Nové separační techniky ve spojení s hmotnostní spektrometrii Friedecký D., Hlídková E., Bekárek V., Kapustová M., Kittlová L., Růžičková V, Ševčíková J., Mičová K., Polýnková A., Wojtowicz P., Krätschmerová H., Barešová A., Prachařová J., Adam T.
Laboratoř dědičných metabolických poruch, FN a UP Olomouc
Trojitý kvadrupól (QqQ) - citlivý, rychlý, vhodný pro stanovení - neumí přesnou hmotu, málo citlivý sken - kvantifikace pomocí interních standardů - Sledování produktu rozpadu mol. Iontu
Průletový analyzátor (TOF) - umí přesnou hmotu nebo rychlý sken
Q1 Výběr prekurzorového iontu
Q2 Fragmentace
Q3 Výběr produktového iontu
LC-QqQ UHPLC, 1,7 µm RP – tyrosinkinázové inhibitory ANP – nukleotidy
FIA-QqQ Acylované karnitiny a aminokyseliny Imatinib - tyrosinkinázový inhibitor Homocystein
GCxGC-TOF // LC-TOF Diagnostika DMP v moči
Stanovení TKI (LC-QqQ) Plasma – deproteinace (MeOH+IS), sonifikace, vortex, zamražení, centrifugace ACQUITY UPLC®BEH C18 (Waters) 1.7 µm, 2.1 x 50 mm MF: A) NH4COOH (4mM, pH 3.2), B) MeOH; 83 % A (1.0 min) => 50 % A (2.1 min) 40 °C, 0.5 ml/min, 350 => 450 bar, MS: ESI+
Imatinib
LOD: 1.2 ng/ml, celkový čas analýzy: 3,2 min
H N
N
N
N
N
C23H17N6O Mw=393.15
HN O
Analyte
IM D8IM desIM NIL LAP DAS
MRM transition (m/z)
Dwell time (ms)
DP (V)
CE (V)
494 - > 394 502 - > 394 480 - > 394 531 - > 290 582 - > 366 489 - > 402
50.00 50.00 5.00 50.00 50.00 100.00
116.00 116.00 126.00 101.00 111.00 86.00
37.00 37.00 37.00 41.00 47.00 45.00
CAD: 6.00 psi CUR: 20.00 psi GS1: 50.00 psi GS2: 50.00 psi IS: 5500.00 V TEM: 500.00 °C EP 10.00 V Type of scan: MRM Polarity: Pozitive Positive Ion source:Turbo Spray
D8-IMA, 502=>394 De-IMA, 480=>394
DAS, 489=>402 LAP, 582=>366 NIL, 531=>290
IMA, 494=>394
1.2
1.6 Time (min) 2.0
Stanovení TKI (LC-QqQ) Pacienti s chronickou myeloidní leukémii na terapii Glivecem (400mg/den) Hladiny 100 – 3000 ng/ml, diag. význam u pacientů se špatnou odpovědí
Stanovení TKI (LC-QqQ)
Pacientky s karcinomem prsu na terapii Tykerbem (Lapatinib, 1200 mg/den)
A) c = 21 500 ng/ml (jaterní toxicita); B) c = 4 200 ng/ml; C) c= 387 ng/ml (přerušení terapie progrese)
Stanovení nukleotidů (LC-QqQ) 45 nukleosid mono-, di- a trifosfátů (A, G, C T, U, HX, koenzymy) Fibroblasty – quenching, deproteinace (MeOH), sonifikace, vortex, centrifugace Luna NH2 - ANP, (Phenomenex) 3.0 µm, 2.0 x 150 mm MF: A) NH4Ac (20mM, pH 9.5), B) MeOH; 0 % A (5 min) => 95 % A (15 min) 20 °C, 0,2 ml/min, 200 bar MS: ESI-, -4500 V, 500 °C, 25 ms LOD: < 0.1 µM, celkový čas analýzy: 35 min
AMP ADP ATP CMP CDP CTP NADP+ NADPH
MRM [m/z] 345,9→96,9 425,8→158,8 505,8→158,7 321,8→96,8 401,9→158,7 481,8→158,8 742,9→620,8 743,8→407,9
DP, CE [V] -75, -28 -75, -36 -65, -36 -70, -28 -35, -36 -80, -36 -70, -26 -110, -50
Stanovení nukleotidů (LC-QqQ) UDP-glukosa CMP-N-acetylneuraminát UDP-N-acetylglukosamin dAMP FAD UMP GDP-mannosa CMP dTMP AMP GDP-fukosa + NADP UDP-glukuronát CDP dCDP dTDP ADP UDP dADP dGDP GDP IDP CTP dTTP dCTP dUTP UTP dGTP dITP GTP ITP NADPH ATP dATP
Normální fáze (ANP) Aminopropyl Luna SF
IMP GMP dGMP dCMP dUMP NAD +
UDP-galaktosa NADH
1 1
1 2
1 3
1 4
1 5
1 6
1 7
1 8
1 9 Čas
20 [min]
21
22
23
24
25
26
27
28
Stanovení nukleotidů (LC-QqQ) UDP-glukosa
Fibroblasty 100tis. buněk
UDP-N-acetylglukosamin CMP-N-acetylneuraminát UMP ATP
dGMP AMP IMP
ITP
GDP-fukosa
dGDP
GDP-mannosa
GTP
ADP UDP-glukuronát NADP UDP CDP
UDP-galaktosa
IDP GDP
NAD+
CTP
FAD
11
12
13
UTP
14
15
16
17
18
19
20
Č as [m in]
21
22
23
24
25
26
27
28
Stanovení AC&AMK (FIA-QqQ) (5AMK + 20AC) x 2 (IS) KS - terčík (3 mm) => 96 well plates , extrakce (MeOH +IS), centrifugace MF: MeOH + FA, 300/30 µl/min, 80/10 bar; celkový čas analýzy: 55 s MS: ESI+, 4500 V, 300 °C, 70 ms; LOD: AMK 0.9-2.9 µM, AC 0.02-1.07 µM 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5
In t e n s ity , c p s
2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25 Time, min
0.30
0.35
0.40
0.45
Id ALA ALA-D4 LEU LEU-D3 PHE PHE-D5 TYR TYR-D4 VAL VAL-D8 Car Car-D9 C5 C5-D9 C5DC C5DC-D6 C8 C8-D3 C10 C10-D3 C14 C14-D3 C16 C16-D3 0.50 C18 C18-D3
Q1 90,2 94,1 132,0 135,1 166,0 171,1 182,1 186,1 118,1 126,1 162,1 171,1 246,1 255,2 276,1 282,3 288,2 291,1 316,2 319,2 372,2 375,3 400,3 403,3 428,3 431,3
Q3 44,1 48,2 86,1 89,1 120,1 125,2 136 140,1 72 80,1 85 85,1 85,1 85 85,1 84,9 85 85,1 84,9 85 85 85 85 84,9 85,1 85,2
DP 46 41 51 46 51 51 56 51 46 56 61 51 46 66 46 66 56 66 71 81 81 81 76 91 111 91
CE 17 17 15 15 19 19 19 19 15 17 27 29 31 29 33 33 31 35 35 39 45 47 47 49 59 55
Laboratorní vyšetření NS DMP
Stanovení imatinibu (FIA-QqQ) Plasma - deproteinace (MeOH+IS), sonifikace, vortex, zamražení, centrifugace MF: MeOH + FA, 300/30 µl/min, 80/10 bar; celkový čas analýzy: 45 s MS: ESI+, 4500 V, 300 °C, 200 ms; LOD: 9.2 ng/ml D8-IM: 502→394
7792
700
2.3e4
IM: 494→394
B)
Intensity [cps]
A)
Intensity [cps]
Intensity [cps]
1236
4000
1.5e4
IM: 494→217
IM: 494→394
IM: 494→217
IM: 494→217
0.0
0.1
0.4 Time [min]
IM: 494→394
C)
0.0
D8-IM: 502→394
0.1
0.4 Time [min]
D8-IM: 502→394
0.0
0.1
0.4 Time [min]
Stanovení imatinibu (FIA vs. LC MS/MS) Difference (ng/ml) 80
Bland & Altman graph
60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100 0
500
1000
1500 2000 Average LC and FIA (ng/ml)
2500
3000
Stanovení homocysteinu (FIA-MS/MS) Plasma – D4HCys, TCEP (redukce), TCA (deproteinace), centrifugace MF: MeOH + FA, 100 µl/min; MS: ESI+, 4500 V, 450 °C, 100 ms
Plasma + 10 µM HCys
Intensity [cps]
4540
12400
Plasma + 50 µM HCys 136=>90
Intensity [cps]
Plasma
Intensity [cps]
2950
136=>118
140=>94 140=>122
0.0
0.1
0.6 Time [min]
0.0
0.1
0.6 Time [min]
0.0
0.1
0.6 Time [min]
GCxGC-TOF TOF-MS
Autosampler
Sekundární ohřev Modulátor -80°C Primární ohřev
1-5s
1. kolona dlouhá, nepolární, teplotní gradient dimethyl-polysiloxan + 5% diphenylPSO (DB5)
2. kolona krátká, polární, isotermický ohřev 50 / 50 % (DB17)
Coupling of GC × GC and TOF-MS Acquisition rate needed (10 spec/peak)
Peak width
1D 1.3 spectra/second 7.5 s GC × GC 0.1 s 100 spectra/second TOF is the only MS detector that can handle narrow peaks from GC × GC (up to 500 spectra/sec)
IV) Contour plot = bird-eye view
1st dimension RT
Intensity
2nd dimension RT
I) Coeluted peaks in first dimension
st
1
II) Modulation and separation in second dimension
en m i d
RT n sio
2nd dim
ensio n
RT
III) Reconstruction of two-dimensional chromatogram
Aplikace GC x GC-TOF MS pro diagnostiku DMP Zdravé kontroly / moči pacientů se specifickými DMP - vzorky z ERNDIM DPT a rutinní diagnostiky Příprava vzorků Extrakce do ethylacetátu, vysušení Derivatizace - silylace v pyridinu (60 °C, 60 min)
Experimental GC Agilent 7890A, LECO Pegasus HT GC × GC conditions: Injection: Splitless 0.2 µL; 2 min, 250 °C Columns: 1st Rxi-5; 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm 2nd BXP-50; 2.5 m × 0.1 mm × 0.1 µm (both Supelco, USA) Carrier Gas: He at 1 ml/min Temperature Program: 40 °C (2 min), 8 °C/min to 155°C (0.2 min), 10 °C/min to 255 °C (0.20 min), and 100 °C/min to 300 °C (7 min) Secondary Oven: 5 °C above main oven Modulation Offset: 50 °C above main oven Modulation Time: 3 s
TOF MS conditions: Ionization: EI, 70 eV Mass Range: 33–550 u Acquisition Rate: 125 sp./s Data processing: LECO ChromaTOF software Total run time (including data processing): cca 50 min
GC x GC-TOF MS 2D záznam zdravé moči
• automatická dekonvoluce • automatický algoritmus pro hledání píků S/N>200 → 1504 píků, 604 identifikováno (NIST)
Pacient s MCAD (záchyt NS) MEDIUM CHAIN ACYL-CoA DEHYDROGENASE DEFICIENCY RT: 5.03 - 23.07
Diagnostic metabolites Octanoic acid 5-OH-Hexanoic acid 7-OH-Octanoic acid Adipic acid Hexanoylglycine Suberylglycine Decenedioic acid Octenedioic acid +…
95 90 85 80 75 70 65
Relative Abundance
60 55 50 45
13.89
40
Hexanoylglycine TMS not found
Patient misdiagnosed
35 30
Suberylglycine not found 14.16
25 20
hexanoylglycine
12.59
15
7.14
10 5
NL: 2.20E8 TIC F: MS 0055_PIND UR
16.42
100
5.33
13.59
8.64
7.69
15.57
8.34
6.42
9.33 9.88
5.58
10.72
11.69
11.94
13.38
15.03
15.91
17.14 17.74
19.07 19.46
20.85
21.40 22.03
0 6
7
8
9
10
11
12
13
14 Time (min)
15
16
17
18
19
20
21
22
23
GC x GC-TOF MS 2D pacienta s MCAD
hexanoylglycine TMS hexanoylglycine TMS
p-hydroxyphenylacetic
p-hydroxyphenylacetic 2TMS 2TMS
hexanoylglycine hexanoylglycine2TMS 2TMS
Koncentrace metabolitů [mmol/mol kreatinin] Mevalonic Metabolity
kontrola MNGIE
aciduria
Propionic Hawkinsinuria acidemia MCAD
3-Hydroxypropionic acid
1.3–6.2
18.6
7.5
5.1
54.9
7
3-Hydroxyvaleric acid
<1.8
n.d.
n.d.
n.d.
16.6
n.d.
Uracil
1.7–9.5
30.7
3.9
5.1
1.9
2.8
Mevaloniclactone
<1.1
2.1
51.8
0.4
0.4
0.4
Thymine
<0.9
27.3
0.7
0.4
0.1
0.3
Propionylglycine
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
11.2
n.d.
Adipic acid
1.7–11.9
8.6
4.4
3.9
12
6
Mevalonic acid
n.d.
n.d.
1.8
0.2
n.d.
n.d.
4-Hydroxycyclohexylacetate
<2.2
0.2
2.2
58.8
2.1
n.d.
Hexanoylglycine
<0.1
n.d.
0.3
0.1
1.6
4.6
Suberic acid
<4.7
1.9
5
n.d.
9.3
14.8
Sebacic acid
<0.5
0.6
0.3
n.d.
0.6
0.6
Methylcitric acids
<4.3
11.4
8.3
2.9
97.1
3.8
4-Hydroxyphenyllactic acid
<6
11.6
2.4
5.6
5.7
2.7
LC-TOF Sken QqQ vs. TOF Rozlišení ~ 20.000 Přesnost ~ 5 ppm
LC-TOF sken
Analýza močí (LC-TOF) Moč
- diluce MF na c = 0.5 mmol kreatininu, vortex, centrifugace - kontroly / vz. s metabolickou poruchou
Kolona - Luna NH2 - ANP, (Phenomenex) 3.0 µm, 2.0 x 150 mm MF: A) NH4Ac (20mM, pH 9.5), B) MeOH; 0 % A (5 min) => 95 % A (15 min) 20 °C, 0,2 ml/min, 200 bar MS: ESI+ / ESI-, +/-4000 V, 400 °C, sken 60 – 900 m/z, 1 s celkový čas analýzy: 35 min
Analýza močí (LC-TOF) – 2D záznam
LC-TOF – analýza moči x10 6
Cpd 1253: 21.892: +ESI ECC Scan Frag=100.0V Urine_Healthy_pos_A.dx10
5
Cpd 1253: 21.892: +ESI ECC Scan Frag=100.0V Urine_Healthy_pos_A.d
5.2 5.1
7
5 4.9
6.8
4.8 4.7
6.6
4.6 4.5
6.4
4.4
6.2
4.3
6
4.1
5.8
3.9
5.6
3.7
5.4
3.5
5.2
3.3
5
3.1
4.8
2.9
4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3 2.8 2.7
4.6
2.6
4.4
2.5 2.4
4.2
2.3 2.2
4
2.1
3.8
1.9
2 1.8
3.6
1.7 1.6
3.4
1.5 1.4
3.2
1.3 1.2
3
1.1
2.8
0.9
1 0.8
2.6
0.7 0.6
2.4
0.5 0.4
2.2
0.3 0.2
2
0.1 0
1.8
2
2.2 2.4 2.6 2.8
3
3.2 3.4 3.6 3.8
4
4.2
4.4 4.6 4.8
5
5.2 5.4 5.6 5.8
6
6.2 6.4 6.6
6.8
7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8 Counts vs. Acquisition Time (min)
9
9.2 9.4 9.6 9.8
10 10.2 10.4 10.6 10.8 11 11.2 11.4 11.6 11.8 12 12.2 12.4 12.6 12.8 13 13.2
1.6 1.4
1526 komponent, ESI+
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
21.892 Cpd 1253: 21.892
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14 15 16 Counts vs. Acquisition Time (min)
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
LC-TOF – Cystinurie x10 5 Cpd 2: C6H12N2O4S2: +ESI EIC(121.0192, 138.0457, 241.0311, 258.0577) Scan Frag=100.0V Urine_CYS_pos_B.d 1.2 1 15.430
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 x10 5 Cpd 2: C6H12N2O4S2: +ESI EIC(121.0192, 138.0457, 241.0311, 258.0577) Scan Frag=100.0V Urine_Healthy_pos_A.d 1.2
1
1 0.8 0.6 0.4 15.979
0.2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14 15 16 Counts vs. Acquisition Time (min)
17
18
19
20
LC-TOF – Glutarová acidurie x10 4
Cpd 1: <not found>: +ESI EIC(67.0284, 84.0550, 133.0495, 150.0761) Scan Frag=100.0V Urine_Healthy_pos_A.d Smooth 1
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 x10 4
Cpd 1: C5H8O4: +ESI EIC(67.0284, 84.0550, 133.0495, 150.0761) Scan Frag=100.0V Urine_GLUT1_pos_B.d Smooth 1
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5 9 9.5 10 Counts vs. Acquisition Time (min)
10
LC-TOF – Leucinosa x10 4
Cpd 1: C6H13NO2: +ESI EIC(66.5546, 83.5811, 132.1019, 149.1285) Scan Frag=100.0V Urine_MSUD_pos_G.d Smooth 1
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 x10 4
Cpd 1: C6H13NO2: +ESI EIC(66.5546, 83.5811, 132.1019, 149.1285) Scan Frag=100.0V Urine_Healthy_pos_D.d Smooth 1
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5 9 9.5 10 Counts vs. Acquisition Time (min)
10.5
11
11.5
12
12.5
13
Thank you for your attention! Poděkování IGA MZCR NS9627, MSM 6198959205, A/CZ0046/2/0011
