Využití HPLC v analýze potravin
HPLC aplikace
1
HPLC aplikace
2
HPLC aplikace
3
Stanovení přirozených složek potravin
HPLC aplikace
4
Lipidy • Nasycené a nenasycené triacylglyceroly – zpracování potravin • Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné kyseliny • Reakce se světlem a kyslíkem – vznik hydroperoxidů – ovlivnění chuti a kvality tuků • Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků – stanovení obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje) Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů • UV-DAD spektra – stopy hydroperoxidů nasycené x nenasycené triacylglyceroly • Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji – charakteristické spektrum • Příprava vzorku – extrakce petroletherem, rozpuštění v THF
HPLC aplikace
5
Profil triacylglycerolů Starý slunečnicový olej Odezva při 240 nm – hyroperoxidy
HPLC aplikace
6
Analýza olivového oleje 280 nm – konjugované dvojné vazby – špatná kvalita oleje
HPLC aplikace
7
Profil triacylglycerolů v olivovém oleji
HPLC aplikace
8
Mastné kyseliny • Stanovení nenasycených mastných kyselin C4-C22 • Př. máslo a margariny se liší v zastoupení kyseliny máselné v triacylglycerolech • Stanovení jednotlivých mastných kyselin • Hydrolýza (horký metanol a KOH), online derivatizace (bromid fenacylbromidu zavedení chromoforu) - HPLC/UV
HPLC aplikace
9
Složení tuku
HPLC aplikace
10
Sacharidy • Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa • Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze UV-VID nebo FLD • RID – hladiny mg/kg • Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg • Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace, extrakce, SPE přečištění
HPLC aplikace
11
Stanovení sacharidů
HPLC aplikace
12
Vitamíny Přírodní i syntetické Zlepšení nutriční hodnoty potravin Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B6, B2, B1, B12 V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A Hladiny µg/kg Labilní (světlo, teplo) UV, DAD – kvalitativní i kvantitativní stanovení Elektrochemická detekce
HPLC aplikace
13
UV detekce
HPLC aplikace
14
Elektrochemická detekce Vitaminový přípravek
HPLC aplikace
15
V tuku rozpustné vitaminy UV detekce
HPLC aplikace
16
V tuku rozpustné vitaminy Elektrochemická detekce
HPLC aplikace
17
Tokoferoly – normální fáze
HPLC aplikace
18
Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu FLD detekce
HPLC aplikace
19
Biogenní aminy • Stanovení biogenních aminů • Volné aminy přítomny v potravinách a nápojích (ryby, sýry,víno, pivo) • Maximální přípustné hladiny MRL • derivatizace
HPLC aplikace
20
UV detekce Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid)
HPLC aplikace
21
Aminokyseliny • • • • •
Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení Stanovení původu masných výrobků – falšování potravin Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy Automatická online derivatizace - předkolonová, FLD detekce Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym)
HPLC aplikace
22
STANOVENÍ AMINOKYSELIN Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin Analytická koncovka – přesnost, správnost, rychlost
HPLC
Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin) reverzní fázi - oktadecyl (C18), gradientová eluce Detekce a kvantifikace – po předchozí deprivatizaci Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce interní standard kompenzuje: nižší výtěžky derivatizační reakce ztráty při přípravě vzorku variabilní objem při nástřiku vzorku Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, αaminomáselná kyselina, β-aminomáselná kyselina, γ-aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj. HPLC aplikace
23
Derivatizační činidla o-Phthaldialdehyd (OPA) 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Ninhydrin Dansylchlorid AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát) Phenylisothiokyanát (PITC)
HPLC aplikace
24
o-Phthaldialdehyd (OPA)
Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenci excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami HPLC aplikace
25
Separace OPA derivátů aminokyselin
Chromatografické podmínky Gradient: solvent A: 15 mM Na2HPO4 pH 7,2/tetrahydrofuran (96+4); solvent B: 15 mM Na2HPO4/CH3OH/CH3CN (40+36+24). Průtok: 3,5 ml/min; 26 HPLC aplikace program: 0-100 % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5 µm C18 cardtridge.
Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin Charakteristika
OPA
FMOC-Cl
Ninhydrin
Dns-Cl
AQC
PITC
Detekce
FLD
FLD
UV
UV (FLD)
FLD
UV
Citlivost
fmol
fmol
µmol
pmol (nmol)
fmol
pmol
Stabilita derivátu
špatná
dobrá
--
dobrá
dobrá
střední
Rychlost derivatizace
rychlá
rychlá
malá
malá
rychlá
střední
Sekundární aminokyseliny
ne
ano
ano
ano
ano
ano
Interference reagentu
ne
ano
ne
ano
ano
ano
Interference matrice
malý
střední
ne
malý
ne
vysoký
HPLC aplikace
27
Stanovení aminokyselin v pivu po derivatizaci (OPA)
HPLC aplikace
28
Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA)
%F 30
asparagin
homoserin
25
glutamin 20
15
10
kyselina asparagová
kyselina glutamová
5
4
6
8
10
12
min
Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5µm) analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) teplota kolony: 30 °C mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mM Na2EDTA; methanol (Merck); pH 6,4 gradientová eluce: 0 – 15 min. 28 - 50 % methanolu 15 -20 min. 50 % methanolu průtok: 0,7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu FLD detektor: λex = 340 nm; λem =HPLC 455 nm 29 aplikace
D,L-alanin Chirální separace optických izomerů kolona : 25 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil Chiral-1 eluent : 1 mM vodný roztok (CH3COO)2Cu (pH = 5,6) průtok eluentu : 1,2 ml/min teplota : 60 ˚C detekce : UV 240 nm 1. D-alanin 2. L-alanin
HPLC aplikace
30
Bílkoviny kolona : 25 cm x 9,4 mm stac. fáze : Zorbax GF-250 eluent : 130 mM NaCl + 20 mM KCl + 50 mM Na2HPO4 (pH = 7,0) průtok: 1 ml/min detekce : UV 210 nm 1. myší IgM, Mh = 900 000 2. hovězí thyroglobulin, Mh = 669 000 3. β-amylasa z brambor, Mh = 200 000 4. hovězí serum albumin, Mh = 66 000 5. kuřecí albumin, Mh = 45 500 6. hovězí RNAasa, Mh = 13 700 7. azid (tmax), Mh = 65
HPLC aplikace
31
Stanovení peptidů fytochromu V semenech ovsa rostoucích ve tmě HPLC/UV a MS detekce
UV mapování
HPLC aplikace
32
Stanovení peptidů fytochromu semena ovsa rostoucí ve tmě LC-MS
TIC
MS spektrum T12 a T58
HPLC aplikace
33
Deriváty purinu kolona : 30 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil 50-5 eluent : methanol-voda-dichlormethan 47:17:936 (v/v/v) průtok: 0,8 ml/min detekce: UV 280 nm 1. kofein 2. theofyllin 3. theobromin
HPLC aplikace
34
HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění) přečištění SPE A)
Daidzein
25
Genistein
mAU
20
15
10
5
5
6
7
8
9
B) mAU
B)
Daidzein
25
20
10
Genistein
4
11
min
bez přečištění
15
10
5
4
5
6
7
8
HPLC aplikace
9
10
11
min
35
Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\02280023.D) VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\02280019.D)
R40 56,8mg/kg
mAU
RT: 0,00 - 14,99 SM:15G
90
NL: 1,04E7 m/z= 1016,0-1017,0 F: + c ESI SRM ms2 1034,60@34,00 [ 1015,60-1017,60] MS R40
RT: 11,30 MA: 190273064 SN: 1333
Tomatin 77,01 mg/kg
100
80 Relative Abundance
250
200
70 60 50 40 30 20
ST 37 µg/ml
10 0
150
90 80 100
NL: 1,94E5 m/z= 1014,0-1015,0 F: + c ESI SRM ms2 1032,90@38,00 [ 1013,50-1015,50] MS R40
RT: 9,84 MA: 3442329 SN: 439
Dehydrotomatin 2,51 mg/kg
100
70 60 50 40
50
30 20 10 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Time (min)
0 1
2
3
4
5
6
7
8 min
HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R40 (zelené rajče) LC-MS/MS 20x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata) Parametry metody
HPLC-UV
Analyty
Tomatin
Opakovatelnost
4%
Výtěžnost
Dehydrotomatin
85,0% (100 mg/kg)
Nelze stanovit
LC-MS/MS Tomatin
Dehydrotomatin
2,6%
3,1%
94,4% (9 mg/kg)
82,9% (0,9mg/kg)
Detekční limit (LOD)
2 mg/kg
HPLC aplikace 0,1 mg/kg
0,05 mg/kg
Mez kvantifikace (LOQ)
6 mg/kg
0,3 mg/kg
0,15 mg/kg
36
Potravinářská aditiva
HPLC aplikace
37
Acidulanty a regulátory kyselosti Kyselina sorbová a citrónová Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná, vinná kyselina • Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí • Pufrování – kontrola pH (zpracování potravin, finální výrobky) • Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů • Prevence žluknutí a hnědnutí – antioxidační účinky • Úprava viskozity pečených výrobků • Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky • Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa Destilace s vodní parou, SPE HPLC UV/DAD
HPLC aplikace
38
Bílé víno
HPLC aplikace
39
Citrónová kyselina ve vodce
HPLC aplikace
40
Antioxidanty
HPLC aplikace
41
HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů Žvýkačka
HPLC aplikace
42
Konzervační prostředky Benzoová kyselina Sorbová kyselina Propionová kyselina Methyl-, ethyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny (PHB.methyl, PHB-ethyl, PHB-propyl Inhibice růstu mikroorganismů Prodloužení životnosti potravin
HPLC aplikace
43
HPLC/UV-VIS (DAD)
HPLC aplikace
44
Umělá sladidla Acesulfam Aspartam Sacharin Nízkokalorická sladidla: nápoje Regulace hladin – legislativa Možný toxický účinek
HPLC aplikace
45
Aspartam On-column derivatizace, PR chromatografie Srovnání spektra derivatizovaného (OPA) a nederivatizovaného aspartamu
HPLC aplikace
46
Syntetická barviva Použití: při zpracování potravin ve farmaceutickém průmyslu v chemickém průmyslu Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin, zamaskování vlivů zrání a stárnutí Zlepšení přitažlivosti potravin Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací původních látek a degradačních produktů – vývoj citlivých a selektivních analytických metod HPLC/UV-VIS - charakteristická maxima 400 nm (žlutá) – 500 nm (červená) – 600 – 700 nm (zelená, modrá, HPLC „černá“) aplikace
47
Syntetická barviva v limonádě Spektra žlutého, červeného, modrého a „černého“ barviva
HPLC aplikace
48
Ochucovadla Zlepšení chuti potravin Nejčastěji použité látky: Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky Příklady: • Lupulon a humuklon (hořké látky chmele) • Vanilin • Naringenin a hesperidin (hořké látky) Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME) HPLC – málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky
HPLC aplikace
49
Vanilin HPLC/UV, RP Kvalita extraktu vanilinu
HPLC aplikace
50
Stanovení vanilinu v koňaku Identifikace srovnáním spekter
HPLC aplikace
51
Hořké látky: hesperidin a naringenin Pomerančový džus HPLC/UV, RP
HPLC aplikace
52
Rezidua a kontaminanty
HPLC aplikace
53
Aplikace v reziduální analýze Analýza stopových množství sledovaných látek: - vysoká citlivost analytické metody - nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru, na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v analyzovaném vzorku. Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku, zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném do chromatografu, Zlepšení citlivosti - ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla výška píku maximální. Snížení mezí detekce - zvýšení odstupu signálu od šumu Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním vzorku 54 HPLC aplikace
Nejčastější aplikace Stanovení reziduí léčiv
(stanoveny MRL) (dobytek drůbež, maso, mléko, vejce …; působení rezistence) • Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika …) • Antiparazitika • hormony
Mykotoxiny Polyaromatické uhlovodíky Pesticidy
Příklady: HPLC aplikace
55
Rezidua léčiv ve vzorcích vajec HPLC/UV-VIS (DAD); RP
HPLC aplikace
56
Stanovení reziduí tetracyklinů v mase HPLC/UV-VIS (DAD); RP LOD 0,1 mg/kg
HPLC aplikace
57
Mykotoxiny: Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS MS spektra fumonisinu B1, 2, 3
HPLC aplikace
58
Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice, Následná konfirmace dle fragmentových iontů
HPLC aplikace
59
Mykotoxiny
HPLC aplikace
60
Mykotoxiny
HPLC aplikace
61
Mykotoxiny Aflatoxiny HPLC UV/FLD
HPLC aplikace
62
HPLC/FLD stanovení zearalenonu Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC F L D 1 A , E x = 2 3 5 , E m = 4 4 0 ( Z E A R A L ~ 1 \ Z E A R A L ~ 1 \M N Z 6 0 3 0 2 \ S P IK E 1 A . D ) LU
P Ř E Č IŠ T Ě N I S P E – IM U N O A F IN IT N Í S O R B E N T
A
Z E A (3 2 n g )
250
1 6 .1 8 1 200
150
100
1 .1 91
50
0
2 .5 62
2
4
6
8
10
12
14
16
18
m in
F L D 1 A , E x = 2 3 5 , E m = 4 4 0 (Z E A R A L ~ 1 \ Z R 2 0 0 2 0 2 \ S A R K A - I . D ) LU
P Ř E Č I Š T Ě N I G P C – B io B e a d s S -X 3
B 25 0
Z E A (2 5 n g )
1 6 .0 7 2
A re a : 1 8 2 1 .5 8
20 0
15 0
10 0
50
0
2
Zearalenon
4
6
8
10
manuálně
SPE - výtěžnost 109 % HPLC aplikace SPE - opakovatelnost 31 %
12
14
x
16
18
m in
ASPEC
92 % 3%
63
Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation)
Extrakt z tuňáka; 0,2 mg/kg; 1 μl nástřik
HPLC aplikace
64
Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation)
Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik
HPLC aplikace
65
Pesticidy
Rezidua pesticidů ve vzorku salátu Carbendazim – výtěžnost pouze 40%
HPLC aplikace
66
Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky
HPLC aplikace
67
Karbamáty Nesystémové insekticidy HPLC/FLD Pokolonová derivatizace (OPA/NaOH) Materiál: ovoce, zelenina
HPLC aplikace
68
Karbamáty
Analýza standardů
HPLC aplikace
69
Glyfosát
systémový herbicid HPLC/FLD Pokolonová derivatizace
Standard
HPLC aplikace
70
FUNGICIDY oExtrace z ovoce: dichlormetan Kolona: Nucleosil 7 C18 eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH o (pH 7,5) 40 % se 60 % methanolu o 1. 2. 3. 4. 5.
thiabendazol o-fenylfenol Difenylamin Ethoxychin bifenyl
HPLC aplikace
71
PAH HPLC/DAD UV spektrum
HPLC aplikace
72
Parametry DAD a FLD stanovení
HPLC aplikace
73
LOD: DAD, FLD
HPLC aplikace
74
300
200
0 5
0 10 15 20
25.606 - B[ghi]P
400
HPLC aplikace
25
26.294 - I[cd]P
λex/em 216/336 nm 20
24.274 - DB[ah]A
LU
22.933 - B[a]P
15
21.810 - B[k]F
500 10
20.972 - B[b]F
5
18.499 - Chr
0
24.182 - B[ghi]P 24.711 - I[cd]P
23.034 - DB[ah]A
21.852 - B[a]P
20.790 - B[k]F
19.858 - B[b]F
17.147 - B[a]A 17.752 - Chr
14.623 - Pyr
13.710 - Flt
olej, 10 mg matrice v nástřiku
17.604 - B[a]A
60
14.919 - Pyr
80
13.915 - Flt
100
12.625 - Ant
λex/em 216/336 nm 11.632 - Phe
140
12.754 - Ant
160
10.457 10.658- - Ace Fln
180
11.616 - Phe
120
7.947 - Naph
LU
10.281 - Ace 10.543 - Fln
7.685 - Naph
IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD (po GPC přečištění)
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\DATAHP~1\DATA98\MT98OLEJ\025-2201.D)
40
20
0
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\HPCHEM\FLD154-4\DATA\MT00X904\043-4201.D) 25 30 min
jablka, 250 mg matrice v nástřiku
100
75 min
