Základy klonování a genového inženýrství KBC/BAM - Pokročilé biochemické a biotechnologické metody
KLONOVÁNÍ Molekulární klonování: • multikrokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA • spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciálním nosičem – vektor • přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie) • mnohonásobné namnožení vložených DNA fragmentů replikaci v živé buňce – DNA KLONY
Buněčné klonování: • vytváření geneticky identických buněk (organismů) • v živé přírodě přirozené:
kolonie baktérii řízkování rostlin jednovaječná dvojčata umělé ►
k4
Využití molekulárního klonování
• uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny) • produkce proteinů pro různorodé využití • vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)
farmaceutika
zemědělství
základní výzkum
průmysl medicína
Snímek 3 k4
retinis pigmentosa 5 milionu lidi na svete photoreceptor glycoprotein peripherin kokos; 18.4.2010
Příprava knock-out organismu inserční vektor
substituční vektor
pozitivní selekce na neomycin (gen M)
knockoutovaná myš • • • • •
gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu) do jeho ORF transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu) inzerční vektor
gen v genomu EKB 2 on
1 on
4 on Ex 3 on
Ex
Ex
Ex
homologní rekombinace a přerušení genu
knockoutovaná myš • PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen) • možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci • do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB také tento gen • selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk • náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají homologní rekombinace
linearizovaný substituční vektor
se gm en t
2
HSVtk
Ge ne
Ge ne
se gm en t
1
NeoR
náhodná integrace
NeoR NeoR+/ HSVtk-
NeoR+/ HSVtk+
ZINC FINGER NUCLEASES CÍLENÁ MANIPULACE V GENOMU příprava knockoutovaných linií organismů
PŘIROZENÁ REKOMBINACE oprava dvouřetězcových zlomů reakce na poškození DNA
HR – homologní rekombinace NHEJ – nehomologní lepení konců
pg5
ZINC FINGER NUCLEASES chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných „zinkové prsty“
Snímek 9 pg5
The enzyme FokI, naturally found in Flavobacterium okeanokoites, is a bacterial type IIS restriction endonuclease consisting of an N-terminal DNA-binding domain and a non-specific DNA cleavage domain at the C-terminal.[1] Once the protein is bound to duplex DNA via its DNA-binding domain at the 5'-GGATG-3': 5'-CATCC-3' recognition site, the DNA cleavage domain is activated and cleaves non-specifically between nine and 13 nucleotides downstream of the recognition site. galuszka; 21.4.2010
ZINC FINGER NUCLEASES
Testování specifity ZFN
pg6 pg7
Knock-out genu pomocí ZFN
Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459
Snímek 12 pg6
CCR5 - chemokinovy receptor klinicke testy 18 pacientu deletovany homozygot je immunni vuci AIDS galuszka; 21.4.2010
pg7
alela pouze u kavkazoidni rasy, zafixovala se zřejmě během morovych pandemii galuszka; 21.4.2010
KLONOVACÍ VEKTORY A) Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDY •
přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů apod.) 2-100kb
•
replikují se nezávisle na baktérii
•
vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených 1970 - pBR (Bolivar a Rodriguez) •
• • • •
4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli oriV vlastní počátek replikace rezistence k Amp a Tc unikátní restrikční místa kapacita pro inzertovou DNA 1-5 kb ori
MCS (multiple cloning site - polylinker) (
Unikátní synteticky vytvořená sekvence, obsahující za sebou jdoucí restrikční místa frekventovaných restrikčních endonukleas
počátek replikace oriV • cca 300 bp • kóduje sekvenci „antisense“ RNA, která iniciuje DNA replikaci (slouží jako primer) • regulace: „high copy plasmid“ např. ColE1 • vzájemná inkompatibilita
agarosová elektroforesa plasmidové DNA ccc – covalently closed circle oc – open circle
genomická DNA oc forma plasmidu ccc forma plasmidu linearizovaný plasmid 8 kb 6 kb 4 kb 3 kb
ccc
oc
izolace plasmidové DNA • metoda alkalické denaturace • ccc plasmidová DNA je stabilnější v alkalickém pH • linearní genomická DNA se při pH 12 - 12.5 denaturuje a pak při rychle neutralizaci precipituje • v přítomnosti SDS a neutralizaci octanem sodným se precipitují i proteiny a RNA
izolace plasmidové DNA
pg4
Kolony s křemičitým nosičem nebo aktivními DEAE skupinami
DEAE matrice Výtěžky: 1ml LB média 10μg DNA (high-copy plasmid) 1ml LB média 0.5μg DNA (low-copy plasmid)
křemičitá matrice + chaotropní sůl
Snímek 18 pg4
DEAE cistci pro transfekce chaotropni sul jsou obecně iontové sloučeniny, které snižují strukturovanost vody. Ve vodě v tekutém stavu totiž vznikají přechodně vodíkové můstky mezi kyslíkem a vodíkem sousedních molekul, takže je určitým způsobem "strukturovaná". V molekulární genetice je využíván fakt, že molekuly DNA v přítomnosti chaotropních solí adherují na SiO2, tedy obecně na skleněný povrch. ionty guanidinu. galuszka; 20.4.2010
k8
KLONOVACÍ VEKTORY F) bakteriální - BAC umělé bakteriální chromosomy (bacterial artificial chromosomes) odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), „low copy“ 1-2 kopie na buňku
VÝHODY oproti YAC: - stabilita (cirkulární) - snadná manipulace - potlačení rekombinace
Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligaci jsou získány pulsní gelovou elektroforesou VELKÝ VÝZNAM PŘI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY
INVITROGEN
Snímek 19 k8
par A B C dulezite pro rozdelovani do dcerinych bunek repE helikasa musi se rust v bakteriich s deletovanyma rekombinasama kokos; 22.4.2010
SCREENING BACových knihoven pomocí „3D-poolování“
Heterologní expresní systémy • Bakteriální • Kvasinkové • Hmyzí buňky • Savčí buňky • Transgenní rostliny
charakteristika
E. coli
kvasinky
hmyzí buňky
savčí buňky
buněčný růst
rapidní (30min)
rapidní (90min)
pomalý (18-24h)
pomalý (24 h)
požadavky na růstové medium
minimální
minimální
komplexní medium
komplexní medium
cena růstového media
nízká
nízká
vysoká
vysoká
množství exprimovaného proteinu
velké
malé až velké
malé až velké
malé nebo střední
extracelulární exprese
sekrece do inkluzních tělísek
sekrece do media
sekrece do media
sekrece do media
obvykle nutné dodatečné složení
v některých případech nutné dodatečné složení
řádně složené proteiny
řádně složené proteiny
N-glykosylace
-
vysoký obsah manosy
jednoduché, bez sialové kyseliny
komplexní
O-glykosylace
-
+
+
+
fosforylace
-
+
+
+
acetylace
-
+
+
+
acylace
-
+
+
+
γ-karboxylace
-
-
-
+
posttranslační modifikace
skládání proteinů
rekombinatní genetická informace je vklonována do vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci do genomu TA klonování
Taq polymerasy bez 3´- 5´ samoopravné aktivity přidávají na 3´konce dATP
pg8
TA TOPO klonování linearizovaný vektor ošetřen DNA topoisomerasou I rychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy
Snímek 25 pg8
The key to TOPO® cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions both as a restriction enzyme and as a ligase. Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication. Vaccinia virus topoisomerase I specifically recognizes the pentameric sequence 5´-(C/T)CCTT-3´ and forms a covalent bond with the phosphate group attached to the 3´ thymidine. It cleaves one DNA strand, enabling the DNA to unwind. The enzyme then relegates the ends of the cleaved strand and releases itself from the DNA. To harness the religating activity of topoisomerase, TOPO® vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3´ phosphate galuszka; 21.4.2010
rekombinační klonování • místně specifický rekombinační systém bakteriofága lambda – slouží k integraci do genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus) attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci).
rekombinační klonování • rekombinace probíhá v obou směrech a je katalýzována proteiny z λDNA i bakteriálními. • selekce antibiotikum a gen ccdB mezi rekombinantními místy, protein ccdB inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor vstupní vektor
destinační vektor
• Invitrogen dodá dodává všechny typy vektorů vektorů kompatibilní kompatibilních pro rekombinantní rekombinantní klonová klonování • reakce trvá trvá 1 hodinu př při laboratorní laboratorní teplotě teplotě • zachová zachovávání čtecí tecích rá rámců mců (ORF), žádné dné slož složité ité plá plánová nování
Klasické klonování do vstupního vektoru: • pENTR vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je necitlivá na ccdB inhibici) • po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni k ccdB – nerostou nezrekombinované plasmidy • 100% účinné není třeba selektovat pozitivní klony
přímá amplifikace s primery obsahující rekombinační sekvence:
attB1 attB2
rekombinace do donorového vektoru: • pENTR a pDONR: pomocné vektory • pDEST: cílové vektory k použití
LR reakce se účastní integrasa a ekscionasa (αDNA) a IHF (integration host factor) z bakterie
BP reakce se účastní IHF a integrasa
rekombinační klonování
PG2
N-terminal 6xHis tag umožňuje velice účinnou purifikaci proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. detekci pomocí Anti-HisG protilátky EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag T7 transcription termination region silný terminační systém T7 bacteriofága T7 promotor přesná heterogenního proteinu
a
silná
exprese
Ribosome binding site TOPO klonovací klonovací místo pro PCR produkt Xpress™ Xpress™ epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-AspLys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress™ protilátky
gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli pUC origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli C-terminal V5 epitope tag umožňuje detekci fúzního pomocí Anti-V5 protilátky
proteinu
Snímek 32 PG2
T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotorem galuszka; 11.3.2007
exprimovaný protein
reverse primerTAG
„“ signální peptid
exprimovaný protein
V5 epitop
his tag
ATGforward primer
detekce
izolace
reverse primerTAG
his tag
x-press
„“ signální peptid
exprimovaný protein
forward primer
izolace
detekce
PG3
usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka)
CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) CBD - cellulose binding domain
Snímek 34 PG3
FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou celulosa váže aromatické residua AK galuszka; 11.3.2007
izolace proteinu z bakteriální kultury: • pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem
IB
wash I
wash II
100mM
200mM
imidazol 0.5mM
1M
IB
marker
• poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!!
bakt.extrakt
• pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem
k1
tagy založené na sacharid-vazebných proteinech
k2 k3
MBP - maltosa binding protein - amylosa CBP - intein – chitin binding protein - chitin
Snímek 36 k1
inteiny - proteinové introny kokos; 17.4.2010
k2
The most likely mutation is in the rop gene because rop mutants have increased plasmid copy number, and temperature sensitive mutations are most often due to changes in protein structure. An alternative explanation is that the mutation destablizes a stem-loop structure in the RNA which plays a role in regulation. (It is possible to obtain temperature sensitive mutations that decrease the stability of nucleic acid hybrids but, since most nucleic acid hybrids involve a considerable number of base pairs, a single nucleotide substitution is unlikely to have a substantial effect on the Tm of the hybrid. Furthermore, in this case the hybrid is between complementary strands so a nucleotide substitition would result in a different base pair at that position, not mispairing at that position.) kokos; 17.4.2010
k3
15 -30 uvolneni represe az 1000 kopii kokos; 17.4.2010
Který kmen E.coli zvolit?
tonA tonA mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacZ lacZ.M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal endA1 endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA lacIq lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru; zrušení přídavkem IPTG mcrA mcrA, mcrBC mcrBC,, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA recA1 recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli
Nejpoužívanější laboratorní kmeny E.coli kmen
mutace
účel
firma
BL21(DE3)
deficientní deficientní na proteasy
obecná obecná exprese
Stratagene
BL21 (DE3) pLysS
deficientní deficientní na proteasy, proteasy, exprese lysosymu
přesně esně řízená zená exprese
Novagen
BL21 Star (DE3)
RNaseE mutant
exprese s redukovanou degradací degradací RNA
Invitrogen
DB3.1
gyrA462 gyrA462 alela
propagace GATEWAY vektorů vektorů s toxickým genem ccdB ccdB
Invitrogen
DH5λ DH5λ
první první laboratorní laboratorní kmen
propagace plasm plasmidu, idu, klonová klonování.
Life Technologies
Origami (DE3) trxB a gor mutant
exprese, tvoř tvoří disulfidické disulfidické můstky v cytoplasmě cytoplasmě
Novagen
Rosetta
Geny pro argU, argU, argW, argW, glyT, glyT, IleX, IleX, leuW, leuW, metT, metT, proL, proL, thrT, thrT, thrU, thrU, and tyrU
exprese eukaryotní eukaryotních genů genů
Novagen
Top10
ara mutant
propagace plasmi du,, klonová plasmidu klonování.
Invitrogen
regulace exprese pod T7 promotorem • exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein • pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. • v sytému pCR®T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněk
kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS
•
před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein
•
kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG)
•
někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol.
•
T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice
•
T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.
Jaké geny lze v E.coli exprimovat? • většinu z prokaryotických organismů • eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím • většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná) • geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost)
• všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě
stabilizace exprimovaného proteinu
2004
SUMO peptide – Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před proteolýzou zvyšování rozpustnosti proteinu zvyšuje množství exprimovaného proteinu
Sumo proteasa
kvasinkové expresní systémy • • • • •
jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu rychlá propagace a jednoduchá média jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními, „shuttle“ shuttle vektor) vektor většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační modifikace – glykosylace, folding) jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média
hostitelské organismy:
Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pichia pastoris Hansela polymorpha Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica
k9 k10
Saccharomyces cerevisiae (od 1979)
SHUTTLE VEKTOR • GAL1 promotor zajišťuje induktivní expresi vloženého genu • T7 promotor/priming promotor/priming site umožňuje in vitro transkripci a sekvenaci inzertu • Multiple cloning site má 9 jedinečných klonovacích míst • CYC1 terminátor transkripce, stabilizuje mRNA transkript • pMB1 origin (pUCpUC-derived) derived) udržuje „high copy“ replikaci v E. coli • Ampicillin resistance gene selekce v bakterii • URA3 selekce kvasinek v uracil-deficientním médiu • 2 μ origin udržování replikace v kvasince • f1 origin produkce single-stranded DNA
Snímek 45 k9
epimerasa galaktosy UDP-glucosa na UDP galaktosa kokos; 22.4.2010
k10
CYC1 cytochrom c oxidase kokos; 22.4.2010
Saccharomyces cerevisiae
REGULACE EXPRESE • u kmene INVSc1 je transkripce z GAL1 promotoru inhibována přítomnosti glukosy v médiu • transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako zdroje uhlíku do média • alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahující rafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy HOSTITELSKÉ BUŇKY A) standardní kmen E. coli např. TOP10F který slouží pro namnožení plasmidu, jeho udržování a manipulaci s ním. B) kmen S.cerevisiae INVSc1 Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, UraINVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl.
Saccharomyces cerevisiae SEKRECE HETEROLOGNÍHO PROTEINU V KVASINKÁCH • sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný sekreční signální peptid • některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem • často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od S.cerevisae genů pro invertasu (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa-faktor (MFa1) POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY HETEROLOGNÍHO PROTEINU • N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu neaktivního heterologního proteinu • např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky treoninu a serinu zatímco vyšší eukaryota preferuji O-glykosylaci sialovou kyselinou • tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od původních proteinů • N-glykosylace většinou probíhá bez problému • problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylací, acetylací, methylací, miristylací a isoprenylací • problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované cizí proteiny
g10
Pichia pastoris
• v ideálních případech poskytuje 10 až 100 krát vyšší výtěžky než klasická Saccharomyces • klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces • selekce – zeocin nebo nutriční autotrofie • Pichia přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů než Saccharomyces zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu Pichia pastoris je methylotrofní organismus tzn. jako zdroj uhlíků využívá metanol • nejdříve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu) za přítomností kyslíku, proces probíhá v peroxizomech jelikož vzniká toxický peroxid vodíku. Kvasinková AOX má velice slabou afinitu ke kyslíku a proto je AOX exprimováná ve velice velkém množství (5% veškeré mRNA). • toho využívá heterologní expresní systém, kdy je transgen vložen pod AOX promotor.
Snímek 48 g10
roste do vysoké density až sirupovitá galuszka; 1.3.2011
Pichia pastoris HIS4 selekce v Pichii ampicilinová selekce v bakterií AOX1 promotor AOX1 terminátor pBR322 bakteriální počátek replikace
f1 produkce ssDNA S – signální sekvence alfa faktoru 3´AOX1 – ORF pro AOX gen – místo pro homologní rekombinaci
Pichia pastoris
rekombinace a integrace v Pichia pastoris • transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky pomocí homologní rekombinace. • transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku • integrace na AOX1 lokus – gen narušen • může nastat i mnohonásobná inzerce s pravděpodobností 1-10% jednoduché inzerce
rekombinace a integrace v Pichia pastoris
MNOHONÁSOBNÁ REKOMBINACE A INTEGRACE v PICHII • selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu • je třeba otestovat stovky kolonií (1-10% účinnost)
různé typy selekce transformované Pichia pastoris
ANTIBIOTIKA • zeocin 50 μg - 2000 μg /mL • blasticidin • Kanamycin/G418 G418
kanamycin
• nutriční autotrofie – gen pro histidinol fosfatasu (his4) – lepší pro udržování integrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace) • narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat metanol pouze AOX2 (která má daleko nižší aktivitu 5%) • využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1
Pichia pastoris - glykosylace
N-glykany mají vysoký obsah manosy
Yarrowia lipolytica •
je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkány a mastné kyseliny
•
do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen XPR2)
•
promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimovám okolními vlivy
•
hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pXPR2 a vykazuje konstitutivní expresi
•
za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2 nebo sekretované lipázy
•
klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)
Yarrowia lipolytica • •
• • •
vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomu kvasinky) odvozené od základního plasmidu pBR322 pINA1267 – mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes jedinečné NotI místo pINA1294 – mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonová sekvence, která aktivuje nehomologní rekobinaci do genomu kvasinky hostitelský kmen na knockoutovány geny pro extracelulární proteasy do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace)
Heterologní exprese v Yarrowia lipolytica srovnání s ostatními heterologními systémy exprese kukuřičného enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy Escherichia coli (pTYBII cytosolická exprese s protein fusován s inteinem) ± 5 mg/litr média 3 dny Saccharomyces cerevicae (pYES2 sekrece do média) ± 2 μg/litr média
2 měsíce
Pichia pastoris pPICZ-A (přirozený signální peptid) ±10 μg/litr média
3 týdny
Pichia pastoris pPICZ-α (signální peptid z kvasinky) 1 mg/litr média Yarrowia lipolytica pINA1294 (signální peptid z kvasinky) 5mg/litr média přirozený zdroj – kukuřice (purifikace) 2 μg/kg média kukuřičných zrn
3 týdny
1 týden
3 měsíce
mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) • gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba mít v libovolném vektoru • navržení dvou reverzně komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci • vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) • ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) • transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu • 100% účinnost není třeba selekce mutovaný/nemutovaný
mutace místně cílená
originá originální lní plasmid
(site-directed mutagenesis) původní sekvence forward primer reverse primer
M G A L L W L 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’ 3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’ 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’ M G A L L S L
nastavení nastavení PCR s PfuTURBO Taq
PCR s ní nízkým poč počtem cyklů cyklů
PfuTURBO termostabilní DNA polymerasa - nejmenší chybovost - 3´- 5´exonukleasová aktivita DpnI
restrikce s DpnI
XL10-Gold kmen E.coli - nemá knockoutované metyltransferasy transformace a namnož namnožení ení
CÍLENÁ MUTACE KOZAKOVÁ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mRNA) u eukaryot. gccRccATGG
obratlovci
cAAaATG
Drosophila spp.
Saccharomyces cerevisiae aAaAaAATGTCt rostliny
aAcaATGGc
-6 -5 -4 Kozak seq. U A A
AtCKX1 AtCKX2 HvCKX2
G A A
U A G
A A A
-3 -2 -1 start codon +4 +5 +6 A C A A U G G C U 60% 100% 70% G C G
A A C
A A C
A A A
U U U
G G G
G G A
G C G
A U G
syntéza genů na zakázku Minimum charge 0 – 999 bp 1000 – 1999 bp 2000 – 3000 bp price/bp
$159
turnaround time 12#
$0.39/bp
$0.39/bp
$0.39/bp
12#
12#
17#
syntéza DNA ochrana N-bází FOSFORAMIDIT
Syntéza umělého genu
odchylky v genetickém kódu snižují výtěžek heterologní exprese výjimky:
jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC
E. coli AGA 2.2% AGG 1.6%
AGA AGG
Arabidopsis th.
H. sapiens
AGA 18.9% AGG 11.0%
AGA 11.9% AGG 12.1%
Optimalizace syntetického genu firmou Mr.GENE 1. Úprava kodonů 2. Vyvarování se terciárním strukturám mRNA 3. Vyhledávání specifických motivů např. Shine-Dalgarnova sekvence 5'-AGGAGGU-3' polyadenylační signály
NOVÉ METODY SEKVENCOVÁNÍ: Pyrosekvencování
DNA polymerasa dNTP mix ATP sulfurylasa Adenosine 5 fosfosulfát Luciferasa Luciferin Apyrasa
1. Izolace genomové genomové DNA a restrikce na vhodné vhodné fragmenty (300(300-800 bp) bp) 2. Zatupení Zatupení konců konců a navá navázání adaptorové adaptorové sekvence s biotinovou znač značkou (modrá (modrá) a druhé druhé bez (č (červená ervená) 3. Navá Navázání na kulič kuličky se streptavidinem 4. Nanesení Nanesení na mikroreaktorovou destič destičku 5. Provedení Provedení emulsní emulsního PCR (č (červený a modrý primer) primer) 6. Paralelní Paralelní pyrosekvencová pyrosekvencování ve vš všech jamká jamkách
Roche 454/GS FLX Sequencing Technology
Illumina/Solexa 1. 2.
4.
5.
metoda cyklické reverzibilní terminace 3.
6.
„Bridge“ PCR
cyklická reverzibilní terminace
Chemické štěpení ve vodném prostředí za katalýzy paladiem DEALLYLACE
Illumina/Solexa - vyhodnocení
SROVNÁNÍ platforma
Příprava templátu
chemismus
Délka jednoho čtení (bp)
Doba běhu
Přečtené Gb na jeden běh
Cena přístroje (USD)
ROCHE 454
Fragmentace + emulsní PCR
ILLUMINA SOLEXA
Fragmentace + „bridge“ PCR
Cena přečtení lidského genomu
pyrosekvencování
330
8 hod.
0.45
500.000 1.000.000
Cyklická reverzibilní terminace
35
9 dní
35
540.000 200.000
ROCHE 454 + dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy) + rychlé -- chyby v homopolymerních repeticích (AAAAAAAAA, GGGGGGGGGGG)
ILLUMINA/ + nejpoužívanější SOLEXA + obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu -- nízká multiplexita
ODSEKVENOVANÉ GENOMY
největší význam DIAGNOSTIKA •
zlevnit přesekvencování lidského genomu na 1.000 USD (do roku 2015) (nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystems, HELIOS)
•
CANCER GENOME ATLAS
•
TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-seq) – výhoda oproti DNA čipům je že 100% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu
•
SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios) – preinplantační diagnostika
•
SOLID PHASE CAPTURE – NimbleGene™ čip vyrobený pro vychytání kodujících sekvencí a regulačních oblastí z fragmentované genomické DNA před vlastním vysokoúčinným sekvencováním
