Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben
Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben Szigeti Tamás János (WESSLING Hungary Kft.)
Bevezető statisztikák
Aflatoxin vizsgálati igények 2006 – 2013 (db)
Összesen: 18 625 db aflatoxin vizsgálat
Aflatoxin vizsgálati igények 2006 – 2013 (db)
Aflatoxin vizsgálati igények 2006 – 2013 (db)
Aflatoxin M1 vizsgálati igények 2006 – 2013 (db)
Aflatoxin M1 vizsgálati igények 2011-13 (havi db)
2011
2012
2013
Aspergillus flavus telepek kukoricaszemen
Penészgombák Az elmúlt évezred utolsó évtizedeiben fordult a figyelem a mikroszkópikus gombák toxinjai felé. A takarmánynövényeket és élelmiszereket fertőző gombák közül több faj olyan biokémiai szisztémával rendelkezik, amely a gombára ható környezeti hatásokra adott válaszként toxikus vegyületet állít elő (Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Claviceps). Az élelmiszerbiztonsági RASFF riasztások között a legtöbb mikotoxinszennyezettség miatt történt:
RASFF riasztások 2006-ban (MÉBIH adat)
RASFF riasztások 2006-ban (MÉBIH adat)
700 riasztás mikotoxinok miatt
RASFF riasztás tejek: aflatoxin M1 tartalma
Date
Reference
Pro-duct type
Notification type
Controll type
Notified by
Origin
Subject
Distribution
Category
Week
Dátum
Kódszám
Termék típus
Bejelent.tí pus
Ellenőrz.tí pus
Bejelentő
Származás
Tárgy
Ért.helye
Kategória
Hét
food
information for followup
company's own check
food
information for attention
company's own check
food
information for followup
company's own check
food
information for attention
company's own check
2012. 10.25
2012.1 499
2012. 10.22
2012.1 469
2012. 01.23
2012.0 116
2012. 01.17
2012.0 093
2007. 09.17
2007.0 645
food
alert
company’s own check
Slovenia
Italy
Italy
Italy
Italy
Hungary
Aflatoxins (Tot. = 0,074 μg/kg ppb) in raw chilled milk from Hungary
Slovenia
milk and milk products
43
Hungary
Aflatoxins (Tot. = 0,095 μg/kg ppb) in raw milk from Hungary
Italy
milk and milk products
43
Hungary
Aflatoxins (M1: 0,072 μg/l) in raw milk from Hungary
Italy
milk and milk products
4
Slovenia
Aflatoxins (M1: 0,183 μg/kg ppb) in raw milk from Slovenia
Italy
milk and milk products
3
Hungary Slovakia
Aflatoxins (M1 = 0,03; 0,45; 0,43 μg/kg – ppb) in fresh raw milk from Hungary, via the Slovak Republic
Italy Slovakia
milk and milk products
38
1960: Anglia, pulykák X betegsége
1960: Anglia, pulykák X betegsége
Gerald Wogan és George Hermann Büchi
1960/1963 GB/USA
Gerald Wogan: a vegyületet azonosította George H. Büchi: az A. flavus gombát ismerte fel >100 000 pulyka és kacsa pusztulása mogyorótól
Vizsgálatok (1960 – 1963)
G. Wogan a brazíliai földimogyoróból UV-fényben fluoreszkáló vegyületet talált. Az erősen mérgező földimogyoróból G. H Büchi fonalas gombát is izolált, amely táptalajon termelte az ismeretlen anyagot: Aspergilus flavus (magyarul: „kannapenész”)
Aspergillus konidiumtartók
107 spóra/cm2 Aspergillus sp.
Néhány nemzetség és faj Aspergillus (flavus, ochraceus, niger, viridicatum) toxinok: Aflatoxinok (B1, B2, G1, G2, M1, M2) Ochratoxin-A, ochratoxin-B, ochratoxin-C Patulin Penicillium (chrysogenum, brevicompactum) toxinok Ochratoxin-A Patulin Fusarium (graminearum, culmorum) toxinok Zearalenon (F-2 toxin) Nivalenol Deoxinivalenol (DON) T2-toxin Fusarium moniliforme toxinja Fumonizinek Alternaria alternata toxinok Alternariol Altertoxin 1
Néhány nemzetség és faj Aspergillus (flavus, ochraceus, niger, viridicatum) toxinok: Aflatoxinok (B1, B2, G1, G2, M1, M2) Ochratoxin-A, ochratoxin-B, ochratoxin-C Patulin Penicillium (chrysogenum, brevicompactum) toxinok Ochratoxin-A Patulin Fusarium (graminearum, culmorum) toxinok Zearalenon (F-2 toxin) Nivalenol Deoxinivalenol (DON) T2-toxin Fusarium moniliforme toxinja Fumonizinek Alternaria alternata toxinok Alternariol Altertoxin 1
Mikotoxinok meghatározása
A mikotoxinok a gombák, elsősorban a „penészgombák” extracellulárisan kiválasztódó másodlagos anyagcseretermékei. E vegyületek a melegvérűeket főként enterálisan károsítják. Némelyek közülük antibiotikus hatásúak. A „kalaposgombák” toxinjai nem tartoznak az ún. mikotoxinok közé!
Mikotoxinok csoportba-sorolása
Az eddig leírt nagyszámú toxin és gombafaj miatt nehéz a csoportosítás. Az egy nemzetségbe tartozó gombák különböző toxinokat termelnek, és fordítva, taxonómiailag távol álló fajok képesek azonos toxinokat előállítani. Rendszerezési lehetőségek: 1. Kémiai szerkezet alapján 2. Magasabbrendűekre gyakorolt farmakológiai hatás alapján 3. Bioszintézisük alapján (nem teljeskörű)
Furanofuránok - aflatoxinok
Aflatoxin-csoport: szubsztituált kumarin-származékok - aflatoxin B1 - aflatoxin G1 - aflatoxin M1 - aflatoxin B2 - aflatoxin G2 - aflatoxin M2 - aflatoxin B3
Aspergillus flavus, Asp. parasiticus
B1, G1, M1 : 7,8-dihidrofurano(2,3-b)furán B2, G2, M2: 2,3,7,8-tetrahidrofurano(2,3-b)furán
Kumarin régóta ismert íz- és aromaanyag
Fahéj (ceyloni, cassiai) Szagos müge (szeszipari alkalmazás) Brazil tölgy Somkóró
Aflatoxin B1
Alattomos, kifejezetten toxikus vegyület
O
O
O
O
O
OCH3
Aflatoxin B1 (szubsztituált kumarinok)
Kumarin-váz
O
O
O
O
O
OCH3
Aflatoxin B2 (szubsztituált kumarinok)
Hiányzik egy kettőskötés
O
O
O
O
O
OCH3
Aflatoxin G1 (szubsztituált kumarinok)
O
O
O
O
O
O
OCH3
Aflatoxin G2 (szubsztituált kumarinok)
O
O
O
O
O
O
OCH3
Aflatoxin M1 (szubsztituált kumarinok)
Mitokondriális citokróm P450: AFB1AFM1 (15-30 perc)
AFM1 AFB1
Aflatoxin M1 (szubsztituált kumarinok)
O O
OH
O
O
O
OCH3
Az Aspergillus fajok toxintermelési jellemzői - SZAPORODÁS: széles hőmérsékleti intervallumban
- TOXINTERMELÉS: - Valószínűsége: 6-75 % (változó adatok) - Vízaktivitás - Optimális hőmérsékletek: - 20 oC körül: aflatoxin G1 - 30 oC körül: aflatoxin B1 - Hazai klíma? - Maximális koncentráció: a fertőzést követő 2 héten belül - TOXINTERMELÉST TÁMOGATÓ SZUBSZTRÁTOK: - Szacharóz - Glükóz - (NH4)2SO4 Zn,
Az aflatoxinok biológiai hatása (B1 és M1) -
ÉRZÉKENY FAJOK: kacsa, pulyka, egér, tengerimalac, patkány,
- TOLERÁNS FAJ: juhok - TÜNETEK: étvágytalanság, tömegvesztés, elhullás, krónikusan karcinóma kialakulása; - KÓRBONCTAN: májkárosodások (elhalás, daganatok; egy kóreset: napi 100 g sózott mogyoró veszélyes lehet…)
- ADI-ÉRTÉK: 5 ng/ttkg/nap (kb 300 – 400 ng/fő) (FDA adat) - LD50-ÉRTÉK (patkányoknál ip):
O
6 mg/ttkg
O
18 mg/ttkg
Az aflatoxinok biológiai hatása (AFB1, AFM1) T.D.Phillips1, E. Afriyie-Gyawu1, J.Williams2, H.Huebner1, N.A. Ankrah3, D.Ofori-Adjei3, P.Jolly4, N.Johnson1, J.Taylor1, A. MarroquinCardona1, l.Xu5, l.Tang5, & J.S.Wang5:: Reducing human exposure to aflatoxin through the use of clay: A review. Food Additives and Contaminants, February 2008; 25(2): 134–145 1
Department of VIBS-MS 4458, Texas A&M University, Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine, College Station, TX 77843, USA,
2 Peanut
Collaborative Research Support Program, University of Georgia,Griffin, GA, USA,
3
School of Public Health, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana,Legon, Accra, Ghana,
4
Epidemiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA, and
5
Instituteof Environmental/Human Health, Texas Tech University, Box 41163, TTU/TIEHH, Lubbock, TX 79409-1163, USA
A cikk az alábbi oldalon található: http://www.scribd.com/doc/61661206/36450378 (Food Additives and Contaminants, February 2008; 25(2): 133)
Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj
Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj
Az aflatoxin B1 molekulái (vörös színnel) a DNSláncba interkalálódnak.
[d(ATCAFBGAT). d(ATCGAT) és d(ATAFBG-CAT)2]
Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj
Az aflatoxin B1 molekulái (vörös színnel) a DNSláncba interkalálódnak.
Interkalálódott aflatoxin B1
[d(ATCAFBGAT). d(ATCGAT) és d(ATAFBG-CAT)2]
Aspergilloma a tüdőben (a gomba belégzése)
Az Aspergillus spóráinak belégzése következtében gombatelepek alakulhatnak ki a tüdő hörgőiben.
VM 64/2012. (VII. 3.) VM rendelet – Takarmány
mg/kg
0,02 0,01
0,005
0,02
A Bizottság 165/2010/EU rendelete – Tej
µg/kg
0,050
0,025 0,025
Aflatoxin M1 határérték tejben: 0,05 µg/kg
Aflatoxin M1 határérték tejben: 0,05 µg/kg (50 ng/kg)
Analitikai lehetőségek
Amit mérni kell… (néhány század ppb)
1 ppb = 1 gramm/1000 tonna 1 ppb = 1 µg/kg 1 ppb ≈ 1 µg/liter Számottevő mérési bizonytalanság!
Méréstechnika, analitikai lépések
Mintaaprítás, extrakció Immunkromatográfiás tisztítás Származékképzés Műszeres mérés: 1. HPLC/DAD – kis érzékenység nagyobb pontosság 2. HPLC/FLD – nagyobb érzékenység és pontosság 3. ELISA – nagy érzékenységű, kevésbé pontos 5. Értékelés 6. Vizsgálati jegyzőkönyv Mindezek mellett: • Kalibráció, pontosság • Görbeillesztés, línearitás • Ismételhetőség, reprodukálhatóság • Visszanyerés vizsgálata • Alsó méréshatár ellenőrzése 1. 2. 3. 4.
Méréstechnika, analitikai lépések
Mintaaprítás, extrakció Immunkromatográfiás tisztítás Származékképzés Műszeres mérés: 1. HPLC/DAD – kis érzékenység nagyobb pontosság 2. HPLC/FLD – nagyobb érzékenység és pontosság 3. ELISA – nagy érzékenységű, kevésbé pontos 5. Értékelés 6. Vizsgálati jegyzőkönyv Mindezek mellett: • Kalibráció, pontosság • Görbeillesztés, línearitás • Ismételhetőség, reprodukálhatóság • Visszanyerés vizsgálata • Alsó méréshatár ellenőrzése 1. 2. 3. 4.
Immunkromatográfiás oszloptisztítás
Extraktum
Immunkromatográfiás oszloptisztítás
Mosás
Eluálás
Kromatográfiás elválasztás és detektálás
A vizsgálat eredménye: 1. toxin µg/kg 2. toxin µg/kg 3. toxin µg/kg
Kolonna
Kromatogram 1.
2.
3.
Fluorimetriás detektálás származékképzéssel
Mérési hullámhossz
Gerjesztő hullámhossz Norm.
lEx = 373 nm
lEm = 435 nm
40 30 20 10 0 250
300
350
400
450
500
550
nm
HPLC-FLD: nagy érzékenység, precíz konfirmálás
A mérőberendezés Agilent 1100 HPLC-FLD
Mérési eredményeink
2006 óta 18 625 aflatoxin mérés…
Aflatoxin standardek kromatogramja B, G
B1 G1 G2
B2
Aflatoxin standard, G1: 12,5 ng/ml, B1: 12,5 ng/ml, G2: 3,75 ng/ml, B2: 3,75 ng/ml
Minta extraktumának kromatogramja (B, G)
B1 G1 G2
B2
Aflatoxin M1 kromatogramok (tej vizsgálata)
0,02 µg/kg
4.6 4.4
A7.010 rea :1 8.9 75 5
FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TOX 2012-11-08 13-16-13\022-2501.D) LU 4.8
Aflatoxin M1
4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3 0 2 FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TOX 2012-11-08 13-16-13\036-3901.D)
4
6
8
10
12
14
min
8
10
12
14
min
8
10
12
14
min
LU 4.8 4.6
<0,02 µg/kg
4.2 4
15.055
3.8
A7.013 rea :5 .65 42 3
4.4
3.6 3.4 3.2 3 0 2 FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TOX 2012-11-08 13-16-13\037-4001.D)
4
6
4.6 4.4
<0,02 µg/kg
4.2 4
- Aflatoxin_M1 A6.984 rea :9 .95 95 2
LU 4.8
3.8 3.6 3.4 3.2 3 0
2
4
6
Aflatoxin M1 kalibrációs görbéje A fla to x in _ M 1 , F L D 1 A A re a = 2 2 .3 0 7 8 9 7 * A m t + 0 A re a
R e l. R e s % (1 ): -1 8 .9 9 8
5
200
150 4
100
50
3 2 1
0
C o rre la tio n : 0 .9 9 9 6 2 0
2
4
6
8
A m o u n t[n g / m l]
Aflatoxin B1 gyakorisága takarmányokban
>20 µg/kg 7 db minta
Aflatoxin M1 gyakoriság összes tejtermékben
LOQ alatt 351 db minta 0,05 µg/kg aflatoxin M1 (19 db minta)
Aflatoxin M1 gyakoriság 482 db tejtermékben
Aflatoxin M1 gyakorisága 482 db tej- és tejtermék-mintában
> 50 µg/kg minták: 50 db (15,2%)
Tejek aflatoxin M1 tartalma (>LOQ = 0,01 µg/kg) µg/kg
70 db <0,05 µg/kg (21,3%)
50 db ≥0,05 µg/kg (15,2%)
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!
Külön köszönet illeti a WESSLING Hungary Kft. Élelmiszerbiztonsági Üzletága Laboratóriumának munkatársait.
X
