UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové
KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV
Hodnocení zolpidem-tartarátu pomocí HPLC
Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Pavla Pilařová, Ph.D.
Hradec Králové 2016
Iva Kopecká
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“ V Hradci Králové, 9.5.2016
………………………………………. Iva Kopecká
2
Ráda bych poděkovala své školitelce PharmDr. Pavle Pilařové, Ph.D. za odborné vedení, vstřícnost, ochotu a čas, který mi věnovala. Poděkování za pomoc a ochotu patří také celé katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv. Tato práce vznikla za podpory projektu SVV 260 291.
3
Obsah 1. Úvod ............................................................................. 6 2. Teoretická část ............................................................ 8 2.1 Zolpidem a jeho vlastnosti ....................................................................................9 2.1.1 Vzorec a chemické vlastnosti .........................................................................9 2.1.2 Indikace .........................................................................................................9 2.1.3 Mechanismus účinku ......................................................................................9 2.1.4 Farmakokinetické vlastnosti ......................................................................... 10 2.1.5 Kontraindikace ............................................................................................. 11 2.1.6 Nežádoucí účinky ......................................................................................... 11 2.1.7 Interakce ......................................................................................................11 2.1.8 Přípravky s obsahem zolpidemu na trhu ....................................................... 12 2.2 Chromatografie .................................................................................................. 13 2.2.1 Princip..........................................................................................................13 2.2.2 Rozdělení chromatografických metod: ......................................................... 14 2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ....................................... 14 2.2.4 Chromatograf – instrumentace ......................................................................15 2.2.5 Chromatografické systémy ...........................................................................22 2.2.6 Chromatografické podmínky pro separaci zolpidemu pomocí HPLC uvedené v literárních zdrojích ............................................................................................. 25 2.3 Stabilitní studie léčiv .......................................................................................... 27 2.3.1 Zátěžové (stresové) testy .............................................................................. 28 2.3.2 Kinetické výpočty rozkladných reakcí .......................................................... 28
3. Cíl práce .................................................................... 31 4. Praktická část ............................................................ 33 4.1 Chemikálie a pomůcky ....................................................................................... 34 4.1.1 Chemikálie ................................................................................................... 34 4.1.2 Sestava pro HPLC ........................................................................................ 34 4.1.3 Přístroje:....................................................................................................... 35 4.1.4 Pomůcky: ..................................................................................................... 35 4.2 Obecné postupy .................................................................................................. 35 4.2.1 Příprava standardů: ....................................................................................... 35 4.2.2 Příprava mobilní fáze: .................................................................................. 35 4.2.3 Výchozí nastavení chromatografických podmínek ........................................ 36
4
4.2.4 Optimalizace podmínek separace .................................................................. 36 4.2.5 Příprava standardu zolpidemu....................................................................... 37 4.2.6 Příprava stresových zkoušek ......................................................................... 37
5. Výsledky a diskuze.................................................... 39 5.1. Optimalizaze podmínek separace ....................................................................... 40 5.1.1. Vliv koncentrace pufru ................................................................................ 40 5.1.2. Vliv hodnoty pH .......................................................................................... 40 5.1.3. Vliv zastoupení organické složky mobilní fáze ............................................ 41 5.1.4. Vliv teploty ................................................................................................. 42 5.1.5 Nastavení vlnové délky ................................................................................ 42 5.2. Standard, nečistota A ......................................................................................... 42 5.3. Stresové zkoušky............................................................................................... 43 5.3.1. 1,0 M NaOH................................................................................................ 43 5.3.2. Peroxid vodíku ............................................................................................ 45 5.3.3. Denní světlo ................................................................................................ 46 5.3.4. Teplota ........................................................................................................ 48
6. Závěr .......................................................................... 50 7. Zdroje ........................................................................ 52 Abstrakt ......................................................................... 58
5
1. Úvod
6
Zolpidem je léčivo, které patří do 3. generace hypnosedativ. Je indikován k potlačení nespavosti, stíženému usínání a častému buzení během spánku. Ve srovnání s ostatními hypnosedativy je riziko vzniku návyku i intoxikace nižší. Zolpidem je metabolizován enzymy cytochromu P450, z čehož vyplývají interakce s inhibitory a induktory tohoto enzymu. Ke zvýšenému sedativnímu účinku dochází při kombinaci s ostatními tlumícími látkami. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je separační analytická metoda, která je využívána v kvalitativní i v kvantitativní analýze látek. Mezi hlavní výhody této metody patří především selektivita, citlivost, možnost automatizace a poměrně velká rychlost. Tato analýza má široké uplatnění také díky různým způsobům detekce či složení mobilní a stacionární fáze. Pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčivého přípravku po celou dobu jeho použitelnosti slouží stabilitní studie léčiv. Jedná se o testy vlivu vnějších podmínek prostředí ale i vnitřních faktorů na stabilitu vzorku. Existuje několik druhů testů lišících se definovanými podmínkami studií. Pomocí výsledků stabilitních studií pak lze stanovit podmínky skladování léčivého přípravku a dobu použitelnosti, výsledky jsou také součástí registrační dokumentace přípravku.
7
2. Teoretická část
8
2.1 Zolpidem a jeho vlastnosti 2.1.1 Vzorec a chemické vlastnosti
Sumární vzorec: C42H48N6O8 Molekulová hmotnost: 764,88 Systematický název: bis {N,N-dimethyl-2-[6-methyl-2-(4-methylfenyl)imidazo[1,2a]pyridin-3-yl]acetamid}-(2R,3R)-2,3-dihydroxybutandioát Obsahuje 98,5% až 101,0% sloučeniny C42H48N6O8, počítáno na bezvodou látku. (12) Vlastnosti Zolpidem je bílý nebo téměř bílý krystalický hygroskopický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě, mírně rozpustný v methanolu, prakticky nerozpustný v dichlormethanu. (12) Nečistoty N,N-dimethyl-2-[4-dimethyl-2-(4-methylfenyl)imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl]acetamid (12)
2.1.2 Indikace Zolpidem se řadí do 3. generace hypnosedativ, tzv. Z-drugs. Je indikován ke krátkodobé léčbě nespavosti při potížích s usínáním nebo častým buzením během noci.(11)(12)
2.1.3 Mechanismus účinku Zolpidem je imidazopyridinové hypnosedativum, nepatří mezi benzodiazepiny. Je agonistou GABA-A receptorů, selektivní pro Ω1 podjednotku – tzv. benzodiazepinová
9
podjednotka receptoru. Váže se přednostně na Ω1 podjednotku narozdíl od zmíněných benzodiazepinů, má tedy selektivnější sedativně-hypnotické působení (benzodiazepiny mají díky vazbě na Ω2 podjednotku i účinky myorelaxanční a antikonvulzivní). GABAA receptor vyvolá změnu kanálu pro chloridové ionty, zvýší se průnik chloridových iontů a dojde k hyperpolarizaci, čímž se zastaví přenos vzruchu a nastane sedace. Jako antagonista je účinný flumazenil. Zolpidem zachovává spánkovou architekturu, zkracuje spánkovou latenci a počet probuzení a zlepšuje kvalitu spánku. (11)(12)
2.1.4 Farmakokinetické vlastnosti Zolpidem se rychle vstřebává, nástup účinku je velmi rychlý. Biologický poločas je také krátký, pohybuje se přibližně v rozmezí 0,5 hod – 3 hod – má tedy malý vliv na ranní vigilitu. Vaznost na bílkoviny je 93%. Všechny metabolity nejsou farmakologicky aktivní, vylučují se močí a stolicí.
Obr. 1 Metabolismus zolpidemu (13) Hlavními enzymy, které metabolizují zolpidem, jsou enzymy cytochromu P450 – především CYP3A4 a CYP1A2.
10
Riziko rebound insomnie po vysazení zolpidemu je minimální, riziko vzniku tolerance a závislosti je ve srovnání s benzodiazepiny také nižší. (14)
2.1.5 Kontraindikace Mezi kontraindikace zolpidemu řadíme těžkou jaterní nedostatečnost, akutní nebo těžkou respirační nedostatečnost, hypersenzitivitu na účinnou látku a věk do 18 let. (14)
2.1.6 Nežádoucí účinky Častými nežádoucími projevy terapie zolpidemem jsou poruchy nervového systému jako například ospalost, bolest hlavy, závrať, zvýšená spavost, anterográdní amnézie, dále psychiatrické poruchy (halucinace, neklid, noční můry), gastrointestinální obtíže – průjem, nauzea, zvracení, bolesti břicha. Časté jsou i infekce horních i dolních cest dýchacích. Méně častými projevy mohou být: dvojité vidění, zmatenost, podrážděnost, nervozita, agresivita, bludy, zuřivost, nevhodné chování, somnambulismus, změny libida, deprese, zvýšení hodnot jaterních enzymů, svalová slabost, vyrážka, svědění, kopřivka, zvýšené pocení a respirační deprese. (14)
2.1.7 Interakce
V kombinaci s alkoholem dochází ke zvýšenému sedativnímu účinku.
S látkami tlumícími centrální nervový systém – antipsychotiky (neuroleptiky), hypnotiky,
anxiolytiky/sedativy,
antidepresivy,
narkotickými
analgetiky,
antiepileptiky, anestetiky a sedativními antihistaminiky může způsobit zvýšenou ospalost, poruchu psychomotorických funkcí následující den a tím i nepříznivě ovlivnit schopnost řízení. Kombinací zolpidemu s antidepresivy byly výjimečně pozorovány také zrakové halucinace. Fluvoxamin může zvýšit hladinu zolpidemu v krvi. Narkotická analgetika společně užívaná se zolpidemem mohou vyvolat euforii vedoucí k psychické závislosti.
S induktory a inhibitory CYP450 – při podání s rifampicinem (induktor CYP3A4) farmakodynamický efekt zolpidemu snížen, s itrakonazolem (inhibitor CYP3A4) k výrazné změně farmakodynamických a farmakokinetických vlastností nedošlo, s ketokonazolem (silný inhibitor CYP3A4) prodloužení eliminačního poločasu,
11
zvýšení celkové AUC, snížení perorální clearance. Ciprofloxacin hladinu zolpidemu v krvi zvyšuje.
K žádným významným interakcím nedošlo při podání s warfarinem, digoxinem ani ranitidem.
V těhotenství se doporučuje vyhnout se užívání zolpidemu. Data o užívání zolpidemu těhotnými ženami nejsou k dispozici, avšak studie na zvířecích modelech reprodukční toxicitu neprokázaly. Užívání zolpidemu při kojení se také nedoporučuje z důvodu přestupu malého množství zolpidemu do mateřského mléka. Zolpidem má výrazné účinky na schopnost řídit a obsluhovat stroje. (14)
2.1.8 Přípravky s obsahem zolpidemu na trhu
Adorma 5mg, 10 mg, ALKALOID-INT d.o.o., Ljubljana Črnuče, Slovinsko
Apo-zolpidem 10 mg, Apotex Europe B.V., Leiden, Nizozemsko
Eanox 10 mg, DESITIN ARZNEIMITTEL GmbH, Hamburg, SRN
Edluar 5 mg, 10 mg sublingvální tablety, MEDA Pharma s.r.o., Praha, Česká republika
Hypnogen 10 mg, Takeda GmbH, Konstanz, Německo
Sanval 10 mg, Sandoz s.r.o., Praha, Česká republika
Stilnox 10 mg, Sanofi-Aventis s.r.o., Praha, Česká republika
Zolpidem Mylan 10 mg, Generics (UK) Ltd, Potters Bar, Velká Británie
Zolpidem Orion 10 mg, Orion Corporation, Espoo, Finsko
Zolpidem Vitabalans 10 mg, Vitabalans Oy, Hämeenlinna, Finsko
Zolpidem Ratiopharm, Ratiopharm GmbH, Ulm, Německo
Zolpinox 10 mg, SVUS Pharma, Hradec Králové, Česká republika
Zolsana 10 mg, KRKA d.d., Novo mesto, Slovinsko (27)
12
2.2 Chromatografie Chromatografie je dnes jednou z nejpoužívanějších analytických metod. Je to separační metoda, která umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu v poměrně krátkém časovém rozmezí. Výhodou je i malé množství vzorku potřebné k analýze, dále možnost automatizace procesu a citlivost stanovení. (1), (2)
2.2.1 Princip V roce 1993 definoval IUPAC chromatografii takto: „Chromatografie je fyzikální separační metoda, při níž jsou separované složky distribuovány mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární, zatímco druhá se pohybuje v daném směru.“ Chromatografická separace je založena na rozdílné distribuci dělených látek ve směsi mezi dvě různé nemísitelné fáze. Jsou to fáze mobilní (eluent), která je pohyblivá, a fáze stacionární (nepohyblivá, sorbent), která je ve formě sorbentu ukotvená na tuhém nosiči v chromatografické koloně. Mezi stacionární a mobilní fází dochází k neustálému ustalování rovnováhy dělených látek. Aby byla umožněna distribuce mezi oběma fázemi, je nutná existence fázového rozhraní. Pohybem mobilní fáze je vzorek soustavou unášen. Dochází k retenci složek vzorku na stacionární fázi v závislosti na jejich afinitě k jednotlivým fázím. Díky různé retenci těchto složek vzorku se od sebe postupně oddělují. Distribuci složek mezi dvě fáze vyjadřuje distribuční (rozdělovací) konstanta (KD): 𝑐
𝐾𝐷 = 𝑐 𝑠
𝑚
cs – koncentrace složky ve stacionární fázi [mol/l] cm – koncentrace složky v mobilní fázi [mol/l] Čím je tato konstanta vyšší, tím delší dobu setrvávají částice dané látky ve stacionární fázi, a tudíž je i větší retence. Proto jsou pro analýzu důležité rozdílné hodnoty distribučních konstant, aby došlo k rozdělení složek směsi. (1)(2)(3)
13
2.2.2 Rozdělení chromatografických metod: 1) Dle skupenství mobilní fáze:
Kapalinová chromatografie
Plynová chromatografie
2) Dle uspořádání stacionární fáze:
Chromatografie sloupcová
Chromatografie plošná
3) Dle převažujícího mechanismu interakcí
Adsorpční chromatografie – kdy dochází k adsorpci molekul analytu na povrchu adsorbentu
Rozdělovací chromatografie – na základě rozdílné rozpustnosti v nepohyblivé a pohyblivé fázi v důsledku rozdělovacího koeficientu
Iontově-výměnná chromatografie – separace dle výměny iontů mezi stacionární fází (iontoměnič) a mobilní fází (ionty elektrolytu) – závisí na afinitě dělených iontů k funkční skupině iontoměniče, velikost el. náboje iontů a koncentrace iontu
Gelová permeační chromatografie – dělení dle velikosti a tvaru molekul na pórovité stacionární fázi – gelu (menší molekuly se zadržují déle – molekulově sítový efekt)
Afinitní chromatografie – stacionární fáze je schopna vázat ze vzorku právě určité složky, ke kterým má afinitu (úzce selektivní vztah) (1)(2)
2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Kapalinová chromatografie je charakterizována kapalnou mobilní fází. Lze ji provádět v uzavřeném sytému (což je chromatografie sloupcová a vysokoúčinná) nebo v systému otevřeném (tenkovrstvá a papírová chromatografie). Hlavním využitím HPLC je především separace netěkavých, méně těkavých a termicky labilních směsí látek. Lze využít všechny výše uvedené mechanismy separace. Důležitou funkci má na rozdíl od plynové chromatografie mobilní fáze. Jako mobilní fáze se využívají různé druhy rozpouštědel, popř. jejich směsi, o různých polaritách. Složení a vlastnosti pohyblivé fáze
14
jsou spolu se stacionární fází rozhodující pro separaci. U některých látek lze využít i změnu teploty. (1)(2)
2.2.4 Chromatograf – instrumentace Obecně lze chromatograf rozdělit na několik částí: zařízení pro uchovávání a dopravu mobilní fáze, zařízení pro dávkování vzorku, zařízení pro vlastní separaci (kolona + termostat) a detekční zařízení. Někdy bývá k chromatografickému systému připojen i sběrač frakcí. (3)
2.2.4.1 Cesta analytu: zásobník eluentu → odplyňovač → směšovač → vysokotlaké čerpadlo → dávkovač vzorku → kolona → detektor → datová stanice
Obr.2 Kapalinový chromatograf. (6)
2.2.4.2 Zásobník mobilní fáze Většinou se jedná o skleněné nádoby naplněné roztoky eluentů. Jelikož bývají součástí eluentů různá organická rozpouštědla, musí být zásobníky dobře uzavřeny, aby nedocházelo k jejich vypařování. Jako prevence ucpání systému tuhými částicemi z roztoku slouží v nádobě filtry z kovu nebo teflonu s danou porozitou (0,20 μm).
15
Dnes se už převážně setkáváme s více zásobníky. Mezi jednotlivými roztoky dochází k jejich mísení pomocí směšovače, který je zařazen před čerpadlem. Druhou možnost představují 2 čerpadla seřazená před směšovačem. Důležitou úpravou mobilní fáze je kromě filtrování také odplynění. Důvodem pro eliminaci bublinek plynů je především zkreslení naměřených výsledků – a to: nestabilita základní linie (a tím i snížená citlivost detekce), reprodukovatelnost retenčních časů i dávkování vzorku a nestabilita provozu čerpadel. K odplynění se především používá probublávání heliem nebo účinnější vakuový degaser (dříve se k odplynění používala kombinace ultrazvuku a vakuového odplynění). Vakuový odplyňovač pracuje na principu vakuové komory a polopropustné kapiláry, která propouští pouze plyny. Na základě rozdílu tlaku uvnitř a vně kapiláry dochází k odplynění pomocí vakuového čerpadla. (3)(5)
2.2.4.3 Vysokotlaká pumpa Aby mohla mobilní fáze projít přes kolonu, která je plněna mikročásticemi, musí mít vysoký tlak. Další důležitou funkcí pumpy je i zajištění konstantního průtoku. Pumpy můžeme rozdělit dle způsobu dosažení pohybu pístu čerpadla:
čerpadla pracující při konstantním tlaku – kdy se využívá tlak plynu nebo hydraulické kapaliny na píst čerpadla ◦
např.: pneumatická čerpadla
čerpadla pracující s konstantním objemovým průtokem – využití mechanického pohonu ◦
např.: čerpadla injekčního typu, pístová čerpadla, membránová čerpadla
Na čerpadla se kladou vysoké nároky, a to: - vstupní tlaky na čerpadlech v rozmezí 1-100 MPa - možnost změny průtoku mobilní fáze v rozmezí 0,1 – 10,0 ml - průtok přesný a správný (oba do 1%), bezpulsní, bez monotónních změn - konstrukční materiál odolný vůči korozi (nerezová ocel, titan, keramika)
16
- co nejmenší vnitřní objem čerpadel (rychlá výměna mobilní fáze) (3)
2.2.4.4 Dávkovač Také na přesném dávkování vzorku je z velké části závislá účinnost chromatografické analýzy. Nedokonalé dávkování může vést k rozmývání píku a tím ke snížení účinnosti analýzy. Dříve se dávkování realizovala použitím injekční stříkačky přes septum, nebo se zastavením průtoku mobilní fáze. Důvodem pro nižší využívání těchto sept byly nároky na ně kladené, a to především tlaková odolnost a uzavření septa po vytažení stříkačky. Dále riziko vyluhování látek ze septa, možnost ucpání jehly a netěsnost systému. Dnešním trendem jsou tzv. přepínací ventily a hlavně automatické dávkovače – autosamplery. Vysokotlaké dávkovací ventily umožňují dávkování buď s využitím smyčky (viz Obr. 3a) nebo vnitřní dutiny ventilu (viz Obr. 3b).
Obr. 4 Dávkovací vysokotlaké ventily (5) Autosamplery dávkují vzorek ze speciálních nádobek – vialek, které jsou uzavřeny šroubovacím víčkem s pryžovým septem nebo hliníkovým uzávěrem (tzv. krimpovací vialky) o objemu cca 2 ml. Při velmi malém objemu vzorku se do vialek vloží tzv. inserty (pro stovky μl). Vialky jsou umístěny v zásobníku vzorků, ze kterého si autosamplery vzorky odebírají. Ačkoliv je konstrukce automatických dávkovačů jednoduchá, existují
17
také nevýhody tohoto systému - dochází k určitým tlakovým nárazům při přepínání kohoutu mezi jednotlivými polohami a také k přerušení průtoku při přepínání poloh. (5)(3)
2.2.4.5 Chromatografická kolona Výběr kolony má rozhodující význam pro separaci, která závisí na druhu sorbentu, na délce, materiálu, tvaru, vnitřním povrchu kolony, způsobu plnění atd. Kolona je konstruována z vlastního těla kolony, což je trubice s hladkým vnitřním povrchem a koncovky, která zajišťuje těsnost systému, zadržení náplně kolony a rovnoměrnou distribuci mobilní fáze i vzorku. Nejvíce se jako materiál na výrobu kolony osvědčila nerezová ocel, pro tlaky nižší než 10MPa se používají skleněné kolony z borosilikátového skla odolné i silným kyselinám. Polymery se na výrobu kolon nehodí v důsledku nízké tlakové odolnosti. Délka kolony se pohybuje v rozmezí 10-300 mm, vnitřní průměr 2,1-5 mm a velikost náplně 1-10 μm. Výběr rozměrů kolony se provádí na základě použitého materiálu náplně a počtu teoretických pater potřebných k separaci. Platí pravidlo, že čím menší je zrnění sorbentu, tím kratší je kolona. Nejpoužívanější současnou náplní kolony jsou jednoznačně silikagelové stacionární fáze, dále se používají polymery, hybridní stacionární fáze, stacionární fáze na bázi oxidu zirkoničitého, na bázi dalších kovových oxidů a na bázi PGC. Na kolonové náplně jsou kladeny určité požadavky, a to především vysoká účinnost separace, selektivita, chemická, mechanická a termální stabilita a dlouhá životnost kolony. Silikagel má velikost částic 3 a 5 μm, rozmezí pH pro jeho použití je 2-7, teplotní stabilita je do 60°C, tlaková stabilita do 35-40 MPa. Pro účely HPLC se používají tři typy silikagelů – A, B, C. Typ A je vhodný pro kyselé a neutrální látky, má vyšší obsah kovů a kyselý povrch. Silikagel vysoké čistoty nebo-li typ B je vhodný pro bazické a neutrální látky. Hydrosilovaný silikagel (typ C) má Si-OH skupiny nahrazeny skupinami Si-H. Pro zvýšení stability chemické i tepelné a pro zamezení interakce s volnými silanoly dochází k úpravám silikagelu, např.: vložení polární skupiny, polyfunkční navázání ligandu, stérické chránění volných silanolů, hybridní sorbenty, pokrytí volných silanolů – tzv. endcapping. Endcapping je fyzikálně chemický proces, při kterém dochází k redukci
18
volných silanolových skupin chemickou reakcí – např.: substitucí objemným substituentem, husté navázání CH3 skupin. Pro separaci na koloně je také důležitý termostat, který zajišťuje rovnoměrnou distribuci tepla a brání výkyvům teploty. Velké využití termostatu je především u teplotního gradientu, kdy se mění teplota soustavy a je nutná její stabilita. Termostaty jsou buď kapalinové nebo teplovzdušné. Kapalinové termostaty jsou však přesnější a lépe přenášejí teplo, jejich využití je hlavně pro teploty nad 100°C. Pro chlazení kolony na teplotu nižší než je teplota v laboratoři se využívá Peltierova článku. Součástí moderních termostatů může být i detektor unikajících par – ten slouží k ověření těsnosti systému.(3)(7)(9)
2.2.4.6 Detektor Úkolem detektoru je indikace látek vycházejících z kolony a sledování koncentrace jednotlivých složek vzorku. Pomocí vhodného snímače sleduje detektor určitou vlastnost eluátu – tento signál se pak pomocí zesilovače přivádí do zapisovače, který nám poskytne záznam signálu v závislosti na čase. Požadavky na detektory jsou především univerzálnost, selektivita a citlivost. UV-VIS detektor je jedním z nejpoužívanějších detektorů. Používá se pro analýzu látek absorbujícíh v oblasti od 190 - 400 nm (UV) a 400 - 800 nm (VIS) a pro látky, které absorbují v této oblasti po derivatizaci vhodným činidlem. Principem je změna intenzity paprsku procházejícího průtokovou celou detektoru v závislosti na interakci se vzorkem. Zdrojem záření pro UV je vodíková nebo deuteriová lampa, u VIS žárovka s wolframovým vláknem. Hodnota absorbance se odvíjí od počtu funkčních skupin a na vlnové délce. Dle Lambert-Beerova zákona je pak koncentrace látky přímo úměrná absorbanci: 𝐴 = 𝜀∗𝐶∗𝑑 ε – molární absorpční koeficient [l/mol*cm] c – molární koncentrace vzorku [mol/l] d – tloušťka vrstvy [cm] Citlivost UV-VIS detektoru je velmi dobrá, lze provádět gradientovou eluci. Vlnová délka při měření je buď fixní nebo proměnlivá.
19
Typem spektrometrického detektoru je tzv. DAD – spektrofotometrický detektor s diodovým polem, který umožnuje 3D záznam s rozmezím hodnot vlnových délek. Díky tomu lze posoudit čistota píku analyzovaného vzorku. Fluorescenční detektor je vysoce selektivní, vysoce citlivý a jeho odezva nezávisí na kolísání teploty. Měřenou veličinou je v tomto případě fluorescence – je tedy určen pro detekci látek fluoreskujících nebo látek, které lze na fluoreskující převést. Z tohoto vyplývá omezení pro mobilní fázi, která sama o sobě nesmí fluoreskovat nebo naopak fluorescenci zhášet. Při detekci prochází eluát průtokovou celou, kde absorbuje excitační záření ze zdroje. Zdrojem může být rtuťová výbojka nebo wolframová, deuteriová, xenonová lampa či laser. Po absorpci látka vydává fluorescenční záření, které má vyšší vlnovou délku než záření excitační. Emitované záření se po dopadu na fotonásobič mění na elektrický signál úměrný velikosti fluorescence. Důležitou součástí detektoru jsou filtry, popř. monochromátory, které separují excitační a emisní vlnové délky. Měřenou veličinou refraktometrického detektoru je index lomu. Měří se index lomu vzorku oproti indexu lomu mobilní fáze, která je v referenční cele. Existují tři typy refraktometrických detektorů – založené na měření ohybu světla dle Snellova zákona, dále Fresnelův refraktometr – množství světla odraženého na rozhraní sklo-roztok a detektor založený na sledování interference měrného a referenčního paprsku. Výhodou je univerzálnost. Je ale méně citlivý, odezva závisí na teplotě – tudíž je nutný termostat a není možné ho použít při gradientové eluci. Elektrochemické detektory využívají dějů souvisejících s elektrochemickou reakcí na fázovém rozhraní elektroda-roztok. Principem je měření elektrické veličiny měnící se v závislosti na látkovém množství analytu. V průtokové cele detektoru se nachází elektroda s určitým napětím, které je nutné pro průběh elektrochemické reakce. Průchodem vzorku přes tuto celu dojde ke změně elektrického signálu. Elektrochemické detektory lze rozdělit dle podmínek měření na potenciometrii, kdy je elektrochemický článek v rovnováze, tj. faradaický proud je roven nule. Druhým typem jsou metody elektrolytické, kdy článkem protéká elektrický proud a jedním směrem probíhá elektrolýza. U elektrolytických metod se setkáváme se čtyřmi závisle proměnnými veličinami – potenciál elektrody E, elektrický proud I, čas t a koncentrace c. Proud vyvolaný průchodem redukované nebo oxidované látky průtokovou celou měří detektory
20
amperometrické. U těchto detektorů se používají měrné elektrody vyrobené ze skelného uhlíku, grafitových vláken, nitridu boru, zlata, platiny, mědi nebo jiného kovu. Je však nutné povrch elektrody čistit, protože se na něm usazují nečistoty z mobilní fáze a produkty elektrochemické reakce. Jako srovnávací elektrody slouží kalomelová nebo argentchloridová elektroda. Signál detekovaný amperometrickým detektorem je na rozdíl od detektoru coulometrického závislý na rychlosti průtoku mobilní fáze. Coulometrické detektory jsou citlivější než amperometrické a jejich principem je měření náboje, který je třeba k oxidaci či redukci celého vzorku při průtoku měrnou celou. Obecně je citlivost detektorů elektrochemických srovnatelná s fluorescenčními detektory, jejich nevýhodou jsou požadavky kladené na čistotu a nepřítomnost plynů v mobilní fázi, dále její vodivost a co nejmenší potřebné množství organické složky mobilní fáze. Vysoce selektivní a citlivou metodou s širokým využitím se stala detekce pomocí hmotnostní spektrometrie (MS), která poskytuje i údaje o identitě vzorku. Průběh detekce se odehrává ve třech krocích – nejprve se vzorek musí ionizovat – tzn. převést neutrální molekuly na částice elektricky nabité. Existuje velké množství ionizačních metod – jejich volba se odvíjí od vlastností vzorku (těkavost, tepelná odolnost, molekulová hmotnost, polarita). Nejčastěji se užívají techniky ionizace za atmosferického tlaku např. Ionizace elektrosprejem ESI, chemická ionizace APCI a fotoionizace APPI. Vzniklé ionty jsou následně roztříděny dle poměru hmotnost/náboj (m/z) a urychleny v tzv. analyzátoru („srdce hmotnostního spektrometru“). Analýza iontů probíhá několika možnými principy: zakřivení dráhy letu v magnetickém či elektrickém poli, různá stabilita oscilací iontů
v
dvojrozměrné
nebo
trojrozměrné
kombinaci
stejnosměrného
a
vysokofrekvenčního napětí, různá doba letu iontů v oblasti bez pole, různé absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli a dělení iontů na základě různé frekvence harmonických oscilací. Konečnou fází je detekce iontů a zesílení signálu v detektoru. Dalším typem detekce je chemiluminiscenční, kdy se měří fluorescence vyvolaná chemickou reakcí, dále vodivostní detektory meřící elektrickou vodivost mezi dvěmi alektrodami a ELSD (evaporative light scattering detector), jehož principem je rozptyl světla. (3)(5)(7)(11)
21
2.2.5 Chromatografické systémy 2.2.5.1 Systémy s normálními fázemi (NP-HPLC) Tyto systémy se vyznačují polární stacionární fází a méně polární mobilní fází. Nejčastěji se používá jako sorbent silně polární silikagel – ten může být čistý nebo modifikovaný. Příkladem eluentu může být n-heptan, isooktan nebo hexan, které jsou nepolární nebo slabě polární. S rostoucí polaritou analytů, s rostoucí bazicitou funkčních skupin a s povrchem polárního sorbentu roste i retence látek na sorbentu. Retence sloučenin v závislosti na polaritě funkčních skupin roste v tomto pořadí: alifatické uhlovodíky < aromatické uhlovodíky < halogenované sloučeniny < ethery < terciární aminy < nitrily < nitrosloučeniny < estery karboxylových kyselin < ketony < aldehydy < primární aminy < amidy < alkoholy < fenoly < karboxylové kyseliny < sulfonové kyseliny Retenci analytu lze ovlivnit i výběrem mobilní fáze, a to v závislosti na polaritě daného rozpouštědla. S rostoucí polaritou a tzv. eluční silou tohoto rozpouštědla retence zkoušeného vzorku klesá. Pro lepší orientaci byla sestavena tzv. eluotropická řada (viz. Tab.1) vycházející z eluční síly pentanu, jež je rovna nule (ε p0=0). Rozpouštědlo
ε0 (Al2O3)
ε0 (SiO2)
ε0 (C18)
pentan
0,00
0,00
-
hexan
0,00 - 0,01
0,00 - 0,01
-
isooktan
0,01
0,01
-
cyklohexan
0,04
0,03
-
tetrachlormethan
0,17 - 0,18
0,11
-
1-chlorobutan
0,26 - 0,30
0,2
-
xylen
0,26
-
-
toluen
0,20 - 0,30
0,22
-
chlorobenzen
0,30 - 0,31
0,23
-
benzen
0,32
0,25
-
ethylether
0,38
0,38 - 0,43
-
dichlormethan
0,36 - 0,42
0,32 - 0,32
-
22
chloroform
0,36 - 0,40
0,26
-
1,2-dichlorethan
0,44 - 0,49
-
-
methylethylketon
0,51
-
-
aceton
0,56 - 0,58
0,47 - 0,53
8,8
dioxan
0,56 - 0,61
0,49 - 0,51
11,7
1-pentanol
0,61
-
-
tetrahydrofuran
0,45 - 0,62
0,53
3,7
methyl-t-butylether
0,3 - 0,62
0,48
-
ethylacetát
0,58 - 0,62
0,38 - 0,48
-
dimethylsulfoxid
0,62 - 0,75
-
-
diethylamin
0,63
-
-
acetonitril
0,52 - 0,65
0,50 - 0,52
3,1
1-butanol
0,7
-
-
pyridin
0,71
-
-
2-methoxyethanol
0,74
-
-
n-propylalkohol
0,78 - 0,82
-
10,1
propan-2-ol
0,78 - 0,82
0,06
8,3
ethanol
0,88
-
3,1
methanol
0,95
0,70 - 0,73
1
ethylenglykol
1,11
-
-
dimethylformamid
-
-
7,6
voda
-
-
-
Tab.1 Eluotropická řada rozpouštědel (29) Technika NP-HPLC byla dominantní až do 70. let 20. století. Dnes je využití chromatografie na normálních fázích na ústupu. Uplatňuje se však u látek lipofilních, které jsou limitovány rozpustností a dále u analýzy izomerů. (3)(1)
2.2.5.2 Systémy s reverzními fázemi (RP-HPLC) Reverzní nebo-li obrácená fáze – tedy mobilní fáze je polární, kdežto stacionární je s polaritou sníženou. Příkladem eluentu jsou to směsi složky vodné s polárními organickými s vodou mísitelnými rozpouštědly (vodné roztoky acetonitrilu, methanolu, tetrahydrofuranu). Do mobilní fáze se přidávají také roztoky pufrů o vhodném pH. Jako
23
sorbent často slouží silikagel s navázanými dlouhými uhlíkatými řetězci, z nichž nejznámějším je oktadecylsilikagel (SiC18, ODS). Eluční síla u těchto systémů roste s klesající polaritou – tedy opačně, než je tomu u systémů s fázemi normálními. Podle eluční síly lze rozpouštědla seřadit tímto způsobem: voda < methanol < acetonitril < propan-2-ol < dioxan < tetrahydrofuran < aceton Chromatografickou technikou kombinující oba chromatografické systémy je HILIC (chromatografie s hydrofilními interakcemi). Stacionární fáze je hydrofilní a s rostoucí polaritou rozpouštědla roste i retence jako u chromatografických systémů s normálními fázemi. Eluentem je jako v reverzní chromatografii voda nebo pufr s organickým rozpouštědlem. Vzorek je tedy rozdělován mezi polárnější stacionární fázi a méně polární mobilní fázi, mechanismus separace ještě není plně prostudován. Tato technika je vhodná pro polární a hydrofilní látky.(1)(3)(6)
2.2.5.3 Možnosti ovlivnění retence analytu: 1) s rostoucím počtem a řetězcem alkylů v homologické řadě roste i retence látek 2) vliv substituentů - retenci zvyšuje: větší počet aromatických jader, objemné substituenty (např. Halogeny) - retenci snižuje: vyšší počet silně polárních a iontových funkčních skupin v důsledku jejich stoupající polarity (např. -NH2, -COOH, -OH, -SO3H) 3) polární a iontové látky – zadržují se jen velmi málo, nebo vůbec - ionty lze však ovlivnit změnou pH eluentu, dojde tak k potlačení disociace a tím ke zvýšení retence na sorbentu a zamezení chvostování píku Využití chromatografického systému s obrácenými fázemi je díky své univerzálnosti především v oblasti vývoje a optimalizace nových HPLC metod, a to pro směsi malých molekul i pro složité směsi látek. Tento druh separace je jednoznačně dominantní separační technikou.(1)(3)
24
2.2.5.4 Typy eluce Isokratická
Gradientová
Definice
Konstantní složení mobilní fáze.
Vlastnosti a složení eluentu se mění v závislosti na čase. Dochází ke zvyšování eluční síly v průběhu separace.
Výhody
Vyšší stupeň separace analytů. Není nutné ustálení počátečních podmínek před začátkem analýzy.
Zrychlení analýzy. Záruka rozdělení směsi s rozdílnou polaritou. Zmenšení šíře píků. Zvýšení kapacity separace.
Nevýhody
Délka analýzy. Složitější Není jistota, že došlo k úplné separace. separaci všech složek analytu.
Využití
Separace směsí látek o Dominantní metoda. podobných rozdělovacích Použití u látek s různými fyzikálněkonstantách. chemickými vlastnostmi.
nastavení
podmínek
Tab.2 Srovnání metod eluce (1)(3)
2.2.6 Chromatografické podmínky pro separaci zolpidemu pomocí HPLC uvedené v literárních zdrojích V literatuře jsou popsány různé způsoby separace zolpidemu (viz. Tabulka 3).
Metoda č. 1 Stacionární fáze
Bondapack C18
Mobilní fáze
směs acetonitril : 0.01 M KH2PO4 (40:60), pH = 3,5
Detekce
UV při 245 nm
Průtok, typ eluce
1,2 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(19)
Metoda č. 2 Stacionární fáze
Kromasil C8 a Kromasil C18
Mobilní fáze
směs acetonitril : 0.02 M NH4OAc, pH = 8,0
Detekce
DAD při 241 nm
Průtok, typ eluce
1,0 ml/min, gradientová eluce
Zdroj
(20)
25
Metoda č. 3 Stacionární fáze
OD-5-100 C 18 kolona
Mobilní fáze Detekce
methanol : acetonitrile : 26 mM octan sodný (13:10:77), pH=2,0 UV při 240 nm
Průtok, typ eluce
0,3 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(13)
Metoda č. 4 Stacionární fáze
Symmetry C18
Mobilní fáze
Methanol a deionizovaná voda (75:25)
Detekce
UV při 245 nm
Průtok, typ eluce
0,8 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(21)
Metoda č. 5 Stacionární fáze
Nova-Pak C18
Mobilní fáze Detekce
Methanol : tetrahydrofuran : fosfátový pufr (65:5:30), pH = 2,6 DAD při 200 - 400 nm
Průtok, typ eluce
0,8 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(22)
Metoda č. 6 Stacionární fáze
RP-18
Mobilní fáze
Methanol : ammonium acetát pufr (70:30), pH = 5.0
Detekce
UV při 243 nm
Průtok, typ eluce
0,5 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(23)
Metoda č. 7 Stacionární fáze
C18 kolona
Mobilní fáze
Acetonitril : ammonium acetát pufr (60:40), pH = 8.0
Detekce
UV při 245 nm
26
Průtok, typ eluce
1,0 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(24)
Metoda č. 8 Stacionární fáze
C18 kolona
Mobilní fáze
Methanol : acetonitril (50:50)
Detekce
UV při 293 nm
Průtok, typ eluce
1,0 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(25)
Metoda č. 9 Stacionární fáze
Phenomenex Luna C18
Mobilní fáze Detekce
Fosfátový pufr : organická fáze (acetonitril : methanol – 44:56) 40:60 UV při 254 nm
Průtok, typ eluce
1,0 ml/min, izokratická eluce
Zdroj
(26)
Tab. 3 Podmínky chromatografické analýzy zolpidemu popsané v literatuře.
2.3 Stabilitní studie léčiv Stabilitní testy slouží k zajištění kvalitního, bezpečného a účinného léčivého přípravku a to po celou dobu jeho použitelnosti. Dále nám umožňují určit podmínky skladování a uchovávání, vhodný obalový materiál a dobu použitelnosti přípravku. U nově vyvíjených léčiv z těchto testů získáváme informace pro jejich další vývoj a specifikaci. Stabilitu ovlivňují jednak vnější faktory – teplo, vlhko, světlo i vnitřní faktory (složení lékové formy, vlastnosti pomocných látek a jejich interakce, přítomnost reziduí, technologické zpracování apod.) a tím dochází k chemickým, fyzikálním a mikrobiologickým změnám léčivých přípravků. Testy se provádí v tzv. klimatizačních boxech, ve kterých jsou umístěna teplotní a vlhkostní čidla, jejichž signály vyhodnocuje monitorovací zařízení. Výsledky stabilitních testů jsou součástí registrační dokumentace. Stabilním léčivým přípravkem označujeme ten, jehož obsah léčivé látky neklesne pod 95% obsahu vzhledem k jeho počáteční hodnotě, vyhovuje svými fyzikálními
27
vlastnostmi, vzhledem a funkčními zkouškami, a který nepřekračuje stanovený limit rozkladných produktů popř. příbuzných látek po celou dobu do jeho expirace. Podle podmínek testování je můžeme rozdělit na testy zátěžové, zrychlené, dlouhodobé, následné, po prvním otevření obalu a změnové stabilitní. Zrychlené testy se provádí při extrémních podmínkách skladování - tzn. 6 měsíců při teplotě 40°C a relativní vlhkosti 75% - pokud je při těchto podmínkách léčivo nestálé, provede se alternativní test, který trvá 1 rok za podmínek 30°C a relativní vlhkosti 65%. V určitých časových intervalech se provádí testy stability - vyhovují-li výsledky, je doba použitelnosti léčivého přípravku stanovena na 2 roky. Je však nutné provést ještě testy dlouhodobé, které se provádí za běžných podmínek skladování a v závislosti na třídě klimatického pásma. Česká republika patří do pásma prvního – tj. 25°C, relativní vlhkost 60% až po dobu pěti let (maximální doba použitelnosti léčivého přípravku). (18)
2.3.1 Zátěžové (stresové) testy Zátěžové zkoušky slouží jako předběžné stabilitní studie, při kterých se léčivo podrobuje extrémním chemickým a fyzikálním podmínkám – zvýšená teplota, kyselé/zásadité prostředí, oxidace a účinek světla za účelem simulace nestandardních podmínek výroby, skladování, transportu a působení vnějšího prostředí. Na základě výsledků testů se získají informace o stabilitě léčiva, informace pro vývoj metod a jejich validaci a určí se degradační produkty a chemismus rozkladné reakce. Dle úbytku koncentrace léčiva v čase lze pak určit řád reakce a vypočítat rychlostní konstanty pro dané teploty, ze kterých se pak spočítá t0,9 – což je doba, za kterou poklesne koncentrace účinné látky na 90% původní hodnoty koncentrace. Doba trvání stresových zkoušek je 1 až 3 měsíce. (18)
2.3.2 Kinetické výpočty rozkladných reakcí Výpočty kinetických charakteristik vycházejí z řádu reakce a z výpočtu rychlostní konstanty. Je tedy nutné určit nejdříve řád reakce – a to dosazením experimentálních dat (naměřené koncentrace léčiva c v různém čase t) do kinetických rovnic a hledat typ kinetické rovnice, při které je rychlostní konstanta neměnná. Obvykle pro rozkladné reakce platí kinetika 1. řádu, která se graficky vyjadřuje jako exponenciála a vyjadřuje ji rovnice:
28
log 𝑐 = log 𝑐0 −
𝑘∗𝑡 2,303
c0 – výchozí koncentrace [mol/l] c – aktuální koncentrace [mol/l] k – rychlostní konstanta [s-1] t – čas [s] Rychlostní konstanta se se vzrůstající teplotou zvyšuje, tudíž je nutné pro každou teplotu tuto konstantu spočítat. Ze získané rychlostní konstanty při dané teplotě pak lze spočítat t0,9 – dobu, kdy výchozí koncentrace účinné látky poklesne na 90% původní hodnoty koncentrace. Tato doba pro reakce 1. řádu nezávisí na původní koncentraci účinné látky. 𝑡0,9 =
0,1054 𝑘
t0,9 – doba poklesu výchozí koncentrace účinné látky na 90% původní hodnoty [s] k – rychlostní konstanta za dané teploty [s-1] Dále lze pomocí Arrhenionvy rovnice popsat vliv teploty na rychlost rozpadu účinné látky a tím tak odhadnout dobu použitelnosti léčivého přípravku. Z Arrheniovy rovnice se vypočítá hodnota aktivační energie E A, což je energie, kterou molekula musí získat, aby mohla proběhnout určitá reakce. Grafickým vyjádřením je přímka závislosti rychlostních konstant na teplotě, z čehož lze odvodit rychlostní konstantu rozkladné reakce i při nižších teplotách. log 𝑘 = log 𝐴 −
𝐸𝐴 2,303 ∗ 𝑅 ∗ 𝑇
k – rychlostní konstanta [s-1] A – frekvenční faktor [s-1] (pravděpodobnost s jakou dojde k účinné srážce reagujících molekul) EA – aktivační energie [J/mol]
29
R – univerzální plynová konstanta [J/mol*K] T – absolutní teplota [K] (18)
30
3. Cíl práce
31
Cílem této práce bylo nalézt optimální podmínky pro separaci hypnosedativa zolpidemu a jeho nečistoty A pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Následně byly nalezené podmínky využity pro pilotní studie stability zolpidemu při zátěžových testech ve stresových podmínkách prostředí - zvýšená teplota, kyselé prostředí, oxidativní prostředí a expozice dennímu světlu.
32
4. Praktická část
33
4.1 Chemikálie a pomůcky 4.1.1 Chemikálie
pracovní standard: zolpidem tartarát, č. šarže: 06070813-S (Farmak Olomouc)
nečistota
A
(N,N-dimethyl-2-[7-methyl-2-(4-methylphenyl)-imidazo[1,2-
a]pyridin-3-yl]acetamid), č. šarže: 06020906-S (Farmak Olomouc)
Placebo pro tablety Zolpinox, SVUS, Česká republika
methanol (MeOH), Chromasolv gradient grade for HPLC, Sigma Aldrich, Německo
acetonitril (ACN), Chromasolv gradient grade for HPLC, Sigma Aldrich, Německo
kyselina fosforečná 85%, Dr. Kulich Pharma Hradec Králové, Česká republika
ethanol, Penta, Česká republika
Triethylamin, Penta, Česká republika
hydroxid sodný, Penta, Česká republika
kyselina chlorovodíková, Penta, Česká republika
peroxid vodíku 3%, Fagron Olomouc, Česká republika
voda čištěná reverzní osmózou, Millipore
dihydrogenfosforečnan draselný, Penta, Česká republika
hydrogenfosforečnan sodný, Penta, Česká republika
4.1.2 Sestava pro HPLC Byly využívány dvě stejné sestavy o tomto složení:
kontrolní jednotka: CTO-20AC VP Shimadzu
čerpadlo: LC-20AD XR VP Shimadzu
34
degasér: DGU-20A3 VP Shimadzu
termostat kolony: CTO-20AS VP Shimadzu
PC program: Shimadzu LC Solution
UV-VIS detektor: SPD-20A VP Shimadzu
autosampler: SIL-20AC XR VP Shimadzu
řídící jednotka: CBM-20A VP Shimadzu
chromatografická kolona: Merck LiChroCart, 125 x 4 mm, zrnění 5µm, sorbent LiChrospher 100
4.1.3 Přístroje:
digitální váhy: Sartorius AG typ A200S, Německo
pH-metr: SCHOTT CG 843, Schott Instruments GmbH, Německo
magnetické míchadlo, IKA Color Squid, Německo
4.1.4 Pomůcky:
kádinky, odměrné baňky, odměrné válce, zkumavky, stojan na zkumavky, dělené pipety, balónek k pipetě, skleněná tyčinka, zábrusové lahve k uchovávání kapalin, vialky, laboratorní lžičky, lodičky, střička, mikropipety, membránový filtr 0,45 μm a 0,22 μm, alobal.
4.2 Obecné postupy 4.2.1 Příprava standardů: Na analytických vahách bylo naváženo 25 mg standardu zolpidemu a rozpušteno v 50 ml methanolu.
4.2.2 Příprava mobilní fáze: Použitá mobilní fáze byla složená ze dvou částí:
anorganická složka: fosforečnanový pufr
organická složka: methanol a acetonitril
35
Pufr byl připraven navážením 5,6 g kapalné kyseliny fosforečné do odměrné baňky a jejím rozpuštěním v 1,0 l čištěné vody na výslednou koncentraci 0,06 mol/l. Dále bylo upraveno pH na určitou hodnotu (pH 3,0; pH 4,0; pH 5,5 nebo pH 7,0) pomocí triethylaminu. Roztok s upraveným pH byl následně přefiltrován přes porcelánovou fritu a následně přes mikrofiltr s velikostí pórů 0,45 μm. Pufr byl smíchán s organickou částí – tj. methanolem a acetonitrilem v daném poměru. Byly připraveny tyto koncentrace kyseliny fosforečné: 0,03 mol/l, 0,06 mol/l, 0,1 mol/l, 0,12 mol/l. Použité poměry fosforečnanový pufr : methanol : acetonitril – 59:23:18; 59:20,5:20,5; 59:41:0; 62:19:19; 65:20:15; 70:17:13.
4.2.3 Výchozí nastavení chromatografických podmínek Všechna měření probíhala na koloně Merck LiChroCart, 125 x 4 mm, zrnění 5µm, sorbent LiChrospher 100 s tímto nastavením chromatografu:
Mobilní fáze: fosforečnanový pufr (0,03 mol/l, 0,06 mol/l, 0,1 mol/l, 0,12 mol/l; pH 3,0; 4,0; 5,5; 7,0) : methanol : acetonitril
Teplota: 25°C, 30°C, 40°C, 50°C
Průtok: 1 ml/min
Detekce: 254 nm, 293 nm
Nastřikovaný objem: 20 μl
4.2.4 Optimalizace podmínek separace Výchozí poměr složek mobilní fáze byl následující: 59 % pufru, 23 % methanolu a 18 % acetonitrilu. Následně docházelo ke změnám procentuálního zastoupení jednotlivých částí mobilní fáze – 50:50 (s vynecháním acetonitrilu), dále 70:17:13, 62:21:17, 65:20:15. Dále byly sledovány retenční časy v závislosti na změně molarity a pH pufru (0,03 mol/l; 0,06 mol/l; 0,067 mol/l; 0,1 mol/l; 0,12 mol/l; pH 3,0; 4,0; 5,5; 7,0). Hodnota pH byla upravována roztokem triethylaminu s výjimkou pufru o pH 7,0, který byl připraven dle ČL 2009 tlumivý roztok fosforečnanový o pH 7,0 (0,067 mol/l). Dalším parametrem, který byl pozorován, byla teplota. Testovala se separace analytů při teplotách 25°C, 30°C, 40°C a 50°C.
36
Na základě naměřených chromatogramů byla jako optimální zvolena metoda s těmito parametry: mobilní fáze s poměrem 65:20:15, fosforečnanový pufr o hodnotě pH 4,0 a molaritou 0,06 mol/l. Teplota kolony byla nastavena na teplotu 30°C.
4.2.5 Příprava standardu zolpidemu Vzorek pro analýzu byl získán naředěním standardu zolpidemu methanolem na koncentraci 0,1 mg/ml.
4.2.6 Příprava stresových zkoušek Stabilita zolpidemu byla testována působením kyseliny, zásady, oxidačního prostředí, denního světla a zvýšené teplotě. Jako kyselé prostředí byla zvolena kyselina chlorovodíková a to v koncentraci 0,1 M a 1,0 M, zásadou pak byl hydroxid sodný ve stejné koncentraci jako kyselina – tedy 0,1 M a 1,0 M a jako oxidační činidlo působil peroxid vodíku v koncentraci 3%. Tato tři činidla byla přidávána v objemu 5 ml k 5 mg zolpidemu. V prostředí kyseliny chlorovodíkové se zolpidem rozpustil, v peroxidu vodíku částečně a v hydroxidu sodném se nerozpustil. K úplnému rozpuštění všech vzorků došlo až při přípravě na analýzu – tj. neutralizací roztoku a doplněním methanolem na objem 25 ml v odměrné baňce (vzorek s peroxidem vodíku pouze doplněn methanolem na objem 25 ml.
Vzorek
Neutralizační činidlo
0,1 M kyselina chlorovodíková
1,0 M hydroxid sodný
1,0 M kyselina chlorovodíková
Koncentrovaný hydroxid sodný
0,1 M hydroxid sodný
1,0 M kyselina chlorovodíková
1,0 M hydroxid sodný
Koncentrovaná kyselina chlorovodíková
Další vzorek byl připraven navážením 5 mg zolpidemu, přidáním 5 ml čištěné vody a jeho vystavením na denním světle. Po dané době byl vzorek kvantitativně převeden do 25 ml odměrné baňky a doplněn po rysku methanolem. Vzorek na testování stability za zvýšené teploty byl připraven navážením 5 mg zolpidemu a jeho vystavením teplotě zpočátku 60°C a poté 90°C v laboratorní peci, dále byl vzorek opět kvantitativně
37
převeden do 25 ml odměrné baňky a doplněn methanolem. Zkoumán byl i vliv zvýšené teploty na vodný roztok zolpidemu, který se připravoval navážením 5 mg zolpidemu a přidáním 5 ml čištěné vody, před analýzou byl vzorek opět naředěn methanolem do 25 ml odměrné baňky. Pro stresové zkoušky pak byla vybrána metoda přípravy vzorku zolpidemu s vodou a jeho vystavení teplotě 40°C.
38
5. Výsledky a diskuze
39
5.1. Optimalizaze podmínek separace 5.1.1. Vliv koncentrace pufru Analýza zolpidemu, podmínky separace: 0,06 mol/l fosforečnanový pufr : methanol : acetonitril – 70:17:13, pH= 3,0; teplota: 25°C
0,12 mol/l
0,06 mol/l
Komentář: Se snižující se koncentrací fosforečnanového pufru se retenční čas zolpidemu prodlužoval. Při koncentraci pufru 0,03 mol/l byl standard eluován až kolem 70. minuty analýzy.
5.1.2. Vliv hodnoty pH Byly zkoušeny různé hodnoty pH fosforečnanového pufru o koncentraci 0,06 mol/l. Pro analýzu zolpidemu byla použita mobilní fáze: fosforečnanový pufr : methanol : acetonitril - 59:23:18, teplota na koloně: 25°C.
pH=4,0 pH=3,0
pH=5,5 50 pH=7,0 7,0
Komentář: S rostoucím pH docházelo ke zvýšení retenčního času a k zvětšení eluční zóny analytu.
40
5.1.3. Vliv zastoupení organické složky mobilní fáze Analýza zolpidemu, podmínky separace: 0,06 mol/l fosforečnanový pufr:methanol: acetonitril 65:20:15, pH= 4,0, teplota na koloně 30 °C
Komentář: Zároveň s optimalizací obsahu a složení organické části mobilní fáze byl také testován vliv koncentrace a pH fosforečnanového pufru. Bylo zkoušeno velké množství různých mobilních fází, zpočátku byly vybrány mobilní fáze z literatury (viz. Metoda č. 8, kap.č. 2.2.7) acetonitril:methanol (50:50) retenční čas zolpidemu byl však velmi krátký (přibližně kolem 2. minuty analýzy). Dále byly testovány mobilní fáze vycházející ze složení uvedeném v European Pharmacopoeia 8.0 – methanol:acetonitril:fosforečnanový pufr o pH 5,5 (23:18:59) – při tomto složení byl retenční čas zolpidemu pro naše účely příliš dlouhý, proto bylo potřeba pracovat na zkrácení doby analýzy. Se zvyšujícím se zastoupením organické složky byla retence na koloně dle předpokladu zkracována. Za účelem sledování rozkladných produktů zolpidemu byla upravována mobilní fáze tak, aby bylo možné pozorovat i rozkladné produkty před píkem standardu. Pro další testování stability zolpidemu byla zvolena mobilní fáze o složení: Anorganická složka: 0,06 mol/l fosforečnanový pufr o pH= 4,0 Organická složka: methanol, acetonitril Poměr složek mobilní fáze: fosforečnanový pufr:methanol:acetonitril (65:20:15)
41
5.1.4. Vliv teploty Analýza zolpidemu, podmínky separace: 0,06 mol/l fosforečnanový pufr:methanol: acetonitril 65:20:15, pH= 4,0
25°C 30°C 40°C 50°C Komentář: S roustoucí teplotou se retenční čas standardu zolpidemu zkracuje. Na základě optimální symetrie byla zvolena jako konečná podmínka pro separaci teplota 30°C. Symetrie píku při teplotě 30°C byla 0,945.
5.1.5 Nastavení vlnové délky Na začátku bylo měření prováděno dle poznatků z literatury při dvou vlnových délkách 254 a 293 nm. Pro další měření byla zvolena vlnová délka 254 nm, při které byla lepší odpověď detektoru ve srovnání s další testovanou vlnovou délkou 293 nm.
5.2. Standard, nečistota A Vybrané chromatografické podmínky byly aplikovány pro analýzu specifikované nečistoty A, aby bylo možné sledovat, jestli některý rozkladný produkt nemá shodný retenční čas. Následující chromatogram je analýza standardu zolpidemu a nečistoty A za podmínek: poměr složek mobilní fáze: 65:35, pH = 4,0, molarita fosforečnanového pufru: 0,06mol/l, organická fáze složená z methanolu a acetonitrilu (20:15), teplota na koloně 30°C.
42
standard zolpidemu
nečistota A
5.3. Stresové zkoušky Analýzy stresových zkoušek byly provedeny za těchto podmínek: fosforečnanový pufr 0,06 mol/l:methanol:acetonitril - 65:20:15, pH= 4,0; teplota: 30°C; detekce 254 nm. Pro stresové zkoušky zolpidemu bylo vybráno prostředí 1M NaOH, peroxid vodíku, zvýšená teplota (40°C ve vodě) a denní světlo. Prostředí 1M kyseliny chlorovodíkové pro hodnocení nebylo vybráno z důvodu malého množství detekovatelných rozkladných produktů – stejně tak i v prostředí 0,1M HCl a 0,1M NaOH.
5.3.1. 1,0 M NaOH Chromatogram zolpidemu v prostředí 1,0 M hydroxidu sodného.
zolpidem neč. 1 168 hod 48 hod 24 hod placebo 72 hod
43
Graf změny plochy píku nečistoty 1 v čase.
1M NaOH - nečistota 1 (3,890) 300000 250000
plocha
200000 150000 100000 50000 0 0
50
100 čas (hod)
150
200
Graf procentuálního úbytku zolpidemu v prostředí 1M NaOH v závislosti na čase.
1M NaOH - zolpidem (%) 120,00 100,00
%
80,00 60,00 40,00
20,00 0,00 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
čas (hod) Komentář: Byla pozorována jedna nečistota s retenčním časem okolo 4. minuty analýzy. Ostatní nečistoty byly pro limitem kvantifikovatelnosti.
44
5.3.2. Peroxid vodíku Chromatogram zolpidemu v prostředí 3% peroxidu vodíku.
zolpidem neč. 1
168 hod 48 hod 24 hod placebo 72 hod
Graf změny plochy píku nečistoty 1 v čase.
plocha
Peroxid - nečistota 1 (2,496) 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 0
50
100 čas (hod)
45
150
200
Graf procentuálního úbytku zolpidemu v prostředí 3% peroxidu vodíku v závislosti na čase.
Peroxid - zolpidem (%) 120,00 100,00
%
80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
čas (hod) Komentář: Byla pozorována jedna nečistota s elucí ve 2,5 minutě analýzy. Ostatní nečistoty byly pro limitem kvantifikace.
5.3.3. Denní světlo Chromatogram zolpidemu v prostředí denního světla. neč. 1 zolpidem neč. 2 neč. 3
168 hod 48 hod 24 hod placebo 72 hod
46
Graf změny plochy píku nečistot 1, 2 a 3 v čase.
Denní světlo - nečistoty 1, 2 a 3 100000
neč. 2 neč. 1
80000
plocha
60000 40000
neč. 3
20000 0 0
50
-20000
100
150
200
čas (hod)
Graf procentuálního úbytku zolpidemu v prostředí denního světla v závislosti na čase.
Denní Světlo - zolpidem (%) 120,00 100,00
%
80,00 60,00 40,00 20,00
0,00 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
čas (hod) Komentář: Byly pozorovány tři nečistoty nad limitem kvantifikovatelnosti s retečními časy 1,8 (nečistota 1), 5,2 (nečistota 2) a 6,7 (nečistota 3).
47
5.3.4. Teplota Chromatogram zolpidemu v prostředí zvýšené teploty.
zolpidem neč. 2
neč. 1
168 hod 48 hod 24 hod placebo 72 hod
Graf změny plochy píku nečistot 1 a 2 v čase.
Teplota - nečistota 1 a 2 7000 6000
neč. 2
plocha
5000 4000
neč. 1
3000 2000 1000 0 -1000 0
50
100 čas (hod)
48
150
200
Graf procentuálního úbytku zolpidemu v prostředí zvýšené teploty v závislosti na čase.
Teplota - zolpidem (%) 120,00 100,00
%
80,00 60,00 40,00
20,00 0,00 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
čas (hod) Komentář: Byly pozorovány dvě nečistoty nad limitem kvantifikovatelnosti s retečními časy 2,9 (nečistota 1) a 6,8 (nečistota 2).
49
6. Závěr
50
Teoretická část diplomové práce je zaměřena na charakterizaci zolpidemu, jeho farmakokinetiku a farmakodynamiku. Dále byla popsána analytická metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie z hlediska její instrumentace, metod analýzy a chromatografických systémů. Poslední část teoretické části se týká stabilitních studií léčiv – především stresovým zkouškám a kinetickým výpočtům rozkladných reakcí. V praktické části je zkoumán vliv jednotlivých podmínek analýzy na retenci zolpidemu. Na základě těchto údajů z chromatografické analýzy byla optimalizována metoda pro jeho stabilitní zkoušky. Byla použita mobilní fáze složená z fosforečnanového pufru (0,06 mol/l, pH 4,0), methanolu a acetonitrilu v poměru 65:20:15. Teplota na koloně byla 30°C a průtok mobilní fáze 1 ml/min. Detekce probíhala v UV oblasti při vlnové délce 254 nm. Následně byly prováděny stabilitní testy zolpidemu v zásaditém prostředí 1M hydroxidu sodného, při zvýšené teplotě, vystavení dennímu světlu a oxidativnímu působení peroxidu vodíku. Největší pokles zolpidemu v čase byl zaznamenán u vzorků vystavených dennímu světlu, úbytek zolpidemu byl v tomto případě 56%. V tomto prostředí také vznikalo nejvíce nečistot – nad limitem kvantifikovatelnosti byly pozorovány tři nečistoty s relativní retencí 0,16; 0,45 a 0,58.
51
7. Zdroje
52
(1) MOTYKA K., HLAVÁČ J. Stručný přehled separačních metod. 1. vydání. Univerzita Palackého v Olomouci, 2009. ISBN 978-80-244-2304-3 (2) KLOUDA, P. Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 1996. ISBN 80-902155-0-5. (3) NOVÁKOVÁ L., M. DOUŠA Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Hradec Králové: Lucie Nováková, 2013. ISBN 978-80-260-4243-3. (4) ŠVEC, F. Co dnes hýbe kapalinovou chromatografií?: Chemické listy [online]. 2008 [cit. 2015-09-18]. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2009_04_266270.pdf (5) CHURÁČEK J., JANDERA P. Úvod do vysokoúčinné kapalinové kolonové chromatografie. 1. vyd. SNTL, 1985. ISBN 04-607-85. (6)
HPLC:
Wikipedie [online].
2014
[cit.
2015-09-18].
Dostupné
z:
https://cs.wikipedia.org/wiki/HPLC#cite_note-2 (7) CHURÁČEK J., JANDERA P. Separace látek - Kapalinová vysokoúčinná kolonová chromatografie. Vyd. druhé, nezměněné, SNTL Praha, 1986. ISBN 05-033-86. (8) SOLICH P. Pokroky v HPLC. In: Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy v Praze: Studijní materiály Katedry analytické chemie, předmět Speciální metody instrumentální analýzy[online]. 2012 [cit. 2015-09-25]. Dostupné z: https://intranet.faf.cuni.cz/Studijnimaterialy/KACH/?path=farmacie%5cspeci%C3%A1ln%C3%AD+metody+instrument %C3%A1ln%C3%AD+anal%C3%BDzy%5cp%C5%99edn%C3%A1%C5%A1ky (9) HPLC: Vlastnosti LC detektorů [online]. 2014 [cit. 2015-09-18]. Dostupné z: http://www.hplc.cz/Teorie/table_detectors.html (10) PACÁKOVÁ V., ŠTULÍK K. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Státní pedagogické nakladatelství Praha, 1986. Univerzita Karlova v Praze. ISBN 17-207-86. (11) ŠTAUD F., Hypnosedativa/anxiolytika. In: Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy v Praze: Studijní materiály Katedry analytické chemie, předmět Speciální metody instrumentální analýzy[online]. 2013 [cit. 2015-09-25]. Dostupné z:
53
https://intranet.faf.cuni.cz/Studijnimaterialy/KFLT/?path=farmakologie+ii%5cfarmakologie+ii++dokumenty%5csp+farmacie_p%C5%99edn%C3%A1%C5%A1ky+farmakologie+ii_te xty (12) Český lékopis 2009: Doplněk 2011. 2011. vyd. Praha: Grada Publishing a.s., 2011. ISBN 978-80-247-3785-0.
(13) Obrázek převzat z: WANG Q, SUN L., LAU Ch. E. Determination of zolpidem in serum microsamples by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetics in rats. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications [online]. 1999,
299-305
[cit.
2016-03-23].
Dostupné
z:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037843479900376X (14) Výpis z databáze SPC přípravku Zolpinox 10 mg: potahované tablety. aktualizováno 20.10.2014. (15) REG-83 - Požadavky na stabilitní studie v registrační dokumentaci [online]. 2005 [cit.
Dostupné
2015-03-23].
z:
http://www.sukl.cz/leciva/reg-
83?highlightWords=PO%C5%BDADAVKY+STABILITN%C3%8D+STUDIE+REGI STRA%C4%8CN%C3%8D+DOKUMENTACI (16) VETCHÝ D. Stabilitní testy ve farmacii. Praktické lékárenství [online]. 2006 [cit. 2015-03-23].
Dostupné
z:
http://www.praktickelekarenstvi.cz/artkey/lek-200606-
0009.php (17) VETCHÝ D., FRÝBORTOVÁ K., RABIŠKOVÁ M., HÄRING A. Testování stability léčivých přípravků. Chemické listy [online]. 2006 [cit. 2015-03-23]. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2006_01_24-29.pdf (18) KLIMEŠ J. Kontrolně-analytické hodnocení léčiv. Stabilitní studie léčiv I. In: Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy v Praze: Studijní materiály Katedry farmaceutické chemie a kontroly léčiv, předmět Kontrola chemických léčiv [online]. 2015 [cit.
2015-10-25].
Dostupné
z:
https://intranet.faf.cuni.cz/Studijni-
materialy/KFCHKL/?path=kontrola+chemick%C3%BDch+l%C3%A9%C4%8Div+ii% 5cp%C5%99edn%C3%A1%C5%A1ky
54
(19) ZEANY El B. A., MOUSTAFA A. A., FARID N. F. Determination of zolpidem hemitartrate by quantitative HPTLC and LC. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [online]. 2003,
393-401
[cit.
2016-03-23].
Dostupné
z:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0731708503002437 (20) LAVIANA L., MANGAS C., FERNÁNDEZ-MARÍ F., BAYOD M.,
BLANCO D. Determination and in-process control of zolpidem synthesis by highperformance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [online]. 2004,
925-928
[cit.
2016-03-23].
Dostupné
z:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0731708504004066 (21) TRAPANI G., LOPEDOTA A., BOGHETICH G., LATROFA A., FRANCO M., SANNA E., LISO G. Encapsulation and release of the hypnotic agent zolpidem from
biodegradable
polymer
microparticles
containing
hydroxypropyl- -cyclodextrin. International Journal of Pharmaceutics [online]. 2003, 47-57
[cit.
Dostupné
2016-03-23].
z:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517303004745 (22) TRACQUI A., KINTZ P., MANGIN P. High-performance liquid chromatographic assay with diode-array detection for toxicological screening of zopiclone, zolpidem, suriclone and alpidem in human plasma. Journal of Chromatography 616 [online]. 1993, 95 - 103 [cit.
2016-03-24].
Dostupné
z:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037843479380476K (23) SARAVANAN V. S., REVATHI R. Comparative UV-spectroscopy and HPLC methods for content analysis of zolpidem tartrate in solid dosage forms. Turkish Journal of
Pharmaceutical Sciences [online]. 2014, 127-136 [cit. 2016-03-24]. Dostupné z: http://www-scopus-com.ezproxy.is.cuni.cz/record/display.uri?eid=2-s2.084904652378&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&st1=Comparative+UVspectroscopy+and+HPLC+methods+for+content+analysis+of+zolpidem+tartrate+in+so lid+dosage+forms&st2=&sid=9F27021F198D266AE6DE4A2E6172DD47.WeLimyRv BMk2ky9SFKc8Q%3a40&sot=b&sdt=b&sl=123&s=TITLE-ABSKEY%28Comparative+UV-
55
spectroscopy+and+HPLC+methods+for+content+analysis+of+zolpidem+tartrate+in+so lid+dosage+forms%29&relpos=0&citeCnt=0&searchTerm= (24) KONOZ E., SARRAFI MOHSEN A. H., ABDOLAHNEJAD R., BAHRAMIZONOZ M. Development and validation of a reversed-phase HPLC method for the estimation of zolpidem in bulk drug and tablets. Journal of Chemistry [online]. 2013 [cit. 2016-03-24].
Dostupné z: http://www-scopus-com.ezproxy.is.cuni.cz/record/display.uri?eid=2-s2.084869077065&origin=resultslist&sort=plff&src=s&st1=Development+and+Validation+of+a+ReversedPhase+HPLC+Method+for+the+Estimation+of+Zolpidem+in+Bulk+Drug+and+Tablets &st2=&sid=9F27021F198D266AE6DE4A2E6172DD47.WeLimyRvBMk2ky9SFKc8Q %3a180&sot=b&sdt=b&sl=129&s=TITLE-ABSKEY%28Development+and+Validation+of+a+ReversedPhase+HPLC+Method+for+the+Estimation+of+Zolpidem+in+Bulk+Drug+and+Tablets %29&relpos=0&citeCnt=0&searchTerm= (25) MAHAJAN M. P., SAWANT S. D. Stability indicating RP-HPLC method for the estimation of zolpidem tartrate in bulk and tablet dosage form. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences [online]. 2012, 268-274 [cit. 2016-03-24]. Dostupné z: http://www-scopus-com.ezproxy.is.cuni.cz/record/display.uri?eid=2-s2.084870732863&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&st1=Stability+indicating+RPHPLC+method+for+the+estimation+of+zolpidem+tartrate+in+bulk+and+tablet+dosage +form&st2=&sid=9F27021F198D266AE6DE4A2E6172DD47.WeLimyRvBMk2ky9S FKc8Q%3a370&sot=b&sdt=b&sl=121&s=TITLE-ABSKEY%28Stability+indicating+RPHPLC+method+for+the+estimation+of+zolpidem+tartrate+in+bulk+and+tablet+dosage +form%29&relpos=0&citeCnt=4&searchTerm= (26) NANTHAKUMAR R., CHITRA K., VINODHINI C., REDDY U. M. C. Development and validation of RP-HPLC method for the estimation of zolpidem tartrate in tablets. Indian Drugs [online]. 2010, 57-61 [cit. 2016-03-24]. Dostupné z: http://www-
scopus-com.ezproxy.is.cuni.cz/record/display.uri?eid=2-s2.079251592876&origin=resultslist&sort=plff&src=s&st1=Development+and+validation+of+RP-
56
HPLC+method+for+the+estimation+of+zolpidem+tartrate+in+tablets&st2=&sid=9F27 021F198D266AE6DE4A2E6172DD47.WeLimyRvBMk2ky9SFKc8Q%3a600&sot=b& sdt=b&sl=110&s=TITLE-ABS-KEY%28Development+and+validation+of+RPHPLC+method+for+the+estimation+of+zolpidem+tartrate+in+tablets%29&relpos=1&c iteCnt=0&searchTerm= (27)
Databáze
léků
[online]. 22.3.2016
[cit.
2016-03-26].
Dostupné
z:
http://www.sukl.cz/modules/medication/search.php (28) COUNCIL OF EUROPE. European pharmacopoeia. 8th ed. Strasbourg: Council Of Europe, 2013. ISBN 978-92-871-7525-0 (29) Equal Solvent Strengths. SanderKok.com [online]. 11.8.2007 [cit. 2016-03-26]. Dostupné z: http://www.sanderkok.com/techniques/hplc/eluotropic.html
57
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Farmaceutické chemie a kontroly léčiv Kandidát: Iva Kopecká Školitel: PharmDr. Pavla Pilařová, Ph.D. Název Diplomové práce: Hodnocení zolpidem-tartarátu pomocí HPLC V této diplomové práci byla optimalizována metoda pro separaci zolpidemu-tartarátu a jeho nečistoty A. Testoval se vliv složení mobilní fáze, molarity fosforečnanového pufru, jeho pH a teploty na koloně. Byly stanoveny optimální podmínky separace – methanol:acetonitril: 0,06 mol/l fosforečnanový pufr pH 4 (20:15:65), teplota na koloně 30°C, průtok mobilní fáze rychlostí 1ml/min a detekce v UV oblasti při vlnové délce 254 nm. Tato metoda byla následně použita pro hodnocení stabilitních zkoušek za těchto zátěžových podmínek – zásadité prostředí, zvýšená teplota, oxidativní prostředí a denní světlo. Byl sledován pokles koncentrace účinné látky zolpidemu tartrátu v daném prostředí v čase a zároveň případný vznik rozkladných produktů účinné látky.
58
Abstrakt Charles University in Praque, Faculty of Pharmacy in Hradci Králové Department: Pharmaceutical Chemistry and Drug Control Candidate: Iva Kopecká Tutor: PharmDr. Pavla Pilařová, Ph.D. Name of Degree Paper: Evaluation of zolpidem tartrate using HPLC
In the diploma thesis, there was optimazed the method of separation of zolpidem tartrate and its impurity A. There was tested the influence of the composition of the mobile phase, molarity of phosphate buffer, its pH and the temperature on the column. The optimal conditions of the separation were determined – methanol:acetonitril: 0,06 mol/l phosphate buffer pH 4 (20:15:65), the temperature on the column 30°C, the flow rate of the mobile phase was 1ml/min and the detection in the UV in the wavelength of 254 nm. Afterwards, the method was used for rating of stability tests in these load conditions – alkaline environment, increased temperature, oxidative environment and daylight. The decrease of the concentration of effective substance of zolpidem tartrate in the given environment and time was observed as well as the potential development of the destructive products of the effective substance.
59
