Faculteit Toegepaste Wetenschappen Vakgroep Toegepaste Wiskunde en Informatica Voorzitter: Prof. dr. ir. G. Vanden Berghe Vakgroep Moleculaire Genetica Voorzitter: Prof. dr. Anna Depicker
BiNGO: een Cytoscape-plugin voor functionele annotatie van genclusters
door Karel Heymans
Promotor: Prof. dr. V. Fack Scriptiebegeleider: Dhr. Steven Maere
Afstudeerwerk ingediend tot het behalen van de graad van licentiaat in de informatica, optie: toepassingsgerichte informatica Academiejaar 2003–2004
Toelating tot bruikleen De auteur geeft de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van het afstudeerwerk te kopi¨eren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.
Karel Heymans
25 mei 2004
i
Dankwoord Graag zou ik iedereen willen bedanken die heeft bijgedragen tot de verwezenlijking van dit eindwerk, in het bijzonder dank ik: • mijn promotor, Prof. dr. V. Fack, die mij de kans heeft aangereikt deze scriptie aan te vatten; • mijn scriptiebegeleider, dhr. Steven Maere, die met veel enthousiasme en zo mogelijk met nog meer vakkennis mijn werken richting heeft gegeven; • mijn vriendin, Mieke Jacob, voor het vinden van een coole en catchy naam voor mijn Cytoscape-plugin, met name: BiNGO; • mijn ouders voor de steun tijdens mijn studies; • mijn zus, Reinhilde, voor het nalezen op dt-fouten.
ii
BiNGO: een Cytoscape-plugin voor functionele annotatie van genclusters door Karel Heymans Afstudeerwerk ingediend tot het behalen van de graad van licentiaat in de informatica, optie: toepassingsgerichte informatica Academiejaar 2003–2004 Universiteit Gent Faculteit Toegepaste Wetenschappen
Promotor: Prof. dr. V. Fack
Samenvatting
Het doel van deze scriptie is het schrijven van een programma met als functionaliteit het berekenen en visueel voorstellen van overrepresentatie van functionele klassen in een cluster genen die de gebruiker selecteert in een graaf. BiNGO (Biological Network Gene Ontology), de software die in het kader van deze scriptie werd ontwikkeld, is opgevat als een plugin voor Cytoscape, een bestaand pakket voor visualisatie van biologische netwerken. Zowel plugin als moederprogramma zijn in Java geprogrammeerd. Voor de berekeningen wordt er gebruik gemaakt van statistische testen (hypergeometrische test, binomiale test) en ook van multiple testing correcties (Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate, Bonferroni correctie van de Family-Wise Error Rate). Bij de visualisatie van de netwerken in Cytoscape wordt er gebruik gemaakt van het grafische pakket GINY (Graph INterface librarY). De plugin maakt hier ook gebruik van. Trefwoorden: Cytoscape, Java, overrepresentatie, visualisatie, statistiek.
iii
Inhoudsopgave 1 Inleiding 1.1
1
Het biologische luik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.1.1
Het centrale dogma
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.1.2
Biologische achtergrond . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Gene Ontology (GO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2.1
Wat is een ontologie?
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2.2
De verschillende ontologie¨en in GO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2.3
Hoe zien ontologie¨en eruit? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.2.4
Wat is een annotatie? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.3
Waarom is deze scriptie belangrijk? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.4
Korte beschrijving van de BiNGO-functionaliteit . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.5
Vergelijking met andere GO-tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.5.1
Introductie GO-tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.5.2
Vergelijking GO-tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
1.2
2 Introductie Cytoscape
13
2.1
Wat is Cytoscape? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
2.2
Hoe is Cytoscape ontstaan? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
2.3
De Cytoscape “Core”-functionaliteit en -architectuur . . . . . . . . . . . . . . . .
14
2.3.1
Data-integratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
2.3.2
Annotatietransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.3.3
Graaf lay-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.3.4
Attribuut-Naar-Visueel mapping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.3.5
Graafselectie en -filteren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2.3.6
Plugin-interface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2.4
Graph INterface librarY (GINY) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2.5
De Cytoscape “Core”-Objecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
2.5.1
CyNetwork . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
2.5.2
CyWindow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
iv
2.5.3
CytoscapeObj . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Statistische analyse
19 21
3.1
Algemene principes toetsen van hypothesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
3.2
Bespreking van de verschillende ge¨ımplementeerde testen . . . . . . . . . . . . . .
23
3.2.1
Hypergeometrische test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.2.2
Binomiale test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.2.3
χ2 -test
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
Bespreking van de verschillende correcties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
3.3.1
Bonferroni controle van de Family-Wise Error Rate . . . . . . . . . . . . .
27
3.3.2
Benjamini & Hochberg controle van de False Discovery Rate . . . . . . .
27
3.3
4 Implementatie van BiNGO 4.1
4.2
4.3
4.4
29
Plugin-architectuur in Cytoscape . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
4.1.1
Overzicht van het maken van een Cytoscape-plugin . . . . . . . . . . . . .
29
4.1.2
Stap 1: Extend AbstractPlugIn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
4.1.3
Stap 2: Cre¨eer een Jar-file . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
4.1.4
Stap 3: Obfusceren van de plugin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
4.1.5
Concrete implementatie van de plugin-architectuur in BiNGO: BiNGOplugin.java . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
SettingsPanel: de gebruikersinstellingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
4.2.1
SettingsOpenPanel, SettingsSavePanel: het kiezen van de bestanden
32
4.2.2
HelpMenuBar: het help-menu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
4.2.3
SettingsPanelActionListener: de luisteraar . . . . . . . . . . . . . . .
33
Implementatie van de testen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
4.3.1
DistributionCount: het tellen van de genen . . . . . . . . . . . . . . . .
35
4.3.2
Implementatie van de hypergeometrische test . . . . . . . . . . . . . . . .
36
4.3.3
Implementatie van de binomiale test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
Implementatie van de correcties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
4.4.1
Implementatie van de Bonferroni correctie van de Family-wise Error Rate
38
4.4.2
Implementatie van de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
4.5
DisplayBiNGOWindow: de visualisatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
4.6
CreateBiNGOFile: het gegevensbestand over de overrepresentatie . . . . . . . . .
41
5 Handleiding BiNGO
43
5.1
Het BiNGO-venster met zijn opties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
5.2
Richtlijnen voor de combinatie statistische testen en correcties
45
v
. . . . . . . . . .
5.3
Het aantal categorie¨en . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
5.4
Testen tegenover genoom of graaf? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
5.5
Het ontologiebestand en het annotatiebestand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
5.6
Het SIF-bestand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
5.7
Het databestand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
5.8
De visualisatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
6 Clusteronderzoek met BiNGO
52
6.1
Inleiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
6.2
Bespreking van de geselecteerde cluster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
6.3
Screenshots van het onderzoek van de cluster met BiNGO . . . . . . . . . . . . .
54
6.3.1
Screenshots van het testen tegenover het genoom . . . . . . . . . . . . . .
54
6.3.2
Screenshots van het testen tegenover de graaf . . . . . . . . . . . . . . . .
55
Bespreking van het onderzoek van de geselecteerde cluster . . . . . . . . . . . . .
55
6.4
7 Besluit
70
7.1
Conclusies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
7.2
Distributie via website en cd-rom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
7.3
BiNGO in de toekomst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
vi
Lijst van figuren 1.1
Voorbeeld van een microarray-compendium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2.1
Grafische voorstelling van de Cytoscape “Core” . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
5.1
Het BiNGO-venster met zijn opties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
6.1
Screenshot: De graaf met test-data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
6.2
Screenshot: De graaf met test-data met geselecteerde cluster
. . . . . . . . . . .
53
6.3
Screenshot: De te onderzoeken cluster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
6.4
Screenshot: Hypergeometrische test tegenover het hele genoom . . . . . . . . . .
58
6.5
Screenshot: Hypergeometrische test, Benjamini & Hochberg, genoom . . . . . . .
59
6.6
Screenshot: Hypergeometrische test, Bonferroni, genoom . . . . . . . . . . . . . .
60
6.7
Screenshot: Binomiale test tegenover het hele genoom . . . . . . . . . . . . . . .
61
6.8
Screenshot: Binomiale test, Benjamini & Hochberg, genoom . . . . . . . . . . . .
62
6.9
Screenshot: Binomiale test, Bonferroni, genoom . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
6.10 Screenshot: Hypergeometrische test tegenover de genen in de graaf . . . . . . . .
64
6.11 Screenshot: Hypergeometrische test, Benjamini & Hochberg, graaf . . . . . . . .
65
6.12 Screenshot: Hypergeometrische test, Bonferroni, graaf . . . . . . . . . . . . . . .
66
6.13 Screenshot: Binomiale test tegenover de genen in de graaf . . . . . . . . . . . . .
67
6.14 Screenshot: Binomiale test, Benjamini & Hochberg, graaf . . . . . . . . . . . . .
68
6.15 Screenshot: Binomiale test, Bonferroni, graaf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
vii
Lijst van tabellen 1.1
Vergelijking GO-Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
3.1
Beslissingsmogelijkheden bij nulhypothesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
3.2
Dataorganisatie voor χ2 -test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
4.1
Vergelijking uitvoeringstijden hypergeometrische distributie. . . . . . . . . . . . .
37
5.1
Corpus van het databestand in BiNGO
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
6.1
Tabel met de genen en hun functies uit de geselecteerde cluster . . . . . . . . . .
57
viii
Hoofdstuk 1
Inleiding BiNGO staat voor Biological Network Gene Ontology en voldoet aan de ongeschreven wet dat tools van zijn soort de twee letters ’GO’ in hun naam dragen (cf. FatiGO, GOTM, GOSurfer, GoMiner, ... voor een beschrijving van deze tools zie sectie 1.5.1 op pagina 9). BiNGO is opgevat als een plugin voor Cytoscape, een bestaand pakket voor visualisatie van biologische netwerken dat een goede plugin-architectuur bevat. Cytoscape is een programma waar elke dag nog aan gewerkt wordt. Het is een programma dat elke dag evolueert, er elke dag nieuwe concepten bijkrijgt. Gedurende dit academiejaar is Cytoscape ook ge¨evolueerd. Zo is bijvoorbeeld besloten over te stappen van het grafische pakket Y-files naar het grafische pakket GINY. Ook conceptuele veranderingen in de architectuur hebben zich dit jaar voorgedaan in Cytoscape. Als voorbeeld hiervan kan men zeggen dat men de grote klasse CytoscapeWindow opgesplitst heeft in verschillende kleinere klassen (zoals onder andere CyWindow, CyNetwork, ...). BiNGO is compatibel gemaakt met elke versie die dit jaar uitgekomen is en is compatibel met Cytoscape 2.0, ALPHA1. Op 11 mei echter is de versie Cytoscape 2.0, ALPHA2 ter beschikking gesteld op een apart gedeelte van de site1 , een deel speciaal voor de ontwikkelaars van Cytoscape en voor de programmeurs van plugins voor het moederprogramma, waar trouwens ook de versie Cytoscape 2.0, ALPHA1 gepubliceerd is. De nieuwe versie bevat echter te veel veranderingen in klassen die essentieel zijn voor de plugin zoals die er nu uitziet om deze nog compatibel te krijgen v´o´or het inleveren van de scriptie. De veranderingen situeren zich vooral rond de klasse CyNetwork besproken in sectie 2.5.1 op pagina 18. In een latere versie van BiNGO zal de plugin wel bruikbaar zijn met de recentste versie, maar momenteel is er wegens de naderende deadline enkel compatibiliteit met de vorige ALPHA versie. De BiNGO-plugin en de versie Cytoscape 2.0, ALPHA1 staan ter beschikking op de site2 . 1 2
http://www.cytoscape.org/alpha.html http://www.psb.ugent.be/cbd/BiNGO/BiNGO.html
1
De taak van de plugin bestaat uit het berekenen en visueel voorstellen van overrepresentatie van functionele klassen van genen. Het berekenen gebeurt aan de hand van statistische tests en multiple testing correcties. Het visueel voorstellen gebeurt aan de hand van het grafisch pakket dat reeds gebruikt wordt door Cytoscape. In het eerste hoofdstuk wordt de biologische kant van de zaak belicht en wordt er ook een korte beschrijving gegeven van de functionaliteiten van BiNGO. Tevens wordt BiNGO daar vergeleken met andere GO-tools die ook overrepresentatie van functionele klassen van genen nagaan. Het tweede hoofdstuk behandelt het moederprogramma van de plugin: Cytoscape. Het geeft aan hoe het programma ontstaan is, wat de belangrijkste functionaliteiten zijn en hoe het geconcipieerd is. Hoofdstuk drie vertelt ons de theoretische opbouw van de statistische analyse van de data. Hierin wordt speciaal aandacht geschonken aan de ge¨ımplementeerde statistische tests en multiple testing correcties. In hoofdstuk vier wordt de implementatie van de plugin behandeld. Elke klasse wordt er uitvoerig besproken. Het vijfde hoofdstuk bevat de handleiding voor BiNGO en het zesde hoofdstuk bevat het onderwerpen van BiNGO aan een testcluster van genen geselecteerd in een netwerk. De conclusies, distributie en toekomstperspectieven in verband met BiNGO worden besproken in het zevende en laatste hoofdstuk.
1.1 1.1.1
Het biologische luik Het centrale dogma
Alle informatie voor de bouw en functie van een cel en zijn componenten zit vervat in het DNA, onder de vorm van genen. Die worden eerst, onder de invloed van eiwitten die bekend staan als transcriptiefactoren, overgeschreven (getranscribeerd) naar mRNA. Dit mRNA wordt uiteindelijk vertaald in eiwitten, de functionele eenheden (werkpaarden) van de cel. Elke stap van DNA naar eiwit wordt be¨ınvloed door regulatorische processen die de intermediaire componenten bewerken, knippen, modificeren of degraderen. Ook de functionaliteit van de eindproducten, de eiwitten, wordt continu gestuurd door regulatorische processen.
1.1.2
Biologische achtergrond
E´en van de belangrijkste doelstellingen van de moleculaire biologie vandaag is het ontrafelen en in kaart brengen van de complexe interacties tussen DNA, RNA en eiwitten die de functionaliteit van een organisme bepalen. De laatste jaren is onder impuls van technologische ontwikkelingen enerzijds en de beschikbaarheid van volledig gesequeneerde genomen anderzijds een drastische verschuiving in aanpak opgetreden. Daar waar genen, eiwitten en hun interacties vroeger als onafhankelijke entiteiten werden bestudeerd, treedt nu meer en meer een globale benadering op de voorgrond: systeembiologie. De grootschalige experimenten die daarmee gepaard gaan,
2
zoals expressie-profiling met microarrays (zie figuur 1.1 op pagina 3), genereren een enorme hoeveelheid data die met de huidige methodes niet adequaat kan geanalyseerd worden. Vaak gaat het om datasets met honderden datapunten voor duizenden genen, een complexiteit die een nieuwe dimensie geeft aan data-analyse. Om het onderliggende netwerk van interacties op te stellen, te visualiseren en te analyseren is de ontwikkeling van nieuwe concepten en technologie vereist. Het uiteindelijke doel van systeembiologie is om op basis van het netwerk van interacties tussen cellulaire componenten de functie van elke component en de respons op een verstoring van die component te achterhalen.
Figuur 1.1: Voorbeeld van een microarray-compendium [Hea00]. Dit is een hi¨erarchisch geclusterde weergave van de respons van de ongeveer 6000 genen in gist (horizontaal) op 300 perurbatie-experimenten (verticaal). De kleur geeft weer in welke mate een bepaald gen tot expressie komt (men meet mRNA niveau’s) in een bepaald experiment in vergelijking met de controleconditie. Rood is overge¨expresseerd, groen is onderge¨expresseerd.
Systeembiologie is een jong en sterk interdisciplinair onderzoeksveld. Niet alleen de moleculaire biologie speelt in dit veld een belangrijke rol, maar ook wiskunde, statistiek, fysica en informatica. Een van de kernvragen is hoe men verschillende types van informatie kan samenbrengen en analyseren als een overzichtelijk geheel. Grafen blijken uiterst nuttig te zijn om fundamenteel verschillende types van informatie in eenzelfde formaat bij elkaar te brengen. Eiwit-interactiedata, signaaltransductiecascades, transcriptiefactornetwerken en metabolische pathways hebben een
3
vanzelfsprekende grafische voorstelling. Ook transcriptoomdata kunnen grafisch vertaald worden. De uitdaging is nu om deze verschillende netwerken verder te integreren en te annoteren. De technologie daarvoor moet nog grotendeels ontwikkeld worden, hoewel veel basistechnieken kunnen ontleend worden aan de discrete wiskunde, meer bepaald de logica, grafentheorie en combinatorische statistiek. Het is belangrijk om alle beschikbare informatie over de genen in het netwerk te verwerken. Ongetwijfeld de belangrijkste bron van informatie bij het analyseren en annoteren van genoomwijde datasets is het uitgebreide corpus van functionele informatie dat in de laatste 30 jaar werd verzameld. De laatste jaren werden een aantal initiatieven ontwikkeld om die informatie samen te brengen en gestructureerd aan te bieden onder de vorm van een gecontroleerd vocabularium. Een van de belangrijkste initiatieven daaromtrent is Gene Ontology (GO). GO is een hi¨erarchische structuur van termen in drie grote onderverdelingen: biologisch proces, moleculaire functie en cellulair compartiment. Elk gen wordt op basis van literatuurinformatie geannoteerd op een of meerdere nodes van elke klasse. In sectie 1.2 op pagina 4 wordt Gene Ontology besproken.
1.2
Gene Ontology (GO)
Het Gene Ontology (GO) project is ontstaan om aan de nood van een consistente omschrijving van genproducten in verschillende databanken te voldoen. Een genproduct is een RNA- of prote¨ıneproduct dat door een gen ge¨encodeerd is. De GO-medewerkers hebben drie structuren, drie ontologie¨en ontwikkeld die genproducten omschrijven inzake hun biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functies. Deze zijn ontwikkeld op een species-onafhankelijke manier. [ABB+ 01] [ABB+ 00]
1.2.1
Wat is een ontologie?
Ontologie betekent de kunst (of de wetenschap) om alles een juiste naam te geven. Ontologie¨en zijn specificaties van een relationeel vocabularium. Met andere woorden het zijn sets van gedefinieerde termen zoals men die in een woordenboek zou vinden, maar met die aanpassing dat de termen in een netwerk zitten. De termen in een gegeven ontologie zijn beperkt tot diegene die in een bepaald gebied gebruikt worden. In het geval van GO zijn de termen allemaal biologisch.
1.2.2
De verschillende ontologie¨ en in GO
GO is georganiseerd in drie structuren: molecular function, biological process en cellular component. Een genproduct heeft ´e´en of meerdere moleculaire functies en wordt gebruikt in ´e´en of meerdere biologische processen. Het kan tevens geassocieerd zijn met ´e´en of meerdere cellulaire
4
componenten. Zo kan bijvoorbeeld cytochrome c beschreven worden door de moleculaire functie electron transporter activity, door de biologische processen oxidative mitochondrial matrix en induction of cell death en door de cellulaire componenten mitochondrial matrix en mitochondrial inner membrane. Moleculaire functie Moleculaire functies beschrijven activiteiten, zoals catalysatorische of bindende activiteiten, op het moleculaire niveau. De termen in de GO-moleculaire functies stellen eerder deze activiteiten voor dan de entiteiten die deze acties uitvoeren. Ze specificeren niet waar of wanneer of in welke context de acties plaatsvinden. Algemeen beschouwd corresponderen moleculaire functies met activiteiten die door een individueel genproduct kunnen uitgevoerd worden, maar sommige activiteiten worden uitgevoerd door een verzameling van genproducten (complexes of gene product groups genaamd). Voorbeelden van veel voorkomende functionele termen zijn catalytic activity, transporter activity en binding, voorbeelden van minder voorkomende functionele termen zijn adenylate cyclase activity en Toll receptor binding. Biologisch proces Een biologisch proces wordt bereikt door ´e´en of meerdere geordende moleculaire functies. Voorbeelden van veel voorkomende biologische processen zijn celgroei en maintenance or signal transduction. Voorbeelden van meer specifieke termen zijn pyrimidine metabolism en alpha-glucoside transport. Het kan moeilijk zijn om onderscheid te maken tussen moleculaire functies en biologische processen maar de algemene regel is dat een proces meer dan ´e´en afzonderlijke stap bezit. Cellulaire component Een cellulaire component is wat de benaming al aangeeft, namelijk een deel van een cel maar met de eigenschap dat het deel uitmaakt van een groter object. Dat groter object kan een anatomische structuur (bijvoorbeeld rough endoplasmic reticulum of nucleus) of een genproductverzameling (bijvoorbeeld ribosoom, proteasome of een protein dimer ) zijn.
1.2.3
Hoe zien ontologie¨ en eruit?
GO-termen zijn georganiseerd in een structuur die men een gerichte acyclische graaf noemt (Directed Acyclic Graph (DAG)). Deze structuur verschilt van een hi¨erarchie (of boomstructuur) in het feit dat een kind (meer bepaald een term) meerdere ouders kan hebben. Elke GO-term moet ook beantwoorden aan de zogenaamde ”true path”-regel. Deze regel zegt dat als een kindterm het genproduct beschrijft, al de ouders ervan ook van toepassing moeten zijn voor dat
5
genproduct.
1.2.4
Wat is een annotatie?
GO op zich is enkel een systeem om genen en prote¨ınen te annoteren, het zorgt niet voor het relateren van databankelementen (genen) aan een annotatiewaarde. Hier komen de annotatiebestanden in het spel, deze zorgen voor additionele informatie bij de GO-bestanden. De termen van de Gene Ontology worden gebruikt in de annotatie van genproducten in biologische databanken. GO-annotaties zijn associaties die gemaakt worden tussen genproducten en de GO-termen die deze beschrijven. Elk gen wordt op ´e´en of meerdere GO-termen geannoteerd.
1.3
Waarom is deze scriptie belangrijk?
Het aantal genen in sets van genen kan zeer groot zijn en de functionele data die met elk gen kunnen geassocieerd worden zijn nogal complex. Het zoeken naar patronen en het evalueren van de functionele significantie van deze patronen voor grote groepen van genen is een grote uitdaging voor biologen en is ook uiterst tijdrovend. Om dit te kunnen verwezenlijken in een kortere tijdspanne zijn er biologische tools nodig, software die de onderzoeker helpt bij het functioneel profileren van deze grote genen-sets. [ZSKS04] Binnen deze scriptie werd een tool ontwikkeld om het GO-initiatief ten volle te benutten bij het functioneel annoteren van grafen en het opstellen van genetische netwerken. Traditioneel wordt de graaf eerst geclusterd in geconnecteerde componenten. Op de methodes die hiervoor ontwikkeld werden wordt verder niet ingegaan. Verdere functionele annotatie van de data gebeurt dan door voor elke cluster na te gaan welke functionele klassen (vb. GO-categorie¨en) statistisch oververtegenwoordigd zijn. Van bijzonder belang bij GO-overrepresentatie analyse is de statistiek en de voorstelling van de resultaten. Meestal worden enkel categorie¨en op een bepaald intermediair niveau in de GOhi¨erarchie getest, waardoor het aantal tests (en de bijhorende correctie) beperkt blijft. Tegelijk wordt echter de rijke hi¨erarchische structuur afgevlakt en gaat de samenhang tussen de functionele klassen verloren. Binnen dit project werd de methodologie ontwikkeld om genen of clusters functioneel te annoteren op alle niveaus in de GO-structuur, en vervolgens de annotaties voor verschillende genen of clusters te vergelijken. Wanneer categorie¨en op alle niveaus in de Gene Ontology getest worden is het van belang om de p-waarden in de juiste context te bekijken. Dat kan door de resultaten als subgraaf op de hi¨erarchische structuur te mappen. Omdat per cluster meerdere tests worden uitgevoerd (soms enkele honderden) moet ook bijzondere aandacht besteed aan het multiple testing probleem. Omdat traditionele correcties zoals de Bonferroni correctie van de Family-Wise Error Rate meestal te conservatief zijn, wor-
6
den veelal minder strenge correcties gebruikt. Voor de bioloog wegen een aantal vals positief ge¨ıdentificeerde categorie¨en immers niet op tegen de mogelijkheid een hypothetische functie voor een onbekend gen te identificeren. Dit maakt het des te meer noodzakelijk om te voorzien in statistische testen die tegelijk gevoelig en toch verantwoord zijn. Een ander punt is de nood om de gebruiker te voorzien van ergonomische tools. Commandline gestuurde tools zijn meestal onbruikbaar voor de doorsnee-bioloog. Enkel vlot bruikbare tools met een intu¨ıtieve interface kennen een wijd verspreid gebruik onder biologen. Bovendien worden zowel Windows, Mac als Unix algemeen gebruikt in de moleculaire biologie. Een programmeur moet dan ook veel oog hebben voor software-ontwikkeling, compatibiliteit en gebruiksvriendelijkheid. Deze plugin zorgt er dus voor dat de onderzoeker op een handige manier een hele set van genen kan verwerken en dan uit de grafische voorstelling van het resultaat een juiste conclusie kan trekken met betrekking tot het al dan niet overgerepresenteerd zijn van de verschillende functionele klassen. Met ander woorden de gebruiker zal te weten komen tot welke functionele klasse(n) de geselecteerde genen het meeste kans maken te behoren. Zoals men in de sectie “Vergelijking met andere GO-tools” zal merken, zijn er al verscheidene tools ontwikkeld die deze functionaliteiten voorzien. Maar eigen aan de in dit document voorgestelde tool is dat het ingebouwd is in een heus netwerk-tool (met name Cytoscape, zie het hoofdstuk over Cytoscape), zodat de gebruiker een cluster genen kan selecteren in een graaf en nog vele andere hulpmiddelen kan gebruiken die in deze netwerk-tool aangereikt worden, dit allemaal in combinatie met de plugin. Ook de visualisatie op het einde van het proces is uniek dankzij de mogelijkheid om de structuur te bekijken aan de hand van een boom, die men dan kan bewaren, editeren, ...
1.4
Korte beschrijving van de BiNGO-functionaliteit
De eerste stap om overrepresentatie van functionele categorie¨en na te gaan is natuurlijk het selecteren van de cluster genen waarin men ge¨ınteresseerd is. In Cytoscape kan dit zoals je in Windows Verkenner bijvoorbeeld een aantal mappen selecteert om te kopi¨eren. De knopen van de graaf die men te zien krijgt in het Cytoscape-venster kunnen genen of eiwitten zijn; beide worden met dezelfde canonische (dus unieke) naam geadresseerd. De bogen in de graaf kunnen eiwit-eiwit-interacties, DNA-eiwit-interacties of andere correlaties zijn. Van de geselecteerde knopen kunnen we de canonische naam opvragen. Via hun annotatie is het mogelijk aan de hand van deze naam de functionele annotaties van deze knopen op te vragen. De volgende stap in ons overrepresentatieproces is het uitvoeren van een statistische test op de genen. De distributie (bijvoorbeeld de hypergeometrische distributie) berekent in welke mate de
7
geselecteerde genen tot een bepaalde GO-categorie behoren, de distributie wordt gebruikt om te bepalen of een bepaalde categorie significant overgerepresenteerd is in de geselecteerde cluster. De waarde die men bekomt is dus een probabilistische waarde en wordt meestal de “p-value” genoemd. Men kan deze statistische test uitvoeren tegenover het hele genoom of tegenover de graaf van waaruit de cluster genen geselecteerd is. Vervolgens kan men optioneel nog een multiple testing correctie (bv. de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate) toepassen op deze distributie. Gezien een groot aantal GO-categorie¨en getest worden, is dit noodzakelijk. De waarden die na correctie bekomen worden, krijgen meestal de naam “adjusted p-values” of dus gecorrigeerde p-waarden. De volgende fase behelst het vergelijken van de verkregen waarden (al dan niet gecorrigeerd) met een door de gebruiker vooropgestelde significantiegrens α. Wanneer deze drempelwaarde niet overschreden wordt, dan is de categorie in kwestie significant overgerepresenteerd in deze cluster. Gangbare waarden voor α zijn vooral 0.05 of 0.01 maar waarden die veel kleiner zijn, zijn niet uitzonderlijk en verhogen natuurlijk de significantie. De bekomen resultaten kunnen vervolgens visueel voorgesteld worden. Eerst en vooral moet een deelboom van de ontologieboom opgebouwd worden. Dit gebeurt door de categorie¨en waarvoor een p-value berekend is naar boven te laten propageren tot aan de wortel van de ontologieboom. Alle gevonden knopen en bogen worden opgenomen in de deelboom. Men kan er echter voor opteren om enkel deze knopen die overgerepresenteerd zijn voor of na correcties naar boven te laten propageren . Wanneer een categorie overgerepresenteerd is, kan men die knoop een ander kleurtje geven (bijvoorbeeld rood) zodat het goed opvallend is voor de gebruiker. Ook kan men de grootte van de knopen laten vari¨eren naargelang het aantal genen dat tot deze categorie behoort. Tevens is er de optie voorzien om een gegevensbestand aan te maken met daarin alle belangrijke informatie in verband met het gedane onderzoek. Om deze tool voor overrepresentatie te integreren in Cytoscape wordt er gebruik gemaakt van de handige plugin-architectuur (in sectie 4.1 op pagina 29 wordt dit in detail besproken). Eens de plugin geladen is via enkele klikken in het menu, vindt men BiNGO in de menubalk onder het menu-item “Plugins” en de berekeningen en visualisatie van de overrepresentatie van een cluster genen kan beginnen.
1.5
Vergelijking met andere GO-tools
In de wereld van de bio-informatica zijn er natuurlijk nog mensen die op het idee gekomen zijn om een soortgelijke tool te ontwikkelen. Meestal gaat dit echter over een stand-alone tool of eentje met een web-interface. Een Cytoscape-plugin bestond nog niet. In deze sectie worden
8
eerst de verschillende tools voorgesteld en vervolgens worden deze onderling vergeleken en ze worden ook vergeleken met BiNGO.
1.5.1
Introductie GO-tools
FatiGO FatiGO3 is een web-based tool van de bio-informatica groep op CNIO (Spanje) die aan een gegeven set van genen representatieve functionele informatie (onder- of overgerepresenteerde Gene Ontology termen) toewijst. De statistische significantie wordt bereikt door gebruik te maken van multiple-testing correctie. FatiGO is ontworpen voor functionele annotatie van DNA microarray data en is gelinkt aan GEPAS (Gene Expression Pattern Analysis Suite)4 . FatiGO maakt gebruik van IDs van genen van de belangrijkste genoom en proteomische databanken (GeneBank5 , UniProt Knowledgebase6 , Unigene7 , Ensembl8 , etc.). [ASDUD04] Onto-Express Onto-Express9 vertaalt lijsten van genen die differentieel gereguleerd bevonden zijn in “high througput”-gen-expressie experimenten, in functionele profielen gebaseerd op GO. De statistische significantiewaarde wordt berekend en de resultaten worden grafisch voorgesteld als staafdiagrammen, taartvoorstellingen en ook hi¨erarchische GO-bomen. Onto-Express is beschikbaar bij “Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory”, Wayne State University. [KDOK02] GOSurfer GoSurfer10 maakt gebruik van informatie over Gene Ontology in de analyse van sets van genen van “genome-wide” experimenten, micro-array analyse of andere zeer parallelle methoden. Deze tool maakt gebruik van rigoureuze statistische testen, interactieve grafieken en geautomatiseerde updating van de beschikbare annotaties voor de meest gebruikte gen-identificatoren (UniGene, LocusLink [PM01]) of Affymetrix probes. GoSurfer is gemaakt op “Harvard School of Public Health”. 3
http://fatigo.bioinfo.cnio.es/; FatiGO http://gepas.bioinfo.cnio.es/; GEPAS 5 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/; GeneBank 6 http://www.ebi.ac.uk/uniprot/; UniProt Knowledgebase 7 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=handbook.chapter.857 8 http://www.ensembl.org/; Ensembl 9 http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm#Onto-Express; Onto-Express 10 http://www.biostat.harvard.edu/complab/gosurfer/; GOSurfer 4
9
GoMiner GoMiner11 is een in Java geprogrammeerd pakket dat lijsten van “interessante” genen organiseert (bijvoorbeeld naar boven of naar beneden gereguleerde genen van een micro-array experiment) om zo biologische interpretatie in de context van Gene Ontology toe te laten. Ook verschaft deze tool kwantitatieve en statistische uitvoerbestanden en twee bruikbare visualisaties: ten eerste een boomachtige structuur en ten tweede een compacte, dynamische interactieve gerichte acyclische graaf. De genen die voorgesteld worden in GoMiner zijn gelinkt met de belangrijkste publieke bio-informaticabronnen. Een tool, MatchMiner, kan gebruikt worden als preprocessor om de namen van de genen te bekomen die als invoer kunnen dienen voor GoMiner en andere GO-tools. [ZFW+ 03] GOTM (GOTree Machine) GOTM of voluit Gene Ontology Tree Machine12 is een web-based tool voor data-analyse en datavisualisatie voor sets van genen. Deze tool zorgt voor het genereren van een GOTree, een boomachtige structuur om te kunnen navigeren in de Gene Ontology gerichte acyclische graaf voor een “input gene set”. Dit systeem zorgt voor een gebruiksvriendelijke datanavigatie en visualisatie. Statistische analyse helpt de gebruikers de belangrijkste “Gene Ontology”-categorie¨en te identificeren voor een invoerset en er worden ook biologische gebieden gesuggereerd waarvoor verdere studie interessant is. [ZSKS04] EASE EASE13 is een standalone softwarepakket van NIAID14 voor Windows besturingssystemen. Wanneer een genenlijst die resulteert uit een microarray of een ander experiment gegeven is kan EASE op een snelle manier voor elke mogelijke GO-term overrepresentatiestatistieken berekenen ten opzichte van alle genen die voorkomen in de dataset. [HDS+ 03]
1.5.2
Vergelijking GO-tools
In tabel 1.1 op pagina 12 staat een vergelijking tussen de verschillende tools die in de vorige sectie besproken zijn en de voor deze scriptie ontwikkelde Cytoscape-plugin BiNGO. Een eerste element dat opvalt is dat BiNGO weliswaar gebruik maakt van Cytoscape maar dat Cytoscape op zich platformonafhankelijk is aangezien het volledig in Java geprogrammeerd is. BiNGO kan dus net zoals de web-gebaseerde tools op gelijk welk besturingssysteem lopen, dit in tegenstelling tot GoSurfer en EASE die enkel onder Windows draaien en GoMiner die enkel op Windows of 11
http://discover.nci.nih.gov/gominer/; GoMiner http://www.gotm.net/; GOTM 13 http://www.ease.org.uk/; EASE 14 http://www.niaid.nih.gov/; NIAID 12
10
Mac werkt. Net zoals de meeste tools, enkel FatiGO is hier een uitzondering, biedt de plugin een multi-level analysis aan. Men moet dus niet zoals bij FatiGO op voorhand een bepaald niveau van de GO-hi¨erarchie specificeren, alle niveau’s worden onderzocht. Voor de visualisatie van de overgerepresenteerde categorie¨en wordt er in BiNGO gebruik gemaakt van een gerichte acyclische graaf die bekomen wordt door de bladeren naar boven te laten propageren tot men aan de root komt. Er is voor deze aanpak gekozen omdat het zo voor de gebruiker duidelijk is waar de origine ligt van een overgerepresenteerde categorie. Ook is er geopteerd om deze categorie¨en in een rode kleur voor te stellen, ze dus te “highlighten” en tevens wordt er een indicatie voor het aantal genen van de cluster in die categorie weergegeven, dit dan in de grootte van de knoop. Andere tools doen ongeveer hetzelfde, maar geen enkele heeft de unieke combinatie van kleur en grootte van de knoop. Voor de statistische analyse werd in BiNGO geopteerd voor de hypergeometrische test en de binomiale test. In een latere versie komt daar dan nog de χ2 -test bij. De hypergeometrische test is echter de belangrijkste. Hij is immers een speciaal geval van de in de literatuur veel besproken Fisher-test en is tevens nauwkeuriger dan de χ2 -test of de binomiale test en dit vooral wanneer het aantal genen in de graaf of het genoom klein is. Omdat er gebruik gemaakt wordt van herhaalde testen om na te gaan welke categorie¨en overgerepresenteerd zijn (Fishing), is het noodzakelijk om ten minste de mogelijkheid aan te bieden tot multiple testing correctie. Volgens de makers van FatiGO gaat deze hogere nauwkeurigheid ten koste van de snelheid, maar in de praktijk is er van deze slechtere performantie niets te merken. Toch is multiple testing correctie om deze reden niet ge¨ımplementeerd in GOTM. Wat ook nog een voordeel is voor de nieuw ontwikkelde plugin is dat BiNGO en het moederprogramma Cytoscape volledig gratis zijn, dit in tegenstelling tot Onto-Express dat slechts gedeeltelijk gratis is. Het laatste en tevens grootste voordeel bij BiNGO is dat het ge¨ıntegreerd is in een breder visualisatieproduct (Cytoscape). Zo kunnen clusters makkelijk ge¨ımporteerd worden, makkelijk op een natuurlijke wijze geselecteerd worden in de grafische omgeving die het moederprogramma aanbiedt. Ook de export van de resultaten kan zo op een duidelijke manier gebeuren door gebruik te maken van de grafische mogelijkheden van Cytoscape. Er is op deze manier ook mogelijkheid tot combinatie met andere tools en plugins. Zo kan bijvoorbeeld in de toekomst BiNGO uitgebreid worden met graaf-clustering, scriptie-onderwerp voor het academiejaar 2004-2005.
11
12
Integratie in breder visualisatie pakket
Correctie voor multiple testing Visualisatie van de overgerepresenteerde GOcategorie¨en Kostprijs
Statistische analyse
Interface/OS Multi-level analysis Visualisatie van de classificatie
Staafdiagram, tabel
Gedeeltelijk gratis Nee
Staafdiagram, tabel
Gratis
Nee
Ja
Binomial test, χ2 test, Fisher’s exact test
Ja
exact
Staafdiagram, tabel
Staafdiagram, tabel, fixed tree
Fisher’s test
Web Ja
Onto-Express
Web Nee
FatiGO
Nee
Nee
Gratis
in Highlight de gerichte acyclische graaf
in Highlight de volledige GOTree
Gratis
Nee
exact
Nee
Fisher’s test
Expandable tree, gerichte acyclische graaf
Fixed tree
χ2 -test
Windows/Mac Ja
GoMiner
Windows Ja
GoSurfer
Tabel 1.1: Vergelijking GO-Tools
Nee
Gratis
Highlight in de gerichte acyclische graaf, staafdiagram
Nee
Expandable Tree, staafdiagram, fixed tree Hypergeometrische test
Web Ja
GOTM
Nee
Gratis
databestand
Ja
Hypergeometrische test
databestand
Windows Ja
EASE
Ja: Cytoscape
Gratis
in Highlight de gerichte acyclische graaf
Hypergeometrische test, Binomiale test (, χ2 -test) Ja
tree, Fixed databestand
alle OS Ja
BiNGO
Hoofdstuk 2
Introductie Cytoscape 2.1
Wat is Cytoscape?
Cytoscape is een open source en platformonafhankelijk computerprogramma dat gebruikt wordt voor het integreren van biomoleculaire interactienetwerken met “high-throughput”-expressiedata en andere moleculaire data tot een globaal conceptueel framework. Het programma is toepasbaar op om het even welk moleculair systeem van componenten en interacties, maar is het krachtigst wanneer het gebruikt wordt voor grote databanken van prote¨ıne-prote¨ıne, prote¨ıne-DNA en genetische interacties die steeds in grotere mate beschikbaar zijn voor mens- en modelorganismen. Een software “Core” verschaft een basisfunctionaliteit voor lay-out en bevraging van het netwerk voor visuele integratie van het netwerk met expressieprofielen, fenotypen en andere moleculaire toestanden en voor het linken van netwerken met databanken van functionele annotaties. De “Core” is uitbreidbaar door een ongecompliceerde plug-in architectuur, die snelle ontwikkeling van extra “features” en nieuwe computationele analyses toelaat. De Cytoscape Core is platformonafhankelijk en kan dus worden uitgevoerd op de meeste besturingssystemen. Bovendien is ze gratis ter beschikking op de Cytoscape website (www.cytoscape.org) als een open source Java Application. Het programma is ook uitvoerbaar vanop het web dankzij Java Web Start. Het grootste deel van dit hoofdstuk is gebaseerd op [SMO+ 03].
2.2
Hoe is Cytoscape ontstaan?
Door de exponenti¨ele groei van experimentele technologie¨en om moleculaire interacties en toestanden te karakteriseren, ontstond de nood aan software tools om de enorme hoeveelheid data te verwerken en te analyseren. Om data van moleculaire interacties te organiseren en voor te stellen in een tweedimensionaal netwerk zijn er viewers beschikbaar die voor meerdere doeleinden bruikbaar zijn (bijvoorbeeld: Pajek [BM98], Graphlet1 , daVinci2 ). Meer gespecialiseerde tools zoals 1 2
http://www.infosun.fmi.uni-passau.de/Graphlet/; Graphlet Toolkit 5.0.1 http://www.informatik.uni-bremen.de/daVinci/; daVinci V2.1
13
Osprey3 en PIMrider4 verschaffen ook deze functionaliteiten, maar linken ook het netwerk aan moleculaire interactie-databanken en functionele databanken zoals BIND [BDW+ 01], DIP [XE01] of TRANSFAC [WCF+ 01]. Vergelijkbaar zijn er voor gen-expressieprofielen en andere moleculaire data verschillende programma’s ter beschikking voor clustering, classificatie en visualisatie (bijvoorbeeld: GeneCluster [TDM+ 99], TreeView [ESBB98], GeneSpring5 ). Ondanks deze vele toepassingen blijft er nog de dringende nood aan software die zowel moleculaire interacties als metingen van de moleculaire toestand (zoals bijvoorbeeld mate van gen-expressie) integreren in een gemeenschappelijk framework, om dan deze data te beschrijven met een wijd assortiment van modelparameters en andere biologische attributen. Bovendien is een flexibel en open systeem nodig om algemene en uitbreidbare berekeningen op het interactienetwerk te kunnen implementeren [Kar01]. Want het is door deze berekeningen dat “high-level” (dus meer algemene) interactie data kunnen gekoppeld worden aan, en een drijfveer zijn voor, de ontwikkeling van “low-level” (dus meer specifieke) fysico-chemische modellen. Om aan deze noden te voldoen, is Cytoscape ontwikkeld door The Institute for Systems Biology in samenwerking met The University of California te San Diego en The Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
2.3
De Cytoscape “Core”-functionaliteit en -architectuur
De basisvoorstelling van biologische data in Cytoscape is een graaf, met de moleculaire entiteiten (i.e. eiwitten of genen) voorgesteld door knopen en de intermoleculaire interacties voorgesteld door bogen tussen de knopen. De Cytoscape Core software voorziet basisfunctionaliteit voor het integreren van arbitraire data in de graaf, representatie van de graaf en de ge¨ıntegreerde data, selectie- en filtertools en een interface naar externe methodes ge¨ımplementeerd als plugins.
2.3.1
Data-integratie
Bijkomende data zijn ge¨ıntegreerd in het graafmodel door gebruik te maken van attributen. Dit zijn (naam, waarde)-paren die knopen of bogen mappen op specifieke datawaarden. Bijvoorbeeld, de knoop met de naam “GAL4” kan een attribuut hebben dat “expression ratio” heet en een waarde van 3,41 heeft. De attribuutwaarden kunnen van gelijk welk type zijn (bijvoorbeeld: strings, discrete of continue getallen, URLs of lists) en ze worden ofwel geladen van een databank, ofwel dynamisch gegenereerd in de sessie zelf. Grafische browsers laten de gebruiker toe alle attributen van de op dat moment geselecteerde knopen en bogen te onderzoeken. 3
http://biodata.mshri.on.ca/; Osprey Network Visualization System http://pim.hybrigenics.com/; PIMRider 5 http://www.silicongenetics.com/; GeneSpring 5.0 4
14
2.3.2
Annotatietransfer
Waar een attribuut ´e´en enkel predicaat van een knoop of boog voorstelt, representeert een ontologie een hi¨erarchische classificatie (vormelijk een gerichte acyclische graaf) van progressief meer specifieke beschrijvingen van eigenschappen van knopen of bogen. Typisch corresponderen ontologie¨en met een bestaande kennisbank die groot, complex en relatief statisch is, zoals bijvoorbeeld de “Gene Ontology”-database [ABB+ 01]. “Hexose metabolism”, dat gedefinieerd is op niveau 6, bijvoorbeeld, vertakt op niveau 7 in meer specifieke processen zoals “galactose metabolism” en “glucose metabolism”. Cytoscape integreert annotaties met andere netwerkdatatypes door de gewenste niveau’s van annotatie in de ontologie te transfereren op knoopof boogattributen. Door gebruik te maken van de “annotation controller” is het mogelijk om meerdere niveau’s actief en in beeld te hebben op hetzelfde moment, elk als een verschillend attribuut van de knopen en bogen waarin men ge¨ınteresseerd is.
2.3.3
Graaf lay-out
E´en van de meest fundamentele tools voor het interpreteren van moleculaire interactiedata is de visualisatie van knopen en bogen door een tweedimensionaal netwerk [TBET99]. De vroegere versie van Cytoscape ondersteunde verscheidene geautomatiseerde algoritmen voor netwerklayout zoals spring-embedded lay-out, hi¨erarchische lay-out en circulaire lay-out. Van deze is springembedded layout de meest gebruikte methode voor het opstellen van algemene tweedimensionale grafen [Ead84]. Deze methode modeleert een mechanisch systeem in hetwelke de bogen van de graaf corresponderen met Hookse veren, die een aantrekkingskracht uitoefenen tussen knopen die ver uiteen liggen en een afstotende kracht tussen knopen die dicht bij elkaar liggen. Voorlopig is enkel deze spring-embedded lay-out ge¨ımplementeerd in de nieuwste versie van Cytoscape, al bestaat er wel al een plugin die de functionaliteit van een hi¨erarchische lay-out aanbiedt.
2.3.4
Attribuut-Naar-Visueel mapping
Zoals de lay-out de locatie van de knopen en de bogen in het venster bepaalt, laat een attribuutnaar-visueel mapping data-attributen toe het uitzicht van de met die attributen geassocieerde knopen en bogen te controleren. Cytoscape ondersteunt een grote verscheidenheid aan visuele eigenschappen zoals kleur, vorm en grootte van de knopen; kleur en dikte van de knooprand en kleur, dikte en stijl van de bogen. Een data-attribuut wordt gemapt op een visuele eigenschap door gebruik te maken van ofwel een “lookup table”, ofwel interpolatie, afhankelijk van het discreet of continu zijn van de waarde van het attribuut. Door visueel expressiewaarden te plaatsen op de interactiepaden die verondersteld zijn die waarden te reguleren, connecteren attribuut-naar-visueel mappings de geobserveerde data rechtstreeks met een onderliggend model.
15
2.3.5
Graafselectie en -filteren
Om de complexiteit van een groot netwerk van moleculaire interacties te verminderen, is het noodzakelijk om selectief subsets van knopen en bogen voor te stellen. Knopen en bogen kunnen geselecteerd worden volgens een grote vari¨eteit aan criteria, zoals selectie via naam, via een lijst van namen of op basis van een attribuut. Meer complexe netwerkselectie-queries worden ondersteund door een filter-toolbox die bestaat uit onder andere een “dichtste buur”-filter, die knopen selecteert met een minimum aantal buren binnen een vooraf bepaalde afstand in het netwerk; een “Local Distance”-filter, die knopen selecteert binnen een gespecificeerde afstand van een groep van vooraf geselecteerde knopen; een “Differential Expression”-filter, die knopen selecteert volgens de met hen geassocieerde expressie-data; een combinerende filter, die knopen selecteert via arbitraire AND/OR-combinaties van andere filters.
2.3.6
Plugin-interface
Plugin-modulen verschaffen een krachtige manier om de Cytoscape Core uit te breiden om nieuwe algoritmen, additionele netwerkanalyses en/of biologische semantiek te implementeren. Plugins krijgen toegang tot het netwerkmodel van de “Core” en kunnen ook de voorstelling van het netwerk beheren. Ook al is de Cytoscape Core open source, toch zijn plugins afzonderlijke stukken software die beschermd kunnen zijn door gelijk welke licentie die de plugin-auteur verlangt. De reeds genoemde hi¨erarchische lay-out (sectie 2.3.3 op pagina 15) is een voorbeeld van een dergelijke plugin en ook het programma dat het doel is van deze scriptie is een plugin voor Cytoscape. In sectie 4.1 op pagina 29 gaan we verder in op plugins en wordt er ook besproken hoe deze te implementeren.
2.4
Graph INterface librarY (GINY)
Cytoscape maakt voor de visualisatie van grafen gebruik van een grafische bibliotheek: Graph INterface librarY of kortweg GINY6 . GINY implementeert een zeer innovatief systeem voor deelgrafen en laat verbluffende visualisatie toe. Bovendien is deze bibliotheek open source (net zoals Cytoscape dus), is ze voorzien van een aantal lay-outalgoritmen en is ze ontworpen met een zeer intu¨ıtieve API. Andere grafische pakketten hebben niet al deze voordelen. Zo zijn bijvoorbeeld Y-Files7 en Tom Sawyer8 duur en dat hoge prijskaartje vormt een barri`ere om onafhankelijke programmeurs aan een applicatie of plugin te laten werken die deze pakketten gebruikt. Ook is het onmogelijk om de code van het pakket te modifi¨eren voor eigen gebruik 6
http://csbi.sourceforge.net/; GINY http://www.yworks.com/en/products yfiles about.htm; Y-Files 8 http://www.tomsawyer.com/home/index.php; Tom Sawyer 7
16
gezien het geen open source bibliotheken betreft. Vroeger was Cytoscape opgebouwd met het grafische pakket Y-Files, maar wegens de kostprijs is dit pakket in de recentste versie van Cytoscape volledig vervangen door GINY. JGraph9 beantwoordt ook niet echt aan de noden van Cytoscape. JGraph is wel meer design-geori¨enteerd, maar komt tekort inzake operaties op de grafen. GINY specifieert bovendien enkel een set van interfaces, zo kunnen andere pakketten geadapteerd worden om GINY-interfaces te implementeren.
2.5
De Cytoscape “Core”-Objecten
Cytoscape bevat verscheidene “Core”-objecten10 die de essenti¨ele datastructuren en venster- en user interface-objecten inhouden. Deze objecten worden gebruikt door de andere objecten van Cytoscape en door de plugins. Vroeger bestond er ´e´en monolithische klasse CytoscapeWindow, maar bij het heropbouwen van Cytoscape zonder Y-Files heeft men ervoor geopteerd om meerdere objecten te maken. In deze sectie gaan we kort kennismaken met deze “Core”-objecten. Een grafische voorstelling van de Cytoscape “Core” ziet u in figuur 2.1 op pagina 17.
Figuur 2.1: Grafische voorstelling van de Cytoscape “Core” 9 10
http://www.jgraph.com/; JGraph http://projects.systemsbiology.net/cytoscape/coreDesign/coreObjects.html; “Core”-Objects
17
2.5.1
CyNetwork
De klasse CyNetwork representeert een graaf/netwerk en de daarmee geassocieerde data. Dit object is het centrale data-object van Cytoscape. CyNetwork bevat een referentie naar de volgende objecten: • De graaf wordt voorgesteld door het grafische pakket GINY. Een graafmodel in GINY, dat natuurlijk bestaat uit knopen en bogen tussen die knopen, wordt opgesplitst in RootGraphs en GraphPerspectives. De RootGraphs bevatten alle knopen en bogen in een graaf, terwijl de GraphPerspectives een subset van die knopen en bogen bevatten (gelijk welke GraphPerspective mag alle knopen en bogen van zijn RootGraph bevatten, maar het hoeft dat niet te doen). Elke GraphPerspective heeft exact ´e´en RootGraph, maar de Rootgraphs mogen gelijk welke hoeveelheid aan GraphPerspectives hebben. Een GraphPerspective wordt bijvoorbeeld gebruikt wanneer men heel het interactienetwerk van gist inlaadt en men enkel de GAL-genen wil bekijken. Dit gebeurt door het inladen van het hele netwerk in de RootGraph en van dit netwerk dan een GraphPerspective verkrijgen die enkel de GAL-genen bevat. • Twee instanties van het GraphObjAttributes-object (met name nodeAttributes en edgeAttributes) bevatten de data-attributen die horen bij de knopen en bogen. • Het ExpressionData-object tenslotte bevat een bundel van expressie-data metingen zoals microarray-data. De klasse ExpressionData voorziet de gebruiker van een parser voor het gebruikelijke bestandsformaat voor expressie-data en een interface voor het toegang verschaffen tot de data. Onder het gebruikelijke bestandsformaat voor expressie-data verstaan we dat “tokens” alfanummerieke waarden zijn die gescheiden worden door witspaties, dat alle lijnen (buiten de hoofding) hetzelfde aantal tokens bevatten met informatie over de genen en dat de hoofding de eerste lijn van het bestand is. Natuurlijk moeten alle lijnen met informatie over de genen en ook de hoofding voldoen aan bepaalde vormeisen, maar daar dieper op ingaan zou ons te ver leiden. Dit object kan ook andere data dan expressiedata voorstellen. De klasse CyNetwork heeft een listener-architectuur voor het op de hoogte stellen van luisteraars wanneer iemand operaties aan het uitvoeren is op het netwerk. Algoritmen moeten de beginActivity-methode aanroepen v´o´or er op het netwerk gewerkt wordt en de endActivitymethode aanroepen wanneer de bewerkingen gedaan zijn.
18
2.5.2
CyWindow
CyWindow bevat alle “view”- en “user interface”-componenten die geassocieerd worden met het voorstellen van de graaf en het beheren van de user interface. Het is het meest gecompliceerde object dat uit CytoscapeWindow is voortgevloeid, aangezien het alles bevat waarvoor de ontwikkelaars nergens anders een gepast plekje vonden. Later kunnen de ontwikkelaars van Cytoscape er toch nog voor opteren om bepaalde delen van CyWindow op te delen in kleinere stukken. Een reeds bestaand voorbeeld hiervan is de klasse CyMenus, die de creatie van alle menu’s en toolbars voor zich neemt. Het CyWindow-object bevat een referentie naar onder andere de volgende objecten: • Het CyNetwork-object van sectie 2.5.1 op pagina 18. • Het CyMenus-object waarvan sprake in deze sectie. • Het GraphView-object van GINY dat instaat voor de visualisatie, dus het tekenen van de graaf. • Het “visual mapping system” dat zegt hoe de knopen en de bogen van de graaf getekend moeten worden. Het maakt gebruik van functies die door de gebruikers gedefinieerd zijn om waarden van verscheidene attributen (zoals bijvoorbeeld de kleur ervan) te berekenen door gebruik te maken van data-attributen die aan elke knoop en boog vastgehangen zijn. Hier wordt de “Attribuut-Naar-Visueel mapping” uit sectie 2.3.4 op pagina 15 dus ge¨ımplementeerd.
2.5.3
CytoscapeObj
De CytoscapeObj-klasse wordt op dit moment gebruikt als een container die alles bevat wat niet bij een netwerk- of vensterklasse past. Dit zijn over het algemeen objecten die uniek zijn binnen ´e´en instantie van Cytoscape en het zijn ook objecten waartoe iedereen toegang wil hebben. Het CytoscapeObj-object bevat een referentie naar de volgende objecten die de zojuist beschreven eigenschappen bezitten: • Het CytoscapeConfig-object: Om Cytoscape te laten lopen worden er een aantal parameters gebruikt die door de gebruiker kunnen opgeroepen worden en die gebruikt worden om te bepalen wat er moet gedaan worden. Bijvoorbeeld of er bepaalde “features” moeten toegepast worden (enabled) of niet (disabled), welke data er moeten opgeladen worden en waar deze bestanden te vinden zijn, welke plugins er moeten geladen worden, . . . De meeste van deze parameters zitten in het CytoscapeConfig-object. Dit object bestaat voornamelijk uit boolese vlaggen of String-variabelen die aangeven wat er moet gebeuren.
19
• Het BioDataServer-object: De BioDataServer is een complex systeem dat informatie verschaft over bepaalde objecten. Algemeen beschouwd kan men via de naam van een entiteit (dit is een gen of een eiwit of een sequentie) en de species tot dewelke het behoort, verscheidene soorten informatie bekomen die met deze naam gerelateerd zijn. Men kan bijvoorbeeld een lijst van gekende synoniemen voor een dergelijke entiteit opzoeken. Ook de canonische naam die met een bepaald synoniem geassocieerd is, kan verkregen worden met behulp van dit object. Bovendien kan men wanneer de naam van een ontologie (bijvoorbeeld “GO Biological Process”) gegeven is, toegang krijgen tot de boom van de annotatie-informatie voor een entiteit, inzake de gewenste ontologie. • Het CalculatorCatalog-object: Voor elk venster is er een eigen “visual mapper” om het uiterlijk van de knopen en de bogen te bepalen. Om alle gekende visualisatiestijlen die gebruikt worden te bewaren, bestaat er ´e´en enkel globaal object, met name het CalculatorCatalog-object.
20
Hoofdstuk 3
Statistische analyse In dit hoofdstuk wordt de theoretische uiteenzetting gegeven van de statistische analyse van de data. Eerst wordt er algemeen uiteengezet wat het toetsen (testen) van hypothesen behelst. Een tweede deel gaat over de verschillende testen die in BiNGO ge¨ımplementeerd zijn. Elke test heeft eigen karakteristieken en dus werd er geopteerd om de gebruiker zelf de keuze te laten tussen de verscheidene distributies die hem of haar aangereikt worden. De derde sectie van dit hoofdstuk gaat over correcties voor multiple testing. De gebruiker is vrij om te kiezen of hij een correctie op deze testen wil of niet en zo ja welke correctie zijn voorkeur wegdraagt.
3.1
Algemene principes toetsen van hypothesen
In de wereld van de wetenschap, biologie, farmacie, . . . moeten er dikwijls binaire beslissingen genomen worden. Er moet dan een keuze gemaakt worden tussen Ja en Nee. Enkele voorbeelden die in de praktijk veel voorkomen: • Is deze man de vader van deze jongen? • Is deze man HIV-positief? • ... • en ook is een bepaalde groep genen die tot een bepaalde categorie behoort overgerepresenteerd? In de gegeven voorbeelden is er altijd sprake van “een effect of associatie” van ´e´en variabele met een andere in de doelpopulatie. In de wetenschap kan de bewering dat de ene variabele met de andere geassocieerd is, onderzocht worden door het al dan niet verwerpen van de nulhypothese dat er geen associatie zou zijn tussen de twee variabelen. Op basis van lukrake observaties
21
beslist men dan om al dan niet de nulhypothese te verwerpen in het voordeel van de alternatieve hypothese. Als men niet de hele populatie observeert, bestaat steeds een kans op een foute beslissing met betrekking tot die populatie. Een goed uitgevoerde statistische toets zal de kans op belangrijke fouten a priori berekenen en binnen gecontroleerde grenzen houden. Concreet wordt bij een statistische toetsingsprocedure eerst een nulhypothese (H0 ) en een alternatieve hypothese (HA ) opgesteld. De nulhypothese zal men wensen te verwerpen ten voordele van de alternatieve hypothese. Een voorbeeld van een dergelijke nulhypothese is: • H0 : de groep genen die tot een bepaalde categorie behoort is overgerepresenteerd. • HA : de groep genen die tot een bepaalde categorie behoort is niet overgerepresenteerd. De volgend stap is een eenvoudige toetsingsgrootheid T defini¨eren, een variabele die men op basis van de observaties kan berekenen (zoals bijvoorbeeld de hypergeometrische distributie). T moet zodanig gekozen zijn dat: • er zoveel mogelijk informatie met betrekking tot de discriminatie tussen nulhypothese en alternatief in T is samengevat, • de theoretische verdeling van T (bij benadering) gekend is in de veronderstelling dat de nulhypothese waar is. De derde stap is een beslissingscriterium defini¨eren voor de toets. Als de geobserveerde waarde van T “te extreem” ligt ten opzichte van haar verdeling onder H0 , zal men H0 verwerpen ten voordele van het alternatief. Een goed gedefinieerde toetsingsprocedure moet a priori aangeven wanneer H0 verworpen wordt ten voordele van HA , bijvoorbeeld van zodra men onder H0 hoogstens 5% kans heeft om een uitkomst te observeren die minstens zo extreem is als de geobserveerde T -waarde. Door de beslissing op deze laatste manier te nemen, aanvaardt men een gecontroleerde kans op een type I-fout: H0 verwerpen op basis van de geobserveerde gegevens terwijl H0 in de doelpopulatie in werkelijkheid toch waar is, dit is dus een vals positief. Hierboven werd de kans op een type I-fout kleiner of gelijk aan 5% genomen. In het algemeen wordt die maximaal getolereerde kans met α aangeduid en wordt ze de betrouwbaarheid(sdrempel) of het signif icantieniveau (significance level) van de toets genoemd. De vierde en laatste stap is het beperken van de kans op een type II-fout: H0 niet verwerpen op basis van de geobserveerde gegevens terwijl H0 in de doelpopulatie toch NIET waar is maar het alternatief HA geldt, dit komt dus overeen met een vals negatief. Een andere manier om een type II-fout in woorden te omschrijven is: niet in staat zijn om een echt alternatief HA te ontdekken. De kans op een type II-fout voor een specifiek alternatief wordt meestal met β aangeduid en 1−β (de kans om dat specifieke alternatief wel te ontdekken) wordt het onderscheidingsvermogen
22
(power) van een toets genoemd. De volgende tabel vat de beslissingsmogelijkheden nog eens samen: Tabel 3.1: Beslissingsmogelijkheden bij nulhypothesen
H0 verworpen
H0 niet verwor-
H0 is waar
HA is waar
type I-fout
correcte uitspraak
kans α
kans 1 − β
correcte uitspraak
type II-fout
kans 1 − α
kans β
pen
In het algemeen wenst men een statistische toets te hanteren die zowel de type I-fout als de type II-fout zo klein mogelijk maakt. Maar als α kleiner wordt, verwerpt men de nulhypothese minder vaak en wordt β automatisch groter. We zullen daarom eerst α fixeren en daarna op zoek gaan naar een test die voor die vaste α een zo klein mogelijke β heeft, en dus de power zo groot mogelijk maakt. Een toets waarbij slechts een alternatief in ´e´en richting wordt beschouwd noemt men ´e´enzijdige toets in tegenstelling tot een tweezijdige toets waarbij men niet a priori aangeeft in welke richting men een verschil verwacht. De p − waarde van een test geeft de kleinste α-waarde aan waarbij de test H0 nog net zou verwerpen. Of anders uitgedrukt: de p-waarde van een uitgevoerde toets is de kans onder de nulhypothese om een toetsresultaat te bekomen dat evenzeer of meer extreem is dan dat wat geobserveerd werd. Dus als de p-waarde zeer klein is, wordt zelfs bij een zeer strenge grens op de type I-fout (kleine α) de nulhypothese toch nog verworpen. Hoe kleiner de p-waarde hoe meer “significant” het testresultaat afwijkt van de verwachting onder de nulhypothese. Het aangeven van een p-waarde voor een toets geeft meer informatie over het resultaat dan een eenvoudige verklaring van al dan niet significant op een vast gekozen α-niveau. [VVDVA03]
3.2
Bespreking van de verschillende ge¨ımplementeerde testen
Er kunnen verschillende statistische benaderingen gebruikt worden om een p-value te berekenen voor elke functionele categorie F. Stel dat er N genen op de graaf gebruikt worden. Om het even welk gen heeft de eigenschap dat die ofwel tot categorie F behoort ofwel er geen lid van is. Met andere woorden kan men dus stellen dat de N genen uit twee categorie¨en bestaan: F
23
en niet-F (NF ). De onderzoekers gebruiken de data-analyse methode van hun keuze om die genen te selecteren die voor hun experiment kunnen dienen. In Cytoscape kan men bijvoorbeeld manueel de knopen in de graaf selecteren waarvan men wil weten of ze overgerepresenteerd zijn. Laat ons veronderstellen dat ze een subset van X genen gekozen hebben. We stellen vast dat x van deze X genen tot F behoren en we willen uitzoeken wat de probabiliteit is dat dit gebeurt. Dus onze vraag is: gegeven N genen van de welke er n tot F behoren en N - n tot NF behoren, we nemen op een willekeurige manier X genen en we vragen ons af wat de probabiliteit is dat we x genen of meer van type F hebben.
3.2.1
Hypergeometrische test
We kunnen dit aanpakken als bemonsteren zonder terugzetten. Dan kan de kans dat een bepaalde categorie x keer voorkomt worden berekend met de hypergeometrische distributie met de parameters (X, N, n) [THC+ 99]: P (x|X, N, n) =
N −n (n x )(X−x )
(N X)
Voortgaande op deze formule kan de p-value die uitdrukt of er x-1 genen of minder behoren tot F, berekend worden door het optellen van de probabiliteiten van een willekeurige lijst van X genen met 1, 2, . . . , x genen die behoren tot categorie F [CB02] [THC+ 99]: p=
x−1 P i=0
−n (ni )(N X−i ) N (X )
Dit komt overeen met een ´e´enzijdige test in dewelke kleine waarden voor p overeenkomen met ondergerepresenteerde categorie¨en. De waarden voor p voor overgerepresenteerde categorie¨en kunnen berekend worden met: p=1−
x−1 P i=0
−n (ni )(N X−i ) N (X )
De uitkomst wordt dan vergeleken met een drempelwaarde α die als veel gebruikte waarden 0.05 en 0.01 heeft. Stel men heeft een significantiegrens van 0.01 of dus 1%, dan zoekt men naar instanties waarvan de probabiliteit dat de overeenkomst toevallig is, kleiner is dan 1%. Wanneer bovenstaande som kleiner is dan die α heeft men te maken met overrepresentatie. [DKM+ 03] De test meet of een cluster meer genen bevat van een bepaalde categorie dan er verwacht wordt bij toeval. Bijvoorbeeld als de meerderheid van genen die in een cluster voorkomen tot ´e´en categorie behoren dan is de probabiliteit laag dat dit gebeurt door toeval en heeft p een waarde dicht bij nul. [WHD+ 02] [Fel68] De hypergeometrische test is een specifiek geval van de in de literatuur veel voorkomende Fisher’s
24
Exact test [KKF+ 81]. Bij deze test moet er een tweede cluster opgegeven worden. Wanneer men voor die cluster al de genen kiest die niet tot X maar wel tot N behoren (dus tot N-X ) dan bekomt men de hypergeometrische test. Om deze reden en ook omdat nog een extra cluster selecteren niet interessant is voor de gebruiker, heb ik geopteerd om deze test niet in de plugin op te nemen.
3.2.2
Binomiale test
Het is algemeen geweten dat wanneer N groot is, de hypergeometrische test naar de binomiale test gaat. In tegenstelling tot de hypergeometrische test is dit een test m´et terugleggen. Wanneer de binomiale test gebruikt wordt, wordt de probabiliteit dat er x genen behoren tot F in een set van X willekeurig gekozen genen, berekend door middel van de klassieke formule van de binomiale kans. In deze formule wordt de kans op het extraheren van ´e´en gen uit F, geschat door de verhouding n/N, P (x|X, n/N ) =
X x
n x N
1−
n X−x , N
en de p-value kan dan berekend worden door: p=1−
x−1 P i=0
X i
n i N
1−
n X−i N
Deze test levert een betere rekentijd op dan de hypergeometrische en zoals gezegd is ze voor grote sets zelfs hetzelfde. Het spreekt dus voor zich dat deze test vooral toepassingen vindt wanneer men met grote hoeveelheden gegevens werkt.
3.2.3
χ2 -test
Een alternatieve benadering van ons probleem is de χ2 -test voor gelijkheid van proporties [FvB93]. Om deze test toe te passen kan er gebruik gemaakt worden van een dataorganisatie zoals in onderstaande tabel. Tabel 3.2: Dataorganisatie voor χ2 -test
Genes on chip
Differentially regulated genes
Having function F Not having F
n11
n12
n11 N.1 =
n11 P2
i=1 ni1
N.2 =
25
P2
i=1 ni2
N1. =
P2
N2. =
P2
N.. =
P
j=1 n1j j=1 n2j
i,j
nij
De punt-notatie in de tabel in de index van sommige variabelen wordt gebruikt om de sommatie naar deze index aan te duiden. Bij deze notatie wordt het aantal genen op de micro-array voorgesteld door N = N.1 , het aantal van deze genen dat tot categorie F behoort wordt gerepresenteerd door n = n11 . Het aantal geselecteerde genen wordt voorgesteld door X = N.2 en het aantal van deze genen dat tot categorie F behoort wordt voorgesteld door x = n12 . De andere elementen uit de tabel zijn te verklaren aan de hand van de hierboven aangehaalde notaties. Gebruik makend van deze notatie kan men de waarde van de χ2 -statistiek , die nodig is voor de χ2 -test, als volgt berekenen: 2
χ2 =
N.. (|n11 n22 −n12 n21 |− N2.. ) N1. N2. N.1 N.2
De waarde die men zo bekomt kan dan vergeleken worden met de kritische waarden die men kan bekomen via de χ2 -distributie met df = (2 − 1).(2 − 1). In de huidige versie van BiNGO is deze statistische test nog niet ge¨ımplementeerd. In een latere versie zal deze test zeker opgenomen worden. Gezien de architectuur van de plugin is het toevoegen van een statistische test geen probleem (zie sectie 4.3 op pagina 35).
3.3
Bespreking van de verschillende correcties
“Multiple testing corrections” (zoals de correcties eigenlijk voluit noemen) stellen de p-waarde bij die men heeft afgeleid uit de gebruikte statistische test en dienen om het voorkomen van vals positieven te corrigeren. Wanneer er immers getest wordt om potenti¨ele significantie na te gaan, wordt elke GO-categorie afzonderlijk van de rest beschouwd. Met andere woorden een test wordt op elke individuele categorie uitgevoerd. Het voorkomen van vals positieven of met andere woorden genen die valselijk overgerepresenteerd genoemd worden (een type I-fout dus) is proportioneel ten opzichte van het aantal uitgevoerde testen en het significantieniveau α. Om dit te verduidelijken kunnen we een doos nemen met twintig knikkers, waarvan er 19 blauw zijn en ´e´en rood. Wat is dan de kans dat men de rode eruit haalt? Juist, ´e´en op twintig. Stel nu dat men twintig keer een knikker uit de doos haalt (en er terug instopt). Zo zal er natuurlijk een grotere kans zijn om de rode knikker uit de doos te halen. Dit is ´e´en min de kans dat men 20 keer een blauwe knikker trekt of dus 1 − (19/20)20 = 64%. Exact hetzelfde gebeurt wanneer enkele honderden categorie¨en terzelfder tijd getest worden. Stel dat de blauwe knikkers “true positive test results” zijn en de rode knikker een vals positief testresultaat is, dan is de kans dat er vals positieven optreden groter naarmate het aantal categorie¨en toeneemt waarop men een statistische test toepast. Stel men heeft ´e´en test met α = 0, 05 dan is er 5% kans op een type I-fout. Wanneer men dan 100 testen heeft (meerdere testen uitvoeren na elkaar krijgt de
26
benaming ’fishing’), dan is het gemiddeld aantal type I-fouten gelijk aan 5 (i.e. 0, 05 × 100). Zijn het 1000 testen dan stijgt het aantal type I-fouten tot 50. Bij de laatste reeks testen zouden er dan ongeveer 50 categorie¨en een vals postief testresultaat opleveren. Men heeft verschillende soorten correcties, elk met hun maat van strengheid. Hoe strenger een multiple testing correction is, hoe minder vals positieve genen er toegestaan worden. Maar ook deze medaille heeft zijn keerzijde aangezien deze strenge correcties een zeer grote hoeveelheid vals negatieven (genen die niet significant genoemd worden en het toch zijn) genereren. Hieronder worden de correcties besproken die ge¨ımplementeerd zijn in BiNGO.
3.3.1
Bonferroni controle van de Family-Wise Error Rate
Deze correctie behoort tot de groep die de Family-Wise Error Rate of kortweg FWER binnen de perken wil houden. De FWER wordt gedefinieerd als de kans op ten minste ´e´en fout van het type I, i.e.: F W ER = P r(V > 0) waarbij V de type I-fout voorstelt en dus gelijk is aan het aantal verworpen juiste nulhypothesen. Voor een sterke controle van de FWER op niveau α is er de Bonferroni-procedure. Dit is misschien wel de meest gekende bij multiple testing. Deze procedure is tevens een singlestep-procedure. Hiermee bedoelt men dat voor alle hypothesen gelijkwaardige multipliciteitsaanpassingen gedaan worden, ongeacht de volgorde van de teststatistieken of ruwe p-waarden. De Bonferroni procedure verwerpt elke hypothese Hi met p-value lager of gelijk aan α/m. De hiermee corresponderende Bonferroni single-step adjusted p-values worden dus gegeven door: p˜i = min(mpi , 1) [GDS03] [Bon35] [Bon36]. De Bonferroni correctie van de FWER is uiterst conservatief en zeer streng. Stel dat men bijvoorbeeld duizend categorie¨en tegelijk test met een significantieniveau van 0.05. De hoogst aanvaardbare p-waarde is dan 0.00005, wat dus daadwerkelijk zeer streng is. Met een FWER van 0.05 is het verwachte aantal vals positieven in dit voorbeeld gelijk aan 0.05 (1000 categorie¨en × 0.00005).
3.3.2
Benjamini & Hochberg controle van de False Discovery Rate
De meest natuurlijke manier om False Discovery Rate (of kortweg FDR) te defini¨eren zou E(V /R) zijn, namelijk de verwachtingswaarde van de proportie van type I errors (V ) binnen de verworpen hypothesen (R). Maar verschillende methodes om het geval R = 0 te behandelen,
27
leiden tot verschillende definities. Wanneer men stelt dat V /R = 0 als R = 0 dan bekomt men de FDR-definitie van Benjamini & Hochberg [BH95], i.e.: F DR = E
V R 1{R>0}
=E
V R |R
> 0 P r (R > 0)
Wanneer het totaal aantal nulhypothesen (m) gelijk is aan het totaal aantal juiste nulhypothesen (m0 ), ook wel de complete nulhypothese genoemd, dan is FDR = FWER. Benjamini & Hochberg hebben een step-up-procedure ontwikkeld voor een sterke controle van de FDR. Step-wise procedures zijn krachtiger dan single-step-procedures en behouden toch de type I error rate controle. De verwerping van een bepaalde hypothese is hierbij niet alleen gebaseerd op het totaal aantal hypothesen maar ook op het resultaat van de tests van andere hypothesen. Step-down-procedures ordenen de p-values (of statistische tests), beginnende met de meest significante, terwijl step-up-procedures (waarvan hier dus sprake) beginnen met de minst significante. Stel dat de p-values als volgt geordend zijn: pr1 ≤ pr2 ≤ . . . ≤ prm . Als men dan vertrekt van i = m en dan als volgende i = m − 1 neemt, dan kan men zo verder gaat totdat men een i∗ kan i ∗ m α. Als i niet gedefinieerd als i∗ dus wel gedefinieerd is,
defini¨eren die het eerste geheel getal i is waarvoor geldt dat pri ≤ is dan wordt er geen enkele nulhypothese verworpen. Anders,
dan moeten alle hypothesen Hri met i = 1, . . . , i∗ verworpen worden. De met de Benjamini & Hochberg procedure corresponderende “adjusted p-values” kunnen dus als volgt bekomen worden:
p˜ri = mink=i,...,m min
m k pr k , 1
[GDS03]. Deze correctie is minder streng en conservatief dan de Bonferroni correctie en laat dus meer vals positieven toe. Hierbij zijn we niet ge¨ınteresseerd in ´e´en vals positief, maar willen we ervoor zorgen dat de proportie van positieve categorie¨en die vals positief is kleiner is dan het significantieniveau. Stel dat men als α een waarde 0.05 heeft, dan is 5% van de categorie¨en die statistisch als significant beschouwd wordt na toepassen van deze correctie door toeval aangeduid en dus een vals positief.
28
Hoofdstuk 4
Implementatie van BiNGO In dit hoofdstuk wordt de implementatie van de plugin besproken. Eerst wordt de architectuur van de plugin besproken zoals die vereist is om in te laden in Cytoscape. In de daaropvolgende secties worden de overige delen van BiNGO besproken zoals bijvoorbeeld de implementatie van de statistische analyse, de implementatie van de visuele voorstelling van de overrepresentatie, ...
4.1
Plugin-architectuur in Cytoscape
Cytoscape ondersteunt een handige Plugin-architectuur die ervoor zorgt dat er op een makkelijke manier extra functionaliteit aan het moederprogramma kan toegevoegd worden. Deze sectie behandelt de theoretische uitwerking om zo een plugin te schrijven en legt er de basisbeginselen van uit. Ook wordt dit dan concreet toegepast op de implementatie van BiNGO.
4.1.1
Overzicht van het maken van een Cytoscape-plugin
Er zijn drie basisstappen in het bouwproces van een Cytoscape-plugin: • Cre¨eer eerst een klasse die de Cytoscape AbstractPlugin-klasse uitbreidt. • Cre¨eer vervolgens een Jar-file voor de plugin. • Als men de plugin wil publiceren (kenbaar maken aan het publiek) moet je je plugin nog “obfusceren” (i.e. onleesbaar maken voor de buitenwereld). Elk van deze stappen wordt in de volgende secties verduidelijkt.
29
4.1.2
Stap 1: Extend AbstractPlugIn
In de eerste stap moet dus een nieuwe klasse gemaakt worden die de Cytoscape AbstractPluginklasse uitbreidt (extends). De source code voor AbstractPlugIn vindt men hieronder: package cytoscape; /** * AbstractPlugin is the class that all plugins must subclass; * the interface is simple - the constructor must take a single * {@link cytoscape.CytoscapeWindow CytoscapeWindow} argument, * and there must be a {@link #describe describe} method * returning a String description of the plugin. */ public abstract class AbstractPlugin { /** * this method’s presence is superfluous; * it is only here so that you don’t have to * call super(cytoscapeWindow) in your ctor. */ public AbstractPlugin() { } /** * required constructor for plugins takes a single * {@link cytoscape.CyWindow CyWindow} argument. */ public AbstractPlugin(CyWindow cyWindow) { } /** * method returning a String description of the plugin. */ public String describe() { return new String("No description."); } } Zoals u in de code hierboven kan zien, hebben plugins twee zaken nodig: • Eerst en vooral moet de klasse van een constructor voorzien zijn die een CyWindow-object (zie sectie 2.5.2 op pagina 19) kan ontvangen. Het CyWindow is een belangrijke Cytoscapeklasse en voorziet toegang tot het hele gamma van Cytoscape-menu’s en grafische objecten. • Ten tweede moet de klasse voorzien zijn van een implementatie van de describe-methode. Deze methode moet een korte omschrijving weergeven (return) van wat de plugin werkelijk
30
doet.
4.1.3
Stap 2: Cre¨ eer een Jar-file
Cytoscape heeft de mogelijkheid om plugins rechtstreeks te laden via Jar-files. Om van deze functionaliteit gebruik te maken, moet de plugin in ´e´en Jar-file gestopt worden. Dit kan gebeuren via de “command line”, via een “makefile” of via een “Ant build file”. Vervolgens kan men dan nagaan of de Jar-file wel degelijk werkt. Daarvoor moet Cytoscape opgestart worden en moet de plugin geladen worden via het Plugins-menu. Om de plugin te laden moet men volgende stappen ondernemen: Plugins → Load Plugin from Jar File en dan natuurlijk de plugin-jar in kwestie selecteren. Eens de plugin geladen is, moet er op het menu-item van de geladen plugin in het Plugins-menu geklikt worden en de plugin wordt uitgevoerd.
4.1.4
Stap 3: Obfusceren van de plugin
Deze stap is in de huidige fase van Cytoscape niet meer nodig. Vroeger was het verplicht voor elke plugin-maker om zijn code te obfusceren, onleesbaar te maken voor de buitenwereld, wegens de licentie-overeenkomst met het grafische (en tevens te betalen) pakket Y-Files. Maar aangezien in de meest recente versie van Cytoscape Y-Files volledig verwijderd is en integraal vervangen is door GINY, is deze laatste fase in het proces om een plugin te schrijven niet meer nodig (zie tevens sectie 2.4 op pagina 16).
4.1.5
Concrete implementatie van de plugin-architectuur in BiNGO: BiNGOplugin.java
BiNGOplugin.java breidt dus de klasse AbstractPlugin van Cytoscape uit (extends). Aan het CyWindow wordt een menu-item met het label “BiNGO-plugin” toegevoegd onder het menu Plugins. Het toe-eigenen van het label “BiNGO-plugin” aan het menu-item gebeurt echter in de interne listener-klasse BiNGOpluginAction, meer bepaald in de defaultconstructor. Deze “luisteraar” produceert een event wanneer er op het menu-item geklikt is in het Cytoscapemenu. Ook zit in deze klasse de verplichte describe-methode. Wanneer er nu op het menuitem geklikt wordt, dan wordt de actionPerformed-methode uitgevoerd. Hierdoor wordt het SettingsPanel (zie sectie 4.2 op pagina 31) op het scherm getoverd.
4.2
SettingsPanel: de gebruikersinstellingen
In de BiNGO-plugin moet de gebruiker de mogelijkheid hebben om bepaalde keuzes te maken, keuzes die afhangen van het soort experiment dat men wil uitvoeren of van de persoonlijke
31
voorkeur van de onderzoeker. BiNGO geeft de gebruiker vele mogelijkheden om zijn of haar onderzoek zo gepersonaliseerd mogelijk te maken. Men kan kiezen uit de verschillende ge¨ımplementeerde testen en correcties aan de hand van een JCombobox, dropdown-menu. De α die bij deze testen als drempelwaarde wordt gebruikt om de p-values mee te vergelijken ten einde de overrepresentatie te weten te komen, kan vrij ingegeven worden. Hiermee wordt bedoeld dat men gelijk welk decimaal getal tussen nul en ´e´en kan opgeven. Deze α wordt dan intern als String beschouwd (om later te converteren naar een BigDecimal, voor meer uitleg zie sectie 4.3 op pagina 35 en sectie 4.4 op pagina 38). Men kan dus ook zeer kleine waarden ingeven die er dan voor zorgen dat de overrepresentatie nauwkeuriger wordt nagegaan en er dus strenger geselecteerd kan worden. Wanneer men alle onderzochte categorie¨en naar de wortel van de boom propageert, wordt dit al gauw een onoverzichtelijk geheel. Daarom is er in BiNGO de mogelijkheid ge¨ımplementeerd om enkel de overgerepresenteerde categorie¨en naar boven te propageren. Hierbij kan men dan nog kiezen tussen de optie of ze overgerepresenteerd zijn voor of na de toepassing van een multiple testing correctie. Net zoals de bij de statistische testen en de multiple testing correcties wordt de keuze gemaakt via een combobox. Een laatste JComboBox zorgt voor de keuze tegenover wat de geselecteerde cluster getest moet worden. De keuzes bestaan uit het testen tegenover het gehele genoom (dit is dan aan de hand van een annotatiebestand) of het testen tegenover de graaf waarin men de cluster geselecteerd heeft.
4.2.1
SettingsOpenPanel, SettingsSavePanel: het kiezen van de bestanden
Vervolgens kan er ook nog opgegeven worden welke annotatie en welke ontologie er gebruikt moet worden. Hiervoor dient de klasse SettingsOpenPanel die bestaat uit een JButton, een knop met daarop een opschrift afhankelijk van de String die met de constructor is meegegeven (dus voor het annotatiepaneel is dat dan logischerwijs “annotatie”) en een niet-editeerbaar JTextField, een tekstveld, waar het path van het gekozen bestand weergegeven wordt. SettingsOpenPanel breidt niet enkel de klasse JPanel uit, ze implementeert ook de klasse ActionListener. Hierdoor wordt de actionPerformed-methode opgeroepen wanneer er op de knop geklikt wordt. Wanneer dit zich voordoet wordt een JFileChooser-venster, een open-file-venster meer bepaald, geopend zodat de gebruiker zijn bestand naar keuze kan selecteren zoals hij of zij dat in de meeste besturingssystemen gewoon is. Naast het kiezen van de annotatie- en ontologiebestanden, is er ook een mogelijkheid voorzien voor de gebruiker om het SIF-bestand dat gaat gecre¨eerd worden voor het opbouwen van het
32
netwerk (zie sectie 4.5 op pagina 39), te bewaren en ook de mogelijkheid om een bestand te maken met alle belangrijke gegevens inzake het onderzoek (zie sectie 4.6 op pagina 41). De klasse SettingsSavePanel zorgt voor deze functionaliteit. Ze bouwt een paneeltje op met daarop onder andere een JCheckBox, een hokje dat men naar believen kan aanvinken. Wanneer men de box “checkt”, opteert men het bestand te bewaren (en in het geval van het BiNGO-gegevensbestand ook voor het aanmaken van het databestand). Een JButton zal bruikbaar worden om net zoals hierboven een JFileChooser-venster, hier dan wel een save-file-venster, op te roepen. Het bruikbaar worden van de knop wordt geregeld door de itemStateChanged(ItemEvent e)methode, die opgeroepen wordt wanneer het hokje aangekruist wordt. SettingsSavePanel implementeert immers naast de klasse ActionListener ook de klasse ItemListener. Bij de checkbox wordt er ook nog gebruik gemaakt van een aparte klasse, met name ToggleIcon. Deze implementeert de klasse Icon en zorgt ervoor dat er in plaats van de default-voorstelling van een aangekruist hokje (deze default-voorstelling is een vol vierkant), er een vierkant hokje met een kruisje erin komt, zodat de gebruiker meer het gevoel heeft dat hij of zij daadwerkelijk het hokje aankruist.
4.2.2
HelpMenuBar: het help-menu
Het JFrame waar het SettingsPanel aan gehecht is, is voorzien van een JMenuBar, een menubalk dus. Deze wordt aangemaakt in de klasse HelpMenuBar. Deze menubalk zorgt ervoor dat de gebruiker een korte gebruikershandleiding kan bekijken en zorgt er tevens voor dat de gebruiker enige informatie over het ontwikkelde product (zoals de ontwikkelaar, plaats van ontwikkeling en de contactmogelijkheden) kan bekijken. Om de twee soorten van informatie op het scherm te tonen, implementeert de klasse HelpMenuBar de klasse ActionListener. De informatie over het product wordt getoond aan de hand van een JOptionPane.showMessageDialog en de handleiding wordt in een nieuw JFrame met daarin een JTextArea aan de gebruiker ter beschikking gesteld.
4.2.3
SettingsPanelActionListener: de luisteraar
Op het SettingsPanel is er ook een JButton aanwezig met als opschrift “Start BiNGO” om het berekenen en visualiseren van de overrepresentatie te initi¨eren. Aan deze knop hangt een luisteraar, met name de klasse SettingsPanelActionListener. Wanneer er dus op de BiNGObutton geklikt wordt, dan wordt de actionPerformed-methode van de luisteraar opgeroepen. Deze controleert eerst of alle velden juist zijn ingevuld. Er wordt gecontroleerd of er wel knopen geselecteerd zijn (anders krijgt men een aanmaning om dit te doen). Natuurlijk moet er ook een test gekozen zijn. Tevens moet er een optie gekozen zijn in verband met de keuze van de grootte van de boom en de keuze tegenover wat er getest moet worden. Bij de keuze van
33
de grootte van de boom is er nog een bijkomende test, met name of er een correctie geselecteerd is in de daarvoor dienende JComboBox wanneer de optie “Overgerepresenteerde categorie¨en na correctie” geselecteerd is. De α-waarde moet opgegeven zijn en binnen de vooropgestelde grenzen liggen (dus 0 < α < 1). Tevens moet het annotatiebestand en het ontologiebestand gekozen zijn. Als aan deze voorwaarden voldaan is, worden de twee files geparsed door een AnnotationFlatFileReader respectievelijk een OntologyFlatFileReader die in Cytoscape aanwezig zijn. In de luisteraar is er ook een mogelijkheid ingebouwd om XML-bestanden te parsen, maar gezien de makers van Cytoscape deze files als te groot en te complex beschouwen en overgeschakeld zijn naar een flatfile-systeem, is dit eerder iets om niet-compatibiliteit te voorkomen als de ontwikkelaars zich alsnog zouden bedenken. Wanneer er bij het parsen een fout optreedt, omdat bijvoorbeeld het geselecteerde bestand niet aan de de hoofdingvoorwaarden (voor meer uitleg over de hoofding van een annotatiebestand zie sectie 5.5 op pagina 47 en voor meer uitleg over de hoofding van een ontologiebestand zie sectie 5.5 op pagina 46) van een dergelijke file voldoet, dan wordt er een duidelijke en gedetailleerde foutmelding aan de gebruiker gegeven, zodat hij zijn lapsus kan corrigeren. Na het parsen van het annotatiebestand en het ontologiebestand naar een annotatie- respectievelijk ontologie-object, wordt er gecontroleerd of de bestanden waarvan men een naam kan opgeven om ze te bewaren (dus de SIF-file en de data-file), een correcte naam hebben. Om de controle van de input te vervolledigen wordt ook nog eens getest of het netwerk dat ingeladen is in Cytoscape wel geschikt is voor onderzoek met BiNGO. Als er bijvoorbeeld enkel namen van steden met elkaar verbonden worden, is het onmogelijk om te bepalen tot welke categorie¨en van de GO deze steden behoren. Eens men alle controles succesvol doorgekomen is, worden de canonische namen van de geselecteerde genen ge¨extraheerd van het netwerk door middel van de methode getSelectedCanonicalNamesFromNetwork. Deze methode geeft dan een Vector terug met daarin de namen van deze genen. Hiermee kunnen de “termIDs” opgezocht worden. Dit gebeurt in de methode getClassificationsFromVector die de labels in de vorm van een array teruggeeft. Om deze GO-Labels te weten te komen, wordt er gebruik gemaakt van het annotatie-object en zijn methode getClassifications met als argument een element uit de Vector. Tenslotte wordt er bepaald welke berekeningen er moeten worden uitgevoerd op de verkregen array: welke test is er gekozen en welke correctie?
Dit gebeurt in de methode performCalculations.
Hoe de berekeningen zelf ge¨ımplementeerd zijn wordt besproken in sectie 4.3 op pagina 35 en sectie 4.4 op pagina 38.
Voor de optie om de gekozen cluster te testen tegenover de
graaf worden eerst nog de namen van al de genen van de graaf opgehaald met de methode getAllCanonicalNamesFromNetwork en wordt deze vector dan als argument meegegeven aan de methode getClassificationsFromVector zodat er een array met de classificaties van het hele netwerk bekomen wordt.
34
4.3
Implementatie van de testen
Voor de implementatie van de testen is er steeds een zelfde structuur aangehouden qua klassen. Zo is er voor elke soort test een klasse xxxDistribution met op de plaats van xxx natuurlijk de naam van de distributie (bijvoorbeeld HypergeometricDistribution). In deze klasse wordt de formule van de distributie ge¨ımplementeerd.
Vervolgens heeft elke test ook nog
een klasse xxxTestCalculate met op de plaats van xxx de naam van de test (bijvoorbeeld BinomialTestCalculate). Hierin gebeurt de berekening van de distributie voor de verschillende genen en deze klasse maakt natuurlijk gebruik van de distributieklasse. Door deze manier van werken is er slechts een kleine aanpassing nodig bij SettingsPanel (namelijk enkel een naam toevoegen aan de array met namen voor de test-ComboBox) en bij SettingsPanelActionListener (namelijk een constante string met de naam van de test en een extra if-clause bij de methode performCalculations) om een nieuwe test toe te voegen, wat natuurlijk het programma makkelijk uitbreidbaar maakt. Bij alle testen komen zeer grote getallen voor (getallen met dertig cijfers zijn geen uitzondering en nog grotere getallen evenmin). Bij deze grote getallen schieten de gewone getal-objecten zoals Integer en Double tekort. Daarom is er bij elke test gebruik gemaakt van de klassen BigInteger en BigDecimal. Deze standaard Java-klassen hebben een voorstellingswijze zodat ze arbitrair grote getallen kunnen voorstellen zonder verlies van precisie, iets wat natuurlijk onontbeerlijk is voor een correct resultaat.
4.3.1
DistributionCount: het tellen van de genen
De distributies hebben vier argumenten in hun constructor. Deze vier argumenten zijn: • N : het aantal genen in de graaf of het genoom • n: het aantal genen uit N die tot een bepaalde categorie F behoren • X : het aantal genen in de cluster die geselecteerd is uit N • x : het aantal genen uit X die tot een bepaalde categorie F behoren Natuurlijk moeten deze aantallen berekend worden. Dit gebeurt in de klasse DistributionCount en die is voor alle distributies logischerwijs hetzelfde. Voor X is dit triviaal aangezien dit overeenkomt met het tellen van het aantal elementen in de meegegeven classif-array. Voor het berekenen van n en x wordt er gebruik gemaakt van de methode count. Hierin worden alle elementen van de reeds genoemde array overlopen en wordt er voor elk element de ouder(s) gezocht. Deze worden in een set en in een stack bijgehouden. De set dient om geen duplicaten te hebben, de stack dient om bij het naar boven propageren (dus het zoeken naar de ouders van
35
de ouders van het element en de ouders daarvan en . . . ) geen elementen te vergeten. Zolang de stack niet leeg is gaat de zoektocht naar alle voorgangers van het element door. Eens dit gedaan is, wordt er over de voor dit element gevonden set, ge¨ıtereerd en wordt er een map bijgehouden met als sleutel de term van het element en als waarde een teller die bijhoudt hoeveel keer deze term al gerefereerd is. Uiteindelijk bekomt men dan een map met de n of x voor elke term. Om de N te berekenen moet de grootste waarde van de n-map gevonden worden. Dit is immers de wortel van de boom-structuur en alle bladeren refereren ´e´en keer naar deze knoop, ergo men vindt het aantal knopen in de boom en dus ook het aantal genen in de graaf of in het genoom (naargelang de keuze bij de combobox in verband met het testen van de cluster tegenover de graaf of het genoom).
4.3.2
Implementatie van de hypergeometrische test
HypergeometricDistribution De implementatie van deze statistische test had een hoge moeilijkheidsgraad. Tot een correct resultaat komen, was geen probleem. De snelheid van de berekening en dus de daarmee gepaard gaande effici¨entie was een ander paar mouwen. Een eerste na¨ıeve implementatie die gewoon de formule implementeerde zoals ze er staat in sectie 3.2.1 op pagina 24, met de daarbij gaande na¨ıeve implementatie van de binomiaalco¨effici¨enten en de daarbij horende faculteiten leverde een pover resultaat op met lange wachttijden. Onaanvaardbaar dus, zeker als men rekening houdt met het feit dat men die berekeningen dan ook nog moet uitvoeren voor meerdere genen. Een minder na¨ıeve implementatie was er ´e´en met een snel algoritme om faculteiten uit te rekenen, met name Prime Factorization and Nested Squaring voorgesteld door Arnold Shoenhage. Zoals de naam het al zegt maakt dit algoritme gebruik van onder andere priem-factorisatie. Meer was er in de geraadpleegde naslagwerken en webpagina’s niet te vinden over dit algoritme, waarvan ik de implementatie gebruikt heb van Peter Luschny (http://www.luschny.de/). Dit algoritme is ongeveer vier keer sneller dan de na¨ıeve implementatie van een faculteit. De totale berekening van de distributie was hierdoor weliswaar substantieel sneller (zo’n 33%) maar toch was de snelheid nog niet wat het moest zijn. De oplossing voor dit probleem heb ik gevonden in het verder uitwerken van de binomiaalco¨effici¨enten. In een aparte klasse BinomialCoefficients is de verder uitgewerkte formule geprogrammeerd. De binomiaalco¨effici¨ent C(n, k) wordt normaal op volgende manier berekend: C(n, k) =
n! k!(n−k)!
Uitgaande van de eigenschap voor binomiaalco¨effici¨enten dat C(n, k) = C(n, n − k), kan men dus maar beter de k nemen waarvoor geldt k ≤ n/2. Bovenstaande algemene formule kan dan
36
op volgende manier herschreven worden wanneer men n! gaat delen door (n − k)!: C(n, k) =
k Q i=1
(n−k+i) i
Men kan gemakkelijk zien dat voor elke noemer i geldt dat het tot dan bekomen product er deelbaar door is. Met deze nieuwe formule is een snelle computatie van de binomiaalco¨effici¨enten wel mogelijk en dus zal de berekening van de hypergeometrische distributie met een meer dan aanvaardbare rekentijd uitgevoerd worden. Een vergelijking van de uitvoeringstijd in milliseconden van de verschillende werkwijzen staat in onderstaande tabel. Er zijn verschillende scenario’s getest, hiermee bedoel ik dat er verschillende waarden voor de argumenten van de hypergeometrische distributie gekozen zijn. Het is dus zeer duidelijk dat met de nieuwe formule voor de binomiaalco¨effici¨enten er een excellente uitvoeringstijd bekomen wordt. Tabel 4.1: Vergelijking uitvoeringstijden hypergeometrische distributie.
Na¨ıeve implemen-
Met
faculteit-
tatie
algoritme
Nieuwe mule
forbinomi-
aalco¨effici¨enten x = 18, X = 50, n = 100, N = 6000
57609
36891
16
x = 2, X = 23, n = 10, N = 1000
125
78
0
x = 23, X = 50, n = 100, N = 250
78
47
16
1285750
866156
4406
48422
32265
0
x = 543, X = 780, n = 1000, N = 6000 x = 16, X = 65, n = 123, N = 6000
HypergeometricTestCalculate De klasse HypergeometricTestCalculate heeft als doel een map (hypergeometricTestMap) aan te maken met als sleutel (key) het identificatienummer van de term en als waarde het resultaat bekomen via HypergeometricDistribution. Ook de map mapSmallX wordt bijgehouden. De reden waarom ook deze map wordt bijgehouden heeft te maken met het bepalen van de grootte van de knopen bij de visualisatie (zie sectie 4.5 op pagina 39). In de constructor wordt reeds de klasse DistributionCount aangesproken om alle parameters te initialiseren voor het eigenlijke berekenen begint. Voor dat berekenen is er de methode HypergeometricTestCalculate. Deze itereert over de sleutels van de mapSmallX-map. Voor elke term wordt de hypergeometrische distributie berekend en wordt er een nieuwe entry gemaakt in de hypergeometricTest-
37
Map-map. Via de getters getHypergeometricTestMap en getMapSmallX kunnen de respectievelijke mappen opgevraagd worden.
4.3.3
Implementatie van de binomiale test
De implementatie van de binomiale test was een stuk sneller geschreven dan die van de hypergeometrische test en loopt voor een groot stuk parallel met de hierboven beschreven test. De distributie (ge¨ımplementeerd in de klasse BinomialDistribution) gebruikt natuurlijk een andere formule (zie sectie 3.2.2 op pagina 25) dan de hypergeometrische. Deze formule is veel eenvoudiger qua complexiteit en daardoor is zelfs een na¨ıeve implementatie voldoende om een snelle uitvoeringstijd te bekomen. Ook deze test maakt gebruik van een xxxTestCalculate-klasse, met name BinomialTestCalculate, waar er hetzelfde gedaan wordt als bij de HypergeometricTestCalculate-klasse maar dan logischerwijs met de binomiale distributie.
4.4
Implementatie van de correcties
Ook voor de implementatie van de correcties is er een vaste klassenstructuur gehanteerd, sterk gelijkend op die van de statistische testen. Eerst en vooral is er voor elke correctie een klasse voor het berekenen van de gecorrigeerde p-waarden (bijvoorbeeld de klasse Bonferroni). Bij deze klasse hoort er dan nog een klasse van de vorm xxxCalculate zoals bijvoorbeeld BonferroniCalculate van waaruit de berekeningen gedelegeerd worden. Ook bij de implementatie van de correcties is er net zoals bij de implementatie van de statistische testen gebruik gemaakt van de klassen BigInteger en BigDecimal voor arbitrair grote gehele getallen respectievelijk arbitrair grote decimale getallen.
4.4.1
Implementatie van de Bonferroni correctie van de Family-wise Error Rate
Bonferroni In deze klasse worden de bij het berekenen van een statistische test bekomen p-waarden, onderworpen aan de Bonferroni correctie. Hierbij moeten de “raw p-values” eerst geordend worden. Voor de ordening is er gebruik gemaakt van het sorteeralgoritme door tussenvoegen (insertion sort algorithm). Dit algoritme werkt als volgt: in de begintoestand is het eerste element op zichzelf beschouwd, gesorteerd. In de eindtoestand moeten alle elementen, als groep beschouwd, gesorteerd zijn. De basisbewerking van het algoritme is het rangschikken van de elementen op de posities 0 tot en met m, waarbij m een waarde tussen 1 en n heeft. Daarbij wordt verondersteld dat de elementen op de posities 0 tot en met m−1 reeds gesorteerd zijn, en wordt het element op
38
positie m op de juiste plaats tussengevoegd. Het algoritme bestaat uit een aantal fasen waarbij m achtereenvolgens waarden van 1 tot en met n aanneemt. [Fac01] Eens de p-waarden geordend zijn met dit algoritme, worden ze stuk voor stuk aan de Bonferroni-correctie onderworpen zoals die gedefinieerd is in sectie 3.3.1 op pagina 27. BonferroniCalculate Vanuit de klasse BonferroniCalculate worden alle bewerkingen in verband met de Bonferronicorrectie gedelegeerd. Eerst worden er twee arrays gemaakt namelijk ´e´en voor de GO-labels of termidentificatie-nummers en ´e´en voor de gevonden p-waarden. Deze worden dan meegegeven aan de constructor van de klasse BonferroniCalculate die er dan zijn bewerkingen op uitvoert. Vervolgens worden de twee arrays die door de klasse BonferroniCalculate aangemaakt zijn, opgehaald (adjustedPvalues en sortedGOLabels) en daarvan wordt er een map gemaakt (bonferroniMap) die dan kan opgevraagd worden.
4.4.2
Implementatie van de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate
De implementatie van de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate loopt volkomen analoog aan de implementatie van de Bonferroni correctie. Nu zijn er de klassen BenjaminiHochbergFDR en BenjaminiHochbergFDRCalculate die de bewerkingen uitvoeren zoals die gedefinieerd zijn in de sectie 3.3.2 op pagina 27.
4.5
DisplayBiNGOWindow: de visualisatie
Eens de berekeningen gedaan zijn en dus de p-values en alle andere nodige informatie gekend is, kan men overgaan op de visualisatie van de gevonden resultaten. Dit gebeurt in de klasse DisplayBiNGOWindow die ervoor zorgt dat er een nieuw CyWindow geopend wordt met daarin de voorstelling van de overrepresentatie. buildNetwork Eerst en vooral moet het netwerk (CyNetwork) opgebouwd worden. Dit gebeurt in de methode buildNetwork. Hiervoor wordt er eerst een SIF-file aangemaakt. Dit is een bestand dat bestaat uit regels zoals “gen1 pp gen2”, wat betekent dat er een boog bestaat tussen gen1 en gen2 (voor een meer extensieve uitleg van het formaat van het SIF-bestand zie sectie 5.6 op pagina 47). Eerst worden de keys van de testMap overlopen en worden alle hi¨erarchische paden ervan gezocht met behulp van ontology.getAllHierarchyPaths(termID). Als er voor de optie
39
gekozen is om enkel de categorie¨en te onderzoeken met overrepresentatie voor correctie of met overrepresentatie na correctie, dan worden eerst de termIDs die hier niet aan beantwoorden er uitgefilterd. De dubbele array die je daarvan als return-waarde terugkrijgt wordt dan overlopen en tussen elke twee opeenvolgende elementen van een rij van deze array bestaat er een boog en komt er dus een entry in het SIF-bestand. Maar dit onmiddellijk wegschrijven zou veel duplicaten veroorzaken. Daarom worden er verschillende maatregelen getroffen om de dubbels die kunnen voorkomen bij zowel de knopen als de bogen te elimineren. Een eerste eliminatie gebeurt tijdens het opbouwen van de set sifSet. Die krijgt elementen van de vorm “gen1 pp gen2”. Aangezien een set als eigenschap heeft dat er geen dubbels in kunnen voorkomen, zorgt dit voor eliminatie van duplicaten. Dit volstaat echter niet. De genen hebben namelijk verscheidene synoniemen voor hun termidentificatienummer. Daarom is er een map nameMap aangemaakt die als sleutel alle termID’s die voorkomen heeft en als waarde voor deze sleutel ´e´en voor elke reeks synoniemen gekozen termidentificatienummer. Dus stel dat het termID 6678 als synoniemen de termID’s 789, 1024 en 456 heeft dan zorgt dit voor 3 koppels in nameMap namelijk (789,6678) , (1024,6678) en (456,6678). De set sifSet wordt nu overlopen met een iterator. Alle termidentificatienummers worden nu opgezocht in de map en de daarmee corresponderende waarde wordt dan opgenomen in een nieuwe set. Op deze manier worden zowel duplicate knopen als duplicate bogen ge¨elimineerd. Nu er geen dubbels meer zijn worden de elementen van de verkregen set weggeschreven naar een bestand. Eens de SIF-file is opgebouwd, wordt ze als argument meegegeven met de methode CyNetworkFactory.createNetworkFromInteractionsFile(SIFFILENAME). Deze “factory” bouwt dan het netwerk op en geeft dat ook terug. Het SIF-bestand kan bewaard worden onder de opgegeven naam die men in het SettingsSavePanel kan opgeven. Is het hokje niet aangekruist, dan wordt het bestand verwijderd. De attributen Eens het netwerk is opgebouwd kunnen de attributen van de knopen (GraphObjAttributes) ingesteld worden. Dit gebeurt in de methode buildNodeAttributes. Eerst halen we de voorlopige attributen op die bij het cre¨eren van het netwerk zijn aangemaakt. Vervolgens kiezen we als omschrijving (description), de naam van de term die we opvragen via het ontologie-object. Dit attribuut wordt ingesteld als label van de knoop. Afhankelijk van de waarde van de p-value, en als er ook een correctie gekozen is afhankelijk van de waarde van de adjusted p-value, wordt de kleur gekozen van de knoop. Een knoop wordt rood gekleurd als zijn waarde kleiner is dan de opgegeven α, anders is de gekozen kleur geel. De grootte van de knopen worden ingesteld
40
door de waarde van de map mapSmallX (dus #genen) in volgende functie in te vullen: knoop grootte = max grootte (1 − exp (−#genen)) Zo worden knopen die veel voorkomen groter voorgesteld dan deze die maar weinig voorkomen en is er toch een beperking inzake maximale grootte (max grootte geeft de maximale grootte van de knopen aan). Buiten deze attributen die visueel zichtbaar zijn voor de gebruiker, zijn er nog andere die men kan opvragen via de “Attribute Browser” van Cytoscape (hoe die opgevraagd moet worden zie sectie 5.8 op pagina 49). Deze attributen zijn: de termID, x, X, n, N en de p-waarden en eventueel de gecorrigeerde p-waarden. Voor de p-waarden en de gecorrigeerde p-waarden kan men zeer grote decimale getallen bekomen. Bij deze getallen kan men niet in ´e´en oogopslag zeggen of ze significant zijn of niet. Daarom is er geopteerd om de getallen voor te stellen in een wetenschappelijke notatie. Het decimale getal 0.000041025622042003 wordt in de geprogrammeerde wetenschappelijke notatie voorgesteld als 0.41026e − 4. Dit gebeurt aan de hand van de methode getScientificNotationFromString. De nullen vooraan worden dus opgeslorpt en er worden vijf cijfers na de komma gezet. Het zesde cijfer bepaalt de afronding van het vijfde cijfer. Wanneer het groter of gelijk is aan 5 wordt er naar boven afgerond anders naar beneden. Na het instellen van de attributen worden deze weer aan het netwerk gehecht. Vervolgens construeren we een nieuw CyWindow, namelijk bingoCyWindow, met onder andere het nieuw aangelegde netwerk met de aangepaste GraphObjAttributes. Tenslotte wordt het venster met de nieuwe graaf aan de gebruiker getoond door het oproepen van de methode showWindow van de klasse CyWindow.
4.6
CreateBiNGOFile: het gegevensbestand over de overrepresentatie
Naast het visueel voorstellen van de berekeningen, wordt er in BiNGO ook de mogelijkheid voorzien een file aan te maken met alle belangrijke gegevens. Zoals reeds gezegd kan de gebruiker kiezen of er zo een bestand al dan niet aangemaakt wordt en kan hij of zij ook zelf de naam van dit bestand kiezen. In de makeFile()-methode gebeurt het wegschrijven naar het bestand dat men heeft opgegeven. Datum en uur van creatie, evenals de gebruikte statistische test en eventueel ook de gebruikte correctie, natuurlijk ook de gekozen α, de ontologie met bijhorende curator en de keuze of er getest is tegenover alle knopen in de graaf of alle genen in het genoom maken de
41
hoofding uit van dit databestand. Zo krijgt de gebruiker een gedetailleerde informatie wanneer het onderzoek is uitgevoerd en wat dat onderzoek juist inhield. In de hoofding worden ook nog de genen weergegeven die tot de geselecteerde cluster behoren. Na de hoofding komt het gedeelte met de gegevens over het gedane onderzoek. Dit gedeelte is zo gemaakt dat de verschillende kolommen (termidentificatienummer, p-waarden, eventueel gecorrigeerde p-waarden, x, n, X, N en de naam van de categorie) gescheiden worden door tabs, dit voor het vergemakkelijken van eventueel parsen van dit bestand. Ook hier worden de p-waarden en de gecorrigeerde p-waarden aan de wetenschappelijke notatie onderworpen.
42
Hoofdstuk 5
Handleiding BiNGO In dit hoofdstuk wordt de handleiding beschreven voor BiNGO. Zo wordt er besproken welke handelingen er allemaal moeten toegepast worden en welke mogelijkheden welke gevolgen hebben. Ook wordt hier beschreven hoe bepaalde bestanden er moeten of zullen uitzien en welke combinaties van opties het beste resultaat geven.
5.1
Het BiNGO-venster met zijn opties
Figuur 5.1: Het BiNGO-venster met zijn opties
43
In bovenstaande figuur wordt het BiNGO-venster (zie sectie 4.2 op pagina 31 voor de implementatie) weergegeven. De onderdelen per nummer zijn: 1. Een dropdown box met daarin de mogelijke testen. 2. Een dropdown box met daarin de mogelijke correcties. 3. Een tekstveld voor het ingeven van de α. 4. Een dropdown box met daarin de opties in verband met het aantal weer te geven categorie¨en. 5. Een dropdown box met daarin de opties waartegen de geselecteerde cluster getest moet worden. 6. Een knop om een “open file”-venster te openen om het annotatiebestand te selecteren. 7. Een tekstveld met het geselecteerde annotatiebestand. 8. Een knop om een “open file”-venster te openen om het ontologiebestand te selecteren. 9. Een tekstveld met het geselecteerde ontologiebestand. 10. Een hokje om aan te vinken of er een databestand moet worden aangemaakt. 11. Een knop om een “save file”-venster te openen om te kiezen waar het databestand bewaard moet worden en onder welke naam. 12. Een tekstveld met de geselecteerde plaats en de gekozen naam voor het databestand. 13. Een hokje om aan te vinken of het SIF-bestand moet worden bewaard. 14. Een knop om een “save file”-venster te openen om te kiezen waar het SIF-bestand bewaard moet worden en onder welke naam. 15. Een tekstveld met de geselecteerde plaats en de gekozen naam voor het SIF-bestand. 16. Een knop om het BiNGO-proces te initi¨eren. 17. Het help-menu. 18. Het deel van het help-menu om de handleiding op te vragen. 19. Het deel van het help-menu om algemene informatie over het programma op te vragen.
44
5.2
Richtlijnen voor de combinatie statistische testen en correcties
Van de ge¨ımplementeerde statistische testen is de hypergeometrische test de beste omdat deze exact is en wanneer het aantal genen in de graaf of het genoom klein is, wordt er nog een accuraat resultaat gevonden. Wanneer men deze statistische test dan nog combineert met de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate, beschikt men over een krachtige tool om overrepresentatie van functionele klassen in een cluster genen na te gaan. De Benjamini & Hochberg correctie van de FDR is immers minder conservatief en meer sensitief dan de Bonferroni correctie van de Family-Wise Error Rate. Voor de significantiegrens α zijn de meest gangbare waarden 0.01 en 0.05.
5.3
Het aantal categorie¨ en
Wanneer men alle onderzochte categorie¨en (de optie ”All Categories”) naar de wortel van de boom propageert, wordt dit al gauw een onoverzichtelijk geheel. Daarom is er in BiNGO de mogelijkheid ge¨ımplementeerd om enkel de overgerepresenteerde categorie¨en naar boven te propageren. Hierbij kan men dan nog kiezen tussen de optie of ze overgerepresenteerd zijn voor (de optie ”Overrepresented Categories before Correction”) of na (de optie ”Overrepresented Categories after Correction”) de toepassing van een correctie. Wanneer men de optie ”Overrepresented Categories after Correction” kiest, spreekt het voor zich dat er een correctie gekozen moet zijn in de daarvoor bestemde combobox. Net zoals bij de testen en de correcties wordt de keuze tussen de drie opties gemaakt via een combobox.
5.4
Testen tegenover genoom of graaf ?
In BiNGO is ook de optie ingebouwd om te specificeren of men de geselecteerde cluster wil testen tegenover de opgegeven annotatie (via het annotatiebestand) en dus eigenlijk tegenover het gehele genoom (de optie ”Test Cluster versus Genome”), dan wel tegenover de graaf waaruit men een aantal knopen geselecteerd heeft (de optie ”Test Cluster versus Graph”). Men gaat dus na bij de keuze om te testen tegenover het genoom, tot welke categorie/categorie¨en van het genoom de genen van de cluster het meeste kans maken te behoren. Bij het testen in de graaf, is dit beperkt tot de categorie¨en van de genen van de graaf. De mogelijkheid om te testen tegenover de graaf kan zeer verschillende resultaten opleveren in vergelijking met het testen tegenover het genoom. Stel bijvoorbeeld dat een categorie van genen veel voorkomt in het genoom. Wanneer men dan een gen van deze categorie in de cluster heeft
45
en men test de cluster tegenover het genoom, dan zal er als resultaat gegeven worden dat deze categorie significant is. Maar stel nu dat die bewuste categorie niet veel voorkomt in de gehele graaf waarin de cluster geselecteerd is (ook al is de graaf een deel van het genoom). Wanneer men dan de cluster test tegenover de graaf zal men vinden dat deze categorie niet significant is.
5.5
Het ontologiebestand en het annotatiebestand
In Cytoscape hebben de annotatie- en ontologiebestanden een vaste structuur1 . In de vorige versies van Cytoscape waren er twee soorten formaten, namelijk XML en gewoon platte tekst (flat file, dus een tekstbestand zonder hi¨erarchische structuur). In de huidige versie echter is platte tekst norm geworden, de ontwikkelaars vonden dat XML te grote bestanden aflevert. Wegens deze keuze van de ontwikkelaars wordt hier enkel het formaat met platte tekst besproken, hoewel BiNGO ook de mogelijkheid voorziet om XML-bestanden in te laden. Het ontologieformaat voor platte tekst Om het ontologieformaat voor platte tekst in Cytoscape te introduceren, volgt hier een voorbeeld ervan uit de GO ontologie: (curator=GO) (type=all) 0003673 = Gene Ontology 0003674 = molecular function [partof: 0003673 ] 0008435 = anticoagulant [isa: 0003674 ] 0016172 = antifreeze [isa: 0003674 ] 0016173 = ice nucleation inhibitor [isa: 0016172 ] 0016209 = antioxidant [isa: 0003674 ] 0004362 = glutathione reductase (NADPH) [isa: 0015038 0015933 0016209 0016654 ] 0017019 = myosin phosphatase catalyst [partof: 0017018 ] ...
Dit formaat heeft enkele vereisten. De eerste lijn bevat twee tussen haakjes geplaatste assignaties voor het opgeven van de curator en het type. In bovenstaand voorbeeld duidt (type=all) erop dat alle drie de specifieke ontologie¨en (moleculaire functie, biologisch proces, cellulaire component) in het ontologiebestand genest zijn. Op de verplichte eerste lijn volgen er ´e´en of meerdere lijnen van de vorm: 1
http://db.systemsbiology.net:8080/cytoscape/tutorial/annotation/index.html
46
nummer = naam [isa:—partof: nummer1 nummer2 ...]
’isa’ en ’partof’ beschrijven de relatie tussen de oudertermen en de kindtermen in de hi¨erarchie van de ontologie. De witspatie voor elk linkse vierkante haakje is niet noodzakelijk. Met nummer wordt er het termidentificatienummer binnen de ontologie bedoeld. Het annotatieformaat voor platte tekst Om het annotatieformaat voor platte tekst in Cytoscape te introduceren volgt hier een voorbeeld ervan uit de GO ontologie: (species=Saccharomyces cerevisiae) (type=Biological Process) (curator=GO) YMR056C = 0006854 YBR085W = 0006854 YJR155W = 0006081 ...
Ook dit formaat heeft enkele vereisten. De eerste lijn bevat twee tussen haakjes geplaatste assignaties voor het opgeven van de species, de curator en het type. Op de verplichte eerste lijn volgen er ´e´en of meerdere lijnen van de vorm: canonischeNaam = termidentificatienummer binnen de ontologie Het selecteren van een dergelijk bestand Om zo een dergelijk bestand te selecteren moet er op de daarvoor bestemde knop op het paneel geklikt worden. Als event komt er dan een “open file”-venster op het scherm zodat de gebruiker kan navigeren in zijn bestanden en zijn keuze kan maken. Wanneer dit gebeurd is ziet de gebruiker het pad van zijn geselecteerd bestand in het tekstveld naast de knop.
5.6
Het SIF-bestand
Om het netwerk van het BiNGO-venster te cre¨eren wordt er een SIF-bestand (”Simple Interaction File”) opgebouwd. De gebruiker kan ervoor opteren dit bestand te bewaren. Men stelt dit in door de passende checkbox aan te klikken en in het “open file”-venster dat men verkrijgt door op de knop naast de checkbox te klikken, een gepaste lokatie en een toepasselijke naam te kiezen voor dit bestand. Het SIF-bestand dat door BiNGO aangemaakt wordt kan er bijvoorbeeld als
47
volgt uitzien: 7582 pp 9605 9309 pp 8652 9719 pp 6974 9308 pp 9309 8152 pp 6139 6997 pp 7001 Elke lijn in dit bestand stelt een boog voor in het netwerk, een boog tussen de twee met hun termidentificatienummer opgegeven knopen.
5.7
Het databestand
Wanneer de gebruiker dit wenst kan hij of zij ervoor opteren om een databestand bij te houden met informatie over het gedane onderzoek. Net zoals bij het SIF-bestand is er ook hier een hokje om aan te vinken en kan op dezelfde wijze door de gebruiker een passende plaats en toepasselijke naam voor het databestand gekozen worden. Een dergelijk bestand bestaat uit twee delen: een hoofding en een corpus. Om de gedachten te vestigen volgend voorbeeld van (een deel van) een databestand in BiNGO: File created with BiNGO (c) on 27-apr-2004 at 19:07:22 ontology: process curator: GO Selected statistical test: Hypergeometric Test Selected correction: Benjamini & Hochberg correction of the False Discovery Rate Selected alpha: 0.05 Testing option: Test Cluster versus Genome The selected cluster: YDR309C
YLR264W
YJR060W
YPL201C
YDL088C
YLR116W
YEL041W
YNL216W
YBL026W
YBR190W
YDR070C
YCL032W
YNL098C
YNL047C
YGR014W
YHR135C
YNL236W
YER065C
48
Beginnend met de hoofding ziet men in het voorbeeld dat de datum en het uur van creatie in het bestand opgenomen zijn. Ook de ontologie en zijn curator worden in het bestand neergeschreven. Als informatie over de statistische analyse die er bij dit onderzoek is ondernomen, maken de naam van statistische test, de correctie (indien van toepassing) en het significantieniveau α deel uit van het databestand. Tevens opgenomen in de hoofding is welke optie er gekozen is in verband met het kiezen tegenover wat de geselecteerde cluster getest is. Hier in het voorbeeld is dit dus tegenover het gehele genoom. Om de hoofding af te ronden, worden de canonische namen van de genen uit de geselecteerde cluster in het bestand opgenomen. Het corpus bestaat zelf ook uit twee delen. De eerste lijn bevat de namen van de kolommen, de naam van de soort van gegevens die in desbetreffende kolommen terug te vinden is. De volgende lijnen bestaan dan logischerwijs uit de gegevens die bekomen zijn door het gedane onderzoek. De kolommen zijn van elkaar gescheiden door tabulaties ten einde het parsen voor de onderzoeker makkelijk te maken. Een voorbeeld van zo een corpus vindt u in tabel 5.1 op pagina 51.
5.8
De visualisatie
Het resultaat van de berekeningen wordt dan uiteindelijk aan de gebruiker visueel kenbaar gemaakt door middel van een nieuw Cytoscape-venster met daarin een boom opgebouwd uit de naarboven gepropageerde categorie¨en die men is tegengekomen bij het onderzoek. Het BiNGOvenster met zijn opties uit sectie 5.1 op pagina 43 blijft bruikbaar zodat men niet telkens alle gegevens terug in orde moet zetten om een kleine aanpassing in de opties te evalueren. In deze boom met categorie¨en hebben de knopen als label de naam van de categorie (bijvoorbeeld ”amino acid metabolism”). De knopen hebben ook verschillende attributen zoals het termidentificatienummer, de p-waarde, eventueel de gecorrigeerde p-waarde, het aantal genen in de graaf of het genoom (N ), het aantal genen uit N die tot die bepaalde categorie behoren (n), het aantal genen in de cluster die geselecteerd is uit N (X ) en het aantal genen uit X die tot die bepaalde categorie behoren (x ). Deze attributen kunnen in Cytoscape opgevraagd worden op de volgende manier: • Klik met de rechtermuisknop op de knoop waarvan men de attributen wil kennen. • In het verkregen menu kan men klikken op ”Attribute Browser” • Dit levert de attribuut-browser van Cytoscape op waarbij men de verschillende attributen kan bestuderen. Enkele van deze attributen worden gebruikt voor de grafische kenmerken van de boom. De kleur wordt bepaald door de p-waarde of indien aanwezig door de gecorrigeerde p-waarde. Rood wil
49
zeggen dat de categorie in kwestie overgerepresenteerd is en een gele kleur wil zeggen dat dit niet zo is. De grootte van de knopen is afhankelijk van x : hoe groter x, hoe groter de knoop. De gebruikte functie hiervoor heeft evenwel een maximum zodat buitensporig grote knopen niet kunnen voorkomen. Voor de functie waarin x een variabele is zie sectie 4.5 op pagina 39. Om de graaf in een boomstructuur te krijgen is er een extra plugin nodig. Voor deze hi¨erarchische lay-out hebben de makers van Cytoscape bij het pakket dat men kan downloaden van hun website een plugin (met name ”HierarchicalLayout.jar”) ge¨ıncludeerd. Toen Cytoscape nog met Y-files werkte zat deze lay-out standaard in het programma maar met de overschakeling naar GINY hebben ze geopteerd om er een plugin van te maken.
50
51
0.22932
0.29376
0.69341e-4
0.28897
0.33912e-1
...
45449
6950
9058
9309
42594
...
0.27013
8652
0.69067e-8
0.44034
7154
46365
0.38179
6793
0.37251
0.25040e-1
16458
7275
0.41348
6520
0.35267e-3
0.14267e-1
6067
6087
P-value
TermId
...
0.72290e-1
0.37154
0.26746e-3
0.37180
0.31483
0.50860e-7
0.46420
0.12420e-2
0.36467
0.51509
0.46856
0.57463e-1
0.49989
0.41273e-1
corrected P-value
...
1
1
12
2
2
5
2
2
1
1
1
2
1
1
x
...
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
X
...
12
118
1227
376
316
25
450
10
109
200
166
86
184
5
n
Tabel 5.1: Corpus van het databestand in BiNGO
...
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
10107
N
...
response to starvation
amine biosynthesis
biosynthesis
response to stress
regulation of transcription
monosaccharide catabolism
development
pyruvate dehydrogenase bypass
amino acid biosynthesis
cell communication
phosphorus metabolism
gene silencing
amino acid metabolism
ethanol metabolism
Name
Hoofdstuk 6
Clusteronderzoek met BiNGO 6.1
Inleiding
Dit hoofdstuk geeft een voorbeeld van de effici¨entie en het vermogen van BiNGO. Er wordt namelijk een cluster onderzocht met de nieuw ontwikkelde plugin en de resultaten van dit onderzoek worden aan de werkelijkheid onderworpen. De cluster werd uit de graaf geselecteerd die men ziet in figuur 6.1 op pagina 52. Dit is een graaf die verkregen is via het inladen van het bestand galFiltered.sif (dat als sample data bij het hele Cytoscape-pakket zit) en door er vervolgens de spring-embedded layout-optie uit het Cytoscape-menu op toe te passen.
Figuur 6.1: Screenshot: De graaf met test-data
Het voorbeeldbestand galFiltered.sif beschrijft een dataset van Ideker et al. [ITR+ 01] over het galactose-metabolisme (een soort suiker) in de gist Saccharomyces cerevisiae. De auteurs voerden talrijke experimenten uit om het galactose-metabolisme te verstoren en de respons te meten. Naast eiwit-interactiedata bevat het netwerk ook informatie over transcriptiefactor-
52
bindingsplaatsen. Daarnaast werden ook metabolische fluxen en expressie van genen gemonitord. Het werk van Ideker et al. wordt algemeen beschouwd als ´e´en van de eerste geslaagde toepassingen van het systeembiologie-concept (zoals beschreven in sectie 1.1.2 op pagina 2).
6.2
Bespreking van de geselecteerde cluster
In figuur 6.2 op pagina 53 ziet men de graaf uit sectie 6.1 op pagina 52 maar nu met de selectie van de cluster. In figuur 6.3 op pagina 53 ziet men dan een close-up van de geselecteerde cluster. De knopen zijn in een cirkelvormige lay-out geordend. Dit is enkel om een duidelijk zicht te krijgen op de cluster. Er is geen verband tussen de eigenschappen van de knopen en de cirkelvormige lay-out.
Figuur 6.2: Screenshot: De graaf met test-data met geselecteerde cluster
Figuur 6.3: Screenshot: De te onderzoeken cluster
53
In tabel 6.1 op pagina 57 staan de genen met hun functies zoals ze op de site van mips1 (Munich Information center for Protein Sequences) in de Comprehensive Yeast Genome Database (CYGD) gegeven zijn. CYGD is zoals de verklaring van de afkorting reeds laat vermoeden een databank voor het gistgenoom en in die databank wordt voor elk gen in het genoom een reeks gegevens bijgehouden waaronder ook de functie van het gen. Zo heeft bijvoorbeeld het gen YBL021C als functie transcriptional activator. De knoop die als label een vraagteken heeft stelt een gen voor waarvan men de betekenis niet kent en de functie niet achterhaalbaar is.
6.3
Screenshots van het onderzoek van de cluster met BiNGO
De cluster uit sectie 6.2 op pagina 53 wordt nu aan de verschillende opties van BiNGO onderworpen. Er is echter geopteerd bepaalde opties van BiNGO constant te houden tijdens de verschillende onderzoeken. Zo is er voor α de gangbare waarde 0.05 gekozen. Voor de representatie van de graaf is er geopteerd om het aantal categorie¨en te beperken tot overgerepresenteerde categorie¨en voor correctie. Als annotatiebestand is er geopteerd voor een bestand dat gekoppeld kan worden aan het bestand voor de ontologie dat het biologisch proces inhoudt. Het onderzoek van de cluster is gebeurd voor zowel de hypergeometrische test als de binomiale test. Bij beide testen is er gebruik gemaakt van ofwel de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate ofwel de Bonferroni correctie van de Family-Wise Error Rate. Ook is er getest zonder multiple testing correctie. Voor elk van de combinaties van testen en correcties is er dan nog eens getest tegenover het genoom en tegenover de graaf.
6.3.1
Screenshots van het testen tegenover het genoom
Hypergeometrische test ’Screenshot: Hypergeometrische test tegenover het hele genoom’ staat op pagina 58. ’Screenshot: Hypergeometrische test, Benjamini & Hochberg, genoom’ staat op pagina 59. ’Screenshot: Hypergeometrische test, Bonferroni, genoom’ staat op pagina 60. Binomiale test ’Screenshot: Binomiale test tegenover het hele genoom’ staat op pagina 61. ’Screenshot: Binomiale test, Benjamini & Hochberg, genoom’ staat op pagina 62. ’Screenshot: Binomiale test, Bonferroni, genoom’ staat op pagina 63. 1
http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/index.jsp; mips
54
6.3.2
Screenshots van het testen tegenover de graaf
Hypergeometrische test ’Screenshot: Hypergeometrische test tegenover de genen in de graaf’ staat op pagina 64. ’Screenshot: Hypergeometrische test, Benjamini & Hochberg, graaf’ staat op pagina 65. ’Screenshot: Hypergeometrische test, Bonferroni, graaf’ staat op pagina 66. Binomiale test ’Screenshot: Binomiale test tegenover de genen in de graaf’ staat op pagina 67. ’Screenshot: Binomiale test, Benjamini & Hochberg, graaf’ staat op pagina 68. ’Screenshot: Binomiale test, Bonferroni, graaf’ staat op pagina 69.
6.4
Bespreking van het onderzoek van de geselecteerde cluster
Eerst en vooral kan er globaal opgemerkt worden dat de juiste categorie¨en voorkomen in de grafen. De categorie¨en die te maken hebben met metabolisme en transcriptie komen in bijna elk screenshot voor als roodgekleurde knopen en dit strookt met wat er staat in tabel 6.1 op pagina 57. Tevens kan men zien dat er minder categorie¨en zijn in de screenshots waar er getest is tegenover de graaf, zoals te verwachten was. Als we de twee statistische testen vergelijken, dan valt het op dat voor de screenshots zonder correctie de grafen identiek zijn. Maar met multiple testing correcties erbij wordt het toch duidelijk dat de hypergeometrische test beter gekozen is dan de binomiale test bij het onderzoeken van deze cluster. Bij het toepassen van de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate op de binomiale test tegenover de graaf wordt geen enkele categorie in verband met transcriptie rood gekleurd, hoewel in tabel 6.1 op pagina 57 nochtans vele genen een functie hebben die hiermee verband houden. Voor de verdere analyse van het onderzoek gaan we ons dus toespitsen op de hypergeometrische test. Bij de hypergeometrische test tegenover het genoom en zonder correctie worden alle bladeren rood gekleurd. Wanneer men de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate toepast krijgt men al wat minder rode knopen en krijgt men een mooi totaalbeeld van wat er allemaal in de cluster zit. Bij het toepassen van de Bonferroni correctie van de Family-Wise Error Rate krijgt men nog minder rode knopen en krijgt men een idee van wat er essentieel is in de cluster.
55
Wanneer we nu tegenover de graaf testen dan bekomen we nog altijd dat alle bladeren rood kleuren wanneer er geen correctie gebruikt wordt.
Maar bij gebruik van de Benjamini &
Hochberg correctie van de False Discovery Rate wordt nu echter weergegeven wat essentieel is in de cluster en bij gebruik van de Bonferroni correctie van de Family-Wise Error Rate wordt geen enkele categorie in verband met transcriptie rood gekleurd. Zoals we reeds opgemerkt hebben, zijn er zeker genen die als functie iets hebben dat in verband staat met transcriptie. Hieruit kunnen we dus concluderen dat de beste resultaten bekomen worden door de combinatie van de hypergeometrische test met de Benjamini & Hochberg correctie van de False Discovery Rate, wat reeds in de handleiding in sectie 5.2 op pagina 45 werd gesuggereerd.
56
Tabel 6.1: Tabel met de genen en hun functies uit de geselecteerde cluster
Gen
Functie
YBL021C
transcriptional activator
YPL248C
transcriptional activator of galactose-induced genes
YOR120W
metabolism
YML051W
negative regulator for the gene expression of the lactose/galactose metabolic genes (transcription)
YBR020W
transcriptional control
YGL035C
involved in glucose-repression (transcriptional repressor)
YIL162W
hydrolysis of terminal non-reducing beta-d-fructofuranoside residues in beta-d-fructofuranosides (metabolism)
YLR377C
key enzyme in gluconeogensis
YDR146C
determines the mother-cell-specific transcription of the HO endonuclease gene that is responsible for the initiation of mating-type switching in yeast (transcriptional factor)
YDR009W
Galactokinase
YBR019C
converts UDP-glucose to UDP-galactose (metabolism)
YBR018C
C4 epimerisation of galactose to glucose (metabolism)
YLR081W
facilitated diffusion transporter required for both the high-affinity
galactokinase-dependent
and
low-affinity
galactokinase-independent galactose transport processes (Cellular transport) YOL051W
auxiliary
transcription
activator
for
genes
encoding
galactose-metabolizing enzymes YKL109W
CCAAT-binding factor subunit (transcriptional control)
YGL237C
CCAAT-binding factor subunit (transcriptional control)
YJR048W
cytochrome-c isoform 1 (energy - respiration)
57
Figuur 6.4: Screenshot: Hypergeometrische test tegenover het hele genoom
58
Figuur 6.5: Screenshot: Hypergeometrische test, Benjamini & Hochberg, genoom
59
Figuur 6.6: Screenshot: Hypergeometrische test, Bonferroni, genoom
60
Figuur 6.7: Screenshot: Binomiale test tegenover het hele genoom
61
Figuur 6.8: Screenshot: Binomiale test, Benjamini & Hochberg, genoom
62
Figuur 6.9: Screenshot: Binomiale test, Bonferroni, genoom
63
Figuur 6.10: Screenshot: Hypergeometrische test tegenover de genen in de graaf
64
Figuur 6.11: Screenshot: Hypergeometrische test, Benjamini & Hochberg, graaf
65
Figuur 6.12: Screenshot: Hypergeometrische test, Bonferroni, graaf
66
Figuur 6.13: Screenshot: Binomiale test tegenover de genen in de graaf
67
Figuur 6.14: Screenshot: Binomiale test, Benjamini & Hochberg, graaf
68
Figuur 6.15: Screenshot: Binomiale test, Bonferroni, graaf
69
Hoofdstuk 7
Besluit BiNGO (Biological Network Gene Ontology) voldoet aan het doel van deze scriptie, namelijk het schrijven van een programma met als functionaliteit het berekenen en visueel voorstellen van overrepresentatie van functionele klassen in een cluster genen die de gebruiker selecteert in een graaf. De software die voor deze scriptie ontwikkeld is, is opgevat als een plugin voor Cytoscape, een bestaand pakket voor visualisatie van biologische netwerken. Deze scriptie is belangrijk voor biologen bij het zoeken naar patronen en het evalueren van de functionele significantie van deze patronen voor grote groepen van genen aangezien dit een tijdrovende bezigheid is zonder software die de onderzoeker helpt bij het functioneel profileren van deze grote genen-sets. In dit hoofstuk worden de conclusies en de toekomstperspectieven nog eens op een rij gezet.
7.1
Conclusies
Voor de functionaliteit die BiNGO vervult, bestonden reeds meerdere GO-tools. Deze vertoonden echter stuk voor stuk tekorten. BiNGO is gratis en platformonafhankelijk, bevat “Multi-level analysis”, correctie voor multiple testing en de belangrijkste statistische tests. Dit zijn allemaal eigenschappen waarvan er steevast minstens ´e´en ontbreekt in de andere GO-tools. Maar wat BiNGO echt uniek maakt, is de integratie als plugin in Cytoscape. Cytoscape is stilaan de standaard aan het worden voor visualisatie van biologische netwerken. Door gebruik te maken van de kracht van de visualisatie in het moederprogramma kan er met de nieuw ontwikkelde plugin meer ontdekt worden door de onderzoeker. De interpretatie van het gedane onderzoek is namelijk makkelijker wanneer er een goede visualisatie voorhanden is. Voor de berekening van overrepresentatie van functionele klassen in een cluster genen zijn twee statistische testen ge¨ımplementeerd: de hypergeometrische test en de binomiale test. Uit het onderzoek van de testcluster in hoofdstuk 6 op pagina 52 is gebleken wat er reeds theoretisch gezegd
70
was over de correctheid van de testen, namelijk dat de hypergeometrische test betere resultaten geeft dan de binomiale test. Tevens zijn er voor deze “multiple tests” correcties ge¨ımplementeerd: de Bonferroni controle van de Family-Wise Error Rate en de Benjamini & Hochberg controle van de False Discovery Rate. Ook hier werd in het onderzoek van de testcluster bevestigd wat er reeds theoretisch gesteld was, namelijk dat de Benjamini & Hochberg controle van de False Discovery Rate minder streng is dan de Bonferroni controle van de Family-Wise Error Rate en dus gevoeliger is.
7.2
Distributie via website en cd-rom
Om de plugin en de versie van Cytoscape waarvoor het werkt te distribueren is er een website gemaakt, namelijk http://www.psb.ugent.be/cbd/BiNGO/BiNGO.html. Bij deze scriptie zit er tevens een cd-rom met daarop deze twee programma’s, maar ook nog tal van “extra’s”. De bronbestanden van zowel BiNGO als Cytoscape v2.0 ALPHA1 zijn aanwezig op het schijfje, net als de API met browsable source code van de plugin. Tevens zijn er hulpbestanden op het schijfje gebrand: een ontologiebestand (go process080903.txt), een annotatiebestand (biologicalProcess.txt) en een SIF-bestand (galFiltered.sif). Dat SIF-bestand is gebruikt voor het testen van BiNGO aan de hand van een cluster genen. De resultaten van dit onderzoek staan ook op de cd-rom. Zowel de originele screenshots als een handige webpagina waar men makkelijk de verschillende resultaten kan vergelijken zijn ter beschikking. Ook de gratis Java-editor (JCreator) waarmee het programma geschreven is en de thesistekst in pdf-formaat op de BiNGO-cd. Tenslotte is er nog de README-file die de gebruiker wegwijs maakt aangaande de bestanden op de cd-rom.
7.3
BiNGO in de toekomst
BiNGO is een project dat nooit af is. Zo kan er extra functionaliteit aan de plugin toegevoegd worden of kan de huidige functionaliteit uitgebreid worden. In een scriptieonderwerp voor het academiejaar 2004-2005 wordt gesuggereerd de mogelijkheid aan te bieden aan de onderzoeker om algoritmen te gebruiken die clusters automatisch berekenen en selecteren naast de mogelijkheid die nu in BiNGO zit, namelijk het manueel selecteren van de cluster. Voor zeer ingewikkelde netwerken waar clusters niet meer zomaar manueel kunnen geselecteerd worden zijn deze algoritmen meer dan gewenst. Hoewel de belangrijkste statistische methoden reeds ge¨ımplementeerd zijn, kan de huidige functionaliteit inzake multiple testing en multiple testing corrections uitgebreid worden. Als extra statistische test denk ik dan vooral aan de χ2 -test.
71
Aangezien de ontwikkelaars van Cytoscape om de haverklap een nieuwe versie uitbrengen van hun programma moet er ook blijvend aan BiNGO gewerkt worden om het compatibel te houden met de laatste versie van het moederprogramma. Gezien het feit dat de ontwikkelaars van Cytoscape geen aandacht schenken aan de backwards-compatibility van plugins die voor andere versies geschreven zijn, moet er dus voortdurend aan de software die voor deze scriptie ontwikkeld is, gesleuteld worden. Nu is BiNGO compatibel met de versie Cytoscape v2.0 ALPHA1.
72
Bibliography [ABB+ 00]
The Gene Ontology Consortium: M. Ashburner, C.A. Ball, J.A. Blake, D. Botstein, H. Butler, J.M. Cherry, A.P. Davis, K. Dolinski, S.S. Dwight, J.T. Eppig, M.A. Harris, D.P. Hill, L. Issel-Traver, A. Kasarskis, S. Lewis, J.C. Matese, J.E. Richardson, M. Ringwald, G.M. Rubin, and G. Sherlock. Gene ontology: tool for unification of biology. Nat Genet, 25:25–29, 2000.
[ABB+ 01]
The Gene Ontology Consortium: M. Ashburner, C.A. Ball, J.A. Blake, D. Botstein, H. Butler, J.M. Cherry, A.P. Davis, K. Dolinski, S.S. Dwight, J.T. Eppig, M.A. Harris, D.P. Hill, L. Issel-Traver, A. Kasarskis, S. Lewis, J.C. Matese, J.E. Richardson, M. Ringwald, G.M. Rubin, and G. Sherlock. Creating the gene ontology resource: design and implementation. Genome Res, 11:1425–1433, 2001.
[ASDUD04] F. Al-Shahrour, R. Daz-Uriarte, and J. Dopazo. Fatigo: a web tool for finding significant associations of gene ontology terms with groups of genes. Bioinformatics, 20:578–580, 2004. [BDW+ 01]
G.D. Bader, T. Donaldson, C. Wolting, B.F. Oellette, T. Pawson, and C.W. Hogue. Bind - the biomolecular interaction network database. Nucleic Acids Res., 29:242– 245, 2001.
[BH95]
Yoav Benjamini and Yosef Hochberg. Controlling the false discovery rate: A practical and powerfull aproach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), 57(1):289–300, 1995.
[BM98]
V. Batagelj and A. Mrvar. Pajek - program for large network analysis. Connections, 21:47–57, 1998.
[Bon35]
C. E. Bonferroni. Il calcolo delle assicurazioni su gruppi di teste. In Studi in Onore del Professore Salvatore Ortu Carboni., 1935.
73
[Bon36]
C. E. Bonferroni. Teoria statistica delle classi e calcolo delle probabilit` a., volume 8. Pubblicazioni del R Istituto Superiore di Scienze Economiche e Commerciali di Firenze, 1936.
[CB02]
G. Casella and Roger L. Berger. Statistical inference. Thomson Learning, 2002. ISBN: 0534243126.
[DKM+ 03]
Sorin Draghici, Purvesh Khatri, Rui P. Martins, G. Charles Ostermeier, and Stephen A. Krawetz. Global functional profiling of gene expression. Genomics, 81:98–104, 2003.
[Ead84]
P. Eades. A heuristic for graph drawing. Congressus Numerantium, 42:142–160, 1984.
[ESBB98]
M.B. Eisen, P.T. Spellman, P.O. Brown, and D. Botstein. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14863– 14868, 1998.
[Fac01]
V. Fack. Datastructuren en Algoritmen 1. Academia Press, P. Van Duyseplein 8, 9000 Gent, 2001.
[Fel68]
W. Feller. An Introduction to Probability Theory and Its Applications., volume 1. Wiley Text Books, 1968. ISBN: 0471257087.
[FvB93]
L.D. Fisher and G. van Belle. Biostatistics: a methodology for health sciences. John Wiley and Sons, New York, 1993. ISBN: 047116609X.
[GDS03]
Yongchao Ge, Sandrine Dudoit, and Terence P. Speed. Resampling-based multiple testing for microarray data analysis. Technical Report 633, Departement of Statistics, University of California, Berkeley, January 2003.
[HDS+ 03]
Douglas A. Hosack, Glynn Jr. Dennis, Brad T. Sherman, H. Clifford Lane, and Richard A. Lempicki. Identifying biological themes within lists of genes with ease. Genome Biology, 4:R70, September 2003.
[Hea00]
T.R. Hughes et al. Functional discovery via a compendium of expression profiles. Cell, 102:109–126, 2000.
[ITR+ 01]
Trey Ideker, Vestein Thorsson, Jeffrey A. Ranish, Rowan Christmas, Jeremy Buhler, Jimmy K. Eng, Roger Bumgarner, David R. Goodlett, Ruedi Aebersold, and Leroy Hood. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science, 292:929–934, May 2001.
74
[Kar01]
P.D. Karp. Pathway databases: A case study in computational symbolic theories. Science, 293:2040–2044, 2001.
[KDOK02]
Purvesh Khatri, Sorin Draghici, G. Charles Ostermeier, and Stephen A. Krawetz. Profiling gene expression utilizing onto-express. Genomics, 79(2):266–270, February 2002.
[KKF+ 81]
J.W. Kennedy, G.W. Kaiser, L.D. Fisher, J.K. Fritz, J. Myers, W. andMudd, and Ryan T. Clinical and angiographic predictors of operative mortality from the collaborative study in coronary artery surgery (cass). Circulation, 63(4):793–802, 1981.
[PM01]
K.D. Pruitt and D.R. Maglott. Refseq and locuslink: Ncbi gene-centered resources. Nucleic Acids Res, 29(1):137–140, January 2001.
[SMO+ 03]
Paul Shannon, Andrew Markiel, Owen Ozier, Nitin S. Baliga, Jonathan T. Wang, Daniel Ramage, Nada Amin, Benno Schwikowski, and Trey Ideker. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research, 13:2498–2504, 2003.
[TBET99]
I.G. Tollis, G.D. Battista, P. Eades, and R. Tamassia. Graph drawing - Algorithms for the visualization of graphs. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ, 1999.
[TDM+ 99]
P. Tamayo, D. Dlonim, J. Mesirov, Q Zhu, S. Kitareewan, E. Dmitrovsky, E.S. Lander, and T.R. Golub. Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: Methods and application to hematopoietic differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci., 96:2907–2912, 1999.
[THC+ 99]
S. Tavazoie, J.D. Hughes, M.J. Campbell, R.J. Cho, and G.M. Church. Systematic determination of genetic network architecture. Nat. Genet., 22:281–285, 1999.
[VVDVA03] P. Verbeeck, M. Van Dale, and S. Van Aelst. Wiskunde en statistiek: Cursus voor de tweede kandidatuur geologie. pages 48–61, 2003. [WCF+ 01]
E. Wingender, X. Chen, E. Fricke, R. Geffers, R. Hehl, I. Liebich, M. Krull, V. Matys, H. Michael, and R. Ohnauser et al. The transfac system on gene regulation. Nucleic Acids Res., 29:281–283, 2001.
[WHD+ 02] Lani F. Wu, Timothy R. Hughes, Armaity P. Davierwala, Mark D. Robinson, Roland Stoughton, and Steven J. Altschuler. Large-scale prediction of saccharomyces cerevisiae gene function using overlapping transcriptional clusters. Nature Genetics, 31:255–265, July 2002.
75
[XE01]
I. Xenarios and D. Eisenberg. Protein interaction databases. Curr. Opin. Biotechnol., 19:375–378, 2001.
[ZFW+ 03]
Barry R. Zeeberg, Weimin Feng, Geoffrey Wang, May D. Wang, Anthony T. Fojo, Margot Sunshine, Sudarshan Narasimhan, David W. Kane, William C. Reinhold, Samir Lababidi, Kimberly J. Bussey, Joseph Riss, J. Carl Barrett, and John N. Weinstein. Gominer: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data. Genome Biology, 4:R28, 2003.
[ZSKS04]
Bing Zhang, Denise Schmoyer, Stefan Kirov, and Jay Snoddy. Gotree machine (gotm): a web-based platform for interpreting sets of interesting genes using gene ontology hierarchies. BMC Bioinformatics, 5:16, 2004.
76
