Principy a využití qPCR KBC/BAM Pokročilé biochemické a biotechnologické metody
Mgr. Mária Šmehilová, Ph.D. UP‐PŘF‐CRH Oddělení molekulární biologie
Úvod do PCR • PCR - 1984 Kary Mullis (Nobelova cena za chemii, 1993)
Úvod do PCR PCR – jednotlivé fáze: y
Exponenciální ◦ Jestliže je efektivita reakce 100% – produkt se přesně zdvojnásobí ◦ Specifická a precizní
y
Lineární ◦ Vysoká variabilita ◦ Jsou spotřebovávány reakční komponenty a PCR produkty začínají degradovat
y
Plateau ◦ End-point analýzy - reakce je ukončena, PCR produkty degradují
Úvod do PCR
PCR phases in linear view
Oblast detekce konvenční PCR
Plateau
Linear
[DNA] Exponential
Oblast detekce Real-time qPCR Cycle #
Konvenční PCR
Izolace DNA/RNA (přepis)
• DNA-polymeráza • standardní termocyklér • detekce na gelu
PCR - Amplifikace
Elektroforéza
Konvenční PCR Výhody • Efektivní metoda • Rychlá analýzy (od 30 min do 2 h) • Vysoká specifita a citlivost • Relativně levná Nevýhody • Nemožnost automatizace • Nízká přesnost • Obtížná kvantifikace • Rozlišení pouze na základě velikosti produktu • Výsledky těžko interpretovatelné v číslech • Stejný end-point u různého počátečního množství templátu • Různý end-point u stejného počátečního množství templátu • Malé dynamické rozmezí
Real-Time PCR • Real-time PCR monitoruje fluorescenci emitovanou v průběhu reakce jako indikátor tvořeného amplikonu v každém cyklu PCR (v reálném čase) • Speciální real-time PCR termocykléry s detektory umožňují kvantifikaci v reálném čase a díky sběru dat i automatizaci
AB StepOnePlus Real-time PCR thermal cycler
Princip metody •
•
Kvantifikace: detekce fluorescence, která se uvolňuje v přímé úměře na množství amplifikované DNA při použití fluorescenčního substrátu v PCR reakci Fluorescence: - barvivo interkalující s dvouřetězcovou DNA (např. SYBR® Green) - hydrolýza specifické fluorescenční sondy komplementární k amplikonu (např. TaqMan) - hybridizace specifické fluorescenční sondy (FRET)
Fluorescence SYBR Green:
TaqMan:
SYBR Green • barvivo, které po vazbě na dsDNA emituje silný fluorescenční signál • nevýhodou je nespecifita vazby • nutná optimalizace • nutná analýza křivky tání • neúměra signálu u různě dlouhých produktů • omezené použití pro multiplex
TaqMan próby • sekvence o velikosti primeru komplementární k specifickému místu templátu • kovalentně vázaný fluorofor na 5´ konci próby • kovalentně vázaný zhášeč (quencher) na 3´ konci póby • princip založen na využití 5´-3´ exonukleasové aktivity Taq DNA polymerázy • množství detekované fluorescence je přímo úměrné množství fluoroforu uvolněného z DNA přítomné v PCR reakci • vysoká specifita detekce
5' exonukleasová aktivita Taq DNA polymerasy
Mocellin et al. Trends Mol Med 2003
TaqMan – používané fluorofory a zhášeče
NFQ – non fluorescent quencher (TaqMan MGB próby) Nutné ověřit kompatibilitu páru fluorofor-zhášeč! Při multiplexu je nutné vybrat páry s minimálním překryvem spekter!
www.giagen.com
Reference dye • Pro normalizaci PCR-nezávislých kolísání fluorescence • Pomáhá tvořit stabilní baseline pro kvantifikaci • Používáním referenčních barviv se eliminuje re-kalibrace cykléru a jeho nastavení ROX – konjugát glycinu s 5-carboxy-X-rhodaminem, sukcinimidyl esterem
• bez přirozené autofluorescence – nižší fluorescence pozadí • zvyšuje se poměr signál:šum – zvyšuje se citlivost • maximalizuje se překryv spekter – zvyšuje se efektivita zhášení • umožňuje širší výběr reportérových barviv pro multiplexing
www.sigmaaldrich.com
TaqMan Primery
• Tm (58 - 600 C) • délka 15 - 30 bp • obsah G+C 30 - 80% • ideálně žádné opakování G nad 4 • ne víc než 2 G+C na 3’ konci • žádný G na 5' konci • velikost amplikonu 50 - 150 bp • pokrytí přechodu exon-exon v cDNA
Další typy prób používané v qPCR
Wong & Medrano (2005) BioTechniques 39:75-85
Terminologie Real-time qPCR •
Matematické vyjádření amplifikace PCR
•
Amplifikační křivka - baseline, mez detekce, CT, ∆Rn
•
Kinetika Real-time qPCR - kvantifikace, efektivita, dynamické rozpětí
Log fluorescence (Rn)
Amplifikační křivka
Baseline – fáze obsahující amplifikaci pod mezí detekce přístroje Threshold – práh detekce vznikající fluorescence (v místě protnutí amplifikační křivkou je definováno CT) CT – (cycle threshold) počet cyklů, který vznikající fluorescence potřebuje k překročení prahu detekce Rn – podíl intenzit emisí fluorescence reportérového barviva a pasivního barviva ∆Rn – (Rn-baseline), je počítáno jako rozdíl Rn hodnot vzorků a negativní kontroly nebo pozadí, čímž vyjadřuje množství signálu generovaného v PCR reakci
CT •
Hodnota CT udává cyklus, ve kterém dojde poprvé k významnému vzestupu ∆Rn, což koreluje s počátečním množstvím templátu v reakci
•
Základní parametr používaný v kvantifikaci
•
Hodnota CT nad 40 znamená žádnou amplifikaci a nemůže být použita k výpočtům pro kvantifikaci
•
Teoreticky jediná kopie cílové molekuly by měla vytvořit CT hodnotu 40 za předpokladu 100% efektivity reakce
∆Rn •
Rn+ je hodnota Rn reakce obsahující všechny komponenty, hodnota Rn- je hodnota Rn slepé (negativní, bez templátu, NTC) reakce (hodnoty baseline)
•
∆Rn hodnota představuje rozdíl mezi Rn+ a Rn-, zároveň je tedy indikátorem velikosti síly signálu tvořeného během PCR
•
∆Rn je vynášeno proti počtu cyklů PCR, čímž jsou tvořeny amplifikační křivky a stanoveny hodnoty CT
Matematické vyjádření PCR
Xn A
Xn = X0(1 + E)n
X0 Počet cyklů Xn = množství PCR produktu po n cyklech X0 = počáteční počet kopií E = efektivita amplifikace n = počet cyklů
Efektivita qPCR (%) • Je dána směrnicí lineárního vynesení CT vůči logaritmu počtu kopií E = 10(-1/směrnice) -1 (x100 pro %) • Exponenciální amplifikace: E = 10(-1/směrnice) • Efektivita reakce: - 100% (2 kopie v každém cyklu) dělá směrnici -3,3219 - ideálně v rozmezí 90-110% • Efektivitu reakce snižuje: - délka amplikonu - sekundární struktura - vlastnosti primerů,…
Stanovení efektivity Real-time PCR
Příklad: stanovení efektivity PCR pro referenční gen (Gst), analyzovaný gen 1 (TyrA) a 2 (TyrB). Směrnice přímek vypočítány z CT (v průsečících s regresní přímkou) vůči počátečnímu množství DNA (průměr ze tří měření) Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Res 2001
Matematické vyjádření PCR
Xn
Xn = X0(1 + E)n
A
Xn = PCR produkt po n cyklech X0 = počáteční počet kopií E = efektivita amplifikace n = počet cyklů
X0 Počet cyklů
Rozdíl 0.1 v efektivitě amplifikace představuje pětinásobný rozdíl ve finálním množství PCR produktů po 30 cyklech. Xn = X0(1+E)n
Situace 1: E = 0.9
Situace 2: E = 0.8
Xn = 100 (1+0.9)30 Xn = 2.3 x 1010
Xn = 100 (1+0.8)30 Xn = 4.6 x 109
Dynamické rozpětí • Slouží k stanovení efektivity qPCR – demonstruje možnou matematickou variabilitu směrnice (efektivity), přesný výpočet efektivity PCR závisí na rozmezí množství templátu použitého pro série ředění • Analýza dynamického rozpětí se provádí ve 3 opakováních s minimálně 5 stupni ředění koncentrace templátu • Směrnice = -3,3±10% znamená efektivitu 100% ±10%, PCR s nižší efektivitou mají nižší citlivost
www3.appliedbiosystems.com
Kvantifikace – absolutní vs. relativní Absolutní • Přímo determinuje výchozí počet kopií cílových molekul • Založena na existenci lineárního vztahu mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a CT příslušné amplifikační křivky • Amplifikuje se vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci, vzniká kalibační přímka (standard curve), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku • Využití v detekci specifických mikroorganismů
www.generi-biotech.com
Kvantifikace – absolutní vs. relativní Relativní • Porovnává se relativní změna genové exprese (relativní expresní poměr) v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku • CT amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti CT housekeeping genu • Použití referenčního vzorku (endogenní, interní kontroly) • Ideální pro stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje sestrojení kalibrační přímky Srovnávací • Matematické stanovení • Kalibrační vzorek použit jako 1 standard • Ideální v případech, kdy stačí vyjádření v podobě poměrů, k ověřování trendů
Endogenní kontrola (Normalizace) • Pečlivý výběr genů pro endogenní kontrolu
Sabek et al. Transplantation 2002
• Obvykle provozní geny (housekeeping, vysoce abundantní s konstantní expresí) • Ideální použití kombinace endogenních kontrol • Nutná validace vybraných endogenních kontrol
Relativní kvantifikace s použitím endogenní kontroly
• CT hodnoty endogenních kontrol by měly být nižší než 22
Relativní kvantifikace • Ct je nepřímo korelováno s počátečním počtem kopií, v každém cyklu se zvojnásobuje množství amplikonů (při 100% E), rozdíl v 1 cyklu je tedy dvojnásobek kopií Metody pro stanovení relativní kvantity exprese genů - Založeno na porovnání Ct hodnot mezi sledovanými geny a geny kontrolními (provozními) „Metoda ∆∆Ct“ - Model bez korekce efektivity RQ = 2-∆∆Ct ∆∆ Ct = ∆ Ct vzorek - ∆ Ct kontrola ∆ Ct = Ct sledovaný gen - Ct gen provozní • Liší-li se CT: • Množství kopí je tedy
∆CT = 3,31 23,31 = 9,9 x
Relativní kvantifikace • Ct je nepřímo korelováno s počátečním počtem kopií, v každém cyklu se zvojnásobuje množství amplikonů (při 100% E), rozdíl v 1 cyklu je tedy dvojnásobek kopií Metody pro stanovení relativní kvantity exprese genů - Založeno na porovnání Ct hodnot mezi sledovanými geny a geny kontrolními (provozními) „Pfafflova metoda“ - Bere se v úvahu možný rozdíl mezi rychlostí-efektivitou amplifikace u jednotlivých genů, pro každý gen se stanovuje E = 10(-1/směrnice) - Výpočet poměru množství cílového ku referenčnímu genu: RQ = Etarget∆Cttarget(kontrola-vzorek) / Ehousekeeping∆Cttarget(kontrola-vzorek) - Na rozdíl od metody ∆∆Ct se ∆Ct počítá pro geny (stanovované a kontrolní) rozdíl (od kontrolních) u jednotlivých experimentálních vzorků
Příprava experimentu qPCR •
•
Příprava vzorků: - správný odběr vzorků - izolace nukleových kyselin (DNA, RNA – reverzní transkripce) Kvantitativní Real-time PCR: - příprava reakcí pro SYBR ® Green nebo TaqMan - kvantitativní PCR v Real-time termocykléru - analýza a vyhodnocení dat
Správný odběr vzorků • •
DNA: - DNAsy! RNA: - RNAsy! - flash freeze -80°C! - kontaminující materiál (jiná pletiva, tkáně, látky inhibující následný proces izolace NK)
Příprava reakcí pro analýzu •
SYBR vs. TaqMan chemismus SYBR Green – kdy ANO a kdy NE • Detekce nízkých hladin patogenů • Analýzy nevyžadující specifické rozlišení • Diskriminace alel • Screening transkriptů před analýzou s próbami • Multiplex analýzy • Při plně optimalizovaném PCR systému (žádná diverizace primerů, nespecifické amplikony) • Amplifikace neobvyklých amplikonů
• Navržení primerů, prób: - validované vs. vlastní design
Příprava reakcí pro analýzu Reakční komponenta • SYBR Green x TaqMan premix • Primery • Próby • Templát
Finální koncentrace 1x 300 (50-900) nM 250 (50-500) nM 100 ng/10µl
Nastavení cyklování - počet cyklů, teploty Step
Temp.
Time
Cycles
Initial denaturation
95°C
7 min
1
Denaturation
95°C
5s
Annealing/extension
60°C
30 s
- analýza křivky tání (60-95°C)
40 cycles
Kontrola lineárního průběhu exponenciální fáze
Linear view
log view
Analýza disociační křivky • Fluorescence se snižuje se vzrůstající teplotou • DNA vlákna se začínají oddělovat • SYBR green se uvolňuje z DNA • Fluorescence se snižuje • Jednoduchá detekce teploty tání amplikonu • Kontaminující DNA, dimery primerů nebo nesprávné vazby primerů jsou detekovány jako další peak • Detekce disociační křivky umožňuje detekci nespecifických produktů
www.generi-biotech.com
Vyhodnocení - výsledky Průběh amplifikace (křivky Ct)
Srovnání koncentrací vzorků (podle endogenní kontroly)
cDNA
Míra exprese analyzovaných genů RNA (neg. kontr.)
Kontrola denaturačních křivek
Logaritmické zobrazení amplifikace (stanovení společné meze detekce)
Aplikce Real-time qPCR - I • Kvantifikace exprese genů • Ověřování a validace metod • Quality control •Testování genetické stability a bezpečnosti pro životní prostředí • Stanovování účinnosti léčiv různých terapií / monitoring léčiv •Kvantifikace virů • Detekce patogenů
Aplikace Real-time PCR - II • Stanovení míry poškození DNA (nestabilita mikrosatelitů) • Hodnocení stupně ozáření • In vivo zobrazování buněčných procesů • Studie mitochondrialní DNA • Detekce metylací DNA • Detekce inaktivací na chromozomu X • LATE-PCR (linear-after-the-exponential): nová metoda pro analýzu počtu cílových molekul v extra malých vzorcích, což je použitelní pro rutinní analýzy ve velkých objemech (klinické diagnózy, DNA sekvenování, forenzní medicína)
Real-time PCR Applications - III • Identifikace vysoce polymorfních úseků antigenů lidských leukocytů (HLA loci) • Monitorování vývoje po transplantacích orgánů • Monitorování chimerismu po transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSCT) • Monitorování minimální residuální choroby po HSCT • Genotypizace (alelická diskriminace) - Trizomie a stanovení variability v počtu kopií - Mikrodelece v genotypech - Haplotypizace - Kvantitativní analýza mikrosatelitů - Prenatální diagnostika z fetálních buněk krve matky - Preoperační diagnostika nádorových onemocnění
Real-time qPCR ve forenzní medicíně
Wikimedia Commons/German National Archive
DNA analýza úlomků kostí exhumovaných na Urale v roce 2007 potvrdila totožnost dvou dětí posledního Ruského cara Mikuláše II Alexandroviče popravených v r. 1918.
Alelická diskriminace s TaqMan próbami
Stanovení počtu kopií • stanovení počtu kopií na základě rozdílů v hybridizaci prób
Barrois M et al. Clin Genet 2004
Real-time qPCR - nevýhody • Není úplně vhodá pro multiplexing (ale je možná) • Nastavování analýz vyžaduje značné technické zkušenosti • Relativně vysoká pořizovací cena zařízení • Intra- a inter- variace mezi analýzami RNA labilita • DNA kontaminace (u mRNA analýz)
