POTENSI BAKTERI Bacillus SEBAGAI AGENSIA BIOREMEDIASI LIMBAH INDUSTRI YANG MENGANDUNG MERKURI Enny ZULAIKA1*, Umi SHOLIKAH2 dan Yulianto ADE PRASETYA2 1
Program Studi Biologi-FMIPA, Kampus ITS Sukolilo, Surabaya 60111 2 Mahasiswa S1 Program Studi Biologi, FMIPA ITS, Surabaya * e-mail :
[email protected], Telp/Fax : 031-5963857 Abstrak
Bacillus merupakan bakteri di alam yang jumlah dan keanekaragamannya cukup tinggi baik species, habitat maupun potensinya. Bacillus dapat diisolasi dari berbagai macam habitat sampai habitat yang ekstrim seperti lingkungan yang tercemar merkuri. Bacillus S1Hg, S13Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg (koleksi laboratorium Mirobiologi dan Bioteknologi, Jurusan Biologi) dapat hidup di media yang mengandung merkuri sampai dengan 25 mg/L. Tujuan dari penelitian ini akan melakukan eksplorasi species dan potensi Bacillus sebagai dekontaminan merkuri, kemudian akan melakukan aplikasi dalam skala laboratorium sebelum di aplikasikan dalam skala industri. Genera Bacillus di atas juga resisten terhadap logam Pb, Cu dan Cd 25 mg/L, sehingga sangat berpotensi digunakan sebagai agensia dekontaminan logam berat Pb, Cu dan Cd. Kata kunci: Bacillus, merkuri, bioremediasi dan bioreduksi Key word: Bacillus, mercury, bioremediation and bioreduction
Pendahuluan Bakteri Bacillus di alam jumlahnya cukup banyak dan keanekaragamannya cukup tinggi, Bacillus dapat disolasi dari lingkungan perairan tawar, perairan asin, tanah, tanaman, hewan dan udara bahkan di lingkungan ekstrim (Pignatelli, 2009). Pada lingkungan ekstrim tercemar merkuri, bakteri yang dapat hidup dinamakan Bakteri Resisten Merkuri (BRM). Eksplorasi Bacillus yang merupakan BRM telah dilakukan di perairan yang tercemar merkuri seperti sungai di Iran (Kafilzadeh & Mirzaei, 2008), perairan pantai di India (Kamala & Krishnamoorty, 2006; De & Ramaiah, 2007), di Indonesia, eksplorasi Bacillus telah dilakukan di sungai Cisadane Banten (Badjoeri, 2008), sungai Sangon Kulonprogo Yogyakarta (Suheriyanto et al., , 2008), Sungai Kalimas Surabaya (Zulaika et al., 2011). Menurut Chojnacka (2010), bakteri yang diisolasi dari lingkungan yang tercemar logam berat mempunyai resistensi terhadap logam berat yang ada di sekitarnya. Seminar Pemetaan Potensi dan Inovasi Ilmu Pengetahuan, Teknologi, Seni dan Budaya (IPTEKSB) Jatim, Ristek-ITS, Surabaya, 2 Mei, 2012
Resistensi tersebut dapat melalui mekanisme biosorbsi dan/atau biakumulasi, berhubungan dengan adanya gen mer operon di kromosom, plasmid atau transposon yang mengatur mekanisme tersebut (Silver, 1996). Gen meroperon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan gen organomerkuri liase (merB) (Nascimento dan Souza, 2003). Gen merA adalah gen yang bertanggung jawab terhadap keberadaan enzim merkuri reduktase. Enzim merkuri reduktase akan memberikan 2 elektronnya kepada NADPH atau NADH sehingga Hg2+ berubah menjadi Hg0 yang bersifat volatil dan akan dikeluarkan dari sel (Brown et al., 2002). Bacillus S1Hg, S13Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg telah dikarakterisasi morfologi, fisiologi dan biokimianya, isolat tersebut sekarang merupakan koleksi laboratorium Mikrobiologi & Biotknologi, Jurusan Biologi FMIPA-ITS. Untuk mengungkap lebih mendalam tentang Bacillus yang akan digunakan sebagai agen bioremediasi merkuri maka diperlukan penelitian lanjutan, yaitu 1
(1) Kepastian identitas species/strain Bacillus dengan karakterisasi molekular 16S rRNA, (2) Pengaruh faktor lingkungan dan nutrisi untuk viabilitas Bacillus dalam mereduksi dan mengakumulasi logam merkuri, (3) Mengetahui aktivitas enzim merkuri reduktase di antara genera Bacillus, (4) Aplikasi bioaughmentasi Bacillus untuk mereduksi dan mengakumulasi merkuri di pengolah limbah skala laboratorium.
Metodologi 1. Karakterisasi molekular 16S rRNA pada Bacillus Karakterisasi molekular gen 16S rRNA terdiri dari beberapa tahap yaitu (1) isolasi DNA kromosamal, (2) PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan parsial universal primer forward 27F: 5’-AGAGTTTGA TCMTGGCTGAG-3’ (Lane et al., 1991), 533F: 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3’ (Weisburg et al. 1991) dan universal primer reverse 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3’ (Turner et al. 1999) untuk memperoleh sekuen gen 16S rRNA, (3) elektroforesis DNA hasil PCR dengan TE Agarose (Triana, 2005), sequencing gen 16 S rRNA sesuai prosedur ABI PRIMS 310 menggunakan mesin sequencer. 2. Pengaruh faktor lingkungan Bacillus dalam mengakumulasi dan mereduksi logam merkuri Faktor lingkungan sebagai parameter viabilitas Bacillus adalah sumber karbon sebagai nutrisi yaitu glukosa atau sukrosa (2%, 5%, 10%), knsentrasi HgCl2 (25, 50, 75 dan 100 mg/L). Sebanyak 4 ml kultur Bacillus (103 CFU/ml), 1 ml HgCl2 (1000 mg/L), medium cair Nutrient Broth sampai dengan volume total 40 ml (konsentrasi HgCl2 25 mg/L), untuk konsentrasi 50, 75 dan 100 mg/L menyesuaikan (Badjoeri, 2008). Kultur diinkubasi selama 24 jam, 48 jam dan 72 jam, kemudian konsentrasi Hg diukur dengan ICP (Inductively Couple Plasma) sebagai logam Hg yang tidak diakumulasi oleh sel Bacillus. Perbedaan konsentrasi awal dengan konsentrasi akhir
adalah konsentrasi logam Hg yang diakumulasi sel Bacillus. Perhitungan jumlah logam Hg yang diakumulasi Bacillus menggunakan metode Csuros dan Csuros (2002) dan efisiensi bioakumulasi Bacillus dengan formula Joshi (2003). 3. Mengetahui aktivitas enzim merkuri reduktase diantara genera Bacillus Aktivitas enzim merkuri reduktase diukur berdasarkan oksidasi NADPH atau NADH pada panjang gelombang λ 340 nm dengan metode Ogunseitan (1998). Bacillus yang telah dikulturkan (12 jam) disonikasi dengan ultrasonic processor, disentrifus kemudian supernatan ditampung sebagai ekstrak enzim (ml/jumlah sel). Tiga mililiter ragen Mercury Reduction Assay terdiri dari 50 mM bufer fosfat, 500 µM EDTA, 200 µM MgCl2.6H2O, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol, 0,1 NADPH atau 0,2 mM NADH, 0,5 ml ekstrak enzim dan HgCl2 dengan konsentrasi 25, 50, 75 dan 100 mg/L. Inkubasi dilakukan 30, 60, 90, 120 dan 150 menit. Aktivitas enzim merkuri reduktase diukur dengan spektrofotometer pada λ 340 nm. Satu unit aktivitas enzim merkuri reduktase didefinisikan sebagai jumlah NADH atau NADPH yang teroksidasi per menit/per jumlah sel. 4. Aplikasi bioaughmentasi Bacillus untuk mengakumulasi dan mereduksi merkuri di pengolah limbah skala laboratorium Bacillus yang telah diketahui potensi keunggulannya diaplikasikan pada pengolah limbah skala laboratorium. Pilot plan menggunakan lumpur atau limbah cair dari indutri yang diperkirakan menghasilkan limbah merkuri. Digunakan dua pilot plan, yang pertama tanpa penambahan Bacillus dan yang kedua dengan penambahan Bacillus. Parameter yang digunakan untuk menganalisis kemampuan Bacillus sebagai agen bioremediasi terdiri dari (1) Bioakumulasi, (2) Bioreduksi, (3) Aktivitas enzim merkuri reduktase dan (4) Efisiensi.
2
membentuk endospora, kemoorganotrof (oksidatif dan fermentatif), katalase positif, dan halotoleran NaCl 5% (Tabetl 1). Sedangkan karakterisasi molekular pada genera Bacillus belum dilakukan, diharapkan dari hasil karakterisasi molekular akan didapatkan strain anggota Bacillus yang mempunyai susunan genetik sama atau hampir sama dengan genomik Bacillus type strain yang ada di data bank sekuen gen 16S rRNA yang tersedia di website http://www.ncbi.nih.gove/Taxonomy
Hasil 1. Karakterisasi molekular 16S rRNA pada Bacillus Kepastian isolat S1Hg, S13Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg sebagai strain anggota genera Bacillus telah didapatkan melalui uji morfologi, fisiologi dan biokimia (Holt et al., 1994). Sifat tersebut adalah sel berbentuk batang dengan ukuran 0,5-2,5 µm x 1,210µm, bersifat Gram positif, motil, Tabel 1. Karakter kunci Bacillus No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
KARAKTER KUNCI Sel batang Gram MotilItas Endospora 1 endospora/sel Aerobik/Anaerobik fakultatif Kemoorganotrof (O atau F) Katalase Tumbuh pada NaCl 5% Ukuran sel 0,5 - 2,5 x 1,2 - 10 µm
Bacillu +s
S1 + + + + + +/+ + + +
+ + + + + + + + +
Bioakumulasi dan bioreduksi Bacillus terhadap merkuri masih dalam tahap penelitian. Kurva pertumbuhan Bacillus
SS19 + + + + + -/+ + + + +
DA11 + + + + + +/+ + + +
Kurva Pertumbuhan SA1Hg 0,8 0,7 0,6 0,5 DO
DO
Kurva Pertumbuhan S1Hg
Series1
0,4 Series1
0,3 0,2 0,1 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415161718 192021222324
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324
waktu
waktu
Kurva Pertumbuhan DA11Hg
Kurva Pertumbuhan SS19Hg 0,7 0,6
DO
0,5 DO
SA1 + + + + + +/+ + + +
S1Hg, S13Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg tanpa penambahan nutrisi pada jam ke 4 sampai dengan 18 menunjukkan adanya peningkatan jumlah sel setelah masa inkubasi 18 jam menunjukkan penurunan jumlah sel menuju kematian (gambar 1).
2. Pengaruh faktor lingkungan Bacillus dalam mengakumulasi dan mereduksi logam merkuri
0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
S13 + + + + + +/+ + + +
0,4 0,3
rata2
0,2 0,1 0
0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
rata2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
waktu
waktu
Gambar 1. Kurva pertumbuhan Bacillus S1Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg
3
Dengan penambahan nutrisi, glukosa atau sukrosa sebagai sumber karbon diharapkan Bacillus akan tetap bertahan hidup dengan kurva pertumbuhan sigmoid dan fase kematian dapat diperlambat. Diharapkan dengan renewable Bacillus proses bioremediasi dapat berjalan efisien dan efektif. 3. Mengetahui aktivitas enzim merkuri reduktase diantara genera Bacillus Aktivitas enzim merkuri reduktase pada Bacillus belum dilakukan penelitian, enzim merkuri reduktase ini berperanan mereduksi ion Hg2+ menjadi Hg0 volatil yang dilepas ke lingkungan, dimana Hg0 relatif tidak toksik dibanding Hg2+ dan CH3Hg+. Diharapkan semakin banyak jumlah sel Bacillus akan semakin banyak enzim merkri reduktase yang dihasilkan sehingga reduksi merkuri semakin kuat 4. Aplikasi bioaughmentasi Bacillus untuk mengakumulasi dan mereduksi merkuri di pengolah limbah skala laboratorium Aplikasi Bacillus untuk mengakumulasi dan mereduksi merkuri di pengolah limbah skala laboratorium belum dilakukan. Penelitian ini diharapkan menghasilkan Bacillus yang unggul dan dapat di aplikasikan langsung pada Instalasi Pengolah Limbah (IPAL) industri yang diprakirakan menghasilkan polutan merkuri. Bacillus diharapkan dapat melakukan bioakumulasi, bioreduksi dan mempunyai aktivitas enzim merkuri reduktase maksimal serta penambahan nutrisi yang minimal akan menekan biaya produksi industri lebih efisien.
diisolasi dari lingkungan yang tercemar logam berat merupakan bakteri yang mempunyai resistensi tinggi tinggi terhadap logam berat di sekitarnya. Resistensi tersebut melalui mekanisme adaptasi atau mekanisme metabolisme dengan menggunakan logam berat sebagai komponen jalur reaksinya (Nithya et al., 2011). Resistensi bakteri terhadap merkuri karena adanya gen meroperon yang ada di kromosom, plasmid atau transposon yang mengatur mekanisme resistensi tersebut (Silver, 1996). Selain adanya gen mer-operon, mekanisme biosorbsi berhubungan dengan adanya eksopolisakarida (EPS) pada dinding sel bakteri yang berfungsi sebagai pengkelat logam berat di permukaan sel (Iyer et al., 2005). Pola pertumbuhan Bacillus sangat penting untuk mengetahui siklus hidup Bacillus, dengan mengetahui pola pertumbuhan Bacillus dapat digunakan untuk penelitian skala besar dalam mereduksi kontaminan merkuri. Pola pertumbuhan Bacillus sangat tergantung pada sumber karbon seperti halnya ion merkuri Hg2+, dibuktikan pada penelitian Ghoshal et al., 2011; Bacillus cereus JUBT1 menunjukkan pola pertumbuhan linier sampai dengan 80 jam inkubasi (r : 0,957), tidak ada kompetisi sumber karbon sukrosa dan Hg2+ yang ada di dalam substrat. Resistensi dan kekuatan reduksi Bacillus terhadap merkuri di lingkungannya tergantung pada jumlah sel yang digunakan. Semakin padat jumlah sel maka resistensi dan daya reduksi Bacillus akan semakin tinggi, hal ini berhubungan dengan keberadaan enzim merkuri redutase yang dikode gen merA yang mereduksi ion Hg2+ menjadi Hg0 dengan NADPH/NADH sebagai sumber kekuatan reduksinya (Bogdanova, 1998). Simpulan
Pembahasan Bacillus S1Hg, S13Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg resisten terhadap 25 mg/L HgCl2. Bacillus ini diisolasi dari sungai Kalimas Surabaya yang telah tercemar merkuri 0,105 - 6,3 mg/L (Zulaika et al., 2011). Menurut Chojnacka (2010), bakteri yang
Bacillus S1Hg, S13Hg, SA1Hg, SS19Hg dan DA11Hg dengan karakterisasi yang lengkap dan akurat merupakan genera unggul yang dapat dimanfaatkan sebagai agensia bioremediasi merkuri yang efektif dan efisien untuk IPAL industri.
4
Daftar Pustaka Badjoeri, M. (2008) Uji kemampuan Bacillus megaterium menyerap logam berat merkuri. Jurnal Kimia Mulawarman, 6, 5-11. Bogdanova, E.S., Mindlin, S.Z., Kalyaeva E.S. & Nikiforov, V.G. (1988) The diversity of mercury reductases among Mercury-Resistant Bacteria. Biomedical Division. 234 (2), 280-282. Brown, N., Shih, Y., Leang, C., Glendinning, K., Hobman, J. & Wilson, J. (2002) Mercury transport and resistance. Biometals. International Biometals Symposium. Chojnacka, K. (2010) Biosorption and bioaccumulation, The prospects for practical applications. Environment International, 36, 299 - 307. Csuros, M. & Csuros, C. (2002) Cold vapour AAS for solid and semi solids in environmental sampling and analysis for metals. Lewis Publishers, Tokyo. De, J. & Ramaiah, N. (2007) Characterization of marine bacteria highly resistant to mercury exhibiting multiple resistances to toxic chemicals. Ecological Indicators, 7, 511-520. Ghoshal, S., Bhattacharya, P., & Chowdhury, R. (2011) De-mercurization of wastewater by Bacillus cereus (JUBT1): Growth kinetics, biofilm reactor study and field emission scanning electron microscopic analysis. Journal of Hazardous Materials , 194, 355-361. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, H.A., Staley, J.T. & Wiliam, S.T. (1994) Bergey manual of determinative bacteriology. 9th edition. William & Wilkins, Baltimor. Iyer, A., Mody, K. & Jha, B. (2006) Biosorption of heavym by a marine bacterium. Marine Pollution Bulletin, 50, 340-343.
Joshi, N. (2003). Biosorption of heavy metal. Thesis. Department of Biotechnology and Environmental Sciences. Thapar Institute of Engineering Technology. Patyala. http: //www.dspace.vtiet.ac.in.bitstream/123456 789/1/91860.pdf. Kafilzadeh, F. & Mirzaei, N. (2008) Growth pattern of Hg resistant bacteria isolated from Kor river in the presence of mercuric chloride. Journal of Biological Sciences 11 (18), 2243-2248. Kamala, S. & Krishnamoorthy, R. (2006) Isolation of mercury resistant bacteria and influence of abiotic factors on bioavailability of mercury: A case study in Pulicat Lake North of Chennai, South East India. Science of Total Environment, 367, 341-353. Lane, D.J. (1991) in Stackebrandt, E & Goodfellow, M (eds.) 16S/23S rRNA Sequencing In Nucleic Acid Tecchnique in Bacterial Systematics. John Willey & Son, Chichester. Nascimento, A.M.A. & Souza, E. (2003) Operon mer : Bacterial resistance to mercury and potential for bioremediation of contamined environments. Journal Genetics and molecular Research, 2(1), 92-101. Nithya, C., Gnanalakshmi, B. & Pandian, S.K. (2011) Assessment and characterization of heavy metal resistance in Palk Bay sediment bacteria. Marine Environmental Research, 71, 283 - 294. Ogunseitan, O.A. (1998) Protein method for investigating mercuric reductase gene expression in aquatic environments. Appl Environ Microbiol, 64(2), 695-702. Pignatelli, M., Moya, A., & Tamames, J. (2009) A database for describing the environmental distribution of prokaryotic taxa. Environ. Microbiol, 1, 191- 197.
5
Silver, S. (1996) Bacterial resistances to toxic metal ions - A review 1. Gene, 179, 9-19. Suheriyanto, Sutarto, E.S. & Djohan, T.S. (2008) Bakteri resisten metil-merkuri dari sedimen sungai Sangon Kulon Progo. Berkala Ilmiah Biologi, 7 (2), 43-51. Triana, E. (2005) Analisis filogenetik Rhizobia yang diisolasi dari Aschynomene spp. Biodiversitas, 6 (4), 234-239.
Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., & Lane, D.J. (1991) 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, 173: 697-703 Zulaika, E., Widiyanti, A. & Shovitri, M. (2011) Bakteri resisten merkuri endogenik hilir Kalimas Surabaya. Seminar Nasional Teori dan Aplikasi Teknologi Kelautan SENTA 2011, Fakultas Teknologi Kelautan, ITS. 15-16 Desember 2011, Surabaya, Indonesia
Turner, S., Pryer, K.M., Miao, V.P.W., & Palmer, J.D. (1999) Investigating deep phylogenetic relationships among cyano bacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. Journal of Eukaryotic Microbiology. 46,327–338.
6
