DERIVATIZACE V HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII

Škola MS. Derivatizace

DERIVATIZACE V HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII Petr ŠIMEK Biologické centrum AV ČR, v.v.i. Laboratoř analytické biochemie Branišovská 31 CZ – 370 05 České Budějovice [email protected], www.bclab.eu 1

Škola MS. DERIVATIZACE

P. Simek as a lecturer at the Mass Spectrometric School, Seč, September 15-17

Škola MS. DERIVATIZACE 1. Definice derivatizace Cílená přeměna analytu A-X chemickou reakcí jeho reaktivní funkční skupiny s vhodným činidlem D-R

na produkt (derivát) A-R s požadovanými fyzikálně-chemickými vlastnostmi

A-X + D-R

A-R + D-X

Derivatizační technika – ucelená strategie přípravy analytu pro jeho analýzu specifickou instrumentální analytickou technikou 3


2. MS - proč DERIVATIZACE ?? MS – vysoce výkonná technika Derivatizace je v oboru MS často zvažována až jako jedno z posledních řešení

Derivatizace analytu •

změny chemických vazeb vnáší nejistoty/rizika : - jaké derivatizační činidlo použít ? - vlastnosti derivátu ? (molekulová hmostnost, hmotnostní spektrum) - výtěžek reakce ? - vedlejší produkty, nadbytek činidel atd. ? - průběh reakce v matrici, rušivé složky ? - pracnost, časová náročnost, nákladnost vývoje metody ?

Occamova břitva (Occam's Razor, William of Occam, 14.století) „Nejjednodušší varianta z mnoha nabízených řešení je obvykle ta správná“. 4


2.MS - proč DERIVATIZACE ?? Výkonná technika MS & analytický problém & derivatizace analytů

2.1. Obecné charakteristiky derivatizační metod pro MS •

Oproti jiným detekčním technikám větší výběr metod

•

Popsáno enormní množství derivatizačních metod pro MS aplikace

•

Širší uplatnění nalezl jen omezený počet metod

•

Analyt musí mít vhodnou reaktivní funkční skupinu pro transformaci

•

Výhodné jsou protické funkční skupiny s aktivním vodíkem

•

Nejčastější typ reakce – nukleofilní substituce

•

Nejvýhodnější SN2 mechanismus s minimálním výskytem vedlejších reakcí, přesmyků či racemizace analytu

•

Preference derivatizační činidla – malé reaktivní částice (silné nukleofily), snazší derivatizace stericky bráněných funkčních skupin, ale malé hmotnostní posuvy

•

Preferované reakční médium – polární aprotická rozpouštědla

•

Preference jednostupňových, jednoduchých reakcí

5


2. MS - proč DERIVATIZACE ?? Výkonná technika MS versus derivatizace

2.2. Požadavky a kritéria pro aplikaci derivatizační metody v MS •

Derivatizace podstatně mění vlastnosti, převážně snižuje polaritu analytu, mění jeho rozpustnost ve vodné nebo organické fázi, těkavost, ionizační průřez analytu atd.

•

Rychlost konverze v sekundách, max. minutách

•

Vysoké výtěžky, minimum vedlejších reakčních produktů analytu i snadno odstranitelného derivatizačního činidla

•

Jednoduchá příprava, která lze automatizovat

•

Velmi efektivní postup představuje integrace derivatizační reakce s extrakčním krokem přípravy vzorku k analýze 6

Škola MS. DERIVATIZACE 2.3. Literatura: Derivatizace v MS Komárek K., Franc J., Churáček J., Reakční chromatografie v organické analýze, SNTL, Praha 1989 Blau K., Halket J. , Handbook of Derivatives for Chromatography, Wiley, NY 1993 Kitson F.G., Larsen B.R., McEwen C.C., Gas Chromatography and Mass Spectrometry. A practival Guide. Academic Press, NY, 1996 Lunn G., Hellwig L.C., Handbook of Derivatization Reactions for HPLC, Wiley, NY 1998 Rosenfeld J.M. in Sampling and sample preparation for field and laboratory, Pawlyszin J. ed., Chapter.19, Elsevier 2002 Van Berkel G.J. a spol., Chemical derivatization for electrospray mass spectrometry, série článků v Anal. Chem. , RC MS od roku 1999

7

Škola MS. DERIVATIZACE 2.3. Literatura: Derivatizace v MS Zaikin V.G., Halket J.M., Derivatization in mass spectrometry, série přehledných článků v Eur. J. Mass Spectrom. Od 9 (2003),1. Halket J.M., Zaikin V.G., “Analyte Derivatization Strategies for GC-MS” The Encyclopedia of Mass Spectrometry, Volume 8 (Hyphenated \methods), W.M.A. Niessen ed.) Elsevier, 2006. Zaikin V.G., Halket J.M., “Derivatization in Mass Spectrometry”. The Encyclopedia of Mass Spectrometry, Volume 6 (Ionization Methods), M. Gross ed.) Elsevier, 2007. Firemní literatura: Derivatization Reagents, katalog Sigma-Aldrich 2007 aj.

Škola MS. Derivatizační techniky.

3. Rozdělení derivatizačních technik A. Podle způsobu ionizace molekul – derivatizace pro: EI/CI ionizace (hard)

GC-MS

API/MALDI ionizace (soft)

LC-MS, CE-MS, MALDI atd.

B. Podle povahy reaktivní funkční skupiny analytu, která je podrobena derivatizaci C. Podle druhu použitého derivatizačního činidla

9

Škola MS. DERIVATIZACE Program: 1. Úvod – definice předmětu 2. Derivatizační techniky v MS – kritéria, požadavky, literatura 3. Derivatizační techniky 3.1. Derivatizace alkenů, alkynů 3.2. Alkylace 3.3. Silylace 3.4. Esterifikace 3.5. Derivatizace chlorformiáty 3.6. Derivatizace karbonylové skupiny 3.7. Cyklizační derivatizace 3.8. Derivatizace thiolové skupiny 3.9. Acylace 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS 3.11. Derivatizace se značením stabilními izotopy – SIL 4. Závěr

10


3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě Alkény, alkyny – neutrální, nepolární sloučeniny

Reakce na nenasycené (dvojné) vazbě (elektrofilní adice)

Elektrofilní adice nejsou většinou stereospecifické, tvorba izomerních produktů

GC/EI,CI MS a derivatizace - hlavní technika

Strukturní analýza, určování polohy dvojných vazeb

Oldham N.J., Jones R.G., J. Chromatogr. A 1999, 843: 199-236.

API MS nefunguje (absence ionizace v roztocích), nutná derivatizace na nenasycené vazbě

Van Berkel G. a spol., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14: 849-858.

11


3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě (adice, AdE) Derivatizační techniky Dimethyldisulfid (DMDS)

deriváty poskytují interpretovatelná EI spektra

tolerance k jiným funkčním skupinám (acetáty, aldehydy,estery, alkoholy…) zvýšení mol. hmotnosti m/z + 94 / dvojná vazba

12


3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě (adice, AdE) Derivatizační techniky Epoxidace/ oxidace

Oxidace alkenu peroxykyselinou na oxiran s následnou hydrolýzou na 1,2-diol

Alkene + mCPBA oxidace

oxiran

GC/MS OsO4 , KMnO4

hydrolýza

trans-1,2-diol

LC/MS

cis-1,2-diol 13


3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě (adice, AdE) Derivatizační techniky 5-nitro-2-pyridinsulfenyl chlorid (NPSC)

alkén

NPSC

Alkenylsulfidy – 2 izomery 14

Podle Van Berkel G. a spol., RCMS 2000, 14: 849-858.


3.2. ALKYLACE (substituce, SN) A-H + DR

A-R

R ….. Alkyl

Formální náhrada reaktivního vodíku alkylem

Reagující funkční skupina

Derivát

A - OH

A-O-R

A - COOH

A-COOR

A - SH

+ DR

A-S-R

A - SO3H

A-SO3R

A - NH2

A-NH-R

A - NH-R’

A-NR’-R 15

Lze sem řadit 3.2.Silylace, 3.3.Esterifikace i 3.4 Derivatizace s chlorformiáty


3.2. ALKYLACE 3.2.A. Derivatizační techniky a činidla pro EI/CI MS Alkyl halogenidy, např. CH3I, pentafluorbenzylbromid (PFBr) Hydridy Diazoalkány, diazomethan CH3N2 Dimethylsulfát Tetramethylamonium (TMAH), trimethylsulfonium (TMSH) hydroxidy derivatizace v GC injektoru

Reakční podmínky

Často bezvodé prostředí

•

Alkylační činidla značně jedovaté/karcinogenní

•

Produkty derivatizace – deriváty ve vodných médiích stálé

•

Počet aplikací poklesl s nástupem technologií API MS 16


3.2. ALKYLACE 3.2.B. Derivatizační techniky a činidla pro API/MALDI MS Analýza alkoholů, fenolů…

3,4-dikarboxylpyridin anhydride

2-Fluoro-1-methylpyridinium p-toluenesulfonate (FMP-Ts), Quirke J.M.E., Van Berkel G.J., J. Mass Spectrom. 2001, 36: 1294–1300.

Dimethylglycin (DMG) Johnson D.W., J. Mass Spectrom. 2001,36: 277–283.

Benzoylchlorid, ESI MS glykolů po derivatizaci ve vodném médiu Holčapek M. a spol., Anal. Chem. 1999, 71: 2288-2293.

17


3.3. Silylace R3-Si-X + A-H

R3-Si-A + HX

TMS - trimethylsilyl

+ 72

TBDMS - terc.butyldimethylsilyl

+ 114

18


3.3. Silylace R3-Si-X + A-H

R3-Si-A + HX

Reagující funkční skupina

TMS derivát

OH

O-TMS

SH

S-TMS

COOH

COO-TMS

POH

konverze

PO-TMS

SOH

SO-TMS

NOH

NO-TMS

BOH

BO-TMS

NH2

NH-TMS

=NH

=NH-TMS 19


3.3. Silylace Reaktivita funkčních skupin (od nejvyšší k nejnizší) • ROH > fenoly > RCOOH > aminy > amidy •

velký vliv sterické faktory

reaguje také polární a iontové funkční skupiny – fosfát, sulfát, guanidinová skupina

Reakční podmínky • bezvodé prostředí – polární organická rozpouštědla MeCN, DMF, izooktan, toluen • vialky těsněné PTFE-silikonová/neoprenová septa • zahřívání, derivatizace řádově desítky minut • katalýza reakcí přídavkem TMCS, TFA, pyridin, MeCOOK, TMBS, TMIS • deriváty nestálé ve vodných médiích • výhodné pro EI/CI GC-MS aplikace 20


3.3. Silylace - aplikace Aplikace: GC-EI/CI/MS polárních organických látek TMS deriváty BSTFA, BSTFA/TMCS

univerzální, organické kyseliny, báze

MSTFA, MSTFA/TMIS

polární sloučeniny, ketosteroidy

TMSI

reaguje obtížně s primární aminoskupinou pro cukry, alkoholy

TBDMS deriváty MTBSTFA, MTBSTFA/TBDMCS

univerzální, objemná terc.-butylová skupina stabilnější deriváty s NH2 skupinami obtížnější silylace stericky nepřístupných protických míst 21


3.3. Silylace – aplikace Cukry, polyhydroxylované alkoholy Oximace-TMS, GC/MS Śimek P., et al., BC AV ČR, J. Insect Physiology 2007, 53: 580-586.

Mastné/organické kyseliny TMS, GC/MS Chrastina P. a spol., VFN Praha, organické kyseliny v moči

Steroidy Oximace-TMS, GC/MS Hill M. a spol., Endokrinologický ústav Praha, Steroids 2007, 72: 792-801.

22


3.3. Silylace – aplikace Aminokyseliny/hydroxykyseliny/aminoalkoholy TBDMS deriváty, GC/MS Šimek P. et al., HRC-J. High Resol. Chromatogr. 1993, 17: 145-152.

Složky nukleových kyselin, pyridimidinové/purinové báze, nukleosidy TMS deriváty, GC/MS Šimek P. et al., J. Chromatogr. A 1993, 679: 195-200.

23


3.3. Silylace – přednosti a omezení Přednosti •

univerzální , důkladně prozkoumané

•

separace na nepolárních kapilárních GC kolonách

•

EI spectra obsahují charakteristické m/z, 73, 147, M-15 (TMS), M-57 (TBDMS)

•

lze kombinovat s předchozí oximací, acylací, alkylací

•

dlouholetá osvědčená technika v GC/MS, rozsáhlé knihovny spekter derivátů

Omezení •

příprava v bezvodém prostředí

•

deriváty se ve vodném prostředí snadno rozkládají, dobré uzávěry pro uchovávání 24


3.4. ESTERIFIKACE A-COOH + R-OH

A-COO-R + H2O

Esterifikace

A-COOR1 + R-OH

A-COO-R + R1-OH

Transesterifikace

Stránský K., Jursík T., Fett-Lipid 1996, 98:65-77.

A. Esterifikační činidla/techniky pro EI/CI MS 3M HCl < ROH Diazomethan BF3 < ROH Methanolát sodný Dimethylformamid dimethylacetal (esterifikace v GC injektoru) Trimethylanilinium hydroxid (pyrolytická esterifikace) Pentafluorobenzyl chlorid/bromid (elektronegativní funkční skupina pro NICI MS) 25


3.4. ESTERIFIKACE A-COOH + R-OH

A-COO-R + H2O

Esterifikace

B. Esterifikační činidla/techniky pro API/MALDI MS Nejběžnější příprava různě strukturovaných amidů Pentafluorobenzyl chlorid/bromid Fenacyl bromid Deriváty s kvarterní amoniovou nebo fosfoniovou skupinou

Trimethylaminoethyl estery (TMAE). Blair I.A., J. Chromatogr. B 2007,850, 168-176. 26


3.4. ESTERIFIKACE B. Esterifikační činidla/techniky pro API/MALDI MS

TMPPA

Tris(trimethoxyfosfonium)propylamin bromid (TMPPA) RCOOH +

+

CMPI

Aktivovaný karboxyl Leavens W.J. a spol.,

R = H

RCMS 2002, 16:433-441

+

27


3.4. ESTERIFIKACE Reakční podmínky •

bezvodé prostředí – polární organická rozpouštědla nejlépe příslušný ROH

•

výhodná je eliminace vznikající vody, např. dimethoxypropanem

Aplikace •

analytická chemie lipidů – transesterifikace – stanovení methylesterů mastných kyselin, identifikace a určování dvojných vazeb pomocí 3-methylpikolinyl, dimethyoxazolidinonyl (DMOX) esterů

•

klinická chemie – butylace karnitinů pro LC/MS/MS klinická vyšetření VFN, dr. P. Chrastina

28


3.4. ESTERIFIKACE – přednosti a limity Přednosti • snižují aciditu analytů, např. lepší extrahovatelnost z biologických matric •

jednoduché reakce, snadno odstranitelné vedlejší produkty

•

stabilní deriváty, lze kombinovat s jinými derivatizačními postupy, jako acylace, silylace

•

zlepšují odezvu mnoha polárních analytů v API MS

Omezení •

většinou vyžadují pro reakci bezvodé prostředí, a proto náročnější extrakce z komplexních biologických matric

•

delší reakční doba

29


3.5. Derivatizace chlorformiáty Jednoduchá činidla schopná reagovat s protickými funkčními skupinami

O

ve vodném prostředí v sekundách

Cl Vlastnosti

O

Alkyl

•

Vysoké výtěžky ve vodných médiích v sekundách

•

Klesá výrazně polarita analytu, snadno rozpustný v organické fázi, nemisitelné s vodou

•

Derivatizační reakce a extrakce mohou probíhat současně tzv. “phase-transfer” extrakce, “extractive alkylation”

•

Efektivní eliminace anorganických solí, polárních interferujících látek

•

Reakce není ovlivněna běžnými pufry, probíhá ve fyziologickém roztoku, borátovém pufru

•

Esterifikace karboxylové skupiny vyžaduje katalýzu pyridinem 30


3.5. Derivatizace chlorformiáty - reaktivita A. AMINO skupina COOCH2CH3 ClCOOCH2CH3

NH2 R

HN R

Vodné médium , pH > 8

Amino skupina +

RCF →

Alkyl karbamát

(primární, sekundární)

31


3.5. Derivatizace chlorformiáty - reaktivita B. HYDROXY -OH NHCOOCH 2CH 3

NHCOOCH2CH3

COOH

COOH

ECF vodné, pH > 9

OH

O

COOCH2CH3

A-OH + RCF → alkyl karbonát (fenol, aktivované OH)

32


3.5. Derivatizace chlorformiáty - reaktivita C. THIOL SH-

NH 2 COOH

NHCOOCH 2CH3 COOH

ECF

S

SH vodné, pH > 8

COOCH2CH3

A-SH + RCF → Alkyl thiokarbonát (alkyl) 33


3.5. Derivatizace chlorformiáty - Reaktivita Hušek P., FEBS Letts 1991

D. Karboxyl NHCOOCH2CH3

NHCOOCH2CH3

ECF, EtOH

CO OCH2CH3

COOH vodné, pH > 8,

katalýza pyridinem alkoholýza Karboxyl +

RCF → alkyl ester

(aromatický, alifatický) 34


3.5.A. Derivatizace aminoskupiny arylchlorformiáty Schéma reakce s FMOC

Typické prostředí reakce – borátový pufr pH= 10

35


3.5.B Derivatizace alkylchlorformiáty

Methyl-, ethyl-, propyl-, butyl-, isobutyl-, pentyl-, hexyl- chlorformiáty

•Univerzální •EZ-Faast

použití jak v EI/CI MS, tak API MS

kit, Phenomenex Co., USA (propyl chlorformiát)

Hušek P. Šimek P., LC-GC North America 2001, 19: 986-999. Current Pharm. Anal. 2006, 2: 21-41.

nově popsány vlastnosti fluoralkylchlorformiátů (FCF) trifluorethyl (TFECF)

F

F

F

F

F

F

F

pentafluorpropyl (PFPCF) heptafluorbutyl (HFBCF) Hušek P., Šimek P. a spol., J. Chromatogr. 2008, 1186: 391-400.

FCF reaktivnější, esterifikace probíhá přímo s chlorformiátem analogické přednosti jako zavedené fluoracylanhydridy/fluoralkoholy

O O Cl

36

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Chlorformiáty

Využití nových FCF činidel v profilové analýze metabolitů participujících v metabolismu jednouhlíkových skupin

Použity

zkratky běžné v klinické chemii 37


Profilová analýza organických kyselin v krevním séru Šimek P., Hušek P., Zahradníčková H., Anal. Chem. 2008, 80: 5776-5782. Redukce vázaných thiolů R-SS-R R-SH 1,2- dimerkaptopropansulfonátem (DMPS)

homocystin

Homocystein DMPS

Heptafluorobutylchloroformiát 38


Profilová GC/MS analýza 32 metabolitů v séru po aplikaci nového postupu deproteinace/redukce RS-SR skupin/derivatice HFBCF

2HPA 3.76

Cys

Ala Gly 4.61

7.15

Pro

4.86

2.50E7

5.75

Ser2 6.52

5.56

Met

MMA

5.87 4.19

Gln 8.04

4.86

5.75

7.03

4.61

8.24

Hcy

6.95

8.39

7.74

4.99 3.76

Orn

7.42

6.67

5.98

8.56

Phe

6.79

3.59 3.21

DMPS

Lys

5.16

8.45

7.15

Tyr γ-GluCys + Trp 8.92 CysGly 9.02 9.57 Cth 9.26 9.70 r

8.65

9.33

2.50E7 5.59

DTT

5.16 7.42 5.56

8.31

7.72

8.24

6.52

7.74 4.20

5.98

6.63

9.62

7.82

9.67

3.08

3

4

5

6

7

8

9

10

Time (min)

39


Ukázka GC/EI-MS detekce celkového homocysteinu (tHcy) v séru Hcy

(a) Hcy

TIC NL: 1.72E6

100 7.71

7.55

7.96

7.86 7.75

100

NL: 2.08E5

Extr. m/z 282

Hcy 100

7.74

NL: 1.48E5

Extr. m/z 285

d4-Hcy

0 7.50

7.60

7.70

7.80

7.90

8.00

Time (min) 285

100 113

8595

282

183

119 146

100

271 210 227 242 200

318 346 342

314

69

EI spectrum of Hcy+d4-Hcy

300

514 482484 510

373 400

500

m/z

EI spektrum Hcy a d4-Hcy s přímo odečtené z TIC záznamu analýzy séra Koncentrace tHcy = 9 umol/L. Vysoce účinná extrakce/derivatizace analytů z biologické matrice 40


3.6. DERIVATIZACE KARBONYLOVÉ SKUPINY A-C=O + NH2-R

A-C=N-R + H2O

Kondenzační reakce karbonylové skupiny (keton, aldehyd) obecně s aminem (Schiffova báze), konkrétně s hydroxylaminy, hydraziny

Reagující činidlo

Derivát

NH2-O-R

A-C=NH-O-R

oxim

A-C=NH-N-R

hydrazon

NH2-NH-R

+ A-C=O

41


3.6. DERIVATIZACE KARBONYLOVÉ SKUPINY Aplikace • oximace ketokyselin (pro GC aplikace) • oximace redukujících cukrů • záchyt a analýza těkavých karbonylových sloučenin ze vzduchu • oximace redukujících cukrů

Derivatizační činidla O-methylhydroxylamin O-pentafluorobenzylhydroxylamin Dinitrofenylhydrazin Girardova činidla (kvarterní amonium) Dansyl hydrazin 42


3.6. DERIVATIZACE KARBONYLOVÉ SKUPINY

Přednosti • eliminace labilních keto-enol forem, tvorba definovaného derivátu analytu • lepší separační a detekční vlastnosti

Omezení •

zdlouhavější reakce, většinou v bezvodém prostředí, otázka výtěžků

•

oximy tvoří syn-, anti- izomery, které se dělí na GC kapilárních kolonách

43


3.7. CYKLIZAČNÍ DERIVATIZACE RCHO (aldehyd)

acetal

+ RR’CO (keton) ketal

RB(OH)2

cyklický boronát

Analyt se dvěma funkčními skupinami v 1,2-, 1,3- nebo 1,4 polohách alkylové řetězce kondenzuje s vhodným činidlem za vzniku cyklického derivátu s 6>5>7 členným kruhem 44


3.7. CYKLIZAČNÍ DERIVATIZACE Reakční podmínky •

2 funkční skupiny ve stericky vhodné poloze

•

Stabilní konfigurace vznikajícího kruhu, důležité stereochemie analytu

•

Kyselá nebo alkalická katalýza

Reagující analyt

Reagující činidlo

Dioly, aminoalkoholy aj. 1,2- až 1,4- bifunkční analyty jako cukry s vicinálními dioly, Nebo steroidy

aldehyd, keton

brassinosteroidy, ekdysteroidy

Derivát

cyklický acetal nebo ketal aceton, DCDFA acetonid fosgen cyklický karbonát Alkyl/aryl boronát cyklický boronát dansyl-3-aminofenylboronát

45


3.7. CYKLIZAČNÍ DERIVATIZACE Aplikace Derivatizace vicinálních diolů v brassinosteroidech

Dansyl-3-aminofenylboronát Svatoš A. a spol., RCMS 2004, 18: 816–821.

Guanidinová skupina

malondialdehyd hexafluoroacetylaceton

12 M HCl, 1hod., laboratorní teplota

substituované pyridiny

46


3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY SH Vlastnostmi podobná ROH a zejména aciditou fenolům (PhOH)→ negativní ESI spektra Problém: oxidační-redukční děje na SH- skupin

2* R-SH ↔ R-S-S-R A. Redukce disulfidových vazeb (RS-SR) B. Derivatizace SH-skupiny

47


3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY A. Redukce disulfidových vazeb (RS-SR) uvolňování thiolů vázaných v proteinech

Borohydrid sodný Dithiothreitol (DTE), dithioerythritol (DTT), merkaptoethanol (ME) Tris(2-karboxyethyl)fosfin - stabilní, ve vodě rozpustný Krijt J. a spol., Clin. Chem. 2001, 47: 1821-1828.

1,2-Dimerkaptopropan-1-sulfonová kyselina Šimek P. a spol., Anal. Chem. 2008, 80: 1776-1782. Produkty polárního činidla zůstávají ve vodné fázi 48


3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY B. Derivatizace SH skupiny Iodacetamid Dansylaziridinin – specifické činidlo pro thioly

Ellmansovo činidlo, 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoová kyselina), DTNB

49

Škola MS. 3. DERIVATIZAČNÍ TECHNIKY

3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY N-ethylmaleinimid N-(2-ferrocenethyl)-maleinimid (elektrochemicky aktivní funkční skupina)

Karst U. a spol., Anal. Chem. 2007, 79, 7131-7138. Borohydrid sodný + 4,4’-dithiodipyridine (4-DPS). R-SH, R-SS-R v pmol koncentraci Winther J.R. a spol., Anal. Biochem. 2007, 363, 77-82. Van Berkel G a spol., Anal. Chem. 1998, 70: 1544-1554. MS elektrolyticky aktivních 50 látek.


3.9. ACYLACE O

O

A-H + R-C-X

A-C-R + HX

SN s aktivovaným zbytkem karboxylové skupiny

Reagující funkční skupina analytu A-H

Derivát A-

-NH2, -NH=

-NH-CO-R

-OH, fenol

konverze

-SH

-O-CO-R -S-CO-R

A.

Acylace pro EI/CI MS

B.

Acylace pro API/MALDI – kap. 3.10. 51


3.9. ACYLACE Acylační činidla pro EI/CI MS Anhydridy kyselin Acetanhydrid Trifluoracetyl- (TFA), pentafluoropropionyl- (PFP), heptafluorobutyryl- (HFB)

Halogenidy kyselin Např. perfluoroktanoyl, pentafluorobenzoyl- (PFBO)

Acylimidazoly TFAI, PFPI, HFBI – pro derivatizace analytů citlivých na kyseliny, např. indoly

Acylamidy N-methylbis(trifluoracetamid) (MBTFA) Lze zařadit také alkylchlorformiáty (acylace aminoskupiny)

52


3.9. ACYLACE – pro EI/CI MS Reakční podmínky a vlastnosti • bezvodé prostředí • kyselá katalýza - kys. octová, bazická katalýza - CH3COONa, pyridin • preference fluoroalkylovaných činidel, reaktivní, po reakci lze snadno odpařit • derivatizační produkty – fluoroalkylamidy – nestálé ve vodných médiích • perfluoralkylový skelet s acylem - zvyšuje výrazně těkavost derivátů - výborné chromatografické vlastnosti derivátů v GC aplikacích - deriváty výborně záchycují elektrony poskytují NICI MS spektra s detekcí derivátů mnoha látek na attomolové (fg) hladině Lze kombinovat: - s oximací – ve formě acetátů analýza cukrů - silylací, esterifikací – analýza aminokyselin, steroidů - chirální separace na Chirasil-Val GC kolonách

53


3.9. ACYLACE – aplikace GC/EI-MS Chirální GC/MS analýza optické čistoty aminokyselin Stanovení s přesností 0.1% vyžaduje aplikaci deuterovaných činidel pro derivatizaci a GC-MS analýzu, provádí CAT GmbH, Tubingen PFP acyl – isopropyl ester deriváty, kolona Chirasil Val Frank H. et al., J. Chromatogr. 1978, 167: 187

54

Škola MS. 3. DERIVATIZAČNÍ TECHNIKY

3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API/MALDI MS Aminoskupina

Dostatečně bazická, protonizuje se snadno v kyselých roztocích

Velmi reaktivní, přednostní derivatizovaná funkční skupina

Největší množství aplikací v API MS

Každé činidlo má určité přednosti a nevýhody

•

Kritické faktory : - rušivý nadbytek derivatizačního činidla - rušivý vliv matrice vzorku - nestabilita produktů, tvorba více derivátů - omezená rozpustnost činidel ve vodných pufrovaných médiích, což snižuje reaktivitu činidel a ovlivňuje celkově separační procesy a zejména kvantitativní stanovení 55

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API/MALDI MS

Derivatizace fenylisothiokyanátem (PITC) •

Reaguje s primární i sekundární aminoskupinou během 5 min

56

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS

Derivatizace fenylisothiokyanátem (PITC) Biocrates AbsoluteIDQTM, metabolomický kit

přesné stanovení 160 metabolitů v krevním séru (> 10 ul) po derivatizaci PITC a LC/MS/ MS analýze v MRM režimu

vyvinuto na ABI platformě pro API4000 a API 4000 QTrap

stanovení metabolitů ze 4 skupin látek: aminokyseliny, acylkarnitiny, glycerofosfo- a sfingolipidy, hexosy

součástí kitu je MET/Q SW pro automatické zpracování dat

57


Derivatizace 6-aminochinolinyl-N-hydroxysukcinimidyl karbamátem (AQC)

58


Derivatizace 6-aminochinolinyl-N-hydroxysukcinimidyl karbamátem (AQC) Charakteristiky derivatizační metody •

Reakce probíhá pH=8.5-10 v sekundách

•

Tyr, Orn, Lys, Cys – reagují 2 funkční skupiny

•

Jednoduchá příprava, velmi dobrá stabilita produktů.

•

Waters AccQ.TagTM Ultra kit

59


Derivatizace 6-aminochinolinyl-N-hydroxysukcinimidyl karbamátem (AQC) UPLC separace aminokyselin po derivatizaci AQC

Ukázka UPLC/MS separace 10 pmol 27 fyziologických aminokyselin pomocí UPLC na koloně Xbridge C18, 2,1x100 mm, sorbent 1,7 µm.

Waters, 55.ASMS konference, Seattle 2006.

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL (selective isotope labeling)

DERIVATIZACE IZOTOPICKY ZNAČENÝMI ČINIDLY • aktuální oblast nových aplikací derivatizačních technik • analyty s vhodnou funkční skupinou jsou selektivně derivatizovány izotopicky značeným činidlem • smíchání vzorků (kontrola + různé stavy organismu apod.) po derivatizaci činidlem o rozdílném izotopickém složení (SIL) umožnuje pomocí MS přímo sledovat rozdíly a komplexněji vyhodnocovat změny v expresi proteinů (proteomika) nebo v metabolismu (metabolomika) organismu • technika SIL v kombinaci s hmotnostní spektrometrií – nový nástroj v –omickém výzkumu • nová derivatizační činidla, nové protokoly přípravy vzorků, nové programy pro cílené zpracování zpracování dat • současná mnohonásobná analýza vzorků - multiplexing

Derivatizace (iTRAQTM) 2-(N-methylpiperazinyl)-N-hydroxysukcinimidyl acetát

+ H2N-A

A

62

Derivatizace (iTRAQTM) 2-(N-methylpiperazinyl)-N-hydroxysukcinimidyl acetát •

vyvinut Darrylem Pappinem a spol. u Applied Biosystems v r. 2004

•

iTRAQ - soubor isobarických derivatizačních činidel o stejné mol. hmotnosti, avšak jiném izotopickém složení

•

reagují s primární aminoskupinou včetně ω-NH2 lysinu

•

ESI spektrum generuje MH+ signál analytu A s identickou m/z pro každé iTRAQ derivatizační činidlo !

MS2 spektrum poskytuje diagnostické produktové ionty s izotopickým posuvem pro konkrétní derivát (tj. m/z 114, 115, 116, 117) •

MS2

A Reporter ion region

NH-A

63

Derivatizace (iTRAQTM) 2-(N-methylpiperazinyl)-N-hydroxysukcinimidyl acetát Duplexní analýza vzorku a kontroly (ABI protokol)

64

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL

DERIVATIZACE iTRAQ Selektivní izotopické značení (SIL) analytů – současná mnohonásobná (multiplexová) analýza

MS 2

65


DERIVATIZACE iTRAQ Selektivní izotopické značení (SIL) analytů – současná mnohonásobná (multiplexová) analýza 4-plex, zdokonalená verze 8-plex (současná analýza až 8 vzorků derivatizovaných činidly iTRAQ)

66

Škola MS. 3.11. Techniky SIL - iTRAQ

Přednosti techniky iTRAQ •

cílená derivatizace primárních aminoskupin analytů ve vzorku

•

derivatizací nedotčeny posttranslační modifikace proteinu

•

iTRAQ = soubor isobaricky značených činidel (stejná hmotnost, jiné izotopické složení

•

diagnostické m/z v MS2 spektrech – 113 až 121, informace o zastoupení jednotlivých analytů

•

současně zachována strukturní informace (sekvence) analytu (peptidu)

•

až 8-násobná, současná analýza vzorků – multiplexing

•

derivatizační technika nabízí nepřeberné množství aplikací v proteomice a metabolomických aplikacích při porovnávání rozdílů mezi složením vzorků, kvantitativní analýze proteinů a peptidů

67

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL (selective isotope labeling)

Derivatizace (MTEG-OPFP) Pentafluorfenyl 13C-2-methyltetraethylenglykoloxyacetátem

•

Bischoff R., Overkleeft H.V., Anal. Chem. 2008, submitted

•

reaguje s NH2- , SH- a fenolickými skupinami ve vodných médiích

•

PEG řetězec může obsahovat 13C a 18O atomy

•

Relativně málo nákladná příprava isobarických činidel

•

PEG řetězec může obsahovat 13C a 18O atomy

•

Isobarické deriváty se při aplikaci LC-MS nedělí

•

Lze připravit velký počet izobarických derivátů postupným prodlužováním PEG


Derivatizace 13C-MTEG-OPFP

+ NH2-A

PEG-oxyacetamid


Derivatizace 13C-MTEG-OPFP

NH-A Přednosti •

relativně dostupná derivatizační technika a činidla

•

velká flexibilita v inkorporaci izotopů do PEG řetězce

•

výborná citlivost detekce [M+H]+ iontů

•

výborná separace analytů

Omezení, nejasnosti •

detekce analytů probíhá v plném skenu

•

vliv matricových efektů na signál analytů

•

aplikace v metabolomice i proteomice

Škola MS. 3.12. ZÁVĚR

SOUHRN

malé reaktivní částice preferovány jako derivatizační činidla

reakce proveditelné většinou ve vodných médiích, v sekundách, s dobře definovanými deriváty, vysoké výtěžky

EI/CI tvrdé ionizace – u polárních látek derivatizace naprosto nezbytná technika

API/MALDI měkké ionizace - výhodné v mnoha aplikacích, zvláště v kombinaci s extrakčními postupy a u obtížně ionizovatelných látek

často zlepšení separace a citlivosti analytických MS metod

hlavní aplikace na reaktivní amino- a SH- skupině

SIL - izotopicky značená činidla

nové aplikace v -omických oborech – tzv. multiplexing stimulují R&D nových derivatizačních činidel

DERIVATIZACE v oboru MS zůstává významnou analytickou strategií Finanční podpora: Fond na podporu výzkumu, projekt No. A/CZ0046/1/0018

DERIVATIZACE V HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII

Recommend Documents