Derivatizace v HPLC Obecný způsob derivatizace a derivatizační techniky v HPLC Mnoho látek neprojevuje absorpci v UV oblasti nebo fluorescenci - mohou být převedeny na UV – absorbující nebo fluoreskující deriváty před nebo po kolonovou derivatizací Způsob derivatizace oPokolonová derivatizace – nejsou změny v chromatografickém systému oPředkolonová derivatizace – umožní změny v chromatografickém procesu HPLC derivatizace
1
Derivatizace Důvody použití derivatizace v HPLC o - zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec o - zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec o - zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně Způsob derivatizace a) Předkolonová derivatizace (pre-column chromatography); chemická reakce probíhá před kolonou b) Pokolonová derivatizace (post-column chromatography); chemická reakce probíhá za kolonou c) Derivatizace na koloně; chemická reakce probíhá přímo v koloně Všechny způsoby derivatizace mají vliv na eluční charakteristiky separovaných látek (účinnost separace a dobu analýzy), ale požadavky na deriváty jsou poněkud odlišné. HPLC derivatizace
2
Požadavky na deriváty předkolonové derivatizace o derivát musí být chemické individuum a měl by být dostatečně stabilní o derivatizační reakce musí probíhat kvantitativně o derivatizační reakce nemusí probíhat rychle o reakce by měla být pokud možno selektivní o reakce by měla být bez vedlejších produktů a měla by probíhat za mírných reakčních podmínek (pH, teplota) tak, aby nebyla nutná předseparace vzniklého individua o při použití nadbytku derivatizačního činidla musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně a pokud možno by mělo mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti (nevykazuje fluorescenční vlastnosti) Předkolonová derivatizace vyžaduje poměrně velkou experimentální náročnost a zkušenost operátora (reprodukovatelnost výsledků) HPLC derivatizace
3
Předkolonová derivatizace Výhody o Reakční podmínky mohou být vybrány bez omezení o Reakce může být pomalá o Derivatizace může sloužit jako krok přípravy a čištění vzorku o Přebytek činidla může být odstraněn o Derivatizace může zlepšit chromatografické vlastnosti vzorku (rychlejší eluce …) Nevýhody o V průběhu reakce mohou vznikat vedlejší produkty o Reakce by měla být kvantitativní o Po derivatizaci vzniká více podobných sloučenin – selektivita chromatografie může být nižší HPLC derivatizace
4
Požadavky na deriváty pokolonové derivatizace o o o o o o o o
derivatizační reakce nemusí poskytovat jednoznačné chemické individuum derivatizační reakce nemusí probíhat kvantitativně, ale rozhodující je dobrá reprodukovatelnost chemické reakce derivatizační reakce musí probíhat rychle, reakce může probíhat za extrémních podmínek (pH, teplota) používá se nadbytek reakčního činidla a dochází tak ke zřeďování mobilní fáze činidlem a dochází ke snížení účinnosti separace vlivem rozmytí chromatografické zóny reakce může být neselektivní, vedlejší produkty reakce nejsou na závadu není nutné hledat nové podmínky separace, neboť se vzorek separuje v nezměněné podobě vysoké náklady na techniku, neboť se musí používat speciální zařízení a reaktory, v nichž je nutno provádět řadu operací, výhodou je automatizace procesu derivatizace veškeré manuální operace jsou eliminovány HPLC derivatizace
5
Pokolonová derivatizace Výhody o Reakce nemusí probíhat kvantitativně o Další detektor může být vložen před derivatizací (např. kolona – UV detektor – reakce s fluorescenčním činidlem – fluorescenční detektor) o Vysoce specifický detekční systém (např. immunoassay) může být instalován o Vzhledem k separaci před detekcí je možné stanovovat látky, které tvoří identické reakční produkty (např. formaldehyd) Nevýhody o Reakce musí probíhat v prostředí mobilní fáze – omezení možností o Samotné derivatizační činidlo by nemělo vyvolávat odezvu detektoru. Pokolonová derivatizace s cílem zlepšit UV absorpci velmi relativní – všechna dostupná reakční činidla silně absorbují v UV oblasti
HPLC derivatizace
6
Reaktory používané za chromatografickou kolonou Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. V průběhu reakce dochází k rozmývání zóny v celém systému, které je nutno potlačit na minimum.
HPLC derivatizace
7
Teorie toku mobilní fáze pokolonovým reaktorem o
o
o
Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. V průběhu reakce dochází k rozmývání zóny v celém systému, které je nutno potlačit na minimum, čehož se dosáhne vhodnou konstrukcí reaktoru, směšovačů a spojovacího potrubí. Tok kapaliny reaktorem by se měl svými vlastnostmi blížit pístovému toku bez axiálního promíchávání mobilní fáze. Podle účelu lze pak používat různé typy reaktorů a to buď prázdné, které jsou vhodné pro rychlé reakce, kdy doba zdržení tr v reaktoru je menší než 30 sekund, nebo náplňové, které jsou vhodné pro chemické reakce pomalé. Rozšiřování elučních pásů, které přicházejí do reaktoru z kolony a procházejí jím za současné tvorby derivátu, je uvnitř reaktoru způsobováno axiální disperzí, která se vyjadřuje rozptylem, resp. standardní odchylkou HPLC derivatizace
8
Průtokový kapilární reaktor Pro standardní odchylku průtokového kapilárního reaktoru platí: Rozmývání zón (rozšiřování píků) je závislé zejména na průměru reakční kapiláry dt a objemovém průtoku F. Při konstantní hodnotě reakčního času se zmenšujícím se průtokem se rozmývání zón v kapilárním reaktoru zvyšuje. Axiální disperzi je možné snížit geometrickým uspořádáním trubkového reaktoru např. jeho spletením, čímž dojde k rozrušení parabolického profilu toku (vlivem geometrické deformace proudnice). Změna geometrického uspořádání se realizuje u kapilárních reaktorů zhotovených z PTFE HPLC derivatizace
9
Trubkový náplňový reaktor Trubkový náplňový reaktor je trubice, stočená do spirály a naplněná neporézním materiálem. Je-li náplň trubkového reaktoru tvořena skleněnými kuličkami o velmi malém průměru (dp ≈10 μm), pak axiální disperze je srovnatelná s disperzí v kapilárním reaktoru.
HPLC derivatizace
10
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (1) 1. Derivatizační techniky využívající tvorby derivátů reakcí s činidly v kapalné fázi Tato technika je nejrozšířenější a je realizována v derivatizačním reaktoru, kdy do proudu mobilní fáze vycházející z kolony je aplikováno ve směšovací komůrce reakční médium, které vyvolá požadovanou reakci v samotném reaktoru, který může být termostatován Na o o o
tento typ derivatizace jsou kladeny určité požadavky: kapalný reagent musí být mísitelný s mobilní fází nesmí docházet k reakci činidla a mobilní fáze musí vznikat struktury poskytující charakteristické absorpce v UV-VIS oblasti nebo vykazují fluorescenci o využívají se i reakce redoxní nebo hydrolytické HPLC derivatizace
11
Optimalizace parametrů: a) průtok derivatizačního činidla a průtok mobilní fáze b) teplota derivatizační reakce c) vliv pH na derivatizační reakci
HPLC derivatizace
12
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (2) 2. Reakce vyvolaná změnou pH před vstupem do detektoru Do této skupiny derivatizačních technik jsou zařazeny reakce, kdy nevznikají nové deriváty, avšak změnou pH dojde k výrazné změně absorpce v oblasti UV.
HPLC derivatizace
13
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (3) 3. Derivatizační reakce v systému tuhá látka kapalina Vlastní reakce probíhá na povrchu tuhé fáze, která může vystupovat jako vlastní reagent, katalyzátor nebo nosič vázané látky (zpravidla enzymu). Výhodou této techniky je, že nedochází ke zřeďování mobilní fáze činidlem a vliv na rozšíření chromatografické zóny je minimální. Příklad pokolonové derivatizace v systému tuhá látka-kapalina: stanovení nízkých hladin vitaminu K s fluorimetrickou detekcí. Vitamin K je redukován na hydronaphtochinon po předchozí hydrolýze. K redukci vitaminu K se používají tři způsoby redukce: opokolonová derivatizace s kovovým zinkem oredukce elektrochemická ofotochemická redukce Vitamin K1 může být redukován na příslušný hydrochinon kovovým zinkem za přítomnosti iontů zinku. Zinkový reduktor se zařazuje mezi analytickou kolonu a detektor HPLC derivatizace
14
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (4) 4. Fotochemické derivatizační reakce (působením UV záření) Tato technika má velkou výhodu ve své vysoké specifičnosti a selektivitě, kdy se využívá především tvorby fluoreskujících sloučenin Příklad fotocyklodehydrogenace stilbenu za vzniku derivátů fenanthrenu (toto vede k vyšším hodnotám fluorescence i absorpce v UV oblasti spektra) Obecnou výhodou těchto reaktorů je, že nedochází ke zřeďování mobilní fáze činidlem
HPLC derivatizace
15
Fotochemické derivatizační reakce Výhoda: nedochází ke zředění efluentu derivatizačním činidlem a k rozmývání chromatografické zóny dochází pouze k difuzi v otevřené kapiláře. Nevýhoda: zařazení příliš velkého mrtvého objemu (0,7-1,2 ml) za chromatografickou kolonu ve formě kapiláry, která propouští UV záření. Vysoká specifičnost, selektivita a citlivost fluorescenční detekce Mohou vznikat deriváty, které mají zabudované ve své molekule chromofory, fluorofory nebo elektroaktivní skupinu, které umožní detekci nebo zvýší citlivost detekce. V ideálním případě obsahuje efluent nefluoreskující nebo elektroinaktivní solut, který přechází v reaktoru ve vysoce fluoreskující resp. elektroaktivní derivát, což vede k minimálnímu šumu základní linie a nízké mezi detekce. Příklad - stanovení barbiturátů s elektrochemickou detekcí, s UV detekcí při 270 nm - stanovení beta-laktamových antibiotik s elektrochemickou detekcí
HPLC derivatizace
16
Schéma pokolonové fotochemické derivatizace
HPLC derivatizace
17
Aplikace fotochemické derivatizace Uplatnění fotochemické derivatizace při stanovení aflatoxinů, kdy dochází k fotolýze aflatoxinu G1 a B1 na jejich fluoreskující deriváty G2a a B2a.
HPLC derivatizace
18
Aplikace fotochemické derivatizace Rozdíl ve fluorescenční odezvě separace aflatoxinů před fotolýzou a po fotolýze aflatoxinů
HPLC derivatizace
19
Aplikace derivatizace Aplikované derivatizační reakce vedoucí k tvorbě detekovatelných derivátů V HPLC několik skupin: a) deriváty vhodné k detekci v oblasti UV-VIS spektra b) deriváty vhodné k detekci fluorimetrické c) deriváty vhodné k detekci radiochemické d) deriváty vhodné k detekci elektrochemické e) deriváty vhodné k detekci atomovou absorpční spektrofotometrií
HPLC derivatizace
20
Derivatizace v HPLC 1. Deriváty pro detekci v ultrafialové a viditelné oblasti spektra 1.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny 1.2 Činidla pro karboxylové kyseliny 1.3 Činidla pro hydroxyderiváty 1.4 Činidla pro karbonylskupinu 2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci 2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny 2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu 2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu
HPLC derivatizace
21
1. Deriváty pro detekci v ultrafialové a viditelné oblasti spektra
HPLC derivatizace
22
1.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny Stanovení aminosloučenin metodou HPLC, pomineme-li problematickou přípravu vzorku, separaci těchto látek na chromatografické koloně (iontová chromatografie, separace na reverzní fázi), je limitováno detekcí a to nepřítomností vhodného chromoforu v molekule. Vlastní kvantifikace aminů v HPLC není možná bez předchozího kroku jejich derivatizace. Mechanismus derivatizace: primární a sekundární aminoskupina - nukleofilní substituční reakce oNinhydrin oIsokyanáty a isothiokyanáty oAcylchloridy oArylsulfonylchloridy oNitrobenzeny
HPLC derivatizace
23
Ninhydrin
Separace aminokyselin na ionexové koloně s pokolonovou derivatizací ninhydrinem Molekula aminokyseliny reaguje s dvěma molekulami ninhydrinu za vzniku tzv. Ruhemannova purpuru jehož maximum absorbance je při 570 nm. Sekundární aminokyseliny jako prolin a hydroxyprolin poskytují poněkud odlišný komplex s maximem absorbance při 440 nm (R=H - prolin, R=OH - hydroxyprolin). HPLC derivatizace
24
Isokyanáty a isothyokyanáty Rozložení elektronové hustoty u isokyanátů a isothiokyanátů ukazuje, že atom uhlíku karbonylové skupiny bude silným nukleofilním centrem. Elektrofilní atak může nastat v obou místech - na atomu dusíku nebo kyslíku u isokyanátů a na atomu dusíku nebo síry u isothiokyanatanů. Z uvedeného je zřejmé, že u isokyanátů bude přednostním místem elektrofilního ataku atom kyslíku, u alkylisothiokyanátů pak atom dusíku.
HPLC derivatizace
25
Isokyanáty a isothyokyanáty Fenylisothiokyanát (PITC) a naftylisothiokyanát (NITC) Fenylisothiokyanát (PITC) se používá výhradně pro předkolonovou derivatizaci aminů (C3 až C10) a aminokyselin a následnou separaci derivátu aminokyselin jako fenylthiokarbamoylu (PTC) aminokyselin na reverzní fázi s gradientovou elucí s detekcí UV většinou při 254 nm, i když absorbční maxima derivátů jsou 269 nm. Nevýhodou je, že samotné činidlo reaguje s interferujícími látkami (reziduální kyseliny) ve vzorku a ty dávají interferující píky na chromatogramu (matrix effect). Stabilita derivátu je funkcí teploty a času. Za laboratorní teploty je maximální stabilita při pH 5,0-7,5. Fenylisokyanát a naftylisokyanát Fenylisokyanát reaguje s alifatickými a aromatickými primárními a sekundárními aminy na N,N´-disubstituovanou močovinu. Reakce je kvantitativní a probíhá v několika minutách. Primární aminy poskytují vždy velmi stabilní deriváty, voda a alkoholy také reagují s činidlem, ale aminoskupina je reaktivnější. Reakce probíhá v N,N´-dimethylformamidu (DMF), nadbytek činidla se odstraňuje přídavkem alifatického alkoholu. Separace probíhá na reverzní fázi, detekce při vlnové délce 240 až 260 nm a detekční limit je 1 - 10 ng HPLC derivatizace
26
Acylchloridy Acylchloridy reagují obecně s aminoskupinou za vzniku amidů, přičemž reakce probíhá vždy v alkalickém prostředí, protože se v reakčním prostředí uvolňuje kyselina chlorovodíková a ta by se vázala na původní amin. Jako bazická činidla se používají pyridin, hydroxid sodný, triethylamin. p-Methoxybenzoylchlorid Absorbční maximum derivátů se pohybuje kolem 252 nm.
m-Toluoylchlorid Z mnoha acylchloridů poskytuje pouze m-toluoylchlorid deriváty, které jsou rozpustné v nepolárních rozpouštědlech a jsou tak velmi snadno extrahovatelné z reakčního prostředí. Benzoylchlorid Benzoylchlorid je nejpreferovanější derivatizační činidlo pro diaminy a polyaminy. Detekční limit derivátů polyaminů při vlnové délce 254 nm je asi 100 pmol.
HPLC derivatizace
27
Arylsulfonylchloridy - reagují s primárními i sekundárními aminy za vzniku sulfonamidů Toluensulfonylchlorid (TSCl) Toluensulfonamidy mají vyšší absorbční koeficienty ale také zlepšují separaci na chromatografické koloně (reverzní fáze při vlnové délce 254 nm). N,N´-Dimethylaminoazobenzensulfonylchlorid (DABSCl) - jedno z derivatizačních činidel používaných ke stanovení aminokyselin. Deriváty sulfonamidů mají absorbční maximum při 420 až 450 nm a dovolují tak detekci při vyšších vlnových délkách a nedochází tak k interferencím na chromatografické koloně. Separace aminokyselin probíhá na reverzní fázi při isokratické eluci s UV detekcí při 464 nm, ale nedochází k separaci histidinu a argininu
HPLC derivatizace
28
Nitrobenzeny 2,4-dinitro-1-fluorbenzen (DNFB) (též Sangerovo činidlo) derivatizace aminů a aminokyselin. Reakce 2,4dinitro-1-fluorbenzen s primárními i sekundárními aminy je velmi rychlá. 4 -nitrobenzoyl skupina propůjčuje derivatizovaným aminům vysoce absorptivní chromofor. Separace probíhá na reverzní fázi, detekce při vlnové délce 254 nm. Trinitrobenzensulfonová kyselina (TNBSA) stanovení aminoglykosidů v biologických materiálech - amikacinu a tobramycinu v krevním séru. Deriváty se přečišťují na pevné fázi C18, separace na reverzní fázi při teplotě 50°C a při vlnové délce 254 nm, detekční limit je 25 pmol. Výhodou je selektivita, na rozdíl od 2,4dinitro-1-fluorbenzenu reaguje i s fenoly
HPLC derivatizace
29
1.2 Činidla pro karboxylové kyseliny Alifatické karboxylové kyseliny neobsahují žádný chromofor a vykazují v ultrafialové oblasti spektra velmi nízké hodnoty absorbance Je nutné do molekuly zavést některý z chromoforů. Jedná se o esterifikační reakce Požadavek splňují deriváty, jejichž molekula obsahuje aromatické jádro
HPLC derivatizace
30
Fenacylbromid, naftacylbromid a jejich deriváty Zlepšit citlivost a selektivitu esterifikačních reakcí lze použitím katalyzátorů jako „crown ethery“ (makrocyklický polyether na bázi ethylenoxidu) a terciárních aminů. Crown-ethery (většinou 18-crown-6-ethery, kde 18 značí počet článků makroheterocyklu a číslo 6 počet atomů kyslíku v kruhu heterocyklu) mohou ve vnitřku svého kruhu solvatovat komplexotvorné kovové kationty a tvoři tzv. kryptáty. Dochází tak ke vzniku kryptátu kationu neutralizované karboxylové kyseliny a ten zvyšuje rozpustnost kationu. Aktivovaný anion vytěsní bromid fenacylbromidu (nukleofilní substituční reakce). HPLC analýza probíhá jak na normální tak na reverzní fázi s UV detekcí při 243 nm až 266 nm.
HPLC derivatizace
p-bromfenacylbromid
31
Spektrální vlastnosti reakčních činidel Spektrální vlastnosti některých fenacyl a naftacylbromidů Činidlo
Molární absorpční koeficient
Vlnová délka detekce (nm)
a-bromo-2-acetonafton
37 000
254
a-p-dibromoacetofenon
28 000
260
a-bromoacetofenon
35 000
243
a-bromo-p-nitroacetofenon
14 590 20 000
263 266
HPLC derivatizace
32
N-chlormethyftalimidy N-chloromethylftalimid (ClMPI) a N-chlormethyl-4-nitroftalimid (ClMNPI) reagují kvantitativně s mastnými kyselinami, dikarboxylovými kyselinami a barbituráty. Pro kvantitativní průběh reakce je nutná konverze volného karboxylu na sůl alkalickou nebo amonnou, jako katalyzátor se používá triethylamin a crown ether. Nevýhodou těchto činidel je jejich reakce s alkoholy, s primárními i sekundárními aminy a látkami s kyselým protonem (CH, NH).
HPLC derivatizace
33
1.3 Činidla pro hydroxyderiváty Mezi hydroxyderiváty patří alkoholy, fenoly cukry a steroidy a mnohé z nich jsou důležité biologické sloučeniny. Hydroxylová skupina ochotně přechází na estery reakcí s acylchloridy nebo mohou být derivatizovány substituovanými isokyanáty na N,N´- alkyl disubstituovanou močovinu.
HPLC derivatizace
34
Acylchloridy
o o o
o o
Patří mezi nejznámější a nejrozšířenější derivatizační činidla hydroxylové skupiny; esterifikační reakce s benzoylchloridem a jeho analogy zavádí do molekuly vysoce absorptivní chromofor. Mezi tyto činidla patří: Benzoylchlorid - derivatizace cukrů, alkoholů a glykolů. UV detekce je při 230 nm p-Methoxybenzoylchlorid p-Nitrobenzoylchlorid - derivatizace mono-, di- a trisacharidů, deriváty vykazují maximum absorbance při 260 nm. Relativně nepolární deriváty dovolují rychlou separaci na polární fázi (silikagel nebo oxid hlinitý). 3,5-Dinitrobenzoylchlorid - derivatizace glykosidů (digitoxin, digoxin aj.) Deriváty vykazují absorbční maximum při 230 nm Anthracen-9-karbonylchlorid - deriváty vykazují absorbční maximum při 250 nm
HPLC derivatizace
35
Fenylisokyanáty (PIC) Fenylisokyanáty reagují s hydroxyskupinou podobně jako aminy. Adicí alkoholů na isokyanáty vznikají estery N-substituovaných karbamových kyselin. Deriváty jsou separovány na reverzní fázi při teplotě 50 °C s UV detekcí při 230 nm. Byla vyvinuta metoda pro stanovení sorbitolu a galactitolu derivatizací fenylisokyanatanem. Separace probíhá na reverzní fázi při 240 nm, detekční limit je 3 ng
HPLC derivatizace
36
1.4 Činidla pro karbonylskupinu Samotná karbonylová skupina se chová jako chromofor s absorpčním maximem vyšším než 225 nm (aceton λ max = 270 nm), ale absorpční koeficient karbonylové skupiny je velmi nízký. Aldehydy a ketony reagují se substituovanými hydraziny a hydroxylaminy na příslušné deriváty absorbující v UV oblasti spektra. Jedná se o kysele katalyzovanou nukleofilní adici na karbonylovou skupinu. Při kyselé katalýze vzroste polarita vazby >C=O v protických rozpouštědlech, za přítomnosti kyseliny může dojít k úplné protonaci karbonylu: >C=O(+)-H ―› >C(+)-OH 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH) Ketony a aldehydy reagují s 2,4-dinitroafenylhydrazinem na příslušné 2,4dinitrofenylhydrazony. Tvorba hydrazonů probíhá v kyselém prostředí a separace derivátů probíhá jak na normální tak reverzní fázi. p-Nitrobenzylhydroxylamin (NBHA) Aldehydy a ketony reagují s p-nitrobenzylhydroxylaminem na příslušné oximy Použití - stanovení prostaglandinu v biologickém materiálu
HPLC derivatizace
37
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci
HPLC derivatizace
38
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci Účelem je zavést do molekuly takovou skupinu, která vykazuje fluorescenční vlastnosti, a umožní tak detekci těchto látek. Deriváty vykazují detekční limit až o tři řády nižší než deriváty detekované v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Pro praktické použití fluoroderivátů by měly platit určité předpoklady: a) rychlá a kvantitativní reakce za mírných podmínek (vodněorganická rozpouštědla, laboratorní teplota) b) tvorba nepolárních derivátů dovolující jejich extrakci do nepolárních rozpouštědel c) specifičnost pro danou funkční skupinou d) nadbytek derivatizačního činidla musí být snadno separován od jeho produktů e) deriváty by měly mít uspokojivé chromatografické vlastnosti a měly by být dostatečně stabilní
HPLC derivatizace
39
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci
2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny 2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu 2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu
HPLC derivatizace
40
2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny Sulfonylchloridy Karbonylchloridy Halogennitrobenzofurany Isokyanáty a isothiokyanáty Fluorescamine Schiffovy báze a obdobná činidla
HPLC derivatizace
41
Sulfonylchloridy 5-N,N´-dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid (Dns-Cl) Dansylchlorid (Dns-Cl) je jedno z nejstarších a nejrozšířenějších derivatizačních činidel vůbec, který poskytuje deriváty s aminy i některými fenoly. Reakce s primárními, sekundárními aminy a aminokyselinami probíhá v mírně alkalickém prostředí. Za vyššího pH reaguje i s fenoly, imidazoly a pomalu dokonce i s alkoholy. Rychlost dansylační reakce vzrůstá se vzrůstajícím pH prostředí, ale současně vzrůstá rychlost hydrolýzy derivátů. Optimální pH prostředí se pohybuje od pH 9,5 do 10. Dansylchlorid reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami za vzniku příslušných sulfonamidů s absorpčním maximem při 298 nm, dansylderiváty fluoreskují při hodnotě vlnové délky λ = 470 do 530 nm s excitačním zářením od λ = 340 do 380 nm. Derivatizace probíhá výhradně před kolonou. Největší nedostatek je velmi dlouhý reakční čas (2 až 60 minut) a vysoká reakční teplota (60 až 100 °C). Výhoda - jednoduchý derivatizační krok, velmi krátký čas, Dansylderiváty stabilní
HPLC derivatizace
42
Sulfonylchloridy 5-N,N´-dibutylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid (Bns-Cl) Bansylchlorid (Bns-Cl) je analogem dansylchloridu.Deriváty bansylchloridu jsou stabilnější, ale reakce s aminy je mírně pomalejší. Bansylderiváty jsou ve srovnání s dansylderiváty méně polární a jsou tudíž extrahovatelné lépe z reakční směsi organickými rozpouštědly o nižší polaritě (ethylacetát). 6-N-methylanilinonaftalen-2-sulfonylchlorid (Mns-Cl) Mansylchlorid (Mns-Cl) reaguje s primárními i sekundárními aminy - byl navržen jako činidlo k určení N-terminálních aminokyselin. Mansylderiváty fluoreskují při hodnotách λ = 450 nm s excitačním zářením λ = 321 až 324 nm. 2-p-chlorosulfofenyl-3-fenylidon (Dis-Cl) Disylchlorid (Dis-Cl) reaguje s aminy, imidazoly, fenoly a alkoholy na příslušné amidy resp. estery. Disylchlorid tvoří oranžové až červené deriváty. Tyto deriváty mohou být převedeny na vysoce fluoreskující deriváty - 1-fenyl-3-psulfofenylisobenzofurany - reakcí s alkoholickým KOH nebo ethoxydem sodným. Toto zvýšení detekce umožní detekovat aminokyseliny v rozmezí 0,1 až 1 pmol. 1,2-naftoylbenzimidazol-6-sulfochlorid reaguje s alifatickými i aromatickými aminy, imidazoly. Detekční limit je 0,1 pmol až 50 fmol
HPLC derivatizace
43
Karbonylchloridy 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) deriváty - chloroformáty (oxycarbonylchloridy) - reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami za vzniku fluoreskujících derivátů s excitačním maximem při 263 nm a emisním maximem 313 nm a používá se výhradně k derivatizaci před kolonou 2-Naftyloxycarbonylchlorid (NCF-Cl) reaguje s terciárními aminy za přítomnosti uhličitanu draselného v benzenu v uzavřené vialce při teplotě 100 °C po dobu 1 hodiny. Aminy podléhají za těchto podmínek dealkylaci a vznikají fluorescenční deriváty ve vysokém výtěžku.Tyto deriváty jsou vhodné pro chromatografickou separaci, excitační vlnová délka derivátů je 275 nm, emisní vlnová délka 335 nm s detekčním limitem řádově pmol.
HPLC derivatizace
44
Isokyanáty a isothiokyanáty Činidla s isokyanátovou skupinou resp. isothiokyanátovou skupinou reagují s aminy, fenoly a alkoholy za vzniku derivátů močoviny (thiomočoviny) nebo karbamátů (thiokarbamátů). 2-(4´-isokyanátofenyl)-6-methylbenzothiazol reaguje s primárními i sekundárními aminy nejlépe v chlorbenzenovém roztoku. Deriváty fluoreskují při hodnotách λ = 374 nm s excitačním zářením λ = 350 nm 9-Isothiokyanátoakridin je derivatizačním činidlem isothiokyanátového typu, který reaguje s primárními i sekundárními aminy za tvorby vysoce fluoreskujících derivátů. K maximálnímu výtěžku reakce se reakční směs nechá působit UV záření (fotochemický reaktor). Deriváty v toluenu fluoreskují při hodnotách λ = 500 nm až 525 nm s excitačním zářením λ = 295 nm až 310 nm. Fluoresceinisothiokyanát stanovení volných aminokyselin jako fluoreskujících thiohydantoinů
HPLC derivatizace
45
Fluorescamine
4-fenylspiro[furan-2-(3H),1´-naftalan]-3,3´-dion nefluoreskující derivatizační činidlo s teplotou tání 154 °C. Je velmi dobře rozpustný v acetonu, dioxanu, tetrahydrofuranu, dimethylsulfoxidu apod. Ve vodě je nepatrně rozpustný. Sloučeniny s funkčními nukleofilními skupinami (aminy, alkoholy) jsou schopné reakce s fluorescaminem, ale pouze primární aminy poskytují fluoreskující produkt. Fluorescamin je selektivní derivatizační činidlo pro primární aminy. Při reakci dochází k adici aminu na dvojnou vazbu furanu, přičemž tato reakce je reverzibilní. Poté dochází k přesmyku za vzniku fluoroforu. pH reakčního prostředí se pohybuje od pH 8 do pH 9. Deriváty jsou stabilní v neutrálním a mírně alkalickém prostředí za tmy. Absorbční maximum 390 nm a emisní vlnová délka je 475 nm. Fluorescamin stanovení aminů při pokolonové derivatizaci stanovení aminokyselin v automatických analyzátorech aminokyselin, při předkolonové derivatizaci biogenních aminů.
HPLC derivatizace
46
Schiffovy báze a obdobná činidla (1) o-Phthaldialdehyd (OPA)/alkylthiol Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti 2-merkaptoethanolu nebo jiných thiolů s primárními aminy a aminokyselinami. Reakce je poměrně rychlá a probíhá za laboratorní teploty při pH 10. o-phthaldialdehydu sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenční výtěžky; excitační maxima derivátů se pohybují okolo 340 nm, emisní maxima se pohybují okolo 450 nm. o-phthaldialdehydu reaguje pouze s primárními aminokyselinami
HPLC derivatizace
47
Příklad: Stanovení asparaginu Stanovení asparaginu metodou HPLC/FLD v reverzní fází Schéma probíhající derivatizace asparaginu SCH2CH2 OH CHO
+ CHO
o-ftaldialdehyd
CH2 CH2 OH
+
SH
2-merkaptoethanol
H2NOC
CH2 CH COOH NH2
N
CH COOH CH2CONH2
asparagin
Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5µm) analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) teplota kolony: 30 °C mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mM Na2EDTA; methanol (Merck); pH 6,4 gradientová eluce: 0 – 15 min. 28 - 50 % methanolu 15 -20 min. 50 % methanolu průtok: 0,7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu HPLC 48 FLD detektor: λex = 340 nm; λem = 455derivatizace nm
%F 30
asparagin
homoserin
25
glutamin 20
15
10
kyselina asparagová
kyselina glutamová
5
4
6
8
10
12
min
Chromatografický záznam aminokyselin ve vzorku brambor
Validace metody pro Asparagin Výtěžnost : 92% Opakovatelnost metody(RSD): 4,3% LOD : 5 mg/kg HPLC derivatizace
49
Schiffovy báze a obdobná činidla (2) Benzoin 2-hydroxy-2-fenylacetofenon kondenzuje se substituovaným guanidinem na 2-substituovaný amino-4,5difenylimidazol. Tyto imidazoly jsou vhodné k chromatografické separaci s fluorescenční detekcí s excitační vlnovou délkou 325 nm a emisní vlnovou délkou 425 nm. Přídavek 2-merkaptoethanolu stabilizuje výsledný derivát imidazolu a siřičitan sodný potlačuje pozadí fluorescence. Derivatizace byla uplatněna při stanovení guanidinových derivátů - creatinu, agmatinu apod
HPLC derivatizace
50
2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu Substituované hydraziny Činidla pro alfa-ketokyseliny Kondenzace alifatických aldehydů s 1,3diketony a amoniaku na deriváty lutidinu
HPLC derivatizace
51
Substituované hydraziny Dansylhydrazin (Dns-H) Aldehydy a ketony reagují se substituovanými hydraziny za vzniku hydrazonů a jsou analogické 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Stanovení maduramicinu v krmivech (fluoreskující derivát s excitačním maximem při 220 nm a emisním maximem 470 nm). Stanovení monosacharidů i polysacharidů. Fluoreskující deriváty mají excitační maxima závislá na složení derivátu - 240 nm a 360-370 nm a emisní maxima 525 - 540 nm.
2-Difenylacetyl-1,3-indendion-1-hydrazin reaguje rovněž s ketony a aldehydy za vzniku derivátů s excitačním maximem v rozmezí od 400 do 415 nm a emisním maximem kolem 525 nm 4-Hydrazo-7-nitrobenzofurazan (Nbd-H)
HPLC derivatizace
52
Činidla pro α-ketokyseliny o-Fenylendiamin Kondenzací o-fenylendiaminu a a-ketokyseliny vzniká vysoce fluoreskující derivát hydroxychinolinu. Reakce probíhá ve vodném prostředí kyseliny chlorovodíkové za přítomnosti merkaptoethanolu. Substituované deriváty hydroxychinolinu jsou poměrně stabilní, excitační maxima většiny a-ketokyselin se pohybují kolem 375-377 nm, emisní maxima kolem 407 nm. Detekční limit se pohybuje řádově v pmolech, separace na chromatografické koloně probíhá jak v isokratickém tak gradientovém módu
1,2-Difenylethylendiamin (DPE) je analogem o-fenyldiaminu a používá se k derivatizaci a-ketokyselin (catecholaminů, kyseliny glyoxalové, dopaminu v séru a moči). Deriváty cyklického difenylimidazolidinu mají excitační maxima 345 nm a emisní maxima kolem 485 nm. 1,2-Diamino-4,5-methylendioxybenzen (DMB) kondenzační činidlo pro stanovení a-ketokyselin v séru a moči. Hlavní výhodou DMB je velmi nízká mez detekce a pohybuje se od 6 do 30 fmol v 5 ml vzorku. HPLC derivatizace
53
Kondenzace alifatických aldehydů s 1,3diketony a amoniakem na deriváty lutidinu Aldehydy kondenzují s 1,3-diketony (1,3-cyklohexandion) za přítomnosti amoniaku na fluoreskující deriváty lutidinu Optimální pH reakce je okolo 5, excitační maximum derivátů je okolo 385 nm a emisní maximum 460 nm. Detekční limit se pohybuje řádově kolem jednotek fmol
HPLC derivatizace
54
2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu 4-Bromomethyl-7-methoxykumarin (Br-Mc) 1-Bromacetylpyren 9-anthryldiazomethan
Derivatizace karboxylu je důležitá zejména při stanovení mastných kyselin, dikarboxylových kyselin a dalších organických kyselin. Jako derivatizační činidla se nejčastěji používají deriváty 4- bromomethylkumarinu.
HPLC derivatizace
55
Činidla pro karboxylovou skupinu 4-Bromomethyl-7-methoxykumarin (Br-Mc) činidlo reaguje s karboxylovými kyselinami v acetonovém prostředí za přídavku uhličitanu draselného nebo za katalýzy crown-etherů. Deriváty v methanolu nebo směsném rozpouštědle methanol-voda (1:9) se excitují zářením o vlnové délce 323 až 325 nm a emitují záření okolo od 395 do 402 nm. 1-Bromacetylpyren poskytuje fluoreskující derivát pyrenacylesteru o emisní vlnové délce 420 nm a excitační vlnové délce 360 nm. 9-anthryldiazomethan Esterifikace - reakce karboxylu s diazomethanem. Jako činidlo se využívá 9-anthryldiazomethan za vzniku fluoreskujícího derivátu s excitačním maximem při 365 nm a emisním maximem 418 nm. Činidlo bylo použito ke stanovení řady karboxylových kyselin.
HPLC derivatizace
56
