Využití HPLC pro různé typy analytů

MC230P14 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, 2015/2016

Využití HPLC pro různé typy analytů Josef Cvačka, 30. 11. 2015


Farmaceutické/klinické aplikace

Analýza složek životního prostředí

Průmyslové procesy, kvalita produktů

Kvalita potravinářských surovin a produktů

Výzkum


HPLC separační systémy dle WOS (2010-2015)

Web of Science


Přehled analytů •

peptidy

•

oligonukleotidy

•

sacharidy

•

lipidy

•

steroidy

•

karotenoidy

•

fenolické látky

•

léčiva a drogy

•

vitamíny

•

barviva

•

polycyklické aromáty

•

syntetické polymery


PEPTIDY Základní stavební jednotkou peptidů jsou aminokyseliny (< 50), které lze rozdělit podle polarity postranního řetězce R na polární (nenabité, kyselé, bazické) a nepolární (hydrofobní). Peptidy s basickými a kyselými skupinami jsou charakterizovány izoelektrickým bodem, jejich celkový náboj závisí na pH roztoku (mobilní fáze).

leucin

lysin

k. asparagová

Retenční chování je výrazně ovlivněno celkovou hydrofobicitou a počtem nabitých skupin. U “delších” peptidů (> cca 10 aminokyselin) hraje roli i sekundární struktura, případně tvorba disulfidových můstků. Separační systémy: reverzní chromatografie na C18 nebo C8 (separace dle hydrofobicity) a iontově-výměnná chromatografie (separace dle náboje).


Separace peptidů v RP systémech Reverzní chromatografie je nejčastěji používaná kvůli možnostem měnit složení a pH mob. fáze v širokém rozmezí. Kolony C18 nebo C8 na silikagelovém nosiči, případně polymerní nebo monolitické fáze, pórovitost 50-300 Å, gradientové separace nejčastěji v systémech zředěná kyselina (octová, mravenčí, trifluoroctová)/acetonitril.


Separace peptidů v iontově-výměnných systémech Iontově-výměnná chromatografie nejčastěji využívá silné katexy (sulfo skupina), které jsou negativně nabité v neutrálním a kyselém prostředí. Při nízkém pH je karboxyl peptidů protonován a při separaci se tak projevují bazické funkční skupiny.


Separace peptidů v 2D (RPxIEC) systémech Kombinace separačních mechanismů pro maximální dělení komplexních směsí peptidů. Hlavní využití v proteomice – MS detekce.


Detekce peptidů Spektrofotometrická detekce v nízké UV oblasti 190-215 nm (absorbance amidové peptidické vazby)

Hmotnostně-spektrometrická detekce elektrospray nebo nanoelektrospray Citlivá detekce, určení molekulové hmotnosti peptidu, případně struktury z MS/MS dat.


PROTEINY (BÍLKOVINY) Proteiny jsou vysokomolekulární biomolekuly složené z aminokyselin (>> 50), které mohou být posttranslačně modifikovány. Proteiny v nativním stavu mají charakteristickou 3D strukturu, působením kyselin, bází, solí, org. rozpouštědel apod. denaturují (srážení, ztráta rozpustnosti). Proteiny lze separovat na základě celkové hydrofobicity, velikosti molekul a počtu nabitých skupin. Nejčastěji využívanými separačními systémy jsou: reverzní chromatografie, vylučovací (size-exclusion, gelová) chromatografie a iontově výměnná chromatografie. Separace komplexních proteinových směsí: klasickou metodu (dvourozměrnou gelovou elektroforézu (2D-PAGE)) lze nahradit 2D HPLC separací – kombinace SEC-RPHPLC, IEC-RPHPLC, příp. IEF (izoelektrická fokusace)RPHPLC


Separace proteinů v RP systémech Reverzní chromatografie: Kolony C4 – C18 na silikagelovém nosiči, případně polymerní nebo monolitické fáze, široké póry 300 Å, gradientové separace nejčastěji v systémech zředěná kyselina (octová, mravenčí, trifluoroctová)/acetonitril.


Separace proteinů v SEC systémech Gelová chromatografie: gely různých pórovitostí (200-1000 Å) na silikagelovém nosiči, případně polymerní fáze, separace nejčastěji v roztocích pufrů. Adsorpce analytu na stacionární fázi a denaturace proteinů je minimalizována.


Separace proteinů v iontově-výměnných systémech


Detekce proteinů Spektrofotometrická detekce v UV oblasti 190-215 nm (absorbance amidové peptidické vazby) nebo při 280 nm (absorbance aromatiky tyrosinu a tryptofanu).

Hmotnostně-spektrometrická detekce elektrospray nebo nanoelektrospray Citlivá detekce, určení molekulové hmotnosti proteinu z vícenásobně nabitých iontů (dekonvoluce).


OLIGONUKLEOTIDY Oligonukleotidy jsou krátké oligomery nukleových kyselin. Mají charakter polyaniotů (kvůli přítomnosti fosfátových skupin). Chromatografické chování je ovlivněno celkovou velikostí molekul a sekvencí nukleových kyselin.

Možnosti separace oligonukleotidů: Reverzní chromatografie – separace díky různým nukleobázím v řetězcích. Iontově-výměnná chromatografie – separace na anexech díky záporně nabitým fosfátům. Gelová chromatografie - separace na základě různých velikostí molekul.


RP-HPLC (iontově-párová) oligonukleotidů Pufr slouží jako iont-párové činidlo. TEAA = triethylammonium acetate


SACHARIDY Sacharidy jsou aldehydy nebo ketony (příp. hemiacetaly nebo hemiketaly) s množstvím hydroxyskupin. Existují jako nízkomolekulární látky (mono-, disacharidy) až polymery (polysacharidy)

Možnosti separace mono, di- a oligosacharidů: Normální chromatografie na amino fázích (HILIC) - separace dle polarity sacharidu Chromatografie na iontově vylučovacích kolonách – kombinace separačních mechanismů Gelová chromatografie - separace na základě různých velikostí molekul.


Separace mono, disacharidů na amino fázi Kolony s chemicky vázanými aminoskupinami, mobilní fáze acetonitril/voda.


Separace sacharidů na iontově vylučovacích kolonách Iontoměniče s navázanými ionty kovů: Ca, Ag, Pb apod. Mobilní fáze - voda


LIPIDY Lipidy – strukturně odlišné skupiny sloučenin odvozené od mastných kyselin. Jednoduché lipidy – mastné kyseliny, estery, acylglyceroly; složené lipidy – glykolipidy, fosfolipidy.

Možnosti separace lipidů: Normální a HILIC chromatografie – separace jednotlivých skupin (tříd) lipidů podle polarity funkčních skupin Reverzní chromatografie – separace lipidů v rámci jedné třídy dle hydrofobicity (délky acylových zbytků) Argentační chromatografie - separace podle počtu dvojných vazeb v molekule


HILIC celkového lipidového extraktu modelová směs standardů TG: triacylglycerol, Chol: cholesterol, CE: cholesteryl ester, FA: fatty acid, PG: phosphatidylglycerol, 2-LPG: 2-lysophosphatidylglycerol, 1-LPG: 1-lysophosphatidylglycerol, PI: phosphatidylinositol, CA: cardiolipin, LPI: lysophosphatidylinositol, pPE: phosphatidylethanolamine plasmalogen, PE: phosphatidylethanolamine, 2-LPE: 2-lysophosphatidylethanolamine, 1-LPE: 1-lysophosphatidylethanolamine, pPC: phosphatidylcholine plasmalogen, PC: phosphatidylcholine, SM: sphingomyeline, 2-LPC: 2-lysophosphatidylcholine, 1-LPC: 1-lysophosphatidylcholine.

HPLC podmínky: kolona Spherisorb Si (250×4.6 mm, 5 m), průtok 1 mL/min, teplota 40 °C, gradient: 0 min – 94% A + 6% B, 60 min – 77% A + 23% B Rozpouštědlo A: acetonitril, rozpouštědlo B: 5 mM octan amonný. Detekce ESI-MS Lisa et al., Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 5146– 5156


Separace triacylglycerolů v RP-HPLC

HPLC podmínky: kolony Nova-Pak C18 (300 x 3,9 a 150 x 3,9 mm, 4 µm, Waters) zapojené do série. Mobilní fáze: acetonitril (A) a 2-propanol (B). Lineární gradient- 0 min – 100 % ACN, průtok 1 ml/min, 108 min – 70% IPA, průtok 1 ml/min, 122 min – 80 % IPA, průtok 0,7 ml/min, 128 min – 100 % ACN, průtok 0,7 ml/min, 130min – 100% ACN, průtok 1 ml/min. Pokolonový přídavek 100 mM octanu amonného v 2-propanol-vodě (1:1, v/v). APCI MS detekce full scan m/z 150-1200, 400°C.


Argentační chromatografie triacylglycerolů

HPLC podmínky: kolona Valco ChromSpher 5 Lipids (250x4.6 mm, 5 mm) fáze: hexan (A), hexan/2-propanol/acetonitril 30:9:1, v/v/v (B) . Gradientový program: 100 % A 10 min, lineárně do 18 % B ve 32 min, do 35 % ve 37 min a do 100 % of B ve 40 min. Isokraticky 100 % of B do 41 min. Průtok 1ml/min. Pokolonový přídavek 100 mM octanu amonného v 2-propanol-vodě (9:1, v/v). APCI MS detekce full scan m/z 150-1200, 400°C.


STEROIDNÍ SLOUČENINY Steroidy – terpenoidní lipidy, derivátyderiváty cyklopentanperhydrofenanthrenu. Vznikají oxidací terpenů. Z hlediska chemie jde o alkoholy, alkaloidy, hormony, vitaminy, kyseliny. Separace steroidů: Reverzní chromatografie – na C8-C18, ACN/voda, MeOH/voda


KAROTENOIDY Karotenoidy – přírodní organické pigmenty (tetraterpenoidy), které se vyskytují v rostlinách jako fotosyntetická barviva. Mají výrazné antioxidační účinky.

Separace karotenoidů: Reverzní chromatografie – separace dle hydrofobicity kolony C8-C30, ACN/voda, MeOH/voda


FENOLICKÉ LÁTKY a POLYFENOLICKÉ LÁTKY Flavonoidy – rostlinné fenoly odvozeny od flavanu. Běžně bývají všechny tři kruhy substituovány hydroxyskupinami nebo ethoxyskupinami a jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Flavonoidy mají antioxidační vlastnosti. Separace flavonoidů: Reverzní chromatografie, kolony C8-C18, ACN/voda, MeOH/voda

Kolona: Zorbax SB-C18 column (250mm×4.6mm I.D., 5 um)¨Mobilní fáze: voda (A), acetonitril (B). Gradient:: 0–15 min, 22–28% B; 15–20 min, 28–35% B; 20–40 min, 35–39% B; 40–50 min, 39–100% B; Průtok 1 ml/min. UV detekce 270 nm.


LÉČIVA/DROGY Barbituráty – deriváty kyseliny barbiturové, tlumící účinek na centrální nervovou soustavu (dříve byly využívány jako léky na spaní; využívány k sebevraždám). V krátké době lze vypěstovat závislost.

1 phenobarbital 2 butalbital 3 pentobarbital 4 amobarbital 5 secobarbital

Kinetex® 2.6µm EVO C18 100 Å, LC Column 50 x 2.1 mm, gradientová eluce, (A:10mM uhličitan amonný pH 10; B:acetonitril; 0.25 mL/min), detekce MS Phenomenex


LÉČIVA/DROGY Statiny – hypolipidemika, léčí se jimi zvýšená hladina lipidů (cholesterolu) v krvi.

lovastatin

1 lovastatin 2 atorvastatin 3 pravastatin 4 simvastatin

Kinetex® F5 2.6µm 100 Å [pentafluorofenylová fáze], LC Column 50 x 2.1 mm, gradientová eluce (A:0.1% TFA ve vodě; B:acetonitril;0,5 mL/min), detekce UV/Vis 248 nm Phenomenex


LÉČIVA/DROGY Léčiva na erektilní dysfunkci

sildenafil 1 tadalafil 2 sildenafil 3 vardenafil

Kinetex® 5µm EVO C18 100 Å, LC Column 150 x 4.6 mm, gradientová eluce (A:10mM octan amonný; B:acetonitril; 1.2 mL/min) detekce UV-Vis 230 nm Phenomenex


LÉČIVA/DROGY Opiáty 1 Morphine 2 Oxymorphone 3 Hydromorphone 4 Naloxone 5 Codeine 6 6-MAM 7 Oxycodone 8 Naltrexone 9 Hydrocodone 10 Norfentanyl

11 Tramadol 12 Normeperidine 13 Meperidine 14 Norbuprenorphine 15 Fentanyl 16 Buprenorphine 17 Propoxyphene 18 Norpropoxyphene 19 EDDP 20 Methadone

morfin

Kinetex® 2.6 µm Biphenyl 100 Å, LC Column 50 x 3.0 mm, gradientová eluce (0.1% kyselina mravenčí ve vodě; B:0.1% kyselina mravenčí v methanolu, 0.6 mL/min) teplota kolony 40 °C, detekce MS

Phenomenex


VITAMÍNY all-trans-retinol

gamma-tocopherol

1 Vitamin A (all-trans-retinol) 2 Vitamin E (gamma-tocopherol) 3 Vitamin E (a-tocopherol)

Kinetex® 5µm EVO C18 100 Å, LC Column 100 x 2.1 mm, gradientová eluce (A:voda; B:50:50 2-propanol:acetonitril;0.6 mL/min), detekce MS - APCI, přepínání polarity Phenomenex


BARVIVA Sudan I 1 Sudan I 2 Sudan II 3 Sudan III 4 Sudan Red B 5 Sudan IV

Synergi™ 4 µm Polar-RP 80 Å [ethericky vázaná fenylová fáze], LC Column 150 x 4.6 mm, isokratická eluce voda-acetonitril-methanol (15-20-65), 1 mL/min, detekce UV-Vis 480 nm Phenomenex


POLYCYKLICKÉ AROMÁTY

1 Naphthalene 2 Acenaphthylene 3 Acenaphthene 4 Fluorene 5 Phenanthrene 6 Anthracene 7 Fluoranthene 8 Pyrene

9 benzo(a)anthracene 10 Chrysene 11 benzo(b)fluoranthene 12 benzo(k)fluoranthene 13 benzo(a)pyrene 14 Dibenz[a,h]anthracene 15 benzo(g,h,i)perylene 16 Indeno[1,2,3-cd]pyrene

benzo[a]pyren

Synergi™ 4 µm Max-RP 80 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, gradientová eluce (A:voda; B:acetonitril; 1.5 mL/min) UV-Vis 254 nm Phenomenex


SYNTETICKÉ POLYMERY Možnosti separace synt. polymerů: Reverzní chromatografie – separace dle hydrofobicity Vylučovací chromatografie - separace na základě různých velikostí molekul. RP-HPLC


SYNTETICKÉ POLYMERY SEC-LC

Na základě kalibrace lze z elučních objemů v SEC určit molární hmotnost polymerů.


Vybrané aplikace podrobněji


Forenzní analýza: benzodiazepiny ve vlasech Příprava vzorku - dekontaminace vzorku v isooktanu - sušení, mletí - přídavek vnitřního standardu - sonikace, inkubace v pufru 12 hodin - extrakce org. rozpouštědly

delorazepam

HPLC/MS: - kolona Luna C18 (150×1 mm, 5 μm), 40°C - gradientová eluce, průtok 100 μL/min. A: 0.1% kyselina mravenčí ve vodě B: 0.1% kyselina mravenčí v acetonitrilu - detekce HRMS ESI, orbitrap nordiazepam Vogliardi et al., Anal Bioanal Chem (2011) 400:51–67


Forenzní analýza: benzodiazepiny ve vlasech

- současná identifikace a kvantifikace 28 benzodiazepinů - 50 mg vzorku koncentrace ve vlasech: - kvantifikační limity 1- 10 pg/mg až 1 600 pg/mg - linearita do 1 000 pg/mg Vogliardi et al., Anal Bioanal Chem (2011) 400:51–67


Analýza potravin: mykotoxiny v potravinách Příprava vzorku - přídavek vnitřního standardu - extrakce v acetonitrilu/vodě/k. octové - centrifugace, naředění mobilní fází Aflatoxin B1

HPLC/MS: - kolona Gemini® C18 150×4.6 mm, 5-μm částice, 25 °C - předkolona C18 4×3 m. - gradientová eluce, 1 ml/min A: methanol/voda/k. octová 10:89:1, 5 mM octan amonný B: methanol/voda/k. octová 97:2:1, 5 mM octan amonný - detekce ESI-MS/MS (MRM) na Q-trap 4000

Aflatoxin G1

Sulyok et al., Anal Bioanal Chem (2007) 389:1505–1523


Analýza potravin: mykotoxiny v potravinách

- metoda pro 87 analytů v plesnivých potravinách - limity detekce 0.02 - 225 μg/kg - nalezeno 37 fungálních metabolitů

koncentrace: až 33 mg/kg potraviny

Sulyok et al., Anal Bioanal Chem (2007) 389:1505–1523


Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách Příprava vzorku - filtrace vody - ředění v případě vody z ČOV Estron

HPLC/MS: - kolona Acclaim® PA2, 3 um, 3x150 mm (stabilní ve 100% vodě) - gradientová eluce, 0.2 ml/min A: acetonitril B: 1‰ amoniak ve vodě - detekce ESI-MS/MS (QqQ)

Estradiol

Guo, et al., Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9–18


Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách

- prekoncentrace analytů na SPE koloně IonPac® NG1, 4x35 mm, 2.5 ml vzorku - odstranění nečistot (30% acetonitril ve vodě) - vypláchnutí mobilní fází, separace na analytické koloně - regenerace SPE kolony (90% acetonitril ve vodě) Guo, et al., Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9–18


Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách

- plně automatická metoda pro on-line SPE prekoncentraci - kvantifikace 5 estrogenů a 4 androgenů ve vodách - MRM v negativním módu pro estrogeny, v positivním pro androgeny - limity detekce 0.1 -2.5 ng/L. The - poměrně nízké výtěžnosti pro androgeny 32% - 60% Guo, et al., Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9–18

Využití HPLC pro různé typy analytů

Recommend Documents