BIOSIMILAR :TREND OBAT MASA KINI

BioTrends Vol.7 No.1 Tahun 2016

BIOSIMILAR :TREND OBAT MASA KINI NENG HERAWATI Laboratorium Protein Terapeutik dan Vaksin Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI-Cibinong Science Center (CSC) Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong Jawa Barat (16911) Telp. 021-8744587, Fax. 0218754588 Email: [email protected]/[email protected]

P

engertian Biosimilar menurut badan kesehatan dunia (WHO) adalah istilah yang dipakai untuk obat biologis yang memiliki karakteristik yang mirip dengan obat biologis yang sudah disetujui (originator) atau dapat dibuat ketika masa paten obat originatornya sudah habis, namun tidak identik. Kemiripan tersebut meliputi regulasi, proses produksi, kualitas, keamanan, kemurnian dan potensi atau kemanjurannya (Kumar & Singh, 2014; www.gelifesciences.com). Biosimilar dapat berupa rekombinan protein terapetik, hormon dan antibodi. Obat biologis adalah zat aktif yang terbuat atau diperoleh dari sel-sel hidup melalui proses biologi sebagai contoh adalah insulin dapat diproduksi oleh mahluk hidup (seperti bakteri dan yeast) melalui teknik rekayasa genetika. Efek produk biologis ini diyakini lebih mudah dicerna tubuh karena terbuat dari bahan-bahan makhluk hidup. Kemajuan penelitian bidang bioteknologi, memungkinkan diproduksinya biosimilar dari beberapa sel hidup atau sistem ekspresi (host) dengan memanfaatkan teknologi DNA rekombinan. Sistem-sistem ekspresi tersebut diantaranya: bakteri, yeast, tanaman, serangga dan mammalia. Albumin,

Interferon (Roferon A dan Intron A), Insulin (Insulin glargin) dan Eritropoietin (Epoitin alfa) adalah beberapa contoh produk biosimilar yang telah beredar di dunia industri farmasi. Seiring semakin bertambahnya pola penyakit di masyarakat modern, kebutuhan akan obat biosimilar akan semakin bertambah pula. Hal ini disebabkan karena pola perkembangan penyakit di masyarakat mulai bergeser dari penyakit infeksi menuju penyakit degeneratif (yaitu penyakit yang terjadi akibat bertambahnya usia seseorang) dan penyakit-penyakit serius. Contoh penyakit ini adalah: stroke, kanker, dan diabetes. Obat biosimilar, diharapkan dapat bersaing secara harga dengan obat-obat kimia yang relatif berbiaya tinggi. Munculnya produk-produk biosimilar di pasaran harus dipandang sebagai peluang untuk memperoleh produk obat biologi dengan harga yang lebih murah dan dengan manfaat yang sama atau mendekati produk originatornya. Kondisi ini tentu saja sangat menggiurkan bagi industri farmasi di negaranegara maju dan berkembang.

14

Biosimilar dapat berupa rekombinan protein terapetik, hormon dan antibodi yang terbuat atau diperoleh dari selsel hidup melalui teknik rekayasa genetika, sebagai contoh adalah insulin. Kebutuhan akan obat biosimilar akan semakin bertambah terutama untuk terapi penyakit degeneratif dan diyakini lebih mudah dicerna tubuh.

BioTrends Vol.7 No.1 Tahun 2016

Sebelum membuat biosimilar ada beberapa hal penting yang harus diperhatikan dan dipahami terlebih dahulu yaitu:

glikoprotein (protein yang memiliki pola glikosilasi) diproduksi, mesin produksinya harus mampu melakukan proses modifikasi setelah translasi yang 1. Karakter protein biosimilar akan memodifikasi rantai protein dengan menambahkan gula pada Karakteristik protein tidak hanya sisi glikosilasi. Alasan ini ditentukan oleh struktur primer menjadikan produksi glikoprotein (urutan asam amino) atau lebih dianjurkan dilakukan dalam konformasi spasialnya (struktur sel eukariot, sedangkan protein sekunder sampai quartener), yang non-glikosilasi dapat diproduksi paling penting agar protein pada sel bakteri Escherichia coli. berfungsi secara biologis adalah adanya suatu proses seluler yang Keanekaragaman hayati yang disebut ‘post translational terdapat pada urutan peptida dan modifications’ yang mana proses modifikasi setelah translasi juga ini tidak dikontrol oleh gen yang menjadi sangat signifikan untuk mengkode protein, tetapi murni menguji apakah protein yang merupakan kondisi dari sel yang dihasilkan aktif secara biologi. memproduksinya (host). Banyak strategi dikembangkan Modifikasi tersebut meliputi: selama beberapa tahun terakhir glikosilasi, pembentukan ikatan untuk memenuhi tantangan ini disulfide, gugus fosfat , oksidasi (Chen, 2012). Modifikasi genetik metionin dan deaminasi terhadap mesin biologi bertujuan asparagine. untuk meningkatkan yield dan stabilitas protein terhadap Protein terapetik yang penting perubahan lingkungan atau dalam pengobatan dan telah karakter-karakter lainnya, sebagai dikembangkan adalah contoh, beberapa yeast dan glikoprotein, sebagai contoh sistem lainnya sekarang epoetin (EPO), granulocyte menawarkan modifikasi postmacrophage-colony stimulating translational (misalnya, glikosilasi factor (GM-CSF) dan tissuedan folding) yang sangat plasminogen activator (t-PA). menyerupai pola dari sel mamalia Glikosilasi sangat penting karena (Rader, 2008). ia dapat mempengaruhi aktivitas biologi protein melalui Bagaimana membuat konstruk mekanisme-mekanisme berbeda ekspresi rekombinan DNA untuk (Kuhlmann & Covic, 2006). biosimilar? 2. Sistem ekspresi biosimilar Pemilihan sistem ekspresi protein (host/mesin produksi) dan vektor yang akan membawa gen pengkode protein target menjadi faktor-faktor yang harus dipertimbangkan. Sifat dan karakter protein yang akan diproduksi akan menentukan dimana ia akan diproduksi. Agar

eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi transforman (plasmid rekombinan) yang membawa gen yang menyandi protein target. Pemilihan lokasi ekspresi protein Lokasi protein dapat diekspresikan di dalam sel host misalnya pada membran, badan inklusi atau bisa juga disekresikan ke dalam medium tumbuh. Kita ketahui bahwa biosimilar ditujukan untuk pengobatan penyakit-penyakit non infeksi pada manusia. Sebagian besar protein manusia tergolong glikoprotein, yang mana untuk modifikasinya diperlukan sel/organisme yang mampu melakukan modifikasi ini pada proses produksinya. Ekspresi protein pada badan inklusi bakteri memiliki kendala berupa agregat protein, kondisi ini mempengaruhi konformasi protein menjadi tidak benar. Akibatnya secara resiko klinik menjadi immunogenic (Ho & Trovin, 2013).

Ekspresi ekstraseluler lebih memudahkan dalam proses purifikasi, karena protein yang diharapkan akan dirilis ke dalam media pertumbuhan melalui jalur sekretori yang dimilik sel host. Pemilihan vektor ekspresi Terlepas dari itu, pemilihan lokasi tergantung pada kualitas protein protein akan diekspresikan rekombinan yang akan diproduksi, tergantung dari sifat dan karakter penggunaannya, dan biaya dari protein tersebut, tujuan produksi serta tahap purifikasi utamanya protein yang diproduksi juga penting untuk aktif secara biologis dan tidak dipertimbangkan. Pada prinsipnya menimbulkan efek samping yang vektor ekspresi eukariot tidak beresiko membahayakan pasien. berbeda dengan vektor ekspresi Pemilihan sistem ekspresi yang prokariot. Vektor ekspresi tepat tergantung pada eukariot memiliki promotor karakteristik dan aplikasi dari 15

BioTrends Vol.7 No.1 Tahun 2016

protein rekombinan yang diekspresikan, serta yield yang diharapkan. Artikel ini akan mengulas empat sistem ekspresi yang umum digunakan, E. coli, yeast (Pichia pastoris), Baculovirus/sel serangga, dan sel mamalia. Sistem E. coli, P. pastoris, baculovirus/serangga dan mamalia masing-masing memiliki kelebihan dan kelemahan dalam mengekspresikan protein rekombinan. Apakah sistem tertentu akan mengekspresikan suatu protein pada level tinggi dan menghasilkan produk yang berkualitas adalah tergantung dari protein tersebut. Karakteristik protein dan bagaimana aplikasi tahap downstreamnya juga menjadi pertimbangan dalam memilih metode ekspresi. Protein dengan ukuran lebih dari 100 kDa umumnya diekspresikan dalam sel eukariot, sementara protein yang berukuran kurang dari 30 kDa diproduksi di prokariot.

paling cepat, mudah dan paling murah.

Produksi protein secara ekstraseluler sangat diinginkan Sementara itu kelemahan bakteri karena dapat mengurangi sebagai host diantaranya: kompleksitas pada tahap keterbatasan dalam bioproses dan meningkatkan mengekspresikan protein-protein kualitas produk. Ketidakmampuan eukariotik, disebabkan E. coli mensekresikan produk ketidakmampuan melakukan protein pada media sebagian dari proses modifikasi pertumbuhannya telah lama post-translasional, karena tidak dianggap sebagai kelemahan memiliki enzyme-mediated Nutama dari sistem ini (Chen, linked glycosylation, O-linked 2012). Pada E. coli ekspresi glycosylation, amidation, rekombinan protein normalnya hydroxylation, myristoylation, diarahkan langsung ke sitoplasma palmitation, atau sulfation atau periplasma, dan sedikit yang (Kamionka, 2011, Brondyk, 2009). disekresikan. Protein yang Selain itu ukuran plasmid terbatas langsung diekspresikan pada sampai 15 kb, sebagian besar sitoplasma adalah paling efisien protein toksik untuk bakteri E. karena memberikan hasil lebih coli, adanya badan inklusi, serta dari 30% biomassa (Jana dan Deb, protein tak terlarut. 2005).

Escherichia coli Bakteri E. coli merupakan host pertama yang digunakan untuk ekspresi protein-protein rekombinan dan masih menjadi sistem yang dipertimbangkan dipakai sampai saat ini. Baik skala laboratorium maupun skala industri. Keuntungan menggunakan sel bakteri sebagai sistem ekspresi adalah: tingkat produksi tinggi dan mudah diproduksi skala besar (sampai 100 mg per liter kultur), biaya untuk media dan reagen-reagen yang dibutuhkan tidak mahal, kondisi pertumbuhan cepat (1 sampai 2 hari dari kultur awal ke sel pellet). Ekspresi protein di E. coli merupakan metode yang

Gambar 1. Bakteri E. coli (http://biocliff.blogspot.co.id/2015/02/ecoli-able-to-survive-acid-inside.html) Pada situasi tertentu badan inklusi menjadi penghalang terbentunya protein yang larut dan aktif, namun dalam kondisi khusus juga menguntungkan karena ia resisten terhadap proteolysis, mudah dipekatkan melalui sentrifugasi, tidak terlalu terkontaminasi oleh protein-protein lain, dan dengan beberapa cara mampu melipat kembali menjadi protein aktif dan terlarut (Brondyk, 2009). 16

Penggunaan antibiotik pada sistem E. coli biasanya bertujuan untuk memberikan tekanan selektif untuk meningkatkan stabilitas plasmid, namun dengan adanya kemungkinan potensi risiko penyebaran gen resistensi antibiotik membuatpenggunaan antibiotik pada skala besar sangat tidak diinginkan . Masalah ini menjadi hal yang harus dipertimbangkan para peneliti

BioTrends Vol.7 No.1 Tahun 2016

untuk mencari dan mengembangkan metode alternatif untuk menstabilkan plasmid (Chen, 2012). Yeast Yeast juga telah diterima sebagai host untuk mengekspresikan protein-protein eukariotik. Saccharomyces cerreviseae dan P. pastoris adalah host yang paling atraktif dalam memproduksi jenis protein ini. Keuntungan utama yang ditawarkan oleh sistem ini diantaranya adanya kemudahan dalam teknik-teknik pengembangan dan akses informasi genetiknya, pertumbuhan yang cepat, media kultur sederhana dan murah, serta proses seluler dan metabolismenya juga ditemukan pada eukariot tingkat tinggi (Gargouri et al, 2012). Pada sistem ekspresi ini kita bisa memproduksi protein rekombinan baik secara intraseluler maupun direkayasa untuk masuk ke jalur sekretori yeast, sehingga akan disekresikan pada medium kulturnya. Eukariot uniseluler ini memiliki

kemampuan dalam proses posttranslasional, yaitu menambahkan glycan pada residu asparagine (NLinked) dan residu serin/threonine (O-Linked). Secara substansi struktur-struktur glycan ini berbeda dengan modifikasi yang terjadi pada sel serangga dan mamalia. Permasalahan inilah yang menjadi kendala jika ekspresi dilakukan pada sel yeast. Selain itu khusus S. cerreviseae terdapat beberapa kelemahannya diantaranya: ekspresi rendah, hiperglikosilasi, protein mengandung residu-residu mannose sehingga mengubah fungsi dan protein yg disekresikan jadi antigenic, terkadang protein dipertahankan dalam permukaan periplasma sehingga meningkatkan biaya purifikasi, dihasilkan methanol yang bersifat toksik untuk sel. Baculovirus/sel serangga

(bakteri dan yeast) yeast). Sistem ini juga memiliki mesin terbaik untuk melakukan proses pe pelipatan protein mamali mamalia, sehingga memberi kesempatan terbaik dalam mendapatkan protein yang larut ketika kita mengekspresikan protein yang berasal dari sel mamalia. Kelemahan sel serangga diantaranya biaya yang lebih tinggi dan durasi yang lebih lama untuk memperoleh protein target (biasanya 2 minggu). minggu).Sel serangga digunakan ber berkonjugasi dengansistem vektor ekspresi baculovirus (BEVs) dalam mengekspresikan rekombinan protein. Baculovirus adalah litik, berukuran 130kb, dan merupakan virus double double-stranded DNA (Brondyk, 2009). Jika dibandingkan dengan sel mamalia, sel serangga memiliki beberapa kelebihan yaitu: mudah dikultur,

Sel serangga adalah sistem eukariotik yang lebih tinggi dari yeast serta mampu melaksanakan modifikasi pasca - translasi yang lebih kompleks dibandingkan dengan dua sistem sebelumnya

Gambar 3..Spodoptera frugiperda (http://www.biochrom.de/en /products/cell-culturemedia/insectomed-sfexpress/)

Gambar 2. Sel yeast P. pastoris (http://2013.igem.org/Team:USP(http://2013.igem.org/Team:USP Brazil/Project) 17

solubilitas dan toleransi terhadap osmolalitas tinggi, serta level ekspresi tinggi ketika diinfeksikan dengan rekombinan baculovirus. Sel Spodoptera frugiperda (subclone 9 (Sf-9) dan sel Trichoplusiani (BTI-Tn-5B1-4, trademarked by Invitrogen as High Five cells) adala adalah host yang

BioTrends Vol.7 No.1 Tahun 2016

digunakan dalam produksi vaksin VLP (virus like particle) dengan BEVs rekombinan (http://www.bioprocessintl.com).

Baby Hamster Kidney (BHK) adalah sistem-sistem yang sering dipilih dalam memproduksi protein terapeutik manusia. Sel CHO dan BHK merupakan sel yang

dan Nanda, 2005). Sebagai konsekuensinya sistem ekspresi yang tidak terlalu mahal lebih disukai walaupun protein rekombinan penting yang autentik hanya dapat diperoleh dari sel mamalia. Daftar Pustaka Bhopale G.M dan Nanda R.K. 2005: Recombinant DNA Expression Products for Human Therapeutic use. Current science, 89 (4),614622. Brondyk, WH. 2009: Selecting an Appropriate Method for Expressing a Recombinant Protein.Methods in enzymology, 463,131-147.

Chen, R. 2012: Bacterial Expression Systems for Gambar 4. Kultur sel CHO (http://www.microscopyu.com) Recombinant Protein Production: E. coli and Proteolisis merupakan masalah ideal karena memiliki kemampuan Beyond. Biotechnology dalam sistem BEVs, sehingga dalam proses glikosilasi protein advanced, 30, 1102-1107. menjadi issue penting yang harus pada sisi yang tepat (Bhopale dan diselesaikan ketika sampai pada Nanda, 2005). Adanya proses Gargouri RM, Soussi SA, Abbès tahap bioproses. Protease modifikasi setelah translasi NH, Amor IY, Chabchoub baculovirus terlibat dalam proses memungkinkan pola glikosilasi IB, Gargouri A. 2012:Yeasts as degradasi selama produksi protein dari protein yang diekspresikan a Tool for Heterologous Gene oleh sel serangga (Ikonomu et al, lebih tepat dan konsisten jika Expression.Methods Mol Biol, 2003).Media untuk kultur sel dibandingkan dengan sel lain, 824, 359-370 serangga ini sama mahalnya seperti bakteri dan yeast. dengan kultur sel mamalia. Sel Kemampuan sel CHO untuk Ho, K and Trovin, J.H. 2013: serangga tidak rutin beradaptasi dan tumbuh pada Biologicals Characteristics, in menambahkan galaktosa atau kultur suspensi serta medium Biosimilars: A New terminal asam sialat ke N-link bebas serum juga menjadi Generations of Biologics, glikoprotein.Konsekuensinya kelebihan sistem ini karena sangat Editors Prugnaud, JL and sistem baculovirus tidak dapat ideal untuk diterapkan pada skala Trouvi, JH. Springer digunakan untuk memproduksi industri (Kim et al, 2012). Sel CHO sejumlah gliprotein mamalia. juga dilaporkan mampu http://www.biochrom.de/en/prod memproduksi rekombinan ucts/cell-cultureKultur sel mamalia menjadi antibodi monoklonal sampai skala media/insectomed-sfmetode yang semakin popular di gram/liter (Wurm, 2004). express/ kalangan akademis laboratorium Kelemahan sistem ini terletak dalam memproduksi protein pada biaya produksi produk yang terapeutik.Sistem ekspresi diinginkan menjadi mahal karena http://biocliff.blogspot.co.id/2015 /02/e-coli-able-to-survivemamalia seperti sel Chinese pertumbuhannya lambat dan acid-inside.html Hamster Ovary (CHO) dan sel mahalnya media nutrisi (Bhopale 18

BioTrends Vol.7 No.1 Tahun 2016

Appl. Microbiol. Product Improvement. A http://www.bioprocessintl.com/u Biotechnol.67, 289-298. perspective on Opportunities pstreamKamionka, M. 2011: Engineering for Innovator and Follow-On processing/upstream-singleof Therapeutic Protein Product use-technologies/large-scaleProduction in Escherichia coli. Developers.BioProcess insect-cellbased-vaccineCurrent Pharmaceutical International, p.4-9. development-330217/ akses Biotechnology, 12: 268-274. 19 oktober 2015. World Health Organization.2009: Kim, J.Y.; Kim, Y.G.; Lee, G.M. Expert Committee on http://www.gelifesciences.com/a 2012: CHO Cells in Biological kses 24 Mei 2016 Biotechnology for Production Standardization.Guidelines of Recombinant Proteins: on Evaluation of Similar http://www.microscopyu.com/aks Current State and Further Biotherapeutic Products es 24 Mei 2016 Potential. Appl. Microbiol. (SBPs).World Health Biotechnol.,93, 917–930. Organization. [Online] 23 Ikonomu L, Schneider YJ, dan Oktober 2009 [Cited: Agathos SN. 2003: Insect Cell Kuhlmann, M dan Covic, A. 2006: Agustus 24, 2015.] Culture for Industrial The Protein Science of Production of Recombinant Biosimilars. Nephrol Dial Wurm, F.M. 2004: Production of Proteins. Appl Microbiol Transplant, 21 (5): 4-8. Recombinant Protein Biotechnol, 62,1-20. Therapeutics in Cultivated Kumar, R dan Singh, J. 2014: Mammalian Cells. Nature Jana, S and Deb, J.K. 2005: Biosimilar drugs: Curent Biotechnol, 22: 1393-1398. Strategies for Efficient status. Int J Appl Basic Med Production of Heterologous Res, 4 (2): 63-66. Proteins in Escherichia coli. Rader RA, 2008: Expression Systems for Process and

19