függő dehidrogenáz enzimek nyomonkövethetőek, mivel NAD(P)H erős elnyelő 340 nm-en (UV tartomány) míg fényt bocsájt ki 460 nm-en (kék tartomány). Ilyen rendszereket alkalmaztak már acetaldehid, alanin, malát, glükóz, glicerin, etanol és galaktóz vizsgálatára [27]. Biolumineszcens baktérium (Vibrio fischeri vagy Vibrio harveyi) vagy luminolszerű kemilumineszcenciás anyagok oxidoreduktázokkal történő kombinációjával direkt módon mérhető az ATP, NAD(P)H vagy a H2O2.

Optikai

lumineszcens bioszenzorokat alkalmaznak fermentációs folyamatok megfigyelésére (alkohol) és szénhidrátok meghatározására. A TIR módszerhez hasonlóan a fényvezetőben bekövetkező belső visszaverődés az alapja a Felszíni Plazmon Rezonancia (SPR- Surface Plasmon Resonance) technikának is [28]. Ezek a készülékek a visszaverődést mérő detektort egy biokomponenssel (legtöbbször antitesttel) kombinálják. Az SPR fontos alkalmazása a jelzés nélküli immuno vizsgálatoknak. Egy optikai alapú SPR szenzort egy optikai rendszer, egy az előző rendszerhez kapcsolt jelátvivő és egy optoelektromos jelfeldolgozó alkot. A módszer alapja olyan töltés sűrűség oszcilláció, ami két különböző előjelű dielektromos állandóval rendelkező közeg érintkezésénél jöhet létre, mint pl. fém és dielektrikum. Az SPR egy quantum elektro-optikai jelenség, melyben a fotonok energiája a fém elektronjainak adódik át. A folyamat eredménye a plazmon keletkezése, vagyis gerjesztett elektronok a fém felszínén. A keletkező plazmon intenzitását a fém anyagi minősége és a felszín környezete befolyásolja, ahol a plazmon mezőben bekövetkező kémiai tulajdonságok változása (pl. antitest-antigén kölcsönhatás) jól nyomon követhető. A változások vagy a beeső fény szögében, vagy az elnyelt fény hullámhossz változásában vagy az SPR jelben (rezonancia egységekben (RU) kifejezve) figyelhetőek meg, de leginkább a beeső fény szögének vizsgálata az elterjedt. Az SPR bioszenzorok abszorpciós tulajdonságait kovalensen kötött molekulák felhasználásával határozzák meg. Az SPR szenzorok jól használhatóak környezeti és élelmiszeripari minták vizsgálatára, mivel egyszerű használatukhoz (nem igényelnek jelölést a molekulák) a minta tisztítás nélküli mérése párosul. Az üvegprizma belső felszínén található vékony fémréteg (pl. arany) van kapcsolatban az érzékelő antitest réteggel, mely - 20 -

közvetlen kapcsolatba kerül az antigénnel vagy a meghatározandó anyaggal. A refraktív indexben bekövetkező változások a beeső fény teljes abszorpciójához rendelhető szög eltolódásában követhetőek. Nagy előny, hogy az ilyen immunoszenzorok nem igényelnek inkubációs vagy elválasztási lépést.

II.3.3 Termikus és akusztikus hullám alapú jelátvivők Bár az elektrokémiai és optikai bioszenzorok teszik ki a fejlesztések nagy részét, a termikus és akusztikus jelátvitel is teret nyer. Ugyan ezen alkalmazások szelektivitása nem kiemelkedő, de a miniatürizálásra és párhuzamos vizsgálatokra mutató lehetőségeik mindenképpen az előnyeik között sorolható. Termikus jelátvitel A termikus jelátvitelre alapozott bioszenzorok mikrokaloriméterhez hasonlóak [29], s az enzim vagy mikroorganizmus által katalizált kémiai reakció hőenergia változásait figyelik (20-100 kJ mol-1). Mivel adiabatikus rendszerről beszélünk, a mérés mindig magában foglal sugárzással, vezetéssel és konvekcióval kapcsolatos hőveszteséget is. Alapja legtöbbször termisztor, mely képes 0,0001-0,05 º C tartományban változásokat rögzíteni, s 10-5 M koncentrációt meghatározni. Ilyen jellegű szenzorokkal képesek voltak már meghatározni aszkorbinsavat, glükózt, laktátot, galaktózt, etanolt, penicillin G-t, cefalosporint és oxálsavat. Antitesteket felhasználó alkalmazásokkal (TELISAs) mikrobiológiai szennyeződések is vizsgálhatóak. Piezoelektromos jelátvitel Ezeket a jelátvivőket jelentősebben az immunoszenzorok esetén alkalmazzák, ahol az antitestet vagy antigént a kvarckristály felszínéhez kötik [30,31,32]. A kristály folyadékban adott osszcillációja adott frekvenciájú, azonban tömegváltozással ez a rezgés változik. A nagy specifitású immunoreakciók során a kristályhoz kapcsolódó fehérjék okozta tömegváltozások nyomonkövetése olyan komponensek mérését tette lehetővé, mint mikroorganizmusok, gázok, aromák, peszticidek, hormonok. Ezen a területen a fejlesztések fő csapásvonala a jelátvivők érzékenység és szelektivitás növelése.

- 21 -

II.4 Jövőbeli fejlesztési irányvonalak Felhasználói szempontból a fejlesztéseket a valós és gyors válaszidejű, termelési folyamatokba épített megfigyelőrendszerek igénye határozza meg. A megfelelés ezen igényeknek olyan technikákon keresztül történhet, amelyek nem igényelnek különösebb elemzés előkészítést, és zavartalanul tudnak valós időben működni. Ilyen például a már említett SPR technika. Ugyancsak fontos a biológiai felismerő rész minél hatékonyabb elhelyezése a hordozó felületen, amiben az önszerveződő monorétegek (Self Assembled Monolayer- SAM, [33,75]) vagy a kétrétegű lipid membránok játszanak fontos szerepet. Ezeknél a módszereknél a biomolekulák olyan szervezett, megfelelően irányított rögzítése lehetséges a felszínen, amivel aktivitásuk, stabilitásuk, élettartamuk növelhető. Ugyanakkor a bioszenzorok stabilitás növelése mellett enzimnélküli bioszenzorok fejlesztésére is vannak törekvések, melyek során az elektród felszínt biológiailag jelentős, enzim aktív hellyel módosítják. Ez a megoldás jobb elektronátvitelt biztosít az aktívhely és az elektród felszín között. A mikrobioszenzor technológiák fejlesztői ionszenzitív térvezérlésű tranzisztorok, mikro oxigén, hidrogén peroxid és szénszál elektródok segítségével olyan chip méretű szenzorokra koncentrálnak [34,86,88,90], melyek eldobhatóak és akár több komponens egyidejű meghatározására alkalmasak. A mikrotechnikával ugyancsak jól ötvözhető területnek tűnik a DNS szenzorok felhasználása, melyek patogén mikroorganizmusok kimutatására lehetnek megfelelőek az igényelt specifitás és érzékenység elérése után. A különböző szennyezők kimutatása is aktív kutatási terület, melyek azonban irreverzibilis receptor kötődésekre építenek. Így pl. az antigén-antitest reakciókkal magasfokú specifitás és alacsony kimutatási határok érhetőek el (10-11-10-9 M). Emellett mesterséges akrilamid nanorészecskék kialakításával is kísérleteznek, ahol a célmolekulát jelentő toxint vagy antigént használják sablonnak, s így a célmolekula megkötésére alkalmas kötőhely állítható elő [35]. Másik irányzat a katalizálandó reakció mechanizmusának ismeretében mesterséges enzim előállítása módosított baktérium fehérjeexpresszióján keresztül [36]. Említést érdemel, hogy az orvosi jellegű fejlesztések is támaszkodnak a bioszenzorokra, melynek ékes bizonyítéka pl. a vércukorszint mérésre alkalmas glükóz szenzor. Ezen a területen a távoli jövő célkitűzése a folyamatos üzemű, akár a testbe integrálható szenzor kifejlesztése [37]. A jelenlegi piaci igények és az ehhez kapcsolódó fejlesztési vonalak összefoglalása már megtörtént biotechnológiai folyóiratokban [38].

- 22 -

A kutatási témak különbözősége miatt a konkrét fejezetekhez kapcsolódó irodalmi összefoglalók és célkitűzések a Saját eredményeken belül az egyes részegységek előtt találhatóak.

III. III.1

Saját eredmények Az aszkorbinsav mérésére alkalmas bioszenzor fejlesztése

III.1.1 Bioszenzorral történő aszkorbinsav mérés előzményei Aszkorbinsav meghatározására számos módszer található a szakirodalomban, a klasszikus analitikai eljárások közül elsősorban a titrimetriás meghatározást alkalmazzák, amely pontos, viszont időigényessége miatt sorozat elemzésekben nem használható [39]. A műszeres módszerek között a HPLC-s meghatározás terjedt el, amely akár rendkívül költséges is lehet [40]. Az aszkorbinsav mérésére eddig kifejlesztett HPLC-s módszereket már összefoglalták [41]. Fluorimetriás optikai alapú aszkorbinsav mérésre is volt már példa [42]. Az eddigi kutatások során többfajta elektrokémiai eljárást dolgoztak ki C-vitamin (aszkorbinsav) vizsgálatára, melyek közül néhány a titrimetriában alkalmazott 2,6-diklórfenol indofenolra alapoz [43,44]. Más esetben az aszkorbinsav redukáló sajátságát használták ki Fe(III) → Fe(II) reakción keresztül, melyből ezután Fe(II)-ferrozin kelát detektálása történt spektrometriásan [45]. Szulfonazonnal (III) módosított üveges szén elektróddal aszkorbinsav, dopamin és húgysav mérését már meg tudták valósítani [46]. Az antioxidánsok meghatározására kezdeményezett bioszenzor fejlesztések eredményeit már korábban összefoglalták [47]. C-vitamin tartalmú gyógyászati készítmények elemzésére próbálták meg alkalmazni a kalixarénnel módosított szénpaszta elektródot ciklikus voltametriával [48]. Ez direkt elektrokatalitikus módszernek tekinthető, Pb(II) ionok alkalmazásával sikerült az aszkorbinsav leválási potenciálját 5-600 mV-ról 200 mV-ra csökkenteni, azonban így sem sikerült reális minták esetében megfelelő specifitást elérniük. Ugyancsak szénpaszta elektróddal és peroxidáz enzim tartalmú cukkini extraktum felhasználásával végeztek aszkorbinsav meghatározást hidrokinon redukcióján keresztül -140 mV-on [49].

- 23 -

Szintén direkt amperometriás meghatározást választottak angol kutatók gyümölcsök minőségének, érettségének vizsgálatára [50]. A fent említett zavaró anyagok kiküszöbölésére méretkizárásos membránt alkalmaztak a választott +350 mV potenciálon. Aszkorbát oxidáz enzim rögzítésével török kutatóknak nagyfokú szubsztrátspecifitást sikerült elérniük gyümölcslevek és C-vitamin tabletták elemzésénél [51]. Az enzimet zselatin gélben rögzítették glutáraldehid alkalmazásával oxigén elektród felületén. A mérés során az enzimreakcióban elfogyasztott oxigén mennyiségét mérték, aminek során azonban számos zavaró hatással kell számolni (hőmérsékletfüggés, reális mintákban az oldott oxigén zavaró hatása, nagymértékű háttérzaj, rossz érzékenység). Brazil

kutatók

potenciometriás

detektálással

dolgoztak

ki

enzimatikus

módszert

aszkorbinsav mérésére [22]. Szintén aszkorbinsav oxidázt használtak, amelyet etilénvinilacetát kopolimer membrán felszínéhez kötöttek. A mérést grafit elektróddal végezték, de a már említett hibákat nem sikerült kiküszöbölniük. Ugyancsak brazil kutatók kötöttek uborka (Cucumis sativus) extraktumból származó aszkorbát oxidázt nylon hálóhoz, s oxigén szenzorral vizsgálták a szubsztrát hatására bekövetkező változásokat -600 mV-on [52]. Az eddigi leghatékonyabb módszer készítői SIRE (Sensors based on Injection of the Recognition Element) típusú szenzort alkalmaztak [53]. Ebben az esetben átfolyó rendszerben végzik a méréseket, az enzimet a mérendő oldathoz keverik, és együtt injektálják. A mérés során az aszkorbinsav enzim nélkül illetve enzimmel együtt mért amperometriás jelének különbségéből következtettek az aszkorbinsav mennyiségére. A módszer nagyon pontos, specifikus módszer, a háttér zavaró hatása sem jelentkezik. Hátrányának mondható a drágasága, mivel viszonylag sok enzim szükséges egy méréshez és a felhasznált enzim nem használható újra. A nem átfolyó cellás módszerek hátránya az átfolyó rendszerű (FIA Flow Injection Analysis) bioszenzorokkal szemben, hogy sorozat elemzésekre nem használhatók, azaz az automatizálhatóságuk korlátozott [54]. Enzim nélküli szenzor kifejlesztésére is volt példa, ahol hisztidin-réz komplexet használtak az aszkorbinsav mérésére [55].

III.1.2 Célkitűzés Mivel az antioxidánsok szerepe jelentős többek között az élelmiszertartósításban, minőség megőrzésben, s mennyiségük meghatározása fontos visszajelzés lehet a termék élettartamára - 24 -

vonatkozóan, ezért a kutatási téma első részében a Központi Élelmiszerkutató Intézet bioszenzor fejlesztésén [63,64] alapuló L-aszkorbinsav (antioxidás) sorozat mérésére alkalmas rendszer kifejlesztését tűztük ki célul. A FIA rendszer mérési elve nagyban hasonló a SIRE típusú szenzorra [53], azonban a rögzített, preparált enzim illetve az elektród elkülönítése a rendszer nagyobb rugalmasságát teheti lehetővé (enzimcella egyszerű cseréje). Továbbá a rögzített, regenerálható enzim csökkenti a sorozat mérési költséget.

III.1.3 Enzim: Aszkorbát oxidáz Az aszkorbát oxidáz egy 8 réz (II) iont tartalmazó oxidoreduktáz (E.C. 1.10.3.3). A 8 rézatomot spektroszkópiailag 3 osztályba sorolják attól függően, hogy milyen a kémiai környezetük: I, II és III típusú. Szilárd, kristályos formájában a benne található réz miatt kék színű. Az enzim egy oxigén molekula 4 elektronos redukcióját képes elvégezni, ezzel vizet előállítva, miközben az L-aszkorbinsavat [56] dehidro-aszkorbinsavvá alakítja (4. ábra). OH O

HO

Ox.

O OH

=

→

+ H2O

OH

4. ábra: Az aszkorbát oxidáz által katalizált oxidációs folyamat

Ez a reakció a citokróm c oxidáz enzim reakciójához nagyon hasonló. Csak magasabb rendű növényekben fordul elő, s általában a tökfélék közé tartozó Cucurbita fajokból végzik a preparálását különböző módszerekkel. Szerkezetét tekintve dimer, s molekulatömege közel 140000 Da (a 3D szalagmodellt az 5. ábra szemlélteti).. Az enzim növényekben betöltött in vivo szerepe még nem teljesen tisztázott. In vitro vizsgálatok alapján elmondható, hogy mivel a katecholokkal és a polifenolokkal is reakcióba lép, ezért szerepe lehet olyan biológiai folyamatokban, mint a gyümölcs érése. Működésének inhibítorai, zavaró ionjai: F-, CN-, N3-, Zn2+. Az aszkorbátra mint szubsztrátra megállapított enzim kinetikai állandók: kcat=8x103s-1 és KM=0,2 mM.

5. ábra:Az aszkorbát oxidáz röntgendiffrakcióval meghatározott szalagmodellje (PBD kód 1ASO) [57]

- 25 -

A mechanizmus során az I. típusú rézionnak egy elektront ad át az aszkorbát, s keletkezik az ú.n. szemidehidroaszkorbát, mely ezután spontán átalakuláson megy keresztül. Az ezután bekövetkező regenerálódási folyamat az I-III. típusú réz atomok közötti intramolekuláris elektrontranszfer és a kialakuló réz-oxigén komplex kialakulásán keresztül történik.

III.1.4 Mérőrendszer: FIA (Flow Injection Analysis) rendszer Az első áramlásos befecskendezéses rendszert 1975-ben mutatták be (Ruzicka és Hansen), s a kémiai elemzés automatizált módszereiben alkalmazták. Egy meghatározott mennyiségű mintát injektálunk folyamatos, megszakítás nélküli folyadék áramba, s a mintazóna lamináris áramlással halad végig a csőrendszeren. Az eredeti dugószerű profil az előrehaladás során elmosódik komplex diffúziós és konvekciós folyamatok során, s elkeveredik a vivő közeggel. Ez kémiai reakció lejátszódását is lehetővé teszi, ha a vivő közeg valamilyen reagenst tartalmaz. Fotométerek, flouriméterek, pH vagy ionszelektív elektródok ill. amperometriás cellák építhetőek be detektorként a kialakított átfolyó rendszerbe. Egy FIA rendszer részei tehát a perisztaltikus pumpa, ami a folyamatos folyadékáramot biztosítja, a minta injektor és a detektor. Egyéb a vizsgálatokat segítő elemek is bekerülhetnek a rendszerbe, mint keverő kamrák, katalitikus vagy affinitás oszlopok, gáz diffúziós vagy dialízis kamrák [58,59]. A meghatározott pumpálási sebességnek, az adott csőhossznak és átmérőnek köszönhetően pontos idővel írhatóak le a rendszerben lejátszódó folyamatok, azt is lehetővé téve, hogy kémiai reakciók kinetikai feltételek mellett fussanak az egyensúlyi folyamatok beállta nélkül, tehát a minta rendszerbe adagolása is gyorsabb lehet. A FIA rendszer jele egy meghatározott magassággal és szélességgel leírható csúcs, aminek az alakját a beadagolt minta mennyisége, a rendszerben történő elmosódás és a kémiai reakció gyorsasága határoz meg. Ha a rendszer feltételeket állandó szinten tartjuk, akkor akár a csúcsmagasság változásainak figyelemmel kísérése is elegendő a jel kiértékeléshez. A FIA megoldás a folyamat megfigyelése, ellenőrzése és beépített mintázási lehetősége alapján nagyon ígéretes megoldás bioszenzor fejlesztésekben.

- 26 -

Injektorok Korábban egyszerű fecskendőkkel juttatták a folyadékáramba a mintát, ezután következtek a manuális, majd automata injektor szelepek. Általában a bejuttatott mintamennyiség 15 µl-től 300 µl-ig terjed, ahol az alsó határt a csatlakozók fizikai közelítésének korlátja, míg a felső határt a feltekerhető csőhossz határozza meg. Akkor történik meg az injektálás, ha a mintát tartalmazó hurkot befordítjuk a hordozó fő áramba, s így a vivő közeg bemossa a rendszerbe a mintahurok tartalmát. Ismételhető eredmények manuális injektorral csak megfelelő gyakorlat után érhetőek el, míg egy teljesen automatizált injektor rendszer esetén az ismételhetőség a pontos időzítéssel biztosított. Reakció kamrák A legkönnyebb módja, hogy kémiai, biokémiai reakciót egy FIA rendszerben hajtsunk végre, ha oldható formában hozzáadjuk a reagenst a vivő közeghez, vagy injektoron keresztül bejuttatjuk az áramba. Ez a jelentős reagens fogyasztás elkerülhető, ha a reakcióhoz szükséges reagenst egy az áramlásba bekötött reakció kamrában kötjük meg. Az enzimet, antitestet, egész sejtet szilárd hordozón vagy membránokon köthetjük meg a fizikai tulajdonságaik (méret, töltés, hidrofób domén) felhasználásával. A megkötés során az enzim veszít ugyan mozgékonyságából, azonban aktivitását megőrzi, s regenerálódás után ismételt reakcióba vihető. Különböző feltételeknek kell teljesülniük, hogy a reakciókamra hordozó anyaga megfelelőnek bizonyuljon: - megfelelő stabilitással kell tudnia megkötni az enzimet/fehérjét ionos vagy funkcionális csoportokon keresztül kovalens kötéssel - megfelelő mechanikai sajátosságokkal kell rendelkeznie, hogy bírja az állandó folyadékáramlást - sem a vizsgálandó anyag, sem a keletkező termék nem adszorbeálódhat az anyagon Leggyakrabban a kovalens kötést használják, ami során sokszor ugyan jelentős aktivitás csökkenés figyelhető meg a több ponton történő kötés kialakulás miatt, de hosszú távú stabilitásuk jobb, s kevésbé hatnak rájuk a pH illetve hőmérsékletváltozások. A felvitt enzim mennyiségét a választott reaktor típus határozza meg elsősorban, s mivel az enzim vizsgálandó anyaghoz való hozzáférése is meghatározó a hatékonyság szempontjából, ezért a töltött ágyas kamrák bizonyultak a legjobbaknak. Ennek a megoldásnak a mikrostruktúrás továbbfejlesztését jelenti, mikor az enzim az átfolyó csatorna belső felszínén kerül megkötésre szilícium rétegeken.

- 27 -

Eloszlás Az átfolyó rendszerbe beépített minden új elem megváltoztatja a minta áramlási profilját. Mivel a diffúzió időfüggő folyamat, az alacsony áramlási sebességek is növelik az eloszlási hatást, s a dugószerűen vivőáramba juttatott minta határán kialakuló koncentráció gradiens változásai idővel a minta áram közepének irányába hatnak. A FIA rendszerben bekövetkező eloszlást a diszperziós koefficienssel (D) írják le D=c0/cmax

(1)

ahol c0 a kezdeti, bejutatott koncentráció, míg a cmax pedig, ami ténylegesen elérte a detektort (1. egyenlet). Az áramlási viszonyok miatt a cmax mindig kisebb, mint a kezdeti koncentráció, s D a hígulás mértékét írja le D >1. A D meghatározásához egy adott oldott festék abszorpciójának (H0) és ugyanezen festék injektált mintaként kapott abszorpciójának (Hmax) hányadosaként juthatunk. Tehát a minta eloszlás hatékonysága szempontjából a nagyobb térfogat, magasabb áramlási sebesség, rövidebb csőhosszak és kevesebb áramlásba épített elem a kedvezőbb. Az ismételhető mérések szempontjából elengedhetetlen az eloszlással kapcsolatba hozható tényezők állandón tartása. A kutatómunka során az elsődleges cél az volt, hogy egy olyan mérési módszert fejlesszünk ki, amely alkalmas lehet más szubsztrátok elemzésére is a megfelelő oxidáz enzim használatával, enzim cella cseréjével, ill. lehetőség legyen a rendszer miniatürizálására. Mivel az enzimcella és mérőcella sorba van kötve, ezért a szubsztrát hosszabb időn át érintkezhet az enzimmel, így az enzimreakció teljesebb lehet, ami az érzékenység és kimutatási határ növekedését eredményezheti. A fejlesztés során az enzim reakció hatására bekövetkező aszkorbinsav jel csökkenést mértük, s az alkalmazott üveges szén elektróddal pozitív potenciálon történő mérések esetén alacsony alapvonal zajjal és regenerálódási idővel számolhattunk.

III.1.5 Anyagok és módszerek Anyagok Aszkorbát oxidáz (330 U/mg, Cucurbita sp., EC 1.10.3.3) és HPO3 (Merck) került beszerzésre. Marha szérum albumint (BSA) és a glutárdialdehidet a Sigma-Aldrich szolgáltatta. A sertés vékonybél (természetes fehérje membrán) hazai forrásból származott. Az L-aszkorbinsav, Na2HPO4, KH2PO4, CH3COONa és CH3COOH-at a Spektrum-3D Kft. - 28 -

biztosította. Minden használt vegyszer analitikai tisztaságú volt, s az oldat készítéshez Milli-Q HPLC vizet használtunk.

Mérési eszközök A vizsgálatokra alkalmazott átfolyásos rendszerben aszkorbát oxidáz enzimen alapult az Laszkorbinsav [56] kimutatás.

6. ábra: Az alkalmazott FIA rendszer sematikus ábrája

. Az injektálásos, átfolyásos vizsgálati rendszer (FIA) felépítése a következő volt (6. ábra): puffer tároló edény, perisztaltikus pumpa (Gilson Minipuls3), 2 manuális injektor (20 µl mintabemérő hurok, Rheodyne 7725i, Cotati, CA) és egy vékonyrétegű amperometriás cella (Model. 5040, ESA, USA) összekapcsolva egy elektrokémiai detektorral (Coulochem III, ESA, USA) s digitális jelfeldogozó egységgel (személyi számítógép), Assistant® vízfürdő, digitális kontakt-hőmérő. Az állandó munkapotenciált az amperometriás cellába beépített referenciaelektród biztosította (esetünkben +400 mV az ESA által beépített Cd referencia elektróddal szemben).

III.1.6 A készülék összeállítása Az első készülék összeállítás (7. ábra) a Központi Élelmiszerkutató Intézetben kifejlesztett rendszerhez hasonló volt [63,64], s az első próbafutások alatt különböző mérést befolyásoló tényezőket derítettünk fel: - 29 -

- a perisztaltikus pumpa esetén a pumpát ki kell nyitni minden leállításnál, és az aktuálisan használt csövet le kell venni a nyúlás/eldeformálódás elkerülésére és a hosszabb élettartam érdekében - az injektorba történő befecskendezés után azonnali injektálásnak kell következnie a hiba csökkentésére -

a vékony HPLC csövek csatlakoztatásánál ügyelni kell a pontos illeszkedésre, mivel a csatlakozásoknál kialakuló átmérő növekedések az injektált minta detektált csúcsának elhúzódását eredményezheti

7. ábra: Az első készülék összeállítás (balról: perisztaltikus pumpa, manuális injektor, enzimcella (injektor mögött), amperometriás cella, amperometriás detektor, regiszter)

-

az elektród időszakos tisztítására és kezelésére elektródtisztító eszközöket kell használni, mely megfelelő módszeréhez az irodalmi leírásokat vettük alapul

8. ábra: Az amperometriás mérőcella képe és metszeti ábrája

- 30 -

A munkaelektród üveges szén (Glassy carbon), melyet szén alapú polimer kontrollált körülmények között történő pirolízisével (2000 ºC) állítanak elő. Az ellenelektród rozsdamentes acél. A mérőcellában található kadmium referencia elektród nem igényel cserét, tisztítást vagy speciális töltő folyadékot, s széles pH tartományban ad stabil, pH kompenzált jelet (8. ábrán látható a mérőcella felépítése). Az elektród előkezelését irodalmi leírások alapján dolgoztuk ki [60,61]. Oxidált üveges szénnel már történt korábban L-aszkorbinsav mérés [62].

III.1.7 Elektród előkezelési protokoll 1. fázis: Az elektródot az elektródpolírozó kitt segítségével először közepesen durva műanyag membránon polírozzuk HPLC víz és 0,3 µm szemcseméretű Al2O3 szuszpenzió segítségével (15 perc), majd finom polírozzuk HPLC víz és 0,3 µm szemcseméretű Al2O3 szuszpenzió segítségével (10 perc). Ezután HPLC vízzel öblítjük, s 30 mp-ig ultrahangos mosóban mossuk az esetleges szuszpenzió nyomok eltávolítására (ne törölgessük, mert megkarcolódik!) Ha az elektród felületén szemrevételezés után nem látható karcolás, egyenetlenség, folt, akkor továbbléphetünk a 2. fázisra ellenkező esetben az 1. fázist megismételjük. 2. fázis: A megmosott elektródot kevés 0,1M HCl oldatba állítjuk 30 percre, majd ezután HPLC vízzel mossuk, s kb. 5 percre HPLC vízbe tesszük, hogy a savnyom maradékokat lemossuk. 3. fázis: A savazott elektródot a puffer oldattal mossuk a FIA rendszerben 400 mV-on 10 percig (0,55 ml/perc). Ezután az elektródot 5 percig 1,75 V-on oxidáljuk, majd 30 mpig mossuk a cellát kikapcsolva, s végül 1,5 percig -1,00 V-on redukáljuk. 4. Az elektródot hosszabb ideig mosassuk a pufferrel (2 óra) 400 mV-on, míg az alapvonal kellően alacsony értékre áll be (ez utóbbi segíthető minta injektálásával!). Ha az eljárás megfelelő sikerű, akkor az elektród felülete egységes (folt nélküli), nedvesen szivárványos, szárazon kissé sárgás megjelenésű.

III.1.8 Enzimcella készítés A pH optimum az enzim számára pH=5,5-7,0-ig terjed szabad formájában, ez a megkötődés hatására természetesen változhat, s 4,5 és 8,3 pH-n az enzim aktivitás már csak 50%-a az eredetinek.

- 31 -

Az előzőek figyelembe vétele fontos a cella készítésnél, ahol először a fagyasztott, sózott sertés vékonybelet kiolvasztjuk, s alaposan megmossuk a sótól. Ezután 3-4 db 15-20 cm-es darabot vágunk le belőle, melyeket a nyílásuknál az ujjunkra felhúzva átvágunk, majd a kapott darabokat desztillált vízben tovább áztatjuk, hogy a konzerváló só maradéktalanul kioldódjon. Az előkészített cellát szétszereljük, s az alsó plexi részre alkoholos filctollal felrajzoljuk a teflonlap segítségével az elektrolit csatornát. Ezután kiválasztjuk a megfelelő nagyságú és minőségű béldarabot (ne legyenek rajta kinövések, hibák, fátyolos vagy kemény rész stb.), ráfeszítjük az előkészített plexi lapunkra és gumigyűrűvel rögzítjük az oldalt lelógó részeket (száradás közben összehúzódik!). Szárítószekrényben vagy szobahőmérsékleten szárítjuk (túlszárítani nem szabad, mert töredezni kezd). Eldöntjük, hogy mennyi egység (U) enzimet szeretnénk felvinni a membránunkra, s azt a mennyiséget feloldjuk 2,5-5 mg BSA-val (fehérje stabilizáló szerep, mennyisége az enzim mennyiségtől függ) az enzimre jellemző, optimális 150-200 µl 66 mM, pH=5.6 foszfát pufferben (a BSA nehezen oldódik). Feloldódás után 50 µl 2,5% glutáraldehidet adunk az oldathoz, majd gyorsan felvisszük az előzőleg felrajzolt elektrolit csatornának megfelelően a kifeszített vékonybél membránra. A cellát 12 órán keresztül szobahőn szárítjuk. A sertés vékonybél megfelelő száradása ahhoz kell, hogy a felvitt BSA+enzim+glutáraldehid oldat ne folyjék szét rajta. Dugófúró készlettel kilyukasztjuk a membránt a csavarok helyén, s óvatosan összeszereljük a cellát (a csavarok meghúzásánál a kerékcserénél jól ismert átlós meghúzási sor a javasolt, mert így nem sérül a membránunk). Az enzimcella felépítése a 9. ábrán látható.

9. ábra: A plexi, teflon és sertésbél alapú cella [63,64]

Az első használat előtt a cella aktivitása növekedett a 66 mM-os, pH=5,6 foszfát puffer oldattal való egy éjszakás állás során. A rendszerbe kötés után célszerű volt továbbá nagyobb áramlási sebességgel az amperometriás cella előtt a hulladékgyűjtőbe mosatni az új - 32 -

enzimcellákat, mivel az esetlegesen leváló fehérje részek eltömíthették az amperometriás cella bemeneti nyílását.

III.1.9 Előzetes vizsgálatok A mérések során először az aszkorbinsav jel potenciálfüggését és az aszkorbinsav koncentrációban az enzimreakció hatására bekövetkező változást vettük alapul (10. ábra). 50 mM, pH=5,6 foszfát puffert használtunk, s minden mérési ponthoz 3 injektálás átlagát vettük. Az enzimmel injektált mérésekhez használt oldatot 1000 µl 0,1 mM aszkorbinsav oldat és 1 µl 10 U aktivitású enzimoldat szobahőn történő inkubálásával nyertem. A koncentráció függés vizsgálatánál nehézséget jelentett, hogy a vak cella, enzim cella (50 U aktivitású) csere nem volt könnyen kivitelezhető.

10. ábra: Az aszkorbinsav jel és enzimes aszkorbinsav jel potenciál (A) függése ill. vak és enzimcellával nyert eredmények különbsége (B) 0,5 ml/perc áramlás, 400 mV mellett. (A használt filctollas regiszter miatt a csúcsmagasságok mm-ben megadva.)

Az előzetes eredményekből látszott, hogy az adott aszkorbinsav koncentráció, viszonylag magasabb potenciálon (300 mV felett) ad nagyobb jelet, s az enzimreakció hatására bekövetkezett jelcsökkenés jól megfigyelhető. Továbbá a vak és enzim cellás mérésekből a jel különbség koncentráció függése jól kivehető, bár a linearitás nem volt egyértelmű. A jelek kiértékelésénél a csúcsmagasságokat vettük alapul milliméterben, majd később korrigáltuk az értékeket a félértékszélesség figyelembevételével.

- 33 -

III.1.10 Aszkorbinsav oldat stabilitásának vizsgálata Az elkészített enzimcellák esetén nagy ingadozást tapasztaltam a mért jelekben, ezért vizsgáltam az aszkorbinsav törzsoldat stabilitását először amperometriásan, majd HPLC és UV-VIS fotometriás módszerrel. A mérések során tisztázódott, hogy a stabilizáló szerként az oldatokhoz adott 2 g/100 cm3 HPO3 nagyon eltolja a puffer pH-t (pl.: 0,5 g HPO3 hozzáadása 25 cm3 pH=5,6-os puffer oldathoz pH=1,90 eredményezett!), illetve az aszkorbinsav amperometriás jelének nagysága nagyban függ a pH-tól. Továbbá, ha a mérések során csak a törzsoldatban található HPO3, akkor a hígítási sor készítésénél a legkisebb koncentrációk esetén (0,1 mM és 0,25 mM) ez olyan mértékben hígul, hogy az oldatok stabilitása nagyon lecsökken. Ezért elkezdtem kisebb metafoszforsav koncentrációk vizsgálatát a későbbi minta előkészítés hatékonyságának javítására.

Aszkorbinsav bomlás mérése Irodalmi leírásokban már korábban tanulmányozták az aszkorbinsav bomlását [65]. A mi esetünkben a bomlás megfigyelése először a vakcellával amperometriásan történt, de mivel a jelek instabilitása miatt az egyes párhuzamos injektálások nem voltak összehasonlíthatóak, ezért inkább HPLC-s és UV fotometriás módszereket alkalmaztam a további vizsgálatokhoz (11.ábra). Készülék: Shimadzu LC-10AD, Detektor: Shimadzu SPD-10A, Oszlop: Supelco Discovery C-18 (5 µm töltet, 15 cm x 4,6 mm, eluens: 13,5 g KH2PO4 900 cm3 víz + 1,8 g Ncetil-N,N,N trimetil ammónium bromid 100 cm3 MeOH) [40].

11. ábra: Aszkorbinsav oldat stabilitás vizsgálata HPLC méréssel 66 mM foszfát pufferben, HPLC vízben (0,75 mM konc.) -A rész és (250 mM, 50 mM és 25 mM) metafoszforsavval (0,4 mM konc.) –B rész.

- 34 -

HPLC-s módszerrel vizsgáltam a 2 g/100 cm3 (250 mM), 0,4 g/100 cm3 (50 mM) és a 0,2 g/100 cm3 (25 mM) HPO3 koncentráció, Millipore szűrt víz és csak foszfát puffer mellett az aszkorbinsav törzsoldat stabilitását. Az aszkorbinsav HPLC-s meghatározásánál a fenti standard módszert alkalmaztam. Amint az a 11. ábrán látható, pufferben és Millipore szűrt vízben, szobahőn az aszkorbinsav bomlása viszonylag gyors (pufferben a 15 perc alatt közel felére csökken a mennyisége). Irodalmi koncentrációjú [40] metafoszforsav jelenlétében közel 90 percig stabil, míg 5x hígítású metafoszforsavval 60 percig megfelelő stabilitású az oldat.

Aszkorbinsav oldat stabilitás mérése HPLC-s eredmények mellett ellenőrzésként UV-VIS fotometriát is használtam 265 nm hullámohosszon. Ebben a kísérletsorban az 50 mM metafoszforsav tartalmú, 66 mM foszfát pufferben készített, hűtőben tárolt aszkorbinsav oldat változásait figyeltem meg (1. táblázat). 1. táblázat: 50 mM koncentrációjú HPO3 tartalmú, hűtőben tárolt aszkorbinsav oldat mért abszorbanciája 66 mM foszfát pufferben Konc/Idő 0 perc 60 perc 150 perc 1100 perc 0,02 mM 0,31 0,301 0,315 0,313 0,025 mM 0,394 0,376 0,396 0,399 0,05 mM 0,756 0,755 0,763 0,793 0,1 mM 1,505 1,508 1,515 1,59 0,15 mM 2,224 2,238 2,211 2,294 0,2 mM 2,851 2,841 2,808 2,839

A hűtőben tárolt, alap törzsoldatot csak a hígítások elvégzéséhez vettem ki szobahőmérsékletre. 0,4 g/100 cm3 HPO3 tartalmú pH=8,2 66 mM foszfát pufferben (mért pH=6,7) oldottam a 88,1 mg (10 mM konc.) aszkorbinsavat, melynek mért pH-ja így 6,46-os volt. Ennek az oldatnak vizsgáltam a stabilitását 18,5 órán át 0,02 mM-0,2 mM hígítású kalibrációs sorozatméréssel. A kísérlet eredménye alapján kijelenthető, hogy az 50 mM koncentrációjú metafoszforsavval készített aszkorbinsav oldat legalább 18,5 órán keresztül stabil hűtőben tárolva.

III.1.11 Rézionok hatása a regenerálódásra Az aszkorbát oxidáz enzim egy 8 réz atomot tartalmazó oxido-reduktáz, ahol a Cu(II)→Cu(I) redoxireakció játszódik le. A Cu(II) ionokat tartalmazó oldat elvben segítheti az enzim gyorsabb regenerálódását és így a gyorsabb, hatékonyabb reakciót [66]. Azonban ezen ion jelenléte a HPO3-al stabilizált aszkorbinsav oldatban gyorsítja az aszkorbinsav

- 35 -

bomlását is. A hűtőben tárolt 10 mM-os törzsoldat stabilitásának vizsgálatát 1 mM CuSO4 koncentrációnál, fotometriásan 265 nm hullámhosszon. A kalibrációs sorozat 0,01-0,2 mM aszkorbinsav koncentráció tartományban került elkészítésre. A 12. ábrán jól megfigyelhető, hogy a metafoszforsavval stabilizált aszkorbinsav oldatban jelenlévő 1 mM Cu (II) ion már a hozzáadás pillanatában elősegítette a bomlást.

12. ábra: 50 mM koncentrációjú metafoszforsavval stabilizált aszkorbinsav törzsoldat (Stabil oldat) kalibrációs görbéje és a hozzáadott 1 mM koncentrációjú Cu (II) ionok hatása időben (UV-VIS fotometria, 265 nm)

13. ábra: Enzimcella és elektródregenerálódási vizsgálat 1µM Cu (II) jelenléte nélkül (A) és jelenlétében (B). Minden mérési pontot 2 mM aszkorbinsav oldat háromszori injektálásával kaptuk.

Az enzimcella regenerálódás szempontjából 1 µM koncentrációjú Cu (II) ion jelenlétében vizsgáltam a kapott jelek változásait. Vak és enzimcella esetén figyeltem meg a jelek alakulását 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7 perccel az alapvonalra visszatérés után injektálva. Minden mérési pont 3 injektálás átlagából adódott 2 mM aszkorbinsav koncentrációval.

- 36 -

Az első kísérletben (13. ábra A) a használt puffer oldatban nem volt hozzáadott CuSO4, míg a második kísérlet során igen (13. ábra B). A regenerálódási idők az első esetben: vak- 160 mp, enzim- 150 mp, míg a második esetben: vak- 150 mp, enzim- 135 mp. Összességében megállapítható, hogy az oldathoz adott kis mennyiségű Cu (II) segítette a regenerálódási idő csökkentését, azonban hosszabb távon károsíthatja az enzimcella működését.

III.1.12 Aszkorbinsav mérő bioszenzor optimalizálása Áramlási sebesség vizsgálatok (cellacsere, 1 injektor, 7. ábra) Az enzimreakció szempontjából érdemes volt megnézni az ideális áramlási sebességet, hogy maximális jelcsökkenés legyen megfigyelhető. Alacsonyabb áramlási sebességeknél megnövekszik a tartózkodási idő az enzim cellában, s így növekszik a vak és enzimes jel különbsége, azonban az elmosódó áramlás miatt a detektálási idő és elektródregenerálódás (visszatérés az alapvonalra) is megnőhet. A 14. ábrán néhány cellacserével végzett mérés eredményeit foglaltuk össze.

14. ábra: 2 egymást követő napon (A és B) megismételt áramlási sebesség függés vizsgálat 3 mM aszkorbinsav oldat használatával. Jól megfigyelhető, hogy az áramlási sebesség növelésével csökken az aszkorbinsav jel (vak cella, enzimcella), s reprodukálhatóság szempontjából számottevő különbség van egymást követő napok mérési eredményeiben.

Áramlási sebesség vizsgálatok (enzimcella, 2 injektor, 6. ábra) Ezután megvizsgáltuk a 2 injektoros összeállítással az áramlási sebesség függést (15. ábra), mivel az előző típusú mérésnél a cellák cseréje során áramlási sebesség változások is voltak. A 14. és 15. ábrán is jól megfigyelhető, hogy egymást követő napokon a munkaelektródon

- 37 -

kapott jelek csúcsterületeiben is megfigyelhetők különbségek, ami elektródfelületi változásokkal magyarázhatók.

15. ábra: 400 mV potenciál, pH=5.5, 100 mM foszfát puffer, 300 U enzimcella, 3 mM aszkorbinsav paraméterek mellett áramlási sebesség függés vizsgálat 2 egymást követő napon (A és B). A kapott eredmények alapján az alacsonyabb áramlási sebesség a nagyobb arányú enzimes jelcsökkenés irányába hat.

16. ábra: A 2 injektoros készülék összeállítással kapott csúcsok 100 µM aszkorbinsav cella előtti és cella utáni injektálásával. A csúcsalakok nagy különbsége miatt a digitális jelfeldolgozás elengedhetetlen.

Ezen készülék összeállítás esetén azonban már csak digitális integrálás után lehetett értékelhető eredményeket kapni, hiszen a cella előtt és után injektálva más csúcsmagasságú és alakú jeleket kaptunk (16. ábra).

- 38 -

A méréseket 400 mV potenciál, pH=5.5, 100 mM foszfát puffer, 300 U enzimcella paraméterek mellett végeztem. Az aszkorbinsav törzsoldatból 3 mM hígítást készítettem a vizsgálathoz. Hasonló eredményekre jutottam, mint a cellacserés megoldásnál, hiszen jól megfigyelhető, hogy alacsonyabb áramlási sebességeknél nagyobb arányú a detektált és enzimes jel különbség is, mivel hosszabb időt tölt a minta az enzim és elektrokémiai cellában. Azonban összességében elmondható, hogy markánsabban kimutatható az áramlási sebességcsúcsterület csökkenő tendenciájának összefüggése, ill. a cella csere folyamán megfigyelt áramlási sebesség és áramlási profilváltozásból eredő bizonytalanság is megszüntethető ezzel a mérési móddal.

Potenciálfüggés és regenerálódási idő Annak meghatározására, hogy milyen potenciálon lehet a legnagyobb aszkorbinsav jelet ill. jelkülönbséget kapni, potenciál pásztázást végeztünk az 50-500 mV tartományban. A megfelelő potenciál kiválasztásánál fontos, hogy a lehetőségekhez mérten a legalacsonyabb oxidációs potenciált alkalmazzuk, hiszen magasabb feszültségnél az eloxidálódó, interferáló anyagok mennyisége is megnő a kapott jelben.

17. ábra: Potenciálfüggés vizsgálat (A) az 50-500 mV tartományban ill. elektród regenerálódás (B) vizsgálat 200 µM és 400 µM aszkorbinsav koncentrációkkal. A növekvő oxidációs potenciálnál növekedett a kapott aszkorbinsav jel, enzimes jel mértéke is (A) ill. a megfelelő áramlási sebesség meghatározásánál a jelkülönbség nagyságán túl az elektródjel alapvonalra visszatérése is fontos volt (B –Minta/óra).

A méréseket 200 µM és 400 µM koncentrációkkal végeztük, hogy a hasonló tendenciák jól nyomon követhetőek legyenek. A mérés alapján 400 mV oxidációs potenciált választottuk,

- 39 -

hisz effölött nem növekszik számottevően az aszkorbinsav jel, s a vak és enzimes jel különbsége is itt legnagyobb (17. ábra A). Az áramlási sebesség hatása mellett mértem az egyes injektálások közötti regenerálódási idő hosszát is (injektálástól az alapvonalig (0,080 µA-es jelig) mért idő), mely a leghosszabbnak 0,35 ml/perc-nél 225-240 mp adódott, míg 0,65 ml/percnél a legrövidebbnek 130-145 mp (17. ábra B). Érdemes megjegyezni, hogy a legnagyobb regenerációs idő csökkenés 0,35-0,55 ml/perc közötti szakaszon volt: 75 mp. A megfelelő regenerálódási idő kiválasztása meghatározó lehet nagyobb mintaszám esetén, hiszen sorozatmérések során fontos szempont a mérés gyors kivitelezése. Ezek és a korábbi áramlási sebesség vizsgálatok alapján 0.5 ml/perc áramlási sebességet választottuk a későbbi vizsgálatokhoz.

Ionerősség függés vizsgálata Az ionerősség enzimes reakcióra és jelre gyakorolt hatásának vizsgálatát 20-100 mM foszfát puffer koncentráció tartományban végeztem, s bár a későbbiekben más anyagi minőségű puffereket is használtam, ezek esetében már nem végeztem ilyen jellegű vizsgálatot. Az alkalmazott paraméterek a következőek voltak: 400 mV potenciál, 300 U enzimcella, pH=5.6, szobahő, 0.5 ml/perc áramlási sebesség, 2 mM aszkorbinsav oldat minden puffer koncentrációnál. A két mérést 5 nap különbséggel végeztük el ugyanazzal az enzimcellával. Egyértelműen látszott, hogy nagyobb puffer koncentrációknál nagyobb a kapott jelkülönbség, ami elektrokémiai szempontból magyarázható a töltéshordozó ionok koncentrációjának növekedésével. Ez a jelnövekedés azonban nem jelentette azt, hogy az enzim aktivitás is nagyobb az egyes esetekben, mivel a teljes jelek százalékában arányos jelcsökkenésekről beszélünk (15% és 12,5%-os 18. ábra A és B). A 18. ábrán feltüntetett (A2 és B2) jelszázalékok a teljes aszkorbinsav jel továbbá a teljes aszkorbinsav jel és enzimes jel különbségének százalékos viszonyát mutatják. Irodalmi leírások szerint további vezetősó (100 mM KCl) hozzáadása növelheti a jelintenzitást, azonban ezen puffer koncentrációknál már csak a párhuzamos injektálások eredményén javított valamelyest. A párhuzamos injektálások szórása vezetősó hozzáadása előtt RSD +/- 5% volt, ezért használatát nem tartottuk indokoltnak.

- 40 -

18. ábra: Ionerősség függés mérése új enzimcellával (A1) s 5 nappal később ismételve (B1) 20-100 mM foszfát puffer koncentráció tartományban. A jelkülönbségek növekedése mellett a teljes jelek százalékában közel azonos enzim aktivitás volt kimutatható. Paraméterek: 400 mV potenciál, 300 U enzimcella, pH=5.6, szobahő, 0.5 ml/perc áramlási sebesség, 2 mM aszkorbinsav

pH és hőmérsékletfüggés vizsgálatok A pH függés vizsgálat tekintetében az volt a fontos, hogy az enzim pH optimuma eltolódotte az immobilizáció során, s ha igen milyen mértékben. A natív enzimforma pH optimuma pH=5.5-7.0 (Sigma-Aldrich, Product Information). Az első mérések során foszfát pufferben ellenőriztük a pH=5.0-7.0 tartományt (19. ábra A), s megállapítottuk, hogy a jelkülönbségek egyértelműen növekszenek a savasabb tartományban (19. ábra B), s ez az enzim aktivitás növekedésével magyarázható, hiszen a jelkülönbségek százalékában ugyanez a tendencia figyelhető meg. 2 injektoros összeállításban az alkalmazott paraméterek a következők voltak: 400 mV potenciál, 100 mM foszfát puffer, szobahő, 20 µl mintahurok, 2 mM aszkorbinsav oldat. Mivel a kapott eredmények alapján teljesen egyértelművé vált, hogy pH=5.0 alatt található az optimum az enzimreakció szempontjából, ezért a pH függés vizsgálatát a 2 injektoros összeállításban újra vizsgáltam, de ez alkalommal más puffer (Britton: 0.04 M H3BO3, 0.04 M CH3COOH, 0.04 M H3PO4 0.1 M NaOH-al beállítva ) használatával (20. ábra).

- 41 -

19. ábra: Enzimcella aktivitás pH függésének vizsgálata a pH=5.0-7.0 tartományban. A pH csökkenésével (A) a jelkülönbség százalékok növekedtek (B), ami az aktivitás növekedését jelezte. Paraméterek: 400 mV potenciál, 100 mM foszfát puffer, szobahő, 20 µl mintahurok, 2mM aszkorbinsav injektálva

A vizsgált pH tartomány pH=4.2-6.9, s a paraméterek 400 mV potenciál, 120 mM Britton puffer, szobahő, 20 µl mintahurok, 300 U enzimcella voltak. 200µM és 400µM aszkorbinsavat vizsgáltam, mivel ez már beleesett a későbbi kalibrációs tartományba.

20. ábra: Enzimcella aktivitás pH függésének vizsgálata a pH=4,2-6,9 tartományban 200 és 400 µM koncentrációjú aszkorbinsavval. Paraméterek: 400 mV potenciál, 120 mM Britton puffer, szobahő, 20 µl mintahurok, 300 U enzimcella

- 42 -

Elég nagy szórást tapasztaltam a 200 µM aszkorbinsav jelkülönbség százalékainak savas tartományú pH=4.0-5.0 eredményeiben, ami az enzimcella nem megfelelő aktivitása és injektálási hibákból adódhatott. Azonban így is megállapítható, hogy közelítőleg pH=4.3 és 5.0 közé tehető a pH optimum. A mérések kiegészítéseként UV (265nm-es) detektálás is történt, de ezt a fajta detektálást nagyban zavarta a pH változása, s ezért az eredmények sajnos nem hordoztak kiértékelhető információkat. Mivel az előzetes mérések alapján a valószínűsített optimális pH tartomány pH=4.3 és 5.0 közöttinek adódott, ezért ehhez a tartományhoz kerestem jó puffer kapacitású puffert, s így esett a választás az acetát pufferre (ecetsav pK=4,7). A későbbi reális mintákkal történő mérések során az alkalmazott 200 mM koncentrációban ennél a puffernél volt tapasztalható a legkisebb pH ingadozás. A kérdéses pH tartomány ellenőrző vizsgálata ezért már acetát pufferben készült (21 B ábra), ami alapján elmondható, hogy a pH optimum pH=4.3-5.0 közé tehető. A reakcióteret jelentő enzimcella termosztálását fém tartószerkezet és vízfürdő segítségével oldottuk meg. A hőmérsékletfüggés vizsgálatánál nehézséget okozott az enzimcella (így a reakció tér) hőmérséklet mérése.

21. ábra: Hőmérsékletfüggés (A) mérése 400mV potenciál mellett, 0,55 ml/perc áramlásnál, 300 U enzimcella, pH=4.7, 200mM acetát puffer, 3 mM aszkorbinsav és pH függés (B) mérése 400mV potenciál mellett, 200 mM acetát puffer, 0,5 ml/perc áramlásnál, 300 U enzimcella

A plexi anyagú cella rossz hőátadása miatt a gőztérbe helyezett hőmérő nem a valóságosnak (az enzimcellának) megfelelő hőmérsékletet mutatta, s ezért ezek a mérések nem voltak

- 43 -

megbízhatóak. Azonban a cella furatolása és a hőmérő furatba helyezése, valamint a cella alsó rész aluminium anyagra cserélése nagyban megkönnyítette a hőmérséklet mérést. A későbbiekben az aluminium alsó rész kontakt-hőmérős ellenőrző mérése tovább növelte a mérési stabilitást. Általánosságban elmondható, hogy a várható eredményekkel egybevágó végeredménnyel zárult a hőmérsékletfüggés mérése. A vizsgált 27-40 ºC tartományban (21 A ábra) 36 ºC-ig stabil aktivitás volt kimutatható, azonban felette már számottevő aktivitás csökkenés volt megfigyelhető. Ezek a mérések 400 mV potenciál mellett, 0,5 ml/perc áramlásnál, 300 U enzimcella, pH=4.7, 200 mM acetát puffer mellett folytak. A mérési eredmények alapján a későbbi mérések kivitelezésére a 33 ºC-ot választottuk.

III.1.13 Enzimcella élettartama A cella élettartam vizsgálathoz egy adott enzimcella egymást követő napokon kapott kalibrációs görbéinek meredeksége és a kalibrációs görbeilleszkedések megfigyelése szolgált információval (22. ábra).

22. ábra: A 250 U aktivitású enzimcella kalibrációs görbéinek változásai (Rˇ2- illeszkedés, Meredeksegillesztett görbe meredeksége) a vizsgált időszakban

A kérdéses 250 U névleges aktivitású cellát 18 nappal a használat előtt készítettük, s felhasználásig szárazon, hűtőben tároltuk (4 ºC). Felhasználás előtt a cella 2,5 órás acetát pufferes kondícionálása, majd még ugyanazon a napon (márc. 28) kalibrációs mérés történt. Az első használat után az egyes napok között a cellát hűtőben tároltuk pH=5.6, 66 mM foszfát

- 44 -

pufferen. Az adott 1 hetes vizsgálati periódusban a kalibrációkat követően a 2. táblázatban feltüntetett reális minták mérése történt meg. 2. táblázat: 250 U aktivitású enzimcellával vizsgált reális minták a megfigyelt 1 hetes időszakban

29. márc

30. márc

03.ápr

04. ápr

05. ápr

06. ápr

Móri ezerjó Móri ezerjó Móri ezerjó Multivitamin Multivitamin Multivitamin (bor)

(bor)

(bor)

tabletta

tabletta

ivólé

Amint az a 22. ábrán látható a görbe illeszkedés javult az idő előrehaladtával (kiv. 04.04., ami mérési hibából adódhat), ami az enzimfehérje hidratálódását jelzi. A 04.06. dátummal kapott eredmény, azaz a rosszabb kalibrációs illeszkedés eredménye, már viszont köthető az enzimreakció stabilitás csökkenéséhez. A kalibrációs görbe meredeksége mindeközben tendenciálisan csökkent, ami arra enged következtetni, hogy csökkent a cellaaktivitás. Külön érdekes, hogy a 03.30-04.03. időszakban a hosszabb foszfát pufferes állás kis mértékben segíteni látszott a cella regenerálódásban, hiszen kis mértékű növekedés volt tapasztalható a kalibrációs görbe meredekségében. Mivel a görbemeredekség változásai a kiindulási jel nagyságától is függnek, ezért megfigyeltük az enzim nélküli vak jelek változásait is (3. táblázat), amik csökkenő tendenciát mutattak, ami viszont mutatja az üvegesszén elektród reális mintákra és azokban található elektroaktív komponensekre való érzékenységét. Érdemes megfigyelni a reális minták vizsgálatánál bekövetkező elektródfelszín változás hatását, hiszen a jelnagyságban bekövetkező jelentős csökkenések (9,5%, és 12,2%) a borminták injektálása után figyelhető meg, míg a multivitamin tablettára irányuló vizsgálatok során kisebb mértékű ez a változás. 3. táblázat: 100 µM koncentrációjú aszkorbinsavra mért vak jelek nagysága és a jelcsökkenésből számolt enzimaktivitás alakulása (százalékban) a vizsgált időszakban.

0,1 mM vak jel (nA*s)

28.márc

29.márc

30.márc

17530

17594

15888

03.ápr 15975

04.ápr 14019

05.ápr 14702

06.ápr 14449

Cella aktivitás 39,93725 35,87587 32,47105 33,14554 29,38869 26,83308 28,51408 (%)

Továbbá a napi szintű aszkorbinsav jelekből számolt enzimaktivitás változások a 22. ábrán tapasztalt cellaaktivitás csökkenést mutatták.

- 45 -

III.1.14 Reális minták vizsgálata A bioszenzor reális mintákon történő tesztelése során elsősorban folyadék halmazállapotú minták vizsgálatát végeztem, nevezetesen multivitamin pezsgőtabletta, bor (spiking technikával), és multivitaminos gyümölcslé.

Kalibráció A foszfát pufferes vizsgálatoknál a mintahígítások során elég nagy pH (3-5 tized) eltolódást tapasztaltam, ami a HPO3 hatására bekövetkező pufferkapacitás csökkenéssel magyarázható. Ezen jelenséget kiküszöbölendő új, jobb puffer kapacitású oldatot kerestem. Kipróbálásra került Na2HPO4-citrát puffer, és K-acetát-CH3COOH melyek közül az acetát puffer jónak bizonyult. A stabilabb pH érték biztosítása érdekében a méréseket az ecetsav pK értéke körüli pH-n végeztem pH=4.7-nél. Az acetát pufferes kalibráció eredménye a 23. ábrán látható.

23. ábra: Kalibráció felvétele a 25-400 µM aszkorbinsav koncentráció tartományban. Paraméterek: 400 mV potenciál, pH=4.7, 100 mM acetát puffer, 100 mM KCl, 300 U enzimcella, áramlás 0,5 ml/perc, 33ºC hőmérséklet

A mérések során 400 mV, pH=4.7, 100 mM acetát puffer, 100 mM KCl, 300 U enzimcella, áramlás 0,5 ml/perc paraméterek mellett végeztem. A hígításokat 10 mM aszkorbinsav törzsoldatból végeztem (25-400 µM tartomány).

- 46 -

Amint látható ebben a pufferes közegben elég jó illeszkedésű kalibrációt sikerült megvalósítani (hozzá kell azonban tenni, hogy foszfát pufferes kalibráció során nagyobb arányú jeleket kaptam, s ez a hiba szempontjából előnyösebb). Minden nap új kalibrációt készítettem el, mivel az elektród jele néha egymást követő napokon is számottevően változott.

Bor minták A bor komplex mátrixát (etil-alkohol, glükóz, almasav, borkősav, csersav, polifenolok, glicerin, természetes színanyagok) tekintve ideális tesztelésre, s bizonyos bor készítési eljárásoknál adnak is aszkorbinsavat a borokhoz, forrásban lévő musthoz az un. oxidatív sokk megakadályozására (~60-100 µM koncentráció). Mivel az általam vizsgált borokban nem volt ténylegesen kimutatható az aszkorbinsav, ezért hozzáadott anyag visszamérését próbáltam. 1. mérés 1. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 4 cm3 acetát puffer (minta pH=4.53) 2. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1 cm3 400 µM aszk. s. old. + 3 cm3 acetát puffer (minta pH=4.53, 80 µM hígítási koncentráció) A vak mintára mért aszkorbinsav tartalom 17 µM-nak míg a 2. mintára kapott eredmény 97 µM-nak adódott. 2. mérés 1. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 4 cm3 acetát puffer 2. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1 cm3 200 µM aszkorbinsav + 3 cm3 acetát puffer 3. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1 cm3 400 µM aszkorbinsav + 3 cm3 acetát puffer 4. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1,5 cm3 400 µM aszkorbinsav + 2,5 cm3 acetát puffer A visszamért mennyiségek rendre: 1. 9 µM, 2. 53 µM, 3. 73,5 µM, 4. 116 µM 3. mérés 1. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 4 cm3 acetát puffer 2. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1 cm3 200 µM aszkorbinsav + 3 cm3 acetát puffer 3. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1 cm3 400 µM aszkorbinsav + 3 cm3 acetát puffer 4. minta: 1 cm3 Móri Ezerjó (2005) + 1,5 cm3 400 µM aszkorbinsav + 2,5cm3 acetát puffer A visszamért mennyiségek rendre: 1. N.A., 2. 15,5 µM, 3. 57,2 µM, 4. 81,1 µM

- 47 -

A mérések összesített eredményei a 4. táblázatban láthatók. Mivel a mérések során tapasztalt hiba okaként az esetleges zavaró anyagok oxidációja emelhető ki, ezért a következő méréseket 200 mV-os potenciálon kíséreltem meg, hogy tapasztalható-e javulás.

4. táblázat: A Móri ezerjó fehérbor méréseinek eredményeit összefoglaló táblázat (az 1/5 v/v hígított borra és a standard addícióval aszkorbinsav törzsoldatból bemért mennyiségekre kapott eredmények)

Móri ezerjó 1. mérés 2. mérés 3. mérés

Bor, mért Számított 40 µM Számított 80 µM Számított 120 µM Elvárt (µM) (µM) st. add (µM) st. add (µM) st. add (µM) 17 0 40 97 80 120 9 0 53 40 73,5 80 116 120 NA 0 15,5 40 57,2 80 81,1 120

4. mérés 1. minta: 1 cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 4 cm3 acetát puffer 2. minta: 1cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 1 cm3 200 µM aszkorbinsav + 3cm3 acetát puffer 3. minta: 1cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 1 cm3 400 µM aszkorbinsav + 3cm3 acetát puffer A visszamért mennyiségek rendre: 1. 7,25 µM, 2. 42,7 µM, 3. 89,4µM, 4. N.A. 5. mérés 1. minta: 1 cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 4 cm3 acetát puffer 2. minta: 1 cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 1 cm3 200 µM aszkorbinsav + 3cm3 acetát puffer 3. minta: 1 cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 1 cm3 400 µM aszkorbinsav + 3cm3 acetát puffer 4. minta: 1 cm3 Verpeléti Hárslevelű (2004) + 1,5 cm3 400 µM aszkorbinsav + 2,5cm3 acetát puffer A visszamért mennyiségek rendre: 1. 24µM, 2. 64,7µM, 3. 132,9µM, 4. 155,2µM A mérés pontosságán a 200 mV-on történő mérés sem segített (a mérések eredményeit a 5. táblázat összegzi), ezért vak cellás ellenőrző méréseket végeztem az injektálás hibájának

- 48 -

kiszűrésére. Ezen mérések alapján megállapítást nyert, hogy az alacsonyabb koncentrációknál nagyobb mértékű a hiba, ami viszont valószínűleg az integrálás hibájával magyarázható. 5. táblázat: A Verpeléti hárslevelű fehérbor méréseinek eredményeit összefoglaló táblázat (az 1/5 v/v hígított borra és a standard addícióval aszkorbinsav törzsoldatból bemért mennyiségekre kapott eredmények)

Verpeléti 4. mérés 5. mérés

Bor, mért Számított 40 µM Számított 80 µM Számított 120 µM Számított (µM) (µM) st. add (µM) st. add (µM) st. add (µM) NA 7,25 0 42,7 40 89,4 80 120 24 0 64,7 40 132,9 80 155,2 120

Mulitivitamin pezsgőtabletta mérése Az acetátos kalibrációval multivitamin pezsgőtablettát is vizsgáltam, s ez alapján a következő eredményre jutottam kalibráció után (összesített eredmények a 6. táblázatban). 1. mérés 1 tablettát (60 mg aszkorbinsav/4,1162 g tabletta) 100 cm3 HPLC vízben oldottam fel (3,406 mM aszkorbinsav), 250 µl oldatot hígítottam 4750 µl acetát pufferrel (~170 µM konc.). Kalibráció alapján visszamért mennyiség 179,3 µM, ami a teljes mennyiségre visszaszámolva 63,1 mg aszkorbinsav. 2. mérés 1 tablettát (60 mg aszk. s./3,8473g tabletta) 100 cm3 HPLC vízben oldottam fel (3,406 mM aszkorbinsav), ezt hígítottam acetát pufferrel 10x, 20x és 40x-ére ( ~340µM,~170µM, ~85µM konc.). A kalibráció alapján visszamért mennyiségek 97µM (68,3mg), 172µM (59,2mg) és 328µM (57,8mg). 6.

táblázat: A multivitamin tabletta méréseinek eredményeit összefoglaló táblázat (a 60 mg aszkorbinsav tartalmú tabletta, különböző mértékű hígításaira kapott eredmények)

Multivitamin tabletta 1. mérés 2. mérés

40x híg (µM)

Számított 20x híg Számított 10x híg Számított (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) 179,3 170 97 85 172 170 328 340

- 49 -

Multivitamin ivólé vizsgálata Kalibráció után Cappy Ice Fruit multivitamin rostos ivólé vizsgálatát végeztem (9 mg aszkorbinsav/100 cm3 ivólé, ~511 µM koncentráció) a multivitamin tabletta vizsgálatánál leírt módon. Hígítások 2x (~255 µM), 5x (~102 µM), 10x (~51 µM). Visszamért mennyiségek: 2x- N.A., 5x- 355 µM, 10x- 258 µM. Amint az eredményekből látható a minta mátrixában található festék és egyéb oxidálható zavaró anyagok nagyon befolyásolták a kapott jelek nagyságát, illetve a meghatározás kivitelezhetőségét, mivel tartósabban megváltoztatják a munkaelektród felületét. Esetleges szűrés után akár jobban használható a módszer, bár a legkézenfekvőbb a zavaró hatást okozó komponensek kiszűrése lenne, melyhez azonban az egyes komponensek zavaró hatását külön külön és kombinációban vizsgálni kellene.

Összegzés A kifejlesztett két injektoros és egy cellás bioszenzor az optimális működési paraméterek meghatározása után megfelelő kalibrációra alkalmas volt 25-400 µM tartományban. Reális minták vizsgálata során fehérbor, multivitamin pezsgőtabletta és multivitamin ivólé elemzését végeztük. A multivitamin tabletta esetén hígítástól függően ~3,5-14% eltéréssel lehetett az aszkorbinsav koncentrációt meghatározni. A másik két mátrix eredményei alapján a fehérborban és multivitamin ivólében található könnyen oxidálható komponensek zavaró hatásúak az aszkorbninsav meghatározás szempontjából. Valószínűleg a minták polifenol tartalma (flavonok, fenolsavak, antocianinok, tanninok) jelent a munkaelektródon lejátszódó oxidáció szempontjából nehézséget, ami a munkaelektród felszínén kialakított inkább kis molekulákra pl. aszkorbinsav áteresztő membrán felhasználásával akár kiküszöbölhető lehet.

- 50 -

III.2 Aflatoxin M1 mérésére alkalmas bioszenzor fejlesztése III.2.1 Irodalmi háttér Az

aflatoxinok

vizsgálatát

általában

vékonyrétegkromatográfia

(TLC)

[67],

folyadékkromatográfia (LC) [67], nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) [68] és hagyományosabb immunoelemzéses (mint az enzim csatolt immunokapcsolásos elemzés – ELISA) módszerekkel végzik [69,70]. Mivel azonban ezek a módszerek érzékenység és detektálási határ tekintetében korlátozottak [71], ezért az újabb, hatékonyabb főként immunoelemzés alapú módszerek fejlesztése folyamatos [72,73]. Az újabban megjelent élelmiszerminőségi és élelmiszerbiztonsági szabályozások igényelik az új típusú, megbízható elemzési módszereket. Az elektrokémiai impedancia spektroszkópia (EIS) a vezető és félvezető felszínek változásait roncsolásmentesen vizsgálja, ezért jól használható a biomolekuláris kölcsönhatások dinamikájának követésére [18]. Mivel, mikor az antitest reakcióba lép az antigénnel, megváltoznak az elektród-oldat határfelület elektromos tulajdonságai, ezért az EIS [74-76] megfelelő az adszorpciós és töltés átviteli folyamatok megfigyelésére olyan technikák mellett, mint a Felszíni Plazmon Rezonancia (SPR) [77] és Kvarc Kristály Mikromérleg (QCM) [78]. Impedimetriás mérések jelerősítésére gyakran használnak vezető tulajdonságú anyagot, így arany nanorészecske tartalmú önrendeződő monoréteget már alkalmaztak, hogy növeljék egy impedimetriás

szenzor

érzékenységét

[79].

Aflatoxin

B1

kimutatására

ugyancsak

kifejlesztettek EIS alapú módszert, mely a felszínen elektropolimerizált vezető tulajdonságú polimer töltésátviteli ellenállás változásain alapult (Rct) [80]. Más esetben arany nanorészecske alapú üreges „labdát” módosítottak anti-AFB1 antitestekkel, hogy QCM technikával AFB1-et mérjenek [81]. Ülepítési reakción keresztül jó érzékenységű lúgos foszfatázzal

jelzett

SPR

alapú

immunoszenzort

fejlesztettek

egérből

izolált

IgG

felhasználásával [82]. Más irodalmi leírás alapján aflatoxin B1-marha szérum albumin konjugátum (AFB1-BSA) kötése történt dextrán gélben és a kompetíciós reakció követését SPR technikával végezték [83].

- 51 -

III.2.2 Célkitűzés Az aflatoxin M1 olyan élelmiszerszennyező, ami az emlősök tejében mutatható ki, s a táplálékkal elfogyasztott aflatoxin B1 metabolikus változata. Mennyiségének meghatározása fontos a tej minőségének, emberi fogyaszthatóságának megállapításában. A kutatómunka második részében az aflatoxin M1 kimutatására és mérésére használható egyszerű kivitelű módszer kifejlesztése volt a cél. További cél volt, hogy a fejlesztést olyan kis méretű, eldobható kivitelben valósítsuk meg, mely impedancia alapú és a szükséges érzékenységet valamilyen jelerősítő módszerrel érjük el.

III.2.3 Elektrokémiai Impedancia Spektroszkópia Az EIS nagyon hatékony módszer a vezető tulajdonságú anyagok és felületek tanulmányozásában [91-94]. Az elektrokémiai technikák a felületi jelenségeket vizsgálják a feszültség és az áram kapcsolatán keresztül. Ebben az esetben gerjesztő áramot vagy feszültséget irányítunk a munkaelektródra, s az erre adott válaszreakciókat vizsgáljuk, ami számos információval szolgál a rendszer kinetikai, termodinamikai és mechanikai sajátosságairól. A leggyakoribb elektrokémiai technikákkal szemben, melyek közvetlen áramon alapszanak, mint pl. a kronoamperometria vagy a voltametria, az EIS egy kis amplitúdójú szinusz hullám potenciál szuperpozícionálását jelenti egy állandó polarizációs potenciálra (2. egyenlet). E (t) = Epolarizáció + ∆E(ωt)

(2)

Ahol Epolarizáció a munkaelektród referenciával szemben mért alappotenciálja, ∆E a szinuszhullám amplitúdó és ω a radiálban megadott jelfrekvencia. A kis amplitúdójú (∆E) gerjesztő potenciál (E(t)) egy fix feszültség (Epolarizáció) körül oszcillál adott frekvenciával (ω=2πf), s erre a vizsgált rendszer válaszjellel reagál. Ha a rendszer lineáris (azaz kis amplitúdójú a gerjesztő potenciál), akkor a válasz egy ugyanolyan szinuszos áram, de a feszültségtől különböző amplitúdóval és frekvenciával. Nem lineáris esetben azonban a válasz sokkal összetettebb, nem szinuszos természetű, bár továbbra is periodikus. Vizsgálati szempontból a szinuszos természetű válaszjel modellezhető le, melyet a következő képlet ír le (3. egyenlet). i = I sin (ωt+φ)

(3)

ahol i az áramerősség, I az amplitúdó és ωt+φ φ-vel eltolódott frekvencia.

- 52 -

. 24. ábra: A kis amplitúdójú gerjesztő potenciál és az arra adott válaszjel összefüggése

25. ábra: Az impedancia mérésekhez szükséges gerjesztő jel generáló híd áramkör

A mérés során a gerjesztő potenciálra adott jel (24.-25. ábra) az elektródfelületi viszonyok függvénye, azaz egy teljesen „tiszta” ellenállás esetében nem lesz fázis eltolódás a gerjesztő potenciáljel és áramerősség között, míg egy teljesen „tiszta” kapacitás esetén a fázis eltolódás π/2 (90°). Természetesen reális mérési esetben e két faktor keveredéséről van szó (E(t)= Epol + ∆E sin(ωt), I(t)= ∆I sin(ωt+Φ)). Egy egyszerű rendszerrel kapcsolatban is megjegyezhető, hogy minden frekvencia esetén a válaszjel hordoz kapacitív ill. ellenállással kapcsolatos információkat, csak a súlyozottságuk más a jelben. Az általános Ohm törvény úgy írja le az impedanciát (Z(ω) Ω-ban), mint az alkalmazott szinuszos potenciál és a kapott áramerősség hányadosát (4-6. egyenlet). (4) (5)

- 53 -

(6) Kizárólag ellenállást tartalmazó áramkörben a Zre(ω) (valós) komponens található meg inkább, kizárólag kapacitás jellegű áramkör esetén a Zim(ω) (imaginárius) a domináló. Az impedanciát a Zim(ω) és a Zre(ω) ordináta és abszcissza tengelyen történő ábrázolással vektorként is meg szokták jeleníteni. További ábrázolás mód a két érték által meghatározott vektor értékének és a hozzátartozó frekvenciának a logaritmusos megjelenítése (27. ábra). A legáltalánosabban használt modell áramkör az úgynevezett Randles féle, mely egyszerű elemekkel ír le az impedimetria számára egy elektrokémiai cellát. A benne található részek az oldat ellenállássával (RΩ), az elektromos kettősréteg kapacitásával (Cd) és a Faraday folyamatokat leíró általános impedancia (Zf) elemmel azonosíthatók (26. ábra).

26. ábra: Az impedimetriában gyakran használt elektrokémiai cellát leíró Randles áramkör modellje, RΩ -oldat ellenállás, Cd -elektromos kettősréteg kapacitása, Zf -általános impedancia [95]

Az általános impedancia elem (Zf) tovább bontható egy töltés átviteli ellenállás (Rct) és egy úgynevezett Warburg impedancia elemre (Zw), amit kapacitás jellegű tömegáramlási ellenállásként azonosítanak. Az utóbbi elemek a frekvencia változással ugyancsak jelentősen változnak, így az impedimetriás mérések feladata ezen elemek frekvencia függésének meghatározása, s ezáltal kémiai információ szolgáltatása.

27. ábra: Az imaginárius és valós impedancia (Nyquist) ábrázolása ill. az impedancia modulus és frekvencia logaritmusának (Bode) ábrázolása egy egyszerű kapacitás és ellenállás tartalmú áramkörre (2 párhuzamos RC tipusú elemre modellezve R=100Ω, C=1µF).

- 54 -

Egy egyszerű rendszer esetén nagyon magas és alacsony frekvenciákon inkább az ellenállás (oldat és felületi töltésátviteli) a meghatározó a jelben. A mérés optimalizálása és kiértékelése szempontjából azonban lényeges annak ismerete, hogy milyen közeget befolyásoló részelemekre bontható a vizsgálandó rendszer, azaz milyen egyenértékű áramkörrel írható le. Esetünkben az oldat ellenállással (Rs) párhuzamosan kötve egy kapacitás (Cdl – az elektród felszínen kialakuló elektromos kettős réteg töltéséből) és egy ellenállás (Rct – az elektródon végbemenő oxidációs redukciós folyamatok eletron-átmeneti folyamataival szembeni ellenállás) modellezi legjobban a rendszerünket (28. ábra). 28. ábra: A mért rendszer modellezésére és a mért adatok kiértékelésére szolgáló egyenértékű áramkör

Az impedanciás mérések kivitelezése a már korábban kifejlesztésre került, s a laborban készített nyomtatott elektródokkal történt (29. ábra). Az elektród elkészítésének módszerét a francia kutatócsoport korábbi kutatómunkáiban írta le [84,85].

1

2

3

4

5

29. ábra: A kis méretű (cm lépték) nyomtatott elektródok készítési fázisai. (munka és ellenelektród grafit, referencia Ag-AgCl). A kész elem kör alakú munkaelektród részén (5. fázis) játszódott le a kötődési és elektroülepítési reakció. Az elkészítési fázisok sorban a következőek: 1. Ezüst tartalmú vezető réteg, 2. Az elektródok alapját képező grafit réteg , 3. Ag/AgCl referencia elektród kialakítása, 4. Szigetelő fedőréteg, 5. Munkaelektród módosítása

- 55 -

III.2.4 Aflatoxinok Az aflatoxinokkal kapcsolatos probléma először 1960-ban került az élelmiszerbiztonság középpontjába, amikor Angliában a nagy baromfitelepeken százezer számra pusztultak el a fiatal szárnyasok. A kór „pulyka ’X’betegség”-ként vált ismerté. 1961-ben Sargeant és mtsai kimutatták, hogy a betegséget a takarmányba kevert penészes földimogyoró, pontosabban a rajta lévő Aspergillus flavus által termelt rákkeltő anyag okozta. Ezt az anyagot aflatoxinnak nevezték el. A mikotoxinok (AFM1, AFB1, AFG, OTA, etc.) általában mezőgazdasági terményekben [96] és takarmányokban [97,98] találhatók. Az aflatoxin M1 (AFM1) az aflatoxin B1 (AFB1) hidroxilált metabolitja és megtalálható olyan tejet adó állatok tejében vagy tejtermékében, amik Aspergillus flavus vagy Aspergillus parasiticus fajjal fertőzött takarmányt ettek [99]. Az aflatoxinok potenciális máj karcinogének és DNS-károsító anyagok.

1987-ben az

Egészségügyi Világszervezet (WHO) 1. Osztályú karcinogénnek minősítette, s a legfrissebb élelmiszer minőségi szabályozásoknak is tárgya volt [100], az Európai Közösség az aflatoxin M1 megengedett koncentrációját tejben és tejtermékekben 0.050 ppb (µg/kg)-ban [101] határozta meg felnőttekre és 0.025 ppb (µg/kg)-ban gyerekekre és csecsemőkre [102]. Az aflatoxinok mérésére irányuló kutatások és eredményeik összefoglalását megtalálhatjuk az irodalmi leírásokban [103,104]. Aflatoxinok előfordulása Az aflatoxinok az aspergillus penészgombák (Aspergillus flavus, Aspergillus nominus és Aspergillus parasiticus) által termelt másodlagos metabolitok. Leggyakrabban különböző gabonákban (búza, rizs, köles, zab stb), fűszerekben (paprika, bors, chili), olajosmagvakban (földimogyoró, mandula, pisztácia, szója, napraforgó mag) található meg. A legfontosabb aflatoxin termelő penészgomba az A. flavus. Az egész világon elterjedt, talajban, bomló növényi részeken, raktározott magokon fordul elő. Elsősorban a trópusi, szubtrópusi éghajlaton jellemző, de esősebb meleg nyarakon a mérsékelt égövben is problémát okoz.

- 56 -

Aflatoxin típusai A kutatások során 18 különböző aflatoxin típust különítettek el. Ezek közül a legfontosabbak az aflatoxin B1 (AflB1, CAS No: 1162-65-8); aflatoxin B2 (AflB2, CAS No: 7220-81-7); aflatoxin G1 (AflG1, CAS No: 1165-39-5); aflatoxin G2 (AflG2, CAS No: 7241-98-7). Az A. flavusból és A. parasiticusból izoláltak kisebb mennyiségben termelődő M1 és M2, B2A, G2A típusú aflatoxint. Az aflatoxin M1 és M2 az aflatoxin B1 és B2 metabolitja, ami főként olyan állatok tejéből mutatható ki, amelyek aflatoxinnal szennyezett takarmányt kaptak. Aflatoxinok szerkezete Az aflatoxinok difurán-kumarin származékok, amelyek kémiai szerkezetük alapján két nagy csoportba sorolhatók. Az aflatoxin B1, B2, B2A, M1, M2 a difurokumarociklopentenon csoportba tartoznak, míg az aflatoxin G1, G2, G2A a difurokumarolakton csoportba sorolhatók (30. és 31. ábra).

30. ábra: Aflatoxin M1, M2, B2A, G2A szerkezete

- 57 -

31. ábra: Aflatoxin B1, B2, G1, G2 szerkezete

Az aflatoxinok metanolban, acetonban, kloroformban kiválóan, vízben jól oldódnak. Az aflatoxin B1 és B2 ultraibolya fénnyel megvilágítva kéken fluoreszkál, míg az aflatoxin G1 és G2 zölden. Nem egyformán mérgező hatásúak. Leginkább mérgező közülük a B1, majd a G1, a B2 és végül a G2 következik. Az állatoknak e toxin iránti érzékenysége is más és más fokú. A kacsa és a pulyka halálos adagja 0,02 mg, vagyis 1 mg ötven állatnak az elpusztításához elegendő. Az emlősállatok közül a sertés a legérzékenyebb, a szarvasmarha, a ló és a juh már jobban ellenáll e méregnek. Aflatoxin kémiai tulajdonságai 7. táblázat: A fontosabb aflatoxinok néhány tulajdonsága Aflatoxin

Összegképlet

Molekulasúly

Olvadáspont

B1

C17 H12O6

312

268-269

B2

C17 H14O6

314

286-289

G1

C17 H12O7

328

244-246

G2

C17 H14O7

330

237-240

M1

C17 H12O7

328

299

M2

C17 H14O7

330

293

B2A

C17 H14O7

330

240

G2A

C17 H14O8

346

190

- 58 -

Az aflatoxinok hőstabil vegyületek, 160 °C hőmérsékletet egy órán át, változás nélkül elbírnak (viszonylag magas olvadáspont – 7. táblázat), és csak 300 °C fölött károsodnak szembetűnően. Ilyen magas hőmérsékleten valószínűleg a lakton gyűrű felnyílik és dekarboxileződik. Lúgos oldatokban a lakton hidrolizálódik, de ez a folyamat reverzibilis. Magas hőmérsékleten, ha a lakton gyűrű felnyílt a reakció tovább mehet és az aromás gyűrűről egy metoxi csoport válik le. Az aflatoxin B1 és G1 szervetlen sav jelenlétében, B2A és G2A-vá alakul (molekulasúly növekedés – 7. táblázat). Oxidatív anyagokkal (pl: hidrogén peroxid, ózon, kálium-permanganát) az aflatoxin szintén reakcióba lép, amelynek egyik bizonyítéka, hogy a molekula ultraibolya fény alatt kevésbé fluoreszkál. A pontos folyamat és a reakció során keletkezett termékek még nem ismertek.

III.2.5 Immunoszenzorok Az antitestek (immunoglobulinok, Ig) többfunkciós kötő fehérjék, amiket a gerincesek immunrendszere termel, s fontos szerepük van a szervezet védelmi mechanizmusában. Specifikusan képesek felismerni baktériumokat, toxinokat, s gyakorlatilag bármilyen ligandummal szemben kifejleszthetők. Az olyan anyagok, melyek szervezetbe jutva antitest termelést

indukálnak,

az

antigének.

Általában

ezek

makromolekulák:

fehérjék,

oligoszacharidok. Az antigén azon része, mely az antitesthez képes kötődni az ú.n. epitóp, amiből több különböző is található egy antigénen belül. Ezen részekhez történő specifikus kötődés során alakul ki az antitest-antigén komplex. Az antitestek molekula felismerő képességével az immunoszenzorok nagymértékű szelektivitása érhető el, bár nem mellőzhető, hogy affinitási állandók különbségei jelentősen befolyásolhatják a szelektivitást. Az immunoszenzorok két nagy csoportra bonthatók: jelzett és nem jelzett szenzorok [59,105]. A nem jelzett immunoszenzorokat úgy tervezték, hogy az antigén-antitest immunokomplex

kialakulása közvetlenül meghatározható legyen

fizikai változások

követésével, míg a jelzett módszerek esetén egy könnyen detektálható jelzőanyagot (jelerősítő) is alkalmaznak. Az első esetben az antigén vagy antitest szilárd mátrixba ágyazása adja az érzékelő felszínt, s a szilárd hordozó karakterisztikájában bekövetkező változások

- 59 -

követhetők (leggyakrabban elektród, membrán vagy piezoelektromos anyag). Az oldatban található, meghatározandó antigén vagy antitest felszínhez kapcsolódásának hatására megváltozik az elektród potenciál, transzmembrán potenciál, belső piezofrekvencia vagy optikai tulajdonság. A módszer nagyfokú szelektivitása a beágyazó mátrix nem-specifikus adszorpciójával párosul. A szelektivitás és érzékenység növelése érdekében különböző jelző (nem radioaktív izotóp alapú) anyagokat/molekulákat használnak (8. táblázat). Ha enzimet használnak jelerősítésre, akkor az antigénhez vagy antitesthez kötik kovalensen a fehérjét pl. kataláz enzimet, melyet aztán oxigén elektróddal kötnek össze. 8. táblázat: Nem-izotópos immunoszenzor jelző molekulák (FITC- fluoreszcein izotiocianát, DTPA-In dietilén triamin pentaecetsav-In komplex)

Jelző molekula Enzim

Meghatározás Kataláz, Glükóz oxidáz

O2 amperometriás

Peroxidáz, Luciferáz

Lumineszcens

Ureáz

Fenol potenciometriás

Katalizátor

Hemin

Lumineszcens

Fluorofór

FITC

Floureszcens

Elektroaktív komponens

Ferrocén

Amperometriás

DTPA-In

Elektrokémiai lumineszcens

Pirén

Elektrokémiai lumineszcens

Luminol

Elektrokémiai lumineszcens

Ionos jelző

Potenciometriás

Liposzóma

- 60 -

III.2.6 Anyagok és módszerek Anyagok Minden felhasznált reagens analitikai tisztaságú volt, s nem igényelt további tisztítást. Marha szérum albumin (BSA), BSA-aflatoxin M1 konjugátum (BSA-AFM1), 20 nm kolloidális arany oldat, AMPSO- nátrium (3-[(1,1-dimetil-2-hidroxietil) amino] 2hidroxipropánszulfon sav) só, KCl, NaCl, Tween 20®, Na2HPO4, KH2PO4 a Sigma-Aldrichtól kerültek beszerzésre. AgNO3 só a Flukától és a NH4NO3 Prolabotól származott. Az egérben kifejlesztett anti-aflatoxin M1 antitestet francia forrásból szereztük be. Minden itt nem említett reagens a Sigmatól volt, s minden oldat desztillált víz felhasználásával készült.

Kolloidális arany antitest konjugátum készítése Az antitest-kolloidális arany konjugált az irodalmi leírásoknak megfelelően készült [84]. 25 µl 15 mM koncentrációjú pH=7.4 PBS (phosphate buffered saline) oldatban készített 0.9 mg/ml koncentrációjú anti-aflatoxin M1 antitest oldatot, 100 µl 20 mM pH=9.0 AMPSO puffert, 1 ml 20 nm kolloidális arany oldatot és 10 µl 0.1 M NaOH oldatot kevertünk össze. 30 perces inkubációt követően szobahőmérsékleten 100 µl, AMPSO pufferben készített 1 m/v % BSA oldatot adtunk az elegyhez és 6000 rpm fordulatszámmal centrifugáltuk (Eppendorf® Minispin centrifuga) 30 percig 4 °C-on. Centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk, s 1 ml AMPSO pufferben készített 0,1 % w/v BSA oldatot adtunk a kivált anyaghoz, és megismételtük a centrifugálást. A felülúszó újbóli eltávolítása után a visszamaradt anyagot 100 µl 15 mM pH=7.4 PBS oldatban oldottuk fel s 4°C-on tároltuk felhasználásig.

Immunoszenzor elkészítése Az elektród előkezelést 10 ciklus ciklikus voltametriával végeztük a -0,5 V és 1,1 V közti tartományban, 0,1 V/mp pásztázással, 0,01 V potenciál lépésközzel 0,5 M H2SO4-ban. A maradék sav eltávolítására desztillált vizes mosást alkalmaztunk. 20 µl 15 mM pH=7.4 PBS-ben készített 15 mg/L koncentrációjú BSA-AFM1 konjugátumot egész éjszakás hűtőben (4°C-on) állással adszorbeáltattunk a nyomtatott elektródok munkaelektród részén vízgőzzel telített környezetben. A felszín blokkolási lépést 1% 15 mM pH=7.4 PBS-ben készített BSA oldattal végeztük 1 órán keresztül szobahőn. A blokkolási

- 61 -

lépés után vagy kötési lépés vagy kompetíció következett. A kötési lépés során 20x – 10000x hígítású arany konjugátum (vak elektródok kötése 20x hígítású arannyal nem jelzett antitestekkel történt) reakciója ment végbe az elektród felszínen szobahőn, 1 órán keresztül. Kompetíció során szabad AFM1 (15-2500 ng/L koncentrációban) és 1/500 v/v hígítású arannyal jelzett antitestek reakciója játszódott le az elektród felszínen 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. Minden egyes lépés között mosási lépés következett 15 mM PBS + 0.5% v/v Tween 20 oldat segítségével s kétszer 15 mM pH=7.4 PBS oldattal, hogy a felületaktív anyag maradékokat eltávolítsuk.

Standard tej oldat készítése 10 g teljes tejport (BD 282 európai referencia anyag -nulla szintű AFM1) oldottunk fel 100 ml 15 mM PBS + 0.5% v/v Tween 20 oldatban, amit előzetesen a kezelési protokollnak megfelelően 50 °C-ra melegítettünk. Az oldatot 10 percig centrifugáltuk 6000 rpm fordulatszámon (Eppendorf® Minispin centrifuga) 4 °C-on. A zsíros réteget eltávolítottuk, s a felülúszót tovább hígítottuk (1/1 v/v arányban) 15 mM PBS + 0.5% v/v Tween 20 oldattal. Ez az oldat szolgálta a mátrix hatás vizsgálatának alapját. Visszanyerési vizsgálathoz a centrifugálási lépés előtt adott mennyiségű AFM1 (25, 50, 100 ng/L) antigént adtunk az oldathoz.

Impedimetriás mérések és lineáris pásztázó voltametria (LSV) Impedimetriás és LSV mérések előtt desztillált vizes öblítést alkalmaztunk az elektród felszínen az esetleges maradék klorid eltávolítására, s minden mérést 0.1 M-os NH4NO3 oldatban végeztünk, hogy elkerüljük az ezüst kiválását. Az elektródokat szobahőmérsékleten 0.1 M-os NH4NO3 oldattal hagytuk állni a mérések kivitelezéséig és az ezüst elektroülepítése előtt. Az előkészített elektródok felszínéről történő NH4NO3 oldat eltávolítás után 150 µl 0.1 M-os NH4NO3-ban készített 1 mM-os AgNO3 hozzáadására került sor. Az ezüstréteg elektroülepítése -110 mV-on történt 45 mp-ig kronoamperometriásan. Ezután a fenmaradó oldat eltávolítását követően desztillált vizes mosás következett. A kronoamperometriás, impedimetriás és lineáris pásztázó voltametria méréseket AUTOLAB PGSTAT12 potenciosztáttal végeztük. Az impedanciás mérések kivitelezése 0.1 M-os NH4NO3 oldatban

- 62 -

történt -20 mV-on 10 mV amplitúdóval 1 kHz-től 0.1 Hz-ig 30 pontos elemzéssel (adatfeldolgozás Zview szoftverrel történt), míg a lineáris pásztázó voltametriát ugyancsak az előzőekben használt 0.1 M-os NH4NO3 oldattal -100 mV- 700 mV tartományban 0.05 V/s szkennelés arány és 0.00442 V potenciállépés paraméterek mellett végeztük.

Kalibráció és kiértékelés A kalibrációs görbéket standard AFM1 (0–2500 ng/L) oldatok felhasználásával kaptuk, s elkészítésükhöz 15 mM, pH=7.4, PBS + 0.5% v/v Tween 20® oldatot használtunk.

A

kalibrációs görbék illesztése „4 paraméteres, nem lineáris, logisztikai kalibrációs” egyenlettel történt [106]. A 4 logisztikai paraméter funkció közötti összefüggést a 7. egyenlet írja le:

f ( x) =

1− a  x 1+   c 

b

+d

(7)

ahol a és d aszimptotikus maximum és minimum értékek; c az infelxiós pont értéke (IC50) és b a meredekség. A detektálási határ (LOD) és a lineáris tartomány (LWR) az irodalmi leírások alapján került kiszámításra [107].

III.2.7 Jelerősítés kolloidális arany és mágneses nanorészecskék alkalmazásával A mágneses nanorészecskéket és a kolloidális aranyat már külön-külön [108-112] máskor is alkalmazták immunoreakciók detektálásánál, azonban a kettő kombinációjához kapcsolható impedimetriás mérésről nem esett említés. A kolloidális arany vezető tulajdonságait úgy használhatjuk ki, hogy megváltoztatni képes az elektródfelszín kapacitás és ellenállás viszonyait. A mágneses részecskék ebben az esetben csak az aranyból származó jel növelésére szolgálnak, hiszen a részecskék segítségével a hozzájuk kötődött kolloidális arany koncentráltan kinyerhető, s az elektród felszínen gyűjthető. Mágneses részecskék elkészítése: Ademtech G05030 300 nm IgG egér antitestekkel preparált mágneses részecskéket (névleges felszín ≤10 m2/g) módosítottunk nyúlból származó aflatoxin M1 antitestekkel. - 63 -

Első mosási lépésként 1400 µl 15 mM pH=7.4 PBS, 0,05% Tween 20 oldatba 13 µl gyártó által szolgáltatott mágneses részecske oldatot adtunk. Homogenizálás után 10 percig mágneses részecske gyűjtő dokkolóra tettük (Lifesep 1.5 s). A különvált oldat leszívása után 1397,75 µl 15 mM pH=7.4 PBS, 0,05% Tween 20 és 2,25 µl 0,9 mg/ml aflatoxin M1 antitest oldatot adtunk a visszamaradó mágneses részecskékhez. Homogenizálás után 20 percig szobahőn inkubáltuk az oldatot. Homogenizálás után 10 percig ismét mágneses részecske gyűjtő dokkolóra tettük, s a puffer oldat eltávolítása után 1400 µl 15 mM pH=7.4 PBS, 0,05% Tween 20 oldatban homogenizáltuk a preparátumot. Kolloidális arany részecskék elkészítése: Az 5 nm-es kolloidális arany oldat anti-HRP (Horse Radish Peroxidase) antitestekkel került módosításra. 1000 µl kolloidális arany oldathoz 100 µl 20 mM pH=9.0 AMPSO és 30 µl 0,9 mg/ml anti-HRP oldatot adtunk, s szobahőn inkubáltuk 30 percig. Ezen lépés során a kolloidális arany részecskék és az antitest fehérjében található tiol csoportok kötése történik meg. Ezután a preparált arany 2 lépcsőben Marha Szérum Albuminnal (Bovine Serum Albumin-BSA) került centrifugálásra (a IV.1.2 pontban leírtak alapján), mellyel az esetleges arany felszínen szabadon maradt kötőhelyeket borítjuk be semleges fehérjével. Kötés és kompetíció: Kötési vizsgálatokhoz aflatoxin ELISA kit AFM1-HRP konjugátumát használtuk 1/80 v/v hígításban. Az előzetesen elkészített mágneses részecskék ELISA tálcán szétosztott oldataihoz 1/10 v/v arányban adtunk az elkészített AFM1-HRP konjugátum hígításból (kivéve vak oldat), s szobahőn 20 percig inkubáltuk. A mágneses részecskék összegyűjtése és az oldat eltávolítása után a preparátumot az előre 15 mM pH=7.4 PBS, 0,05% Tween 20 felhasználásával elkészített Au kolloid oldat hígítási sor hozzáadásával szobahőn 60 percig inkubáltunk. A méréshez használt elektród előkezelését PBS pufferben 10 ciklus, 0-1,1V tartományú ciklikus voltametriával végeztük. A mágneses részecskéket az elektródra felvitel után a munkaelektród alá helyezett mágnessel (Ademmag 96-20106) 2 percig gyűjtöttük. Az impedancia méréseket 50 mérési pont gyűjtésével 1 Hz-10 kHz tartományban 10 mV-on végeztük. Mérések között az elektród desztillált vizes mosása történt. A kompetíció HRP-vel jelzett és nem jelzett AFM1 toxin között ment végbe az előkészített mágneses részecskék felszínén 1-1000 ppt koncentráció tartományban. A HRP-vel jelzett toxin 1/800 v/v hígítású volt minden esetben, s az inkubációs idő szobahőn 60 perc. A - 64 -

következő jelerősítési lépéshez a kötési vizsgálatok alapján kiválasztott Au kolloid hígítási koncentráció 1/60000 v/v volt, mellyel 20 perc inkubációt végeztünk szobahőn. Vak mérésekhez az arany kolloid hígításának megfelelő aranymentes anti-HRP antitest oldat készült. A mérés előtt a mágneses részecskék 2 percig mágnesekkel kerültek összegyűjtésre az elektród felszínén (Ademmag 96-20106). Mérések között az elektród desztillált vizes mosása történt. Az eredeti elképzelésben az arannyal jelerősített mágneses részecskék más impedimetriás jelet adnak azokkal szemben, ahol a jelölésmentes toxin van túlsúlyban.

Eredmények A mágneses részecskék kolloidális arannyal történő módosítása az első mérések után, 2000115000 hígítású relatív koncentrációban vizsgálva megfelelőnek tűnt. A 32 A ábrán jól látható, hogy az alacsonyabb kolloidális arany koncentrációk esetén alacsonyabbak voltak a mért kapacitás értékek is. A görbe a koncentráció növekedésével (1/10000 v/v alatt) telítésbe megy át.

32. ábra: 300 nm-es mágneses nanorészecskékkel és 5 nm-es kolloidális arany felhasználásával kapott impedimetriás mérési eredmények. Az A ábrán látható a kolloidális arany-anti HRP konjugátum mágneses részecskékhez kötődésének mérési eredménye 1/2000-1/115000 v/v koncentrációknál (Kezdeti- alap eletród mért kapacitása, Vak- aranymentes anti HRP kötődése után). A B ábrán a kiválasztott kolloidális arany koncentráció mellett elvégzett kompetíció eredménye a 2,5-1000 ppt AFM1 tartományban.

A nyomtatott elektród kezdeti és vak mérési eredménye is számottevően alacsonyabb volt a legalacsonyabb koncentrációjú aranykolloid mért értékénél. Az eredmény alapján a 1/60000 v/v aranykolloid hígítást választottuk a kompetíciós mérések kivitelezéséhez, mivel a görbe ezen szakaszán a kiválasztott aranykolloid koncentráció mellett kivitelezett kompetíció - 65 -

eredményei 2,5-1000 ppt AFM1 koncentráció tartományba a várttól eltérő tendenciát mutattak (32. ábra B). Az arany kötési eredmények alapján a szabad AFM1 koncentráció növekedésével a kapott jelnek csökkennie kellene, hiszen kevesebb AFM1-HRP konjugátum kötődésével kolloidális aranyból is kevesebb megkötésére kerül sor a mágneses részecskéken. A felszínen lejátszódó folyamatok ellenőrzésére a következő impedancia méréseket végeztük el egyenként 3-3 elektródon: (a.) mágneses részecskék, (b.) AFM1 antitesttel módosított mágneses részecskék, (c.) AFM1 antitesttel módosított mágneses részecskék és AFM1-HRP konjugát és (d.) AFM1 antitesttel módosított mágneses részecskék, AFM1-HRP konjugát és módosított kolloidális arany. Ezekben a mérésekben tisztázódott, hogy a mágneses részecskék nem távolíthatóak el maradáktalanul az elektródfelszínről két mérés között, s a kapott tendenciák (32. ábra) annak köszönhetőek, hogy a mérések egymás követő öblítés után, de ugyanazon az elektródon kerültek kivitelezésre. Az aranykolloid kötődés vizsgálatát megismételve cserélt elektródos mérés esetén nem volt kimutatható összefüggés az eredmények között. Minden lehetséges jelhez hozzájáruló faktor kombinációjának vizsgálatára sor került (mágneses részecskék, antitestekkel módosított mágneses részecskék, arany nanorészecskék, antitesttel módosított arany részecskék, antitestek), azonban számottevő jelnövekedés az arany koncentrációjának függvényében nem volt megfigyelhető. A mérések során megerősítést nyert viszont, hogy a cserélt elektródok használata esetén fontos az elektródok megfelelő előkezelése az összehasonlíthatóság érdekében. A későbbiekben minden elektródot 10 ciklusban, 0-1,5 V-ig kondícionáltunk ciklikus voltametriában (10 mV lépések, 0,1 V/s lépés gyorsaság).

III.2.8 Arany nanorészecskék mérése az elektród felszínen Az arany nanorészecskék jó vezetőképességükből kifolyólag megváltoztatják a felszín töltésátvitellel kapcsolatban tanúsított ellenállását. Ezen elméletre alapozva igyekeztünk módszerünkkel az aranyat, s a jel koncentráció függését kimutatni [113-113]. Elkészítés: A 5 nm kolloidális arany anti-HRP konjugátum ugyanolyan módszerrel készült, ahogy az a III.2.7/Kolloidális arany részecskék elkészítése részben leírásra került. A mérésekhez

- 66 -

előkezelt elektródokat használtunk, s oldatban illetve felszínen adszorbeálva vizsgáltuk az arany konjugátum és anti-HRP jeleit. Különböző koncentrációjú 5 nm kolloidális arany-antitest konjugátum és anti-HRP oldat adszorbeálása a munkaelektródokon 12 óra alatt 4 ºC-on, hűtőben történt.

Eredmények Az elkészített elektródokkal legelőször a kolloidális arany-antitest konjugátum vizsgálatára került sor Differenciál Pulzus Voltametriával (DPV) -0.2-1.1 V tartományban, impedanciával 1 Hz-10 kHz tartományban 0 V potenciálon a oldatban vagy a felszínen található kolloidális arany kimutatására. Ezután egy kronocoulometriás oxidáló lépés következett 140 mp-ig, 1.4 V potenciálon az arany ülepítésére/oxidálására, amit egy újabb impedancia mérés és egy DPV mérés követett, annak megállapítására, hogy ilyen oxidáló módszerrel sikerül-e az arany részecskéket a felszínen kötni/kimutatni. Mivel nem volt számottevő változás a felszínről kapott jelekben, ezért az oldatok esetén az egész folyamatot megismételtük 10 perc várakozás után (mely alatt az arany természetesen is kiülepedhet/adszorbeálódhat az elektródfelszínen), de ez utóbbi esetben sem volt megfigyelhető jel változás. A vizsgálatok utolsó részében 0-1.4 V potenciál tartományban (0; 0,5; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4) impedancia mérések kerültek kivitelezésre. 1 V-nál ugyan megfigyelhető volt különbség a vak és kolloidális arany konjugátumos elektródok között, de ezt a későbbi mérések nem igazolták.

III.2.9 Jelerősítés ezüsttel hidrokinon felhasználásával Ahogy arról említést tettek korábbi tudományos munkák [86-90], az ezüst jól alkalmazható az arany jobb detektálására, mivel ez utóbbi katalizálja az ezüst redukálódását és kiülepedési reakcióját. A hidrokinon, mint könnyen oxidálódó ágens, spontán reakcióban is redukálja a +1 oxidációs számú ezüstöt, azonban kolloidális arany jelenlétében ez a reakció gyorsabb, mivel az ezüst az arany részecskéken, mint gócpontokon könnyebben redukálódik.

- 67 -

Az első kísérlet sorban (33. A ábra) a vizsgálatokat 4 mg/ml koncentrációjú 100 mM pH=7.2 foszfát pufferben készített hidrokinon, 10 mM AgNO3 oldat és 1/1000 v/v 5 nm Au kolloid felhasználásával végeztük. Később (33. ábra) 100 mM pH=7.2 foszfát pufferben készített 40 mg/ml hidrokinon és 255 mg/ml citromsav elegyítése történt 3:1 arányban, s ennek az elegynek az elektródon történő 1/10 v/v hígítása volt a különböző koncentrációjú AgNO3 oldatok redukálásának alapja. A redukáló oldatot felhasználásig alufóliával védve hűtőben tároltuk 4 ºC-on.

Eredmények A vizsgálatokban először az arany jelenlétében történő ezüst kiválás került górcső alá, mely során (a) ezüst és hidrokinon, (b) ezüst, hidrokinon és antitestek valamint (c) ezüst, hidrokinon és arany antitest konjugát jelenlétében figyeltük a változásokat (33. A ábra).

33. ábra: Ezüst jelének vizsgálata hidrokinonos redukálás során. Az A ábrán látható az ezüst-hidrokinon (AgHQ), ezüst-antitest-hidrokinon (Ag-Ab) és ezüst-arany konjugát-hidrokinon (Au 1/1000) oldatok időbeli változásai. A B ábrán látható az egyes oldat komponensek külön-külön mért eredményei (hidrokinon-HQ vak, ezüst-Ag vak és arany konjugát + hidrokinon -Au-HQ vak) az ezüst-hidrokinon oldat jelével összevetve.

Az eredményeket az egyes komponensek vak méréseivel is összehasonlítottuk (33. B ábra). Az impedimetriás mérést 1 Hz-10 kHz tartományban 1.0 V-on végeztük. Az eredmények alapján kijelenthető, hogy az egyes oldat komponensek külön-külön nem adnak jelet impedanciában, s az aranyat tartalmazó oldat kisebb mért kapacitással jellemezhető, mint az ugyanolyan koncentrációjú antitestet tartalmazó illetve nem tartalmazó ezüst oldat.

- 68 -

34. ábra: A redukálódó különböző ezüst koncentrációk (0,0625-5 mM) impedimetriás jelének vizsgálata 1/2000 v/v 5 nm Au kolloid és 3 mg/ml hidrokinon jelenlétében 15 perc reakcióidő után -200 mV-on (A). A kiválasztott 1,2 mM AgNO3 koncentrációval elvégzett oldott 5 nm Au konjugát v/v koncentrációk jelei 15 perc után (B) 200 mV-on. Az előző kísérlet ismétlése különböző elektródon adszorbeált 5 nm Au konjugát v/v koncentrációkkal -200 mV-on (C).

Az ezüst koncentráció változások elektród felszínen való kimutatásához 0,0625-5 mM AgNO3 redukálódását vizsgáltunk 1/2000 v/v 5 nm Au és 3 mg/ml hidrokinon (27 mM) koncentráció mellett (15 perc reakció az elektródon 150 µl összoldatban: 105 µl NaNO3 + 15 µl hidrokinon redukáló oldat + 15 µl 1/200 v/v Au oldat + 15 µl Ag oldat) -200 mV-on (redukáló potenciál), 1 Hz- 10 kHz tartományban impedanciával (34 A ábra). Az eredmény alapján megállapítható volt, hogy a nagyobb redukálódott ezüst koncentráció magasabb mért kapacitás értékeket eredményez arany jelenlétében, mint a vak méréseknél. A későbbi vizsgálatok kivitelezéséhez az 1,2 mM AgNO3 koncentrációt választottuk. Az előző kísérletben említett paraméterek mellett különböző koncentrációjú kolloidális arany konjugátum hatása mind oldatban (34 B ábra), mind elektródon adszorbeálva kipróbálásra került (34 C ábra), s jelentős hatást mutatott az ezüst redukálódására és ülepedésére vonatkozóan. Az előbb ismertetett vizsgálatok során ugyanakkor egy a mérést

- 69 -

zavaró kloridion (fehér AgCl csapadék képződése) szennyező forrás is kiszűrésre került, ami után az oldatokat 100 mM NaNO3-ban készítettük. Általánosságban az arany koncentráció hatása kimutatható volt az ezüst ülepedésére és egy arany kötődésre vonatkozó görbét ugyancsak fel lehetett venni, azonban a módszer reprodukálhatósága nem volt megfelelő további vizsgálatokhoz, mivel a reakció oldat eltávolításánál esetenként valószínűleg nem ellenőrzött mennyiségű, kiülepedett ezüst is eltávolításra került.

- 70 -

III.2.10 A kifejlesztett mérési módszer – Jelerősítés ezüst elektromos ülepítésével Az előző részben (III.2.9 rész) ismertetett katalizáló hatás ellenőrzését végeztük elektromos ülepítéssel. Ennek a módszernek az előnye, hogy ilyen módon az ezüst jobban kötődik az elektródfelszínen, s így azt onnan desztillált vizes mosással, tisztítással nem lehet eltávolítani.

35. ábra: Elektródon adszorbeált arany antitest konjugátum és antitest jelenlétében mért amperometriás jelek az ezüst elektromos ülepítése közben a 0-(-400) mV tartományban.

Az első kísérletek során megállapításra került, hogy az ezüst elektromos ülepítését ugyancsak katalizálja az arany jelenléte, ezért jól használható az elektród felszínen adszorbeált arany jelerősítésére, hiszen a relatív arany konjugátum koncentrációk ezüst ülepedésre gyakorolt hatása mind a felszíni töltés átviteli ellenállásban (Rct) és a lineáris pásztázó voltametriában (LSV) jól kimutathatóak voltak. A 35. ábrán megfigyelhető, hogy az ezüst oldatból történő redukálódása kevésbé negatív potenciálon (-130 mV alatt) indul meg arany-antitest konjugátum elektródfelszínen történt adszorpciójánál, mint a csak antitestet tartalmazó oldat adszorpciója esetén. Az ezüst ülepítése kronoamperometriával történt, s ezután impedancia és lineáris pásztázó voltametria (LSV) következett. Az ülepítési potenciál, ülepítési idő és az impedancia mérési potenciálja került optimalizálásra.

- 71 -

Ha külön nincs kiemelve, akkor az arany konjugátum az elektród felszínen volt adszorbeálva.

Ezüst mérhetősége impedanciában [115] Különböző koncentrációjú (0.0625, 0.125, 0.250, 0.5, 0.75, 1.0, 2.0, 5.0 és 7.0 mM) ezüstnitrát oldatokat ülepítettünk elektromosan külön elektródokra, s figyeltük a rendszerben bekövetkező kapacitás és ellenállás változásokat. Ahogy az a 36. ábrán látható a kapacitás exponenciálisan növekedett a koncentrációval, míg a töltés átviteli ellenállás ugyanígy csökkent. Ez a jelenség érthető is, ha figyelembe vesszük, hogy az ezüstnek ugyanúgy, ahogy az aranynak is, vezető tulajdonságai vannak.

36. ábra: Az ezüst elektromos ülepítésének hatására bekövetkező impedanciában mért kapacitás és ellenállás változások a felszínen.

Elektroülepítési idő Előzetesen előkezelt elektródokon 20-20 µl 1/250 v/v Au konjugát és antitest oldatot adszorbeáltunk 1 éjszakán keresztül hűtőben, 4 ºC-on tárolva. Amint az a 37 ábrán is megfigyelhető, az ülepítési idő tekintetében viszonylag nagy különbségek vannak az aranyat tartalmazó s nem tartalmazó elektródok között -130 mV-on végzett kronoamperometriával, s az eredmények alapján a 45 másodperc tűnik megfelelő ülepítési időnek. Az elektromos ülepítés során a fémes ezüst egységesen befedi a munkaelektród felszínét 45 másodpercnél hosszabb idő alatt, ami jól megfigyelhető azon, hogy bár a felszíni ellenállás nem változik

- 72 -

számottevően 45 másodperc feletti időtartamnál, azonban a mért kapacitás és pásztázó voltametria eredménye alapján az ezüst mennyisége tovább növekedett.

37. ábra: 1 mM ezüst nitrát oldat különböző időtartamú elektroülepítése 1/250 v/v Au és Antitest oldatokkal adszorbeált elektródokkal -130 mV-on. A ábra a töltés átviteli ellenállás változása, B ábra a felszíni kapacitás változása illetve C ábra a pásztázó voltametriával mért csúcsterületek.

Mivel a mérések ismétlése során a töltésátviteli ellenállás megfigyelése egyértelműbb összefüggéseket mutatott, ezért a későbbi vizsgálatokban inkább ezen mérések eredményeire támaszkodtunk, s a kapacitás mérések eredményeit inkább ellenőrző jelleggel alkalmaztuk.

Ülepítési potenciál Előzetes vizsgálatban (35. ábra) az arany jelenlétének ezüst elektromos ülepítésre gyakorolt katalizáló hatását már elemeztük, s úgy találtuk, hogy az aranyat is tartalmazó elektródfelszínen az ezüst redukálódása -130 mV-nál egyértelműen megindul, míg a vak elektród esetében ez csak -150 mV-nál kezdődik el. Előzetesen előkezelt elektródokon 20-20 µl 1/250 v/v Au konjugát és antitest oldatot adszorbeáltunk 1 éjszakán keresztül hűtőben, 4 ºC-on tárolva. Az elektromos ülepítést meghatározott ideig (45 mp) végeztük különböző potenciálokon (-70, -90, -110, -120, -130, -140 mV) 1 mM ezüst nitrát koncentráció mellett.

- 73 -

38. ábra: Az elektromos ülepítési potenciál és idő összefoglaló impedimetriás eredményei 1/250 v/v adszorbeált aranyat tartalmazó elektródokkal

Optimális potenciálként a -110 mV-ot választottuk mivel e potenciál felett már nem változik számottevően a töltésátviteli ellenállás (38 A ábra), azonban az ennél alacsonyabb potenciálnál az aranyat tartalmazó és aranyat nem tartalmazó elektródok jele közti különbség csökken. A mérés ellenőrzésére lineáris pásztázó voltametriát alkalmaztunk, mely jó egyezést mutatott eredményeinkkel. A megfelelő ülepítési potenciál és idő alkalmazásával egységes redukált ezüst réteg alakítható ki az elektród felszínen, mely a töltésátviteli ellenállás viszonylagos stabilitásában mutatkozik (38 ábra A és B).

Arany konjugátum kötés vizsgálata Előzetesen az elektródok felszínén adott koncentrációjú BSA-AFM1 konjugátum adszorpciójára került sor. Majd a kötési reakció alatt 20-10000 hígított arany konjugátum oldattal történt az elektródok 1 órás inkubációja szobahőn. A kötési reakció lejátszódása után, amíg az elektród mérése meg nem történt, 100 µl 100 mM NH4NO3 oldat elektródra cseppentése védte meg a munkaelektródot, így az adszorbeált fehérjét a kiszáradástól. Amint az az eredményekből is látszik (39. ábra) a felszínhez kötődő arany konjugátum csökkenése az töltésátviteli ellenállás növekedését idézi elő az elektromos ülepítés után az - 74 -

impedanciában, hiszen adott idő alatt kisebb mennyiségű ezüst redukálódása megy végbe (39 B ábra LSV eredmények).

39. ábra: Az elektródokra kapott jelek impedanciában (A) és lineáris pásztázó voltametriában (B) 1/20-1/10000 v/v koncentrációjú arany konjugátummal történő inkubáció után.

A kötési vizsgálat eredménye alapján az 1/500 v/v Au konjugát hígítás került kiválasztásra a kompetíciós vizsgálatokhoz.

Kompetíció, mátrixhatás, visszanyerés A kompetíció vizsgálatok esetén is BSA-AFM1 adszorpciójára került sor az elektródokon, majd adott koncentrációjú (1:500 v/v) arany konjugátum jelenlétében játszódott le a kompetíció a szabad toxin és a felszínhez kötött között 5-2000 ng/L koncentráció tartományban. Az elektródok elkészítési fázisait és a kompetíció után lejátszódó ezüstöt redukáló elektromos ülepítést foglalja össze a 40. ábra. Az antigének felszínen történő megkötését egy blokkolási lépés követte marha szérum albuminnal, majd a kompetíciós reakció lejátszódása után, a felszínen található kolloidális arany koncentrációjának függvényében redukált ezüstréteg kialakítására került sor. A kompetíció és elektroülepítés lejátszódása után pásztázó voltametriával felszínen kivált ezüst mennyisége jól párhuzamba állítható a kompetíció szabad toxinjának koncentrációival (41. ábra), hiszen magasabb szabad toxin koncentrációnál a felszínen kimutatható ezüst mennyisége csökken.

- 75 -

40. ábra: A kompetíció után felszínen megkötött kolloidális arany elektrokatalitikus hatása az ezüst ülepítésére. 1- antigének kötése, 2- elektródfelszín blokkolása BSA-val, 3- arannyal jelzett antitest- aflatoxin kompetíció, 4Ezüst katalitikus ülepítése

41. ábra: Szabad AFM1 és elektródon adszorbeált AFM1 kompetíció utáni ezüst elektroülepítésének pásztázó voltametriás eredményei különböző (32.6, 125, 250, 500 ppt) szabad toxin koncentrációknál.

Amint az megfigyelhető a kompetíciós reakció hasonló görbét adott, mint a kötés esetén tapasztalt. Ahogy az oldatban levő szabad aflatoxin mennyisége növekszik, kevesebb arany tud a felszínhez kötődni, s csökken az ezüst mennyisége a felszínen, míg a töltés átviteli

- 76 -

ellenállás növekszik (42. ábra). A kalibráció lineáris szakaszának a 15-1000 ng/L tartomány adódott pufferben, s a detektálási határ 10 ng/L, relatív standard deviáció 20%.

42. ábra: Pufferben és 1/2 v/v tejben (mátrix) kivitelezett AFM1 kompetíciós reakció eredménye az 5-2000 ppt tartományban.

Standard tej oldatot mátrixként felhasználva [116] ugyancsak végrehajtottuk a kompetíciót, s ekkor az ellenállás jelek növekedését és a lineáris voltametria jelek csökkenését tapasztaltuk (42. ábra) a mátrix hatása miatt. A tejben elvégzett kalibráció alapján a lineáris tartomány 25125 ng/L-re szűkült, a detektálási határ (LOD) 15 ng/L. 25, 50 és 100 ng/L-es standard addíciós visszanyerési százalékai sorrendben 112%, 122%, 115%. Visszanyerési átlag 116%±6%-nak adódott.

Összegzés A végzett fejlesztő munka az aflatoxin M1 tejben történő kimutatására és mennyiségi meghatározására irányult, melynek során immunoreakción alapuló rendszert vizsgáltunk. A kis kimutatási mennyiségre (25 ng/L és 50 ng/L) tekintettel kolloidális arany és redukált ezüst segítségével történt jelerősítés. Az arany mennyiségétől függő, elektród felszínen kialakított ezüstréteg impedimetriás mérése szolgáltatta az analitikai információt. Tej mátrixban sikeresen kalibrálás történt a kialakított rendszerrel, melynek lineáris tartománya 25-125 ng/L volt. Standard addíciós visszanyerési átlag 25, 50 és 100 ng/L koncentrációkra 116%±6%.

- 77 -

IV.

Összefoglalás

Az értekezés két fő részre osztható, melyekben egy amperometriás enzim alapú és egy impedimetriás immunfehérje alapú szenzor fejlesztés leírása került összefoglalásra. Az amperometriás bioszenzor esetén az aszkorbát oxidáz enzimet természetes fehérje membránon kötöttük meg a Teflon és Plexi alapanyagú enzim cellában. A cella egy FIA rendszerű amperometriás detektorhoz lett csatlakoztatva. A rendszerben két minta injektor (20 µl mintabemérő hurok) volt egy az enzimcella előtt és egy utána. Az optimalizálás során több paramétert vizsgáltunk, s az enzim reakció és a készülék összeállítás szempontjából optimális paramétereknek a következőket találtuk: 400 mV potenciál, 0.5 ml/perc áramlási sebesség, pH=4.5-4.8, 200 mmol/L puffer koncentráció, hőmérséklet 36 °C vagy kisebb. A célvegyület mérésére és kalibrációra az enzimcella előtt és az enzimcella után injektált jelek különbségét alkalmaztuk, s a kiértékeléshez digitális jelfeldolgozást használtunk. 200 mmol/L koncentrációjú acetát pufferben kivitelezett kalibráció jó lineáris illeszkedést mutatott a 25400 µmol/L tartományban, s a kimutatási határ 5 µmol/L, RSD 5%-nak adódott. Különböző aszkorbinsav tartalom kimérésére került sor multivitamin pezsgőtabletta, multivitamin ivólé és bor minták esetén. A 60 mg aszkorbinsav tartalmú multivitamin pezsgőtablettánál az eredmények kielégítőnek mondhatók (visszamérés hatékonységa 96%, 101%, 115% 10, 20 és 40-szeres hígítások esetén), míg bor és multivitamin ivólé esetében visszanyerésnél csak az elvárt eredmények arányai voltak kimutathatóak az összetettebb mátrix hatás következményeként. Az impedimetriás immunoszenzor esetén arannyal jelölt anti-aflatoxin M1 antitestek és ezüst elektroülepítésének együttes alkalmazására került sor az aflatoxin M1 detektálására. Az indirekt típusú kompetíciós ELISA eljárást nyomtatott elektródok felszínén valósítottuk meg. Az ezüst kronoamperometriás elektroülepítése állandó potenciálon, meghatározott ideig történt a jel erősítése érdekében. A számított töltésátviteli ellenállás (Rct) jó egyezést mutatott az AFM1 koncentrációjával. A leírásra került AFM1 immunoszenzor lineáris tartománya 15 és 1000 ng/L közzé tehető 15 ng/L-nek megfelelő kimutatási határral (RSD= 20%). Az impedimetriás eredmények a kontroll lineáris pásztázó voltametria eredményeivel jó egyezést mutattak. A tejben történő mátrix hatás tanulmányozása során töltésátviteli ellenállás növekedés volt megfigyelhető valószínűleg az arannyal jelölt AFM1 antitesteken adszorbeálódó fehérje komponenseknek köszönhetően. Tej mátrixban a lineáris tartomány egy nagyságrenddel

- 78 -

kisebbnek adódott (25–125 ng/L) mint pufferban, és a kimutatási határ 25 ng/L-nek felelt meg. A visszamérés hatékonysága átlaga a spike-olt minták eredményeinek kiértékelése után 116±6% volt. Kísérleteink során be akartuk mutatni, hogy az ezüst irányított elektroülepítése megfelelőbb lehet, mint ezüst redukáló oldatoka használata, mert az utóbbiak reprodukálhatóságát jobban befolyásolja az idő, hőmérséklet ingadozás és fény kitettség. A töltés átviteli ellenállásban bekövetkező

változások

a

felszínen

közvetlenül

megfigyelhetőek

impedancia

spektroszkópiával. Az ilyen típusú EIS alapú felszín vizsgálatnak meg van az az előnye, hogy elhagyható a redox párok használata a folyamatban, de az így kapott jel érzékenyebb lehet a helyi környezeti tényezőkre, a felszíni és az adszorbeált antitestek által létrehozott réteg hibái nehezen észlelhetőek. Konkrétan az immunoszenzor készítése során kialakuló munkaelektród felszínén és BSA-AFM1 konjugát megkötődésekor kialakuló különbségek és/vagy a BSA különböző fokú megkötődése befolyásolhatja az EIS jelet, s így a jel reprodukálhatósága nehezen befolyásolható. Ugyanakkor ez a típusú impedimetriás immunoszenzor elég érzékeny volt, hogy ppt tartományban kimutassa az AFM1 toxint, azonban a tejben található fehérjék befolyásolták, azaz megemelték a kapott töltésátviteli ellenállásból származó jelet.

- 79 -

V.

Summary

This thesis can be separated into two main parts, which contain the description of an amperometric enzyme based and an impedimetric immune based sensor development. In amperometric biosensor the ascorbate oxidase enzyme was immobilized on a natural protein membrane in the Teflon and Plexiglass enzyme cell. The cell was connected to a FIA system with an amperometric detector. In the system two sample injectors with 20 µl loop were used one before and one after the enzyme cell. During optimization several parameters were examined. For measuring analyte concentrations and for calibration procedure substraction of the signal peak area given in the presence of enzyme from the signal peak area given in the absence of enzyme was applied. The evaluation was made by digital integration. The optimal parameters are the followings: 400 mV applied potential, 0.5 ml/min flow rate, pH=4.5-4.8, 200 mmol/L buffer concentration, optimal temperature under 40 °C for this enzyme reaction in the used system. Calibration made in 200 mmol/L acetate buffer provided a good linear working range from 25-400 µmol/L, limit of detection 5 µmol/L, RSD=5%. Multivitamin tablets and wines with different ascorbic acid contents were measured for test measurements. With multivitamin tablet of 60 mg ascorbic acid content the results were satisfactory (recovery 96%, 101%, 115% for 10, 20 and 40 times dilutions respectively), while with wine and multivitamin juice samples using spiking method only the rates of expected results could be calculated due to more complex matrix effect. In case of impedimetric immunosensor gold-labelling of anti aflatoxin M1 antibodies combined with the electrodeposition of silver onto colloidal gold was used for the detection of aflatoxin M1. The indirect like competitive ELISA procedure was performed on screenprinted electrodes (SPEs). Silver was chronoamperometrically electrodeposited at a fixed applied potential and for a determined period of time to amplify the signal. The calculated charge transfer resistance (Rct) was found to correlate well with the concentration of AFM1. The linear working range of the described AFM1 immunosensor ranged between 15 and 1000 ng/L with a limit of detection (LoD) equal to 15 ng/L (R.S.D. = 20%) Impedimetric results were confronted with linear sweep voltametry (LSV) and corresponded well to this technique. By investigating the matrix effect in milk we observed an increase of charge transfer resistance possibly attributed to the presence of the proteic compounds adsorbed on the goldlabelled AFM1 antibody. In milk matrix the linear working range was one order of magnitude

- 80 -

less (25–125 ng/L) than in buffer, and the limit of detection corresponded to 25 ng/L. The recovery percentage of spiked samples was evaluated and the mean of recovery was 116±6%. We also wanted to demonstrate that the controlled electrochemical deposition of silver is more attractive than the use of silver enhancing solutions, because these are more prone to be influenced by the time and temperature variations, and also by light exposure. Changes in charge transfer resistance can be detected and interpreted directly from impedance spectroscopy observations at the interface. This type of interface interrogation by EIS has the advantage to eliminate the use of redox species during the process, but in the same time the signal obtained is very sensible to local environmental conditions and because a redox probe is not use, small defects in the layer/layers of adsorbed immunoreagents are not easily detectable. Concretely, during the construction of the immunosensor, differences of electrode’s working area surface and BSA-AFM1 conjugate and/or BSA different rates of adsorbtion could influence the EIS signal and, as a result, the reproducibility of the signal can be hardly influenced. Nonetheless, this type of impedimetric immunosensor was sensitive enough to detected the AFM1 in the ppt range, but was also influenced by the presence of milk proteins which generated an increase of charge transfer resistance.

- 81 -

VI. Irodalomjegyzék 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

16. 17. 18. 19.

Lucilene Dornelles Mello, Lauro Tatsuo Kubota: Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink industries, Food Chemistry 77 (2002) 237–256 I.E. Tothill: Biosensors developments and potential applications in the agricultural diagnosis sector, Comp. and Electron. in Agricult 30 (2001) 205-218 J. Wang: Amperometric biosensors for clinoical and therapeutic drug monitoring: a review, J. Phramaceutical Biomed. Anal. 19 (1999) 47-53 J. Fitzpatrick, L. Fanning, S. Hearty, P. Leonard, B.M. Manning, J.Q. Quinn,R. O’Kennedy: Applications and recent developments in the use of antibodies for analysis, Anal. Letters 33 (2000) 2536-2609 Erol Akyilmaz, Ali Erdogan, Ramazan Öztürk, Ihsan Yasa: Sensitive determination of l-lysine with a new amperometric microbial biosensor based on Saccharomyces cerevisiae yeast cells, Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2055 Kristina Tag, Klaus Riedel, Hans-Jürgen Bauer, Gerold Hanke, Keith H.R. Baronian, Gotthard Kunze: Amperometric detection of Cu2+ by yeast biosensors using flow injection analysis (FIA), Sensors and Actuators B 122 (2007) 403 Erol Akyilmaz, Ăhsan Yaoa, Erhan Dinçkaya: Whole cell immobilized amperometric biosensor based on Saccharomyces cerevisiae for selective determination of vitamin B1 (thiamine), Analytical Biochemistry, 354 (2006) 78 Mihaela Badea, Antonella Curulli, Giuseppe Palleschi: Oxidase enzyme immobilisation through electropolymerised films to assemble biosensors for batch and flow injection analysis, Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 689 Bertold Hock: Antibodies for immunosensors, Anal. Chim. Acta 347 (1997) 177-186 Daniela De Venuto, Bruno Ricco: Design and characterization of novel read-out systems for a capacitive DNA sensor, Microelectronics Journal 37 (2006) 1610 H. Berney, J. West, E. Haefele, J. Alderman, W. Lane, J.K. Collins: A DNA diagnostic biosensor: development, characterisation and performance, Sensors and Actuators B, 68 (2000) 100 E. Boer, R.R. Beumer: Methodology for detection and typing of food borne micoorganisms, Int. J. Food Microbiol. 50 (1999) 119-130 M.J. Wolcott: DNA based rapid methods for the detection of foodborne pathogens, J. Food Prot. 54 (1991) 387-401 S. Zhang, G. Wright, Y. Yang: Materials and techniques for electrochemical biosensor design and construction, Biosens. Bioel. 15 (2000) 273-282 Mouna Hnaien, Walid Mohamed Hassen, Adnane Abdelghani, Stéphane Cotte, Didier Leonard, Francois Bessueille, Nicole Jaffrezic-Renault: A conductometric biosensor for the estimation of the number of cleaving sites in peptides and proteins, Electrochem. Comm. 11 (2009) 165-168 J. Castillo, S. Gáspár, S. Leth, M. Niculescu, A. Mortari, I. Bontidean, V. Soukharev, S.A. Dorneanu, A.D. Ryabov, E. Csöregi: Biosensors for life quality Design, development and applications, Sensors and Actuators B 102 (2004) 179 Christine Berggren, Bjarni Bjarnason, and Gillis Johansson: Capacitive Biosensors, Electroanalysis, 13 (2001) 173 Bobby Pejcic, Roland De Marco: Impedance spectroscopy: Over 35 years of electrochemical sensor optimization, Electro Chimica Acta 51 (2006) 6217 Liju Yang, Rashid Bashir: Electrical/electrochemical impedance for rapid detection of foodborne pathogenic bacteria, Biotechnology Advances 26 (2008) 135

- 82 -

20.

21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

29.

30. 31. 32.

33.

34. 35.

Julio Cesar B. Fernandes, Lauro Tatsuo Kubota, Graciliano de Oliveira Neto: Potentiometric biosensor for L-ascorbic acid based on ascorbate oxidase of natural source immobilized on ethylene±vinylacetate membrane Analytica Chimica Acta, 385 (1999) 3-12 Emine Karakus, Sule Pekyardimei, Esma Kilic: Potentiometric bienzymatic biosensor based on PVC membrane containing palmitic acid for determination of creatine, Process Biochem 41 (2006) 1371-1377 Viatcheslav Volotovskya, Namsoo Kimb: Ascorbic acid determination with an ionsensitive field effect transistor-based peroxidase biosensor Analytica Chimica Acta 359 (1998) 143-148 S. J. Updike, G. P. Hicks: Enzyme electrode, Nature (1967) 214 (5092) 986 Katsunobu Yamamoto, Haisheng Zeng, Yi Shen, Md Mahiuddin Ahmed, Takeshi Kato: Evaluation of an amperometric glucose biosensor based on a tuhenium complex mediator of low redox potential, Talanta 66 (2005) 1175-1180 C. La Rosa, F. Pariente, L. Hernandez, E. Lorenzo: Amperometric flow-through biosensor for determination of pesticides, Anal. Chim. Acta 308 (1995) 129-136 Vanesa Sanz, Susana de Marcos, Javier Galban: A reagentless optical biosensor based on the intrinsic absorption properties of peroxidase, Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 956 Xu-Dong Wang, Ting-Yao Zhou, Xi Chen, Kwok-Yin Wong, Xiao-Ru Wang: An optical biosensor for the rapid determination of glucose in human serum, Sens Actuat B 129 (2008) 866-873 Stephen J. Daly, Gary J. Keating, Paul P. Dillon, Bernadette M. Manning, Richard O’Kennedy, Heather A. Lee, and Michael R. A. Morgan: Development of Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassay for Aflatoxin B1, Journal of Agricultural and Food Chemistry 48 (2000) 5097 Sunil G. Bhand, Srimathi Soundararajan, Ioana Surugiu-Wammark, Jaqueline Simona Milea, Estera Szwajcer Dey, Maria Yakovleva, Bengt Danielsson: Fructose selective calorimetric biosensor in flow injection analysis, Anal. Chim. Acta 668 (2010) 13-18 Henrik Anderson, Mats J¨onsson, Lars Vestling, Ulf Lindberg, Teodor Aastrup: Quartz crystal microbalance sensor design I. Experimental study of sensor response and performance, Sensors and Actuators B 123 (2007) 27 T. Yakhno, A. Sanin, A. Pelyushenko, V. Kazakov, O. Shaposhnikova, A. Chernov, V. Yakhno, C. Vacca, F. Falcione, B. Johnson: Uncoated quartz resonator as a universal biosensor, Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2127 Joao M. Encarnacao, Peter Stallinga, Guilherme N.M. Ferreira: Influence of electrolytes in the QCM response: Discrimination and quantification of the interference to correct microgravimetric data, Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 1351 Warakorn Limbut, Proespichaya Kanatharana, Bo Mattiasson, Punnee Asawatreratanakul, Panote Thavarungkul: A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3-mercaptopropionic acid, Biosenors and Bioelectronics 22 (2006) 233 Yan Liu, Zonghui Qin, Xingfa Wu, Hong Jiang: Immune-biosensor for aflatoxin B1 based bio-electrocatalytic reaction on micro-comb electrode, Biochemical Engineering Journal 32 (2006) 211 Long Chen, Yoshihito Honso, Shu Seki, Donglin Jiang: Light-Harvesting Conjugated Microporous Polymers: Rapid and Highly Efficient Flow of Light

- 83 -

36.

37. 38. 39. 40. 41. 42. 43.

44.

45. 46.

47. 48. 49.

50.

Energy with a Porous Polyphenylene Framework as Antenna, Journal of Am. Chem Soc., 2010, vol 132, issue 19, p 6742 Justin B. Siegel, Alexandre Zanghellini, Helena M. Lovick, Gert Kiss, Abigail R. Lambert, Jennifer L. St.Clair, Jasmine L. Gallaher, Donald Hilvert, Michael H. Gelb, Barry L. Stoddard, Kendall N. Houk, Forrest E. Michael, David Baker: Computational design of an enzyme catalyst for a stereoselective bimolecular dielsalder reaction, Science, vol.329 (2010) p. 309, DOI: 10.1126/science.1190239 Ting Chen, Keith A. Friedman, Ian Lei, Adam Heller: In situ assembled masstransport controlling micromembranes and their application in implanted amperometric glucose sensors, Anal. Chem. 72 (2000) 3757-3763 John H.T. Luong, Keith B. Male, Jeremy D. Glennon: Biosensor technology: Technology push versus market pull, Biotech. Advances 26 (2008) 492-500 45.1.14 AOAC Official Method 967.21 Ascorbic Acid in Vitamin Prepapations and Juices 2,6-Dichloroindophenol Titrimetric Method (First Action 1967, Final Action 1968) European Standard: Foodstuffs-Determination of vitamin C by HPLC Ref.No.: EN14130:2003 E L.Nováková, P. Solich, D. Solicjová: HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids, Trends in Analytical Chemistry 27 (2008) 942-958 X. Wu, Y. Diao, C. Sun, J. Yang, Y. Wang, S. Sun: Fluorometric determination of ascorbic acid with o-phenylendiamine, Talanta 589 (2003) 95-99 A.B. Florou, M.I.Prodromidis, S.M.Tzouwara-Karayanni, M.I. Karayannis: Fabrication and voltametric study of lanthanum 2,6-dichlorophenolindophenol chemically modified screen printed electrodes. Application for determination of ascorbic acid, Anal. Chim. Acta 423 (2000) 107-114 A.B. Florou, M.I.Prodromidis, S.M.Tzouwara-Karayanni, M.I. Karayannis: Flow electrochemical determination of ascorbic acid in real samples using a glassy carbon electrode modified with a cellulose acetate film bearing 2,6dichlorophenolindophenol, Anal. Chim. Acta 409 (2000) 113-121 P.O.Barrales, M.L.Fernandez de Cordova, A.M. Diaz: Indirect determination of ascorbic acid by solid-phase spectrophotometry, Anal. Chim. Acta 360 (1998) 143152 A.A.Ensafi, M. Taei, T. Khayamian, A. Arabzadeh: highly selective determination of ascorbic acid, dopamine and uric acid by differential pulse voltametry using poly(sulfonazo III) modified glassy carbon electrode, Sens. Act. B 147 (2010) 213221) L.D. Mello and L.T. Kubota: Biosensors as a tool for the antioxidant status evaluation, Talanta 72 (2007) 335 Vijaykumar S. Ijeri, Manuel Algarra, Ana Martins: Electrocatalytic Determination of Vitamin C Using Calixarene Modified Carbon Paste Electrodes, Electroanalysis 16 (2004) 2082 Orlando Fatibello-Filho and Iolanda da C. Vieira L-Ascorbic Acid Determination in Pharmaceutical Formulations Using a Biosensor Based on Carbon Paste Modified with Crude Extract of Zucchini (Cucurbita pepo) J. Braz. Chem. Soc., Vol. 11, No. 4, 412-418, 2000 Shobha Jawaheer, S. F. White, S. D. D. V. Rughooputh, David C. Cullen: Development of a common biosensor format for an enzyme based biosensor array to monitor fruit quality, Biosensors and Bioelectronics 2003, 18, 1429-1437

- 84 -

51. 52. 53.

54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70.

Erol Akyilmaz, Erhan Dinckaya: A new enzyme electrode based on ascorbate oxidase immobilized in gelatin for speceific determination of L-ascorbic acid, Talanta 1999, 50, 87-93 I. N. Tomita, A. Manzoli, F. L. Fertonani and H. Yamanaka* Amperometric biosensor for ascorbic acid Ecl. Quím., São Paulo, 30(2): 37-43, 2005 K. Kriz, M. Anderlund, D. Kriz: Real-time detection of L-ascorbic acid and hydrogen peroxide in crude food samples employing a reversed sequential differential measuring technique of the SIRE-technology based biosensor, Biosensors and Bioelectronics 16 (2001) 363-369 Germán A. Messina, Angel A.J. Torriero, Irma E. De Vito, Julio Raba: Continuousflow/stopped-flow system for determination of ascorbic acid using an enzymatic rotating bioreactor Talanta 64 (2004) 1009–1017 Yasushi Hasebe, Tatsushi Akiyama, Toshimitsu Yagisawa, Shunichi Uchiyama Enzyme-less amperometric biosensor for L-ascorbate using poly-L-histidine-copper complex as an alternative biocatalyst, Talanta 47 (1998) 1139–1147 C.A.B. Clemetson: Vitamin C, CRC Press, Boca Raton, FL, 1989 A. Messerschmidt, R. Ladenstein, R. Huber: Refined crystal structure of ascorbate oxidase at 1,9Å resolution, J. Mol. Biol. (1992) 179-205 Ruth Freitag: Biosensors in Analytical Biotechnology, 1996, R.G. Landes Company and Academic Press Ursula Bilitewski, Antony Turner: Biosensors for environmental monitoring, 2000, Taylor &Francis Royce C. Enstrom,Vernon A. Strasser: Characterization of electrochemically Pretreated Glassy Carbon Electrodes Anal. Chem. 1984, 56, 136-141 Christie D. Allred and Richard L. McCreery: Adsorption of Catechols on Fractured Glassy Carbon Electrode Surfaces Analytical Chemistry 64 (1992) 444 Jeromerajan Premkumar, Soo Beng Khoo: Electrocatalytic oxidations of biological molecules (ascorbic acid and uric acids) at highly oxidized electrodes, Journal of Electroanalytical Chemistry, 576 (2005) 105 N. Adányi, M. Tóth Markus, E.E. Szabó, M. Váradi, M.P. Sammartino, M. Tomassetti, L. Campanella: Analytica Chimia Acta 501 (2004) 219-225 E.E. Szabó, N. Adányi, M. Váradi: Biosensors & Bioelectronics 11 (1996) 10511058 E. Bellocco, D. Barreca, G. Lagana, U. Leuzzi, F. Migliardo, R. La Torre, G. Galli, A. Galtieri, L. Minutoli, F. Squadrito: Neutron scattering and HPLC study on Lascorbic acid and its degradation, Chemical Phisycs 345 (2008) p. 191 Erol Akylmaz, Emine Yorganci, Engin Asav: Do copper ions activate tyrosinase enzyem? A biosensor model for the solution, Bioelectrochem. 78 (2010) 155-160 Official Methods of Analysis- Food composition; Additives; Natural contaminants, vol. 2 K. Helrich, Association of Offical Analytical Chemists Inc., USA, 1990, p. 1201 S. Dragacci, F. Grosso, J. Gilbert, Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography for determination of aflatoxin M1 in liquid milk: collaborative study, Journal of AOAC International, 84 (2001) 437–443. E.K. Kim, D.H. Shon, D. Ryu, J.W. Park, H.J. Hwang, Y.B. Kim, Occurrence of aflatoxin M1 in Korean dairy products determined by ELISA and HPLC, Food Additives and Contaminants, 17 (2000) 59–64. Nurhan Unusan: Occurrence of aflatoxin M1 in UHT milk in Turkey, Food and Chemical Toxicology 44 (2006) 1897,

- 85 -

71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79.

80.

81. 82.

83. 84.

85.

P. Rosi, A. Borsari, G. Lasi, S. Lodi, A. Galanti, A. Fava, S. Girotti, E. Ferri, Aflatoxin M1 in milk: Reliability of the immunoenzymatic assay, International Dairy Journal 17 (2007) 429–435. F. Ricci, G. Volpe, L. Micheli, G. Palleschi, A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis, Analytica Chimica Acta 605 (2007) 111-129. B. Gaag, S. Spath, H. Dietrich, E. Stigter, G. Boonzaaijer,T. Osenbruggen, K. Koopal, Biosensors and multiple mycotoxin analysis, Food Control 14 (2003) 251– 254. Z.Zou, J. Kai, M.J. Rust, J. Han, C.H. Ahn: Functionalized nanointerdigitated electrode arrays on polymer with integrated microfluidics for direct bio-affinity sensing using impedimetric measurement, Sens. Actuat. A 136 (2007) 518-526 S. Hleli, C. Martelet, A. Abdelghani, N. Burais, N. Jaffrezic-Renault: Atrazine analysis using an impedimetric immunosensor based on mixed biotinylated selfassembled monolayer Sens. Actuat. B 113 (2006) 711-717 K.S. Ma, H. Zhou, J. Zoval, M. Madou: DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy Sens Actuat. B 114 (2006) 58-64 T. Kawaguchi, D. R. Shankaran, S. J. Kim, K. Matsumoto, K. Toko, N. Miura, Surface plasmon resonance immunosensor using Au nanoparticle for detection of TNT, Sensors and Actuators B, Chem. 133 (2008) 467–472. T. Yakhno, A. Sanin, A. Pelyushenko, V. Kazakov, O. Shaposhnikova, A. Chernov, V. Yakhno, C. Vacca, F. Falcione, B. Johnson: Uncoated quartz resonator as a universal biosensor, Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2127–2131. M. Wang, L. Wang, G. Wang, X. Ji, Y. Bai, T. Li, S. Gong, J. Li: Application of impedance spectroscopy for monitoring colloid Au-enhanced antibody immobilization and antibody–antigen reactions, Biosensors and Bioelectronics 19 (2004) 575–582. J. H. O. Owino, A. Ignaszak, A. Al-Ahmed, P. G. L. Baker, H. Alemu, J. C. Ngila, E. I. Iwuoha: Modelling of the impedimetric responses of an aflatoxin B1 immunosensor prepared on an electrosynthetic polyaniline platform, Anal. Bioanal. Chem, 388 (2007) 1069–1074. J. Y. Liao: Construction of nanogold hollow balls with dendritic surface as immobilized affinity support for protein adsorption, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 57 (2007) 75-80. H. Tang, Q. Wang, Q. Xie, Y. Zhang, L. Tan, S. Yao: Enzymatically biocatalytic precipitates amplified antibody–antigen interaction for super low level immunoassay: An investigation combined surface plasmon resonance with electrochemistry, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 668–674. S. J. Daly, G. J. Keating, P. P. Dillon, B. M. Manning, R. O’Kennedy, H. A. Lee, M. R. A. Morgan: Development of Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassay for Aflatoxin B1 Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48 (2000) 5097-5104. Silvana Andreescu, Lise Barthelmebs, Jean-Louis Marty: Immobilization of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes: comparative study between three immobilization methods and applications to the detection of organophosphorus insecticides, Analytica Chimica Acta 464 (2002) 171 Thierry Montesinos, Sandra Pérez-Munguia, F. Valdez, Jean-Louis Marty: Disposable cholinesterase biosensor for the detection of pesticides in water-miscible organic solvent, Analytica Chimica Acta 431 (2001) 231

- 86 -

86. 87.

88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104.

Ru-Qiang Liang, Cui-Yan Tan, Kang-Cheng Ruan: Colorimetric detection of protein microarrays based on nanogold probe coupled with silver enhancement, Journal of Immunological methods 285 (2004) 157 Zhao-Peng Chen, Zhao-Feng Peng, Yan Luo, Bo Qu, Jian-Hui Jiang, Xiao-Bing Zhang, Guo-Li Shen, Ru-Qin Yu: Successively amplified electrochemical immunoassay based on biocatalytic deposition of silver nanoparticles and silver enhancement, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 485 Lionel Marcon, Didier Stiévenard, Oleg Melnyk: Electrical detection of human immunoglobulins G from human serum using a microbiosensor, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 81 Xia Chu, Xin Fu, Ke Chen, Guo-Li Shen, Ru-Qin Yu: An electrochemical stripping metalloimmunoassay based on silver-enhanced gold nanoparticle label, Biosensors and Bioelectronics 20 (2005) 1805 I. Alexandre, S. Hamels, S. Dufour, J. Collet, N. Zammatteo, F. De Longueville, J.L. Gala, and J. Remacle: Colorimetric Silver Detection of DNA Microarrays, Analytical Biochemistry 295 (2001) 1 Allen J Bard, Larry R. Faulkner: Electrochemical methods –Fundametals and applications, 2001, John Wiley &Sons Xavier Munoz-Berbel: Microsystems based on microbial biosensing, 2008 Jian Guo Guan, Yu-Quing Miao and Qing-Jie Zhang: Impedimetric Biosensors, Journal of Biosience and Bioengeering 97 (2004) 219 Digby D. Macdonald, Elzbieta Sikora and George Engelhardt: Characterizing electrochemical systems in the frequency domain, Electro Chimica Acta 43 (1998) 87 Jean-Baptiste Jorcin, Mark E. Orazem, Nadine Pébere, Bernard Tribollet: CPE analysis by local electrochemical impedance spectroscopy, Electrochi. Acta 51 (2006) 1473-1479 P.J. Cotty, R.J. Garcia, Influences of climate on aflatoxin producing fungi and aflatoxin contamination, Int. J. Food Microbiol. 119 (2007) 109–115. J.F. Gremmels, Mycotoxins in cattle feeds and carry-over to dairy milk: a review, Food Addit. Contam. 25 (2008) 172–180 H.E. Mee, H.R. Park, S.J. Hu, K.S. Kwon, H. Lee, M.S. Ha, K.M. Kim, E.J. Ko, S.D. Ha, H.S. Chun, D.H. Chung, D.H. Bae, Monitoring of aflatoxin B1 in livestock feeds using ELISA and HPLC, J. Microbiol. Biotechnol. 16 (2006) 643–646 J.L. Richard: Some major mycotoxins and their mycotoxicoses—an overview, Int. J. Food Microbiol. 119 (2007) 3–10 H.P. Egmond, R.C. Schothorst, M.A. Jonker, Regulations relating to mycotoxins in food, Anal. Bioanal. Chem. 389 (2007) 147–157 European Commission Regulation, No. 466/2001/EC of 8 March 2001, Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in Foodstuffs, O.J.E.C., L077 (2001) 1– 13 European CommissionRegulation,No. 683/2004/EC of 13 April 2004, Amending Regulation (EC) No. 466/2001 as Regards Aflatoxins and Ochratoxin A in Foodsfor Infants and Young Children, O.J.E.C., L106 (2004) 3–5. Gordon S. Shepard: Aflatoxin analysis at the beginning of the twenty first century, Anal Bioanal Chem 395 (2009) 1215-1224 Robert Köppen, Matthias Koch, David Siegel, Stefan Merkel, Ronald Maul, Irene Nehls: Determinataion of mycotoxins in foods: current state of analytical methods and limitations, Appl. Microbiol. Biotechnology 86 (2010) 1595-1612

- 87 -

105. Loic J. Blum, Pierre R Coulet: Biosensor principles and applications, 1991, Marcel Dekker 106. M.J. Warwick, L.Brian (Ed.): Immunoassay: A practical guide, Taylor& Francis Ltd. London, UK 1996 pp 150-170 107. B. Prieto-Simon, M. Campas, J.-L. Marty, T. Noguer: Novel highly performing immunosensor-based strategy for ochratoxin A detection in wine samples, Biosens. Bioelectron. 23 (2008) 995-1002 108. Hideo Gotoh, Yukiko Matsumoto: Cell-surface streptavidin fusion protein for rapid selection of transfected mammalian cells, 5-Gene 389 (2007) 146-153 109. A.Radoi, M.Targa, B.Prieto-Simon, J. L. Marty:Enzymes-linked immunosorbent assay ELISA based on superparamagnetic nanoparticles for aflatoxin M1 detection, Talanta 77 (2008) 138-143 110. Aiping Fan, Choiwan Lau, Jianhong Lu: Magnetic Bead-Based Chemiluminescent Metal Immunoassay with a Colloidal Gold Label, Anal Chem, 77 (2005) 3238-3242 111. Bo-Wen Lu, Wen-Chang Chen: A disposable glucose biosensor based on dropcoating of screen-printed carbon electrodes with magnetic nanoparticles, Journal of Magnetism and Magnetic material 304 (2006) e400 112. Horia Chiria,Dumitru-Daniel Herea, Sorin Corodeanu: Microwire array for giant magneto-impedance detection of magnetic particles for biosensor prototype, Journal of Magnetism and Magnetic material 311 (2007) 425 113. A. Bonanni, M.J. Esplandiu, M. del Valle: Signal amplification for impedimetric genosensing using gold-streptavidin nanoparticles, Electro Chimica Acta 53 (2008) 4022 114. Huan Chen, Jian-Hui Jiang, Yong Huang, Ting Deng, Ji-Shan Li, Guo-Li Shen, RuQin Yu: An electrochemical impedance immunosensor with signal amplification based on Au-colloid labeled antibody complex, Sensors and Actuators B 117 (2006) 211 115. Yingzi Fu, Ruo Yuan*, Lan Xu, Yaqin Chai, Yan Liu, Dianping Tang, Ying Zhang: Electrochemical impedance behavior of DNA biosensor based on colloidal Ag and bilayer two-dimensional sol–gel as matrices, Journal of Biochemical and Biophysical methods 62 (2005) 163 116. Charlie O. Parker, Ibtisam E. Tothill: Development of an Electrochemical Immunosensor for Aflatoxin M1 in Milk with Focus on Matrix Interference, Biosensors Bioelectronics 24 (2009) 2452

- 88 -

VII.

Tudományos közlemények és publikációk

Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények: 1. Víg Attila, Iglói Attila, Adányi Nóra, Bóka Beáta, Csutorás Csaba, Kiss Attila: Élelmiszer minták mérésére alkalmas aszkorbinsav bioszenzor fejlesztése FIA (flow injection analysis) rendszerben, Developing of ascorbic acid biosensor in FIA (flow injection analysis) system suitable for food samples, Erdélyi Műszaki Szemle (2007) 39-40. p. 88 2. Attila Víg, Attila Iglói, Nóra Adányi, Gyöngyi Gyémánt, Csaba Csutorás, Attila Kiss: Measuring antioxidants in food with biosensor techniques, microCAD 2008 International Scientific Conference Papers, Miskolc (2008), pp. 63-68 3. Attila Vig, Antonio Radoi, Xavier Munoz-Berbel, Gyongyi Gyemant, Jean Louis Marty: Impedimetric aflatoxin M1 immunosensor based on colloidal gold and silver electrodeposition, Sens. Act. B 134 (2009) p. 214-220 Impact: 3.083 4. Attila Vig, Xavier Munoz-Berbel, Antonio Radoi, Montserrat Cortina-Puig, Jean Louis Marty: Characterization of the gold catalysed deposition of silver on graphite screen printed electrodes and their application to the development of impedimetric immunosensors, Talanta 80 (2009), issue 2, p. 942-946 Impact: 3.29 5. Attila Vig, Attila Igloi, Nora Adanyi, Gyongyi Gyemant, Csaba Csutoras, Attila Kiss: Development and characterization of a FIA system for selective assay of L-ascorbic acid in food samples, Bioprocess Biosyst. Eng., (published online 2010), DOI: 10.1007/s00449-010-0418-6 Impact: 1.823 Össz impakt faktor: 8,196

- 89 -

Az értekezés témájához kapcsolódó konferencia előadások és poszterek: 1. VÍG Attila, IGLÓI Attila, ADÁNYI Nóra, BÓKA Beáta, CSUTORÁS Csaba, KISS Attila Aszkorbát oxidáz alapú aszkorbinsav bioszenzor fejlesztése FIA (flow injection analysis) rendszerben XXII. Nemzetközi Vegyészkonferencia, Csíkszereda, Erdély, 2006

október (poszter) 2. VÍG Attila, IGLÓI Attila, ADÁNYI Nóra, CSUTORÁS Csaba, KISS Attila L-Aszkorbinsav mérésére alkalmas aszkorbát oxidáz bioszenzor fejlesztése FIA (flow injection analysis) rendszerben Centenáriumi Vegyészkonferencia, Sopron, 2007 május (poszter)

3. Iglói Attila, Víg Attila, Adányiné Kisbocskói Nóra, Csutorás Csaba, Kiss Attila Glassy carbon elektród előkezelési eljárásainak kidolgozása szulfit bioszenzor kifejlesztésére

Centenáriumi Vegyészkonferencia, Sopron, 2007 május (poszter) 4. A. VÍG, A. IGLOI, N. ADANYI, Gy. GYÉMÁNT, Cs. CSUTORÁS, A. KISS Development of Ascorbate Oxidase Based Biosensor for Measuring Food Samples Relatenz 2007,

Nemzetközi

Enzimtechnológiai

Konferencia,

University

of

Matanzas,

Matanzas, Kuba, 2007 június (poszter) 5. Attila Igloi, Attila Vig, Nora Adanyi, Csaba Csutoras, Attila Kiss

Development

of

a

sulfite oxidase based amperometric biosensor used in FIA system for the determination of sulfite Euroanalysis XIV, Antwerpen, Belgium, 2007 szeptember (poszter)

6. VÍG Attila, IGLÓI Attila, ADÁNYINÉ Kisbocskói Nóra, CSUTORÁS Csaba, KISS Attila FIA rendszerû aszkorbát oxidáz bioszenzor fejlesztése L-aszkorbinsav meghatározására

Környezetvédelmi Analitikai és Technológiai Konferencia, Eger, 2007 október (poszter) 7. Víg Attila, Iglói Attila, Adányi , Gyémánt , Csutorás Csaba, Kiss Attila Új analitikai eljárás fejlesztése élelmiszer antioxidánsok vizsgálatára- Development of new analytical procedure for investigation of food antioxidants „Lippay János – Ormos Imre - Vas Károly Tudományos Ülésszak”, Corvinus Egyetem, Budapest, 2007. november (poszter)

- 90 -

8. Víg Attila, Iglói Attila, Csutorás Csaba, Kiss Attila, Szováti Katalin C-vitamin sorozatmérésére alkalmas új analitikai mérő-műszer kifejlesztése XVI. Élelmiszer Minőségellenőrzési Tudományos Konferencia, Tihany, 2008. április (poszter) 9. Attila Vig, Xavier Munoz-Berbel, Antonio Radoi, Jean-Louis Marty Impedimetric detection of aflatoxin M1 with biomolecular interaction using colloidal gold XII Trobada Transfronterera Andorra 2008, 2008 szeptember (előadás)

- 91 -