Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice Listopadu, 2012

Bio-Rad Laboratories Munich Manufacturing

Biogenní aminy pro HPLC

Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012

Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories München, Germany

Biogenní aminy

Biogenní aminy Močové katecholaminy Močové metanefriny

VMA/HVA/5-HIAA (Kyseliny vanilmandlové (VMA), homovanilová kyselina (HVA), 5-Hydroxyindoloctová kyselina(5-HIAA))

Serotonin

Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

Klinické souvislosti

Proč měřit Biogenní Aminy: - zvýšené vylučování biogenních aminů je ukazatelem pro nádory chromafinní tkáně


Klinické souvislosti Biogení Aminy: Katecholaminy : - Epinefrin (Adrenalin) - Noradrenalin

Kyseliny vanilmandlové (VMA) Homovanilová kyselina (HVA)

- Dopamin

Metanefriny : - Metanefrine - Normetanefrine - 3-Methoxythyramine

Serotonin

Tyto látky jsou vylučovány nádory v chromafinní tkáni v ledvinách => Phaechromocytoma (Feochromocytom)

5-Hydroxyindoloctová kyselina

(5-HIAA)

Tyto látky jsou vylučovány enterochromafiními buňkami v např. gastrointestinálním traktu Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

Biogenní aminy – metabolismus

Tyrosine

Trypthophane

3-Methoythyramine

L-Dopa Homovanillic Acid (HVA)

Dopamine

Serotonin

Normetanephrine 5-Hydroxyindolacetic Acid (5-HIAA)

Norepinephrine

Epinephrine

Vanilmandelic Acid (VMA) Metanephrine

Metanephrines by HPLC

VMA/HVA/5-HIAA by HPLC

Catecholamines by HPLC

Serotonin by HPLC


Biogenní aminy – chemické vlastnosti

HO

CH(OH)

CH2

NHCH3

H3CO

CH(OH)

CH2

NHCH3

H3CO

HO

HO

Epinephrine

HO

VMA/HVA/5-HIAA

Metanefriny

Katecholaminy

CH2

NH2

HO

H3CO

Vanilmandelic acid

CH(OH)

CH2

NH2

H3CO

HO

Norepinephrine

COOH

HO

Metanephrine

CH(OH)

CH(OH)

CH2

COOH

HO

Normetanephrine

Homovanillic acid CH2

COOH

HO

HO

CH2

CH2

NH2

H3CO

CH2

CH2

NH2

NH2 N

HO

CH2

HO

HO

N

Dopamine Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

3-Methoxythyramine

5-Hydroxyindolacetic acid

H

Serotonin

CH2

Katecholaminy

Katecholaminy: - Epinefrin (Adrenalin) - Noradrenalin - Dopamin


Chemická struktura

HO

CH(OH)

CH2

NHCH3

HO HO

HO

Noradrenalin

Adrenalin

HO

CH2

HO Dopamin Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

CH2

NH2

CH(OH)

CH2

NH2

Vzorky

Druh vzorku: - moč (24h, acidofilní) žádná káva, banany, ananas, ořechy


Princip separace u katecholaminů

4. Krok: Uvolnění z kolonky SP

1. Krok: Acidifikace

HO

HO

CH(OH)

CH2

NH3

OH OOC

B OH

HO

HO HO

CH(OH)

O B

HO

2. Krok: Vazba na separační kolonku (SP) HO HO

CH(OH)

CH2

NH3

OOC

Binding of positiv charged molecules

3. Krok: Promytí Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

NH2

Catechol-specific release

O

5. Krok: Acidifikace HO

CH2

CH(OH)

CH2

HO

6. Krok HPLC analýza

NH3

HPLC Analýza

HO

Chromatografie

CH(OH)

CH2

NH3

HO

O

O S O

- chromatografie na reverzní fázi za vzniku dynamického iontoměniče

Detekce HO

CH(OH)

CH2

NHCH3

- Elektrochemická detekce (ELCD) HO HO

Oxidace na ELCD O


Norepinephrine - 4.07

Chromatogram

0.0

2.5

5.0

Nová verze

Dopamine - 9.84

Internal Standard - 6.54

Epinephrine - 4.70

Stará verze

7.5

Time (min.) Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

10.0

12.5

Nová souprava pro Močové katecholaminy Nové

(kat.č. 195-5370 / 195-5380)

•

Další reagencie pro rozpuštění a úpravu pH

•

Automatická kontrola pH u močových vzorků

• •

Nový druh analytické kolony Nová mobilní fáze => lepší separace => méně nebezpečné (žádný methanol) => stále kompatibilní se soupravou pro Metanefriny => Mobilní fáze a kolona nejsou kompatibilní se strarou verzí kitu => Příprava vzorku není kompatibilní se starou mobilní fází


Staré •

(kat.č. 195-5841N / 195-5700)

Dostupné do března 2013

Močové metanefriny pro HPLC Složení testu •

•

(195-5370)

Souprava reagencií REAG A REAG B REAG C

Acidic Reagent Basic Reagent Reconstitution Reagent

REAG 1 REAG 2 REAG 3

Dilution Reagent Wash Reagent Elution Reagent

DISP COL

Disposable Columns

INT STND CAL MP

Internal Standard Calibrator Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair)

HPLC kolony ANTL CRTR Analytical Cartridge (RP, 500 Inj.) Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.)

•

Nutné vybavení laboratoře Vortex mixér


Přehled produktu

• Příprava vzorku – Acidifikace – Iontová výměnná chromatografie • HPLC Analýza – Chromatografie na reversní fázi – Isokratická eluce – Iontové párování – Elektrochemická detekce => Analytická kolona a mobilní fáze je identická jako pro soupravu na Metanefriny


Metanefriny

Metanefriny : - Metanefrin - Normetanefrin - 3-Methoxythyramine


Biogenní aminy – metabolismus

Tyrosine

3-Methoxythyramine

L-Dopa Homovanillic acid

Dopamine Normetanephrine Norepinephrine

Epinephrine

Vanillylmandelic Acid Metanephrine

Catecholamines Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

Metanephrines

VMA/HVA

Chemická struktura

H3CO

CH(OH)

CH2

NHCH3

HO

HO

Normetanefrin

Metanefrin

H3CO

H3CO

CH2

CH2

HO

3-Methoxythyramin


NH2

CH(OH)

CH2

NH2

Vzorky

Druh vzorku: - moč (24h, acidofilní) zde není dietní omezení


Separační princip u staré soupravy

1. Krok: Kyselá hydrolýza Dekonjugace metanefrinů

5. Krok: Vazba na anion-intoměničovou separační kolonku H3CO

2. Krok: Komxletování katecholaminů Borátový komplex v zásaditém prostředí

CH(OH)

CH2

NH2

CH2NR O Odstranění nefenolických aminů

3. Krok: Vazba na kation-intoměničovou separační kolonku H3CO

CH(OH)

CH2

NH3

6. Krok: Uvolnění z kolonky

OOC

CH2NR Vazba positivně nabitých molekul: - Borát-Katecholaminový-komplex není vázán - odstranění katecholaminů

HO

4. Krok: Uvolnění z kation-intoměničové separační kolonky NH4 H3CO

CH(OH)

CH2

O Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

OOC

NH2

H3CO Změna pH

CH(OH)

HO

7. Krok: HPLC analýza H3CO HO

CH(OH)

CH2

NH3

CH2

NH3

Separační princip u nové soupravy


4. Krok: Eluce Frakcionovaná eluce Boratovým roztokem (borát-komplex s vyšším pH)

2. Krok: Vazba na kation-intoměničovou separační kolonku H3CO HO

CH(OH)

CH2

NH3

OOC

OOC

H3CO HO B

Vazba kladně nabitých molekul

HO

3. Krok: Promytí Promývací krok s destilovanou vodou Odstranění slabě navázaných molekul

4. Krok: Promytí Promytí borátovým roztokem Odstranění katecholaminů


OH OH

O

CH(OH)

CH2

Změna pH

NH2

Frakcionovaná eluce

5 ml Reag 3 promytí Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

4 ml Reag 3 eluce

množství Reag 3 / pH

Separační princip u nové soupravy


4. Krok: Eluce Frakcionovaná eluce Boratovým roztokem (borát-komplex s vyšším pH)

2. Krok: Vazba na kation-intoměničovou separační kolonku H3CO HO

CH(OH)

CH2

NH3

OOC

OOC

H3CO HO

HO

Promývací krok s destilovanou vodou Odstranění slabě navázaných molekul

O

CH2

OH

5. Krok: změna pH H3CO

CH(OH)

CH2

pH shift

HO

4. Krok: Promytí Promytí borátovým roztokem Odstranění katecholaminů


NH2

Změna pH

B

Vazba kladně nabitých molekul

3. Krok: Promytí

OH

CH(OH)

6. Krok: HPLC-Analýza

NH3

HPLC Analýza

H3CO

Chromatografie

CH(OH)

CH2

NH3

HO

O

O S O


Detekce - Electrochemická detekce (ELCD)

H3CO

CH(OH)

CH2

NHCH3

HO H3CO

Oxidace na ELCD O


Chromatogram

Stará verze


Nová verze

Souprava pro močové Metanefriny Nový • • • •

(Kat.č. 195-5410 / 195-5420)

Příprava vzorku pomocí jedné separační kolonky Automatická kontrola pH vzorků moči Nový druh analytické kolony Nová mobilní fáze => lepší separace => méně zdraví nebezpečné (žádný MeOH) => stále plně kompatibilní se soupravou pro Katecholaminy

=> Mobilní fáze a kolona nejsou kompatibilní se starou verzí soupravy => Příprava vzorku není kompatibilní s starou mobilní fází Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

Starý • •

(Kat.č. 195-5935 / 195-6087)

Dvě separační kolonky Dostupné do března 2013

Souprava pro močové Metanefriny Přehled produktu:

•

Příprava vzorku – Kyselá hydrolýza Dekonjugace metanefrinů

– Katexová chromatografie Odstranění interferujících látek a katecholaminů

– Eluce frakční eluce

•

HPLC Analýza – Chromatografie na reversní fázi – Iontové párování – Elektrochemická detekce


Souprava pro močové Metanefriny Komponenty testu •

•

(195-5410)

Reagencie v soupravě REAG A REAG B REAG C

Acidic Reagent Basic Reagent Reconstitution Reagent

REAG 1 REAG 2 REAG 3

Hydrolysis Reagent Dilution Reagent Wash/Elution Reagent

DISP COL

Disposable Columns

INT STND CAL MP

Internal Standard Calibrator Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair)

HPLC kolona ANTL CRTR Analytical Cartridge (RP, 500 Inj.) Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.)

•

Nutné vybavení laboratoře Vortex mixér, vodní lázeň


VMA/HVA/5-HIAA

VMA/HVA/5-HIAA: - Kyselina vanilmandlová (VMA) - Homovanilová kyselina (HVA) - 5-Hydroxyindoloctová kyselina (5-HIAA)


Chemická struktura

H3CO

CH(OH)

COOH

H3CO

CH2

COOH

HO

HO

Kyselina vanilmandlová

Homovanilová kyselina

CH2

COOH

HO N

5-Hydroxyindoloctová kyselina


Vzorky

Druh vzorku: - moč (24h, acidofilní) žádná káva, čaj, čokoláda, banány, vanilka či oříšky


Separační princip pro VMA/HVA/5-HIAA

1. Krok: Příprava vzorku pro vazbu

4. krok: Promytí Promytí s (Reag 1)

H3CO

CH(OH)

COO + (Reag 1) a IS

HO

2. Krok: Příprava separační kolonky

5. Krok: Uvolnění analytu ze separační kolonky Hydrogensulfát sodný

R N

HO S O O R N

Strong Anion Exchange Resin + Buffer (Reag 1)

3. Krok: Vazba na kolonku H3CO

CH(OH)

COO R N

H3CO

CH(OH)

HO

HO Binding of positiv charged molecules


O

6. Krok: HPLC analýza

COO

HPLC Analýza

H3CO

CH(OH)

Chromatografie

COO

H3C HO

Detekce H3CO

CH(OH)

COO

HO H3CO

Oxidace na ELCD O


N R


- Elektrochemický detektor (ELCD)

R CH3

Chromatogram


VMA/HVA/5-HIAA pro HPLC Přehled produktu • Příprava vzorku – Okyselení – Iontoměničová chromatografie • HPLC analýza – Reverzní fáze – Isokratická eluce – Iontové párování – Elektrochemická detekce


Electropherogram

[%] 100 90

Detected Analyte

80 70 60 50 40 30 20 10 300

400 500 600 700 Electrochemical Cell Potential

Internal Standard Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

800

900

[mV]

VMA/HVA/5-HIAA souprava pro HPLC Komponenty testu: •

•

Reagenční spouprava REAG 1 REAG 2 DISP COL

Wash Reagent Elution Reagent Disposable Columns

INT STND 1 INT STND 2 CAL MP

Internal Standard 1 Internal Standard 2 Calibrator Mobile Phase (Acetonitril, Ion Pair)

TEST MIX

Test mix

HPLC kolona ANTL CRTR Analytical Column (RP, 500 Inj.) Micro-Guard Guard Cartridge (250 Inj.)

•

Vybavení laboratoře Vortex Mixér, Centrifuga


VMA rychlá metoda

VMA rychlá methoda • Analýza pouze VMA • Snížení doby chromatografie (20

11 min)

• 2 vnitřní standardy (HICA + HIVA) v oddělených lahvičkách


VMA rychlá metoda

triple test Dr. Reiner Krey Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich

pouze VMA

Děkuji za pozornost!


Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice Listopadu, 2012

Recommend Documents