Berkala Penelitian HAYATI Edisi Khusus No.4F Tahun 2010 Terakreditasi B SK. No. 43/DIKTI/Kep/2008
BAKTERI TAHAN MERKURI DARI KALI MAS SURABAYA BERPOTENSI SEBAGAI AGEN BIOREMEDIASI MERKURI Maya Shovitri, Enny Zulaika, dan Maharani P. Koentjoro Jurusan Biologi FMIPA, ITS. Gedung H Kampus Sukolilo, Surabaya. Telp/Fax. O31-5963857. Email:
[email protected]
ABSTRACT A mercuric ion (Hg2+) is a potentially toxic for environment. But anyhow environment has a natural cleaning process, for instance performed by bacteria. Some bacteria are able to reduce a toxic mercuric ion Hg2+ to a less toxic mercuric ion Hg0. The Mas River, Surabaya was contaminated by mercury of about 0.105 ppm. Concerning to develop a technology for mercury bioremediation, this was a preliminary study focused on isolation and biochemical characterization mercury resistant bacteria from the Mas River. Nine (9) bacterial isolates with resistance up to 10 ppm HgCl2 were successfully isolated, purified and characterized. Based on a serial biochemical tests, they were most probable affiliated with genus Lampropedia, Providencia, Serratia, Shigella, Enterobacter and Bacillus. Key words: mercury, mercury resistant bacteria, the Mas River Surabaya
PENGANTAR Pada kondisi alami konsentrasi merkuri di lingkungan sangat rendah, yaitu sebanyak 1 nanogram/liter. Akan tetapi karena stimulus beberapa faktor, konsentrasi tersebut dapat meningkat dan menyebabkan pencemaran yang membahayakan kehidupan makhluk hidup (Boening, 2000; Bryan and Lanston, 1992; Zilloux et al., 1993; Gravis and Furguson, 1972). Di sisi lain secara alami ada beberapa bakteri yang tahan terhadap merkuri dan menurunkan pencemaran mercuri, seperti Pseudomonas, Bacillus, Serratia, dan Enterobacter (Caslake et al., 2005; Kamala and Krishnamoorthy, 2006; Thotova et al., 2006), karena mempunyai operan gen mer yang menyandi enzim merkuri reduktase yang terkait dengan NADPH. Enzim ini mereduksi ion merkuri yang bersifat racun Hg2+ menjadi ion Hg0 yang tidak berbahaya seperti reaksi 1 (Murtaza et al., 2005; Zeroual et al., 2003; Begley et al., 1986; Nakamura and Silver, 1994; Schiering et al., 1991; Madigan and Martinko, 2006). Hg2+ + NADPH Hg 0 + NADP+ + H+
(1)
Kali Mas, sebuah sungai besar di Surabaya, terukur mengandung merkuri sebesar 0.105 ppm. Konsentrasi tersebut melebihi ambang batas minimal yaitu 0.001 ppm yang ditetapkan Pemerintah melalui PP no. 82 tahun 2001. Karena merkuri yang masuk ke perairan pada umumnya berupa ion Hg2+ (Nakamura et al., 1999; Madigan and Martinko, 2006), maka Kali Mas dapat dikatagorikan telah tercemar racun merkuri. Dimana dari sudut kesehatan, keracunan merkuri dapat merusak hati dan ginjal serta mengganggu sistem syaraf dan pencernaan manusia (Nakamura et al., 1999; Manohar et al., 2002). Penelitian ini adalah studi awal yang bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri tahan merkuri dari Kali Mas Surabaya. Target studi ini adalah selain untuk mengetahui apakah di Kali Mas juga 1
terdapat bakteri tahan merkuri yang dapat melakukan bioremediasi alami, juga untuk mendapatkan koleksi isolat bakteri tahan merkuri yang selanjutnya akan dikembangkan menjadi sebuah teknologi bioremediasi merkuri yang merupakan sebuah aplikasi yang bernilai penting.
BAHAN DAN CARA KERJA Sampel adalah air dan sedimen yang diambil dari Kali Mas Surabaya (S: 07°17’48,6” dan E:112°44’30,1” (Garmin, Etrex 12 Channel®, Taiwan) dan disimpan secara terpisah di botol fial steril. Isolasi dan pemurnian bakteri dilakukan secara aseptis dengan medium biakan Nutrient Agar (Merck®, Jerman) yang mengandung 10 ppm HgCl 2. Isolasi dilakukan dengan menggunakan metode sebar dengan pengenceran bertingkat. Setiap koloni bakteri yang tumbuh setelah 24 jam pada suhu 37oC diamati dan dipindahkan ke medium baru dengan metode goresan. Kemudian setelah 24 jam, satu koloni yang tumbuh dipindah lagi ke medium baru. Pemindahan dilakukan beberapa kali sampai diperoleh isolat bakteri murni dari satu koloni. Isolat murni adalah bakteri yang secara mikroskopis mempunyai bentuk morfologi sel yang sama setelah diwarnai dengan methylene blue. Serangkaian uji biokimia menurut Bergeys manual of determinative bacteriology (Holt et al., 1994) dilakukan untuk karakterisasi isolat bakteri. Karakter biokimia yang diuji adalah jenis gram membran sel, pembentukan endospora, kebutuhan oksigen, kemampuan fermentasi karbohidrat (glukosa, laktosa, dan manitol), katalase, produksi hidrogen sulfida, motilitas, pembentukan indol, metil merah, Voges-Proskauer, sitrat, dan urease. Kurva pertumbuhan isolat bakteri juga diukur setiap jam selama 24 sampai dengan 46 jam dengan mengukur kekeruhan pertumbuhan isolat di medium cair Luria Bertani dengan spektrofotometer (Geneys 20, 4001/4®, USA) pada panjang gelombang 600 nm (Cappuccino and Sherman, 2001; Harley and Prescott, 2002). Kemudian kurva pertumbuhan dianalisa dengan pendekatan Time series dan Quadratic Trend Model melalui program statistika Minitab 14.
HASIL Sembilan (9) bacteria berhasil diisolasi dan dimurnikan. Bakteri berbentuk basil tunggal (HgA4, HgS2, HgS3, HgS7, HgS8, HgS12, HgS13), diplobasil (HgA3), dan kokus tunggal (HgS6) (Gambar 1). Berdasarkan karakter biokimia (Tabel 1), isolat bakteri cenderung masuk genus Lampropedia (HgS6), Providencia (HgA3), Serratia (HgS8), Shigella (HgS2 dan HgS12), Enterobacter (HgA4 dan HgS3), dan Bacillus (HgS7 dan HgS13). Meskipun genus Shigella, Enterobacter, dan Bacillus masing-masing diperoleh 2 isolat, tetapi berdasarkan pola kurva pertumbuhan kedua isolat tersebut ada kemungkinan berbeda spesies. Contoh isolat HgA4 dan HgS3 dari Enterobacter. Kedua isolat tersebut memerlukan waktu adaptasi yang sama, yaitu 3 jam (Gambar 2), tetapi ketika memasuki fase logaritma, kecepatan pembelahan binari mereka berbeda. HgS3 lebih cepat pertumbuhannya (slope kurva 0,18t) daripada HgA4 (slope kurva 0.11t). Slope suatu kurva pertumbuhan menunjukkan kecepatan pertumbuhan spesifik suatu bakteria pada suatu keadaan tertentu, dimana kecepatan tersebut dipengaruhi oleh faktor intrinsik and ekstrinsik dari bakteri tersebut (Arrigo et al., 2006). Fenomena yang sama juga terlihat pada isolat HgS2 dan HgS12 dari genus Shigella, isolat HgS7 dan HgS13 dari genus Bacillus.
2
Gambar 1. Morfologi sel dari isolat bakteri. Perbesaran 1000X. Skala 1: 1.18 µm Tabel 1. Karakter Biokimia Isolat Bakteri Isolat Karakter Gram Spora Katalase Motilitas MR VP Sitrat Indol F. Glukosa F. Laktosa F. Manitol Urease H 2S Obl. aerob Fak. anaerob Afilisasi Genus
HgA3
HgA4
HgS2
HgS3
HgS6
HgS7
HgS8
HgS12
HgS13
+ + + + + + +/-/+/+ +
+ + + + + +/+ +/+/+ +
+ + + +/-/-/+
+ + + + + +/+ +/+/+ +
+ + + + +/-/-/+
+ + + + + + + +/+ +/+ +/+ +
+ + + + +/-/+/+
+ + + + +/-/-/+
+ + + + + +/-/-/+
Providencia
Enterobacter
Shigella
Enterobacter
Lampropedia
Bacillus
Serratia
Shigella
Bacillus
Keterangan : MR = Metil Merah, VP = Voges Proskouer, F = Fermentasi (Asam/Gas), Obl. = Obligat; Fak. = Fakultatif
3
Gambar 2. Kurva pertumbuhan isolat bakteri. (=actual value; ▪ = fitted value; = forecasting value)
PEMBAHASAN Studi awal ini mendapatkan 9 isolat bakteri yang mampu hidup pada cekaman merkuri tinggi 10 ppm HgCl2. Canstein et al. (2002) menyebutkan bahwa isolat bakteri yang mampu hidup minimal pada 5 ppm HgCl2 sudah termasuk kategori bakteri berketahanan tinggi terhadap merkuri. Kesembilan isolat tersebut berdasarkan karakter biokimianya cenderung masuk ke dalam genus Lampropedia, Providencia, Serratia, Shigella, Enterobacter, dan Bacillus. Meskipun sudah diketahui genusnya, identifikasi lanjutan masih perlu dilakukan, untuk menambah informasi karakter biokimia di tingkat genus dan mengetahui nama di tingkat spesies. Pendekatan molekuler juga akan mendukung proses identifikasi ini, misalnya dengan sekuensing gen 16S rRNA dari masing-masing isolat. Genus Serratia, Shigella, Enterobacter, dan Bacillus sudah dilaporkan sebagai bakteri tahan merkuri (Kamala and Krishnamoorthy, 2006; Kafilzadeh and Mirzaei, 2008; Thotova et al., 2006; De et al., 2003), sedangkan genus Lampropedia dan Providencia belum pernah dilaporkan. Ini memberikan peluang untuk mengkaji lebih lanjut tentang potensi kedua genus tersebut sebagai bakteri tahan merkuri. Menurut Holt et al. (1994), genus Lampropedia belum diketahui secara jelas niche ekologinya, tetapi dapat ditemukan pada lingkungan yang kaya dengan senyawa organik, sedangkan genus Providencia di kotoran manusia penderita diare. Melihat kemampuannya tumbuh di medium yang mengandung 10 ppm HgCl2, dapat disebutkan bahwa kesembilan isolat bakteri tersebut mempunyai suatu mekanisme tertentu dalam mengatasi cekaman merkuri. Mekanisme yang banyak dilaporkan adalah bakteri memiliki operon gen mer yang salah satunya menyandi enzim merkuri reduktase. Enzim ini mengkatalisis reduksi ion merkuri Hg2+ yang bersifat racun menjadi ion merkuri Hg0 yang bersifat kurang/tidak beracun (Nascimento and Souza, 2003; Brown et al., 2002; Liebert et al.,
4
1999). Sebagai studi awal, mekanisme ketahanan merkuri dari 9 isolat bakteri belum dikaji. Sehingga selanjutnya banyak sekali studi yang perlu dilakukan untuk mengeksplorasi ke-9 isolat bakteri dari Kali Mas Surabaya ini yang terbukti berpotensi sebagai agen bioremediasi merkuri. Studi lanjutan tersebut antara lain adalah uji kemampuan reduksi merkuri dengan mendeteksi konsentrasi Hg2+ dan Hg0 dalam suatu medium buatan pada awal dan akhir masa inkubasi. Dari uji tersebut akan dapat diketahui apakah ke-9 isolat tersebut melakukan mekanisme yang sama seperti bakteri tahan merkuri yang telah dilaporkan (Nascimento and Souza, 2003; Brown et al., 2002; Liebert et al., 1999) atau dengan mekanisme lain seperti metilisasi dan demetilisasi logam berat (Nascimento and Souza, 2003). Kajian molekuler kemudian juga dapat dikembangkan untuk mendeteksi keberadaan dan sekuensing operon gen mer di isolat bakteri genus Lampropedia dan Providencia dari Kali Mas Surabaya, dimana kedua genus ini yang belum pernah dilaporkan sebagai bakteri tahan merkuri.
KESIMPULAN Sembilan isolat bakteri tahan merkuri 10 ppm HgCl2 telah berhasil diisolasi dan dimurnikan dari Kali Mas Surabaya. Berdasarkan karakter biokimia, isolat-isolat tersebut cenderung masuk dalam genus Lampropedia, Providencia, Serratia, Shigella, Enterobacter, dan Bacillus.
UCAPAN TERIMA KASIH Kami mengucapkan terima kasih kepada DIPA ITS 2009 yang telah mendukung penelitian ini dan kepada bapak Prof. Drs. Nur Iriawan, MIKom., PhD. yang telah membantu analisis statistika kurva pertumbuhan bakteri.
KEPUSTAKAAN Arrigo M, Garcia G, Velasco R, Ordonez J, George S, dan Pin C, 2006. Indirect Measurement of the Lag Time distribution of Single Cells of Listeria innocua in food. Applied and Environmental Microbiology. P. 2533-2538. Begley TP, Walts AE, dan Walsh CT, 1986. Bacterial Organomercuric Lyase: Overproduction, Isolation and Characterization. Biochemistry 25: 7186–7193. Boening DW, 2000, Ecological Effects, Transport And Fate of Mercury : A General Review. Chemosphere. 40 :1335-1351. Brown N, Shih Y, Leang C, Glendinning K, Hobman J, dan Wilson J, 2002. Mercury Transport and Resistance. Biometals 2002. Third International Biometals Symposium. Bryan GW dan Lanston WJ, 1992. Bioavailability, Accumulation and Effects of Heavy Metals In Sediments With Special Reference To United Kingdom Estuaries. A Review. Environ. Pollut. 76 : 89-131. Canstein HV, Li Y, Leonhauser J, Haase E, Felske A, Deckwer WD, dan Dobler IW, 2002. Spatially Oscillating Activity and Microbial Succession of Mercury-Reducing Biofilms in a Technical-Scale Bioremediation System. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1938-1946. Cappucino JG dan Sherman N, 2001. Microbiology: A Laboratory Manual. Benjamin Cummings Publishing : United State of America. Caslake LF, Harris SS, Williams C, dan Waters NM, 2005. Mercury-Resistant Bacteria Associated with Machrophytes from a Polluted Lake. Journal Springer. Departement of Biology-Lafayette College : Philadelphia. 5
De J, Ramaiah N, dan Mesquita A, 2003. Tolerance to Various Toxicants by Marine Bacteria Highly Resistant to Mercury. Journal of Marine Biotechnology 5: 185-193. Gravis J dan Furguson JF, 1972. The Cycling of Mercury Through The Environment. Water Res. 6: 989–1008. Harley JP dan Prescott LM, 2002. Laboratory Exercises in Microbiology 4th Edition. The McGraw−Hill Companies : New York. Holt JG, Krig NR, Sneath P, Staley J, dan Williams S, 1994. Bergeys Manual Of Determinative Bacteriology 9th Edition. Lipincott Williams and Wilkins Company : Philadelphia USA. Kafilzadeh F dan Mirzaei N, 2008. Growth Pattern of Hg Resistant Bacteria Isolated from Kor River in the Presence of Mercuric Chloride. Journal of Biological Sciences 11 (18) :2243-2248. Pakistan. Kamala S dan Krishnamoorthy R, 2006. Isolation of Mercury Resistant Bacteria and Influence of Abiotic Factors on bioavailability of Mercury-A Case Stud in Pulicat Lake North of Chennai, South East India. Science of Total Environment 367 : 341-353. Liebert CA, Hall RM, dan Summers AO, 1999. Transposon Tn21, Flagship of the Floating Genome. Microbiology Moleculer. Biol. Rev, 63 : 507-522. Madigan MT dan Martinko JM, 2006. Brock Biology of Microorganisms. 11nd. Upper Saddle River, New Jersey: Pearson Education, Inc. Manohar DM, Anoop K, Krishman TS, dan Anirudhan, 2002. Removal of Mercury (II) From Aqueous Solutions and Chlor Alkali Indistry Wastewater Using 2-Mercaptobenzimidazole-Clay. Water Res. 36 :16091619. Murtaza I, Dutt A, Mushtaq D, dan Ali A, 2005. Molecular Cloning and Genetic Analysis of Functional Mer b Gene From Indian Isolates of Escherichia coli. Current Microbiol. 51 : 297-302. Nakamura K dan Silver S, 1994. Molecular Analysis of Mercuryresistant Bacillus Isolates From Sediment of Minamata Bay, Japan. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4596–4599. Nakamura K, Hagimine M, Sakai, dan Furukawa K, 1999. Removal of Mercury From Mercury-Contaminated Sediments Using Acombined Method of Chemical Leaching and Volatilization ff Mercury By Bacteria. Biodegradation 10: 443–447. Nascimento AMA dan Souza E, 2003. Operon mer: Bacterial Resistance to Mercury and Potential for Bioremediation of Contamined Environments. Journal Genetics and Molecular Research 2(1):92-101. Peraturan Pemerintah (PP) Republik Indonesia No. 82 Tahun 2001 Tentang Pengelolaan Kualitas Air dan Pengendalian Pencemaran Air. Schiering N, Kabsch W, Moore MJ, Distefano MD, Walsh CT, dan Pfeiffer, 1991. Structure of The Detoxification Catalyst Mercuric Ion Reductase From Bacillus sp Strain RC 607. Nature 353: 168–171. Thotova P, Prita P, dan Javorsky P, 2006. Mercuric Reductase Gene Transfer From Soil Bacteria to Rumen Bacteria. Folia Microbiology, 51 : 317-319. Zeroual Y, Moutaouakkil A, Dzairi FZ, Talbi M, Chung PU, Lee K, dan Blaghen M, 2003. Purification And Characterization of Cytosolic Mercuric Reductase From Klebsiella pneumoniae. Ann. Microbiol. 53 : 149-160. Zilloux EJ, Porcella DB, dan Benott JM, 1993. Mercury Cycling and Effects In Freshwater Wetland Ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 12 : 2245 -2264.
6
