1
Uji Potensi Genera Bacillus Sebagai Bioakumulator Merkuri Umi Sholikah dan Nengah Dwianita Kuswytasari Jurusan Biologi, Fakultas Matematikadan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 E-mail:
[email protected] Abstrak— Merkuri adalah salah satu logam berat yang dalam konsentrasi sangat rendah dapat beracun dan berbahaya. Bakteri yang berasal dari lingkungan tercemar merkuri seringkali resisten terhadap merkuri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas dan kemampuan bioakumulasi genera Bacillus S1, SS19 dan DA11 koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi yang diisolasi dari Kalimas Surabaya dan isolat referensi Bacillus cereus ATCC1178 terhadap logam merkuri. Viabilitas dari bakteri diketahui dengan metode langsung dengan Haemocytometer dan metode tidak langsung dengan pour plate, sedangkan uji bioakumulasi dengan menggunakan ICP (Inductively coupled plasma). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa Viabilitas yang tinggi pada Bacillus S1 dan Bacillus cereus ATCC1178, sesuai dengan daya akumulasinya yang tinggi terhadap Hg2+ antara 89 - 90 % . Viabilitas Bacillus SS19 dan DA11 yang lebih rendah mempunyai daya bioakumulasi terhadap Hg2+ yang relatif rendah pula yaitu 32 - 60%. Kata Kunci— Merkuri, viabilitas, bioakumulasi
P
I. PENDAHULUAN
esatnya pertumbuhan dan perkembangan penduduk perkotaan dan industri menyebabkan limbah yang mengandung logam berat termasuk merkuri semakin meningkat. Dalam kondisi alami, konsentrasi merkuri sangat rendah yaitu satu nanogram/liter (Boening, 2000). Namun karena adanya aktivitas manusia seperti pembakaran batu bara, produksi petroleum, industri kertas, pertanian, dan pemanfaatan merkuri sebagai katalis industri dapat meningkatkan pencemaran merkuri di lingkungan (Nascimento & Charthone-Souza, 2003). Selain itu, ada pula proses alam yang menyebabkan konsentrasi merkuri di lingkungan semakin meningkat seperti letusan gunung berapi, aktivitas geotermal, dan kebakaran hutan liar (Sinha et al, 2011). Merkuri merupakan logam berat dengan toksisitas paling tinggi terhadap sel hidup dan tidak memberikan keuntungan fungsional secara biologis (Oehmen et al., 2009). Merkuri (Hg) merupakan logam berat yang ditemukan secara alami dalam lingkungan dalam berbagai bentuk salah satunya yaitu berbentuk metil merkuri (CH3-Hg). CH3-Hg dapat terakumulasi melalui rantai makanan dan akhirnya meracuni
makhluk hidup termasuk manusia yang tinggal di daerah tercemar merkuri (Ball et al., 2007). Bentuk merkuri anorganik dan organik merupakan salah satu neurotoksin kuat dan memiliki efek yang tinggi terhadap kesehatan manusia (Pepi et al., 2011). Efek racun dari merkuri dapat mengganggu syaraf dan ginjal serta merusak fungsi dari kerja paru-paru (Manohar et al, 2002). Selain itu, keberadaan merkuri di lingkungan dapat menyebabkan deposisi di dalam tanah dan badan air dimana dapat mengganggu rantai makanan setelah terjadi biomagnifikasi. (Sinha et al.,, 2011). Kalimas Surabaya sudah mulai tercemar merkuri, pada tahun 2009 di sedimen Kalimas bagian tengah (Gubeng), konsentrasi merkuri terukur 0,105 mg/L (Shovitri et al., 2010) di sedimen bagian hilir (di dekat Pelabuhan Tanjung Perak) konsentrasi merkuri terukur 6,38 mg/L (Widiyanti, 2011). Konsentrasi tersebut melebihi ambang batas minimal yang telah ditetapkan Pemerintah melalui Peraturan Pemerintah no. 82 tahun 2001 yaitu 0,001 mg/L sehingga Kalimas dapat dikategorikan telah tercemar merkuri. Keracunan merkuri dapat merusak hati, ginjal, mengganggu sistem syaraf dan pencernaan manusia (Manohar et al., 2002). Adanya fenomena peningkatan konsentrasi merkuri di Kalimas sangat membutuhkan perhatian yang serius untuk pencegahannya supaya tidak menimbulkan efek negatif yang berkelanjutan terhadap manusia. Bacillus merupakan bakteri yang cukup melimpah di alam, dapat diisolasi dari berbagai habitat termasuk lingkungan yang tercemar merkuri. Bakteri yang mampu hidup di habitat atau lingkungan yang tercemar merkuri dinamakan bakteri resisten merkuri (BRM). Bakteri resisten merkuri merupakan bakteri yang mempunyai gen resisten merkuri yaitu gen mer operon untuk bertahan pada lingkungan yang tercemar merkuri (Silver & Phung, 1996). Struktur mer operon berbeda untuk tiap jenis bakteri, umumnya struktur mer operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan organomerkuri liase (merB) (Liebert et al., 1999). Bacillus merupakan bakteri yang bersifat kosmopolit dan memiliki resistensi terhadap banyak logam berat seperti Cromium, Arsen, Selenium (Huang et al., 1999), dan juga terhadap merkuri (Bogdanova et al., 2001). Pada penelitian
2 Badjoeri (2008), genera Bacillus mempunyai resisten yang berbeda-beda terhadap merkuri salah satu species Bacillus megaterium merupakan bakteri resisten merkuri dan mampu mereduksi merkuri sampai dengan 98% dari konsentrasi perlakuan. Berdasarkan kenyataan tersebut akan diteliti kemampuan viabilitas dan bioakumulasi genera Bacillus yang diisolasi dari Kalimas Surabaya terhadap merkuri anorganik (HgCl2) II. METODE PENELITIAN Penelitian dilakukan pada bulan Maret sampai dengan bulan Juni 2012 di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA-ITS. Analisis bioakumulasi logam merkuri dilakukan di Laboratorium Pusat Analisis Obat dan Makanan, Fakultas Farmasi, Universitas Surabaya. 2.1 Isolat Uji Genera Bacillus Isolat Bacillus yang digunakan adalah isolat S1, SS19 dan DA11 yang merupakan hasil isolasi dari Kalimas Surabaya. Isolat tersebut telah diuji daya resistensinya terhadap logam Hg dan mampu tumbuh pada media NA-HgCl2 dengan konsentrasi 25 mg/L (Zulaika et al., 2012), selain isolate uji sebagai kcontrol digunakan isolate referensi Bacillus cereus ATCC1178 yang didapat dari Balai Kesehatan Yogyakarta.
memisahkan sel Bacillus dengan filtratnya. Filtrat diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 2 tetes HNO3 kemudian diautoklaf selama 30 menit. Pengukuran bioakumulasi Hg dilakukan pada 12 dan 24 jam inkubasi. Pengukuran konsentrasi Hg dilakukan dengan menggunakan ICP (Inductively Couple Plasma). Pengukuran logam Hg dilakukan pada filtrate medium yang merupakan konsentrasi logam Hg yang tidak diakumulasi oleh Bacillus uji sehingga perbedaan konsentrasi awal (medium tanpa inokulum Bacillus) dengan konsentrasi akhir (medium dengan inokulum Bacillus) merupakan konsentrasi logam Hg yang diakumulasi sel Bacillus. Penghitungan jumlah logam Hg yang diakumulasi isolat Bacillus menggunakan metode Csuros (Csuros dan csuros, 2002), yaitu: Cb= Co-Ceq (ppb) Cb = Konsentrasi logam Hg yang diakumulasi sel Bacillus Co = Konsentrasi awal logam Hg (tanpa inokulum Bacillus) Ceq= Konsentrasi akhir logam Hg pada medium tanpa inokulum Bacillus Setelah mengetahui logam Hg yang tidak diakumulasi oleh sel-sel Bacillus, maka dilakukan pengukuran efisiensi bioakumulasi oleh sel Bacillus dengan formula sebagai berikut:
R= Ceq K – CbP x 100% 2.2 Pembuatan Kurva Pertumbuhan untuk Starter Ceq K Secara aseptis sebanyak satu ose isolat Bacillus berumur 24 jam (isolat yang diremajakan pada media padat NAR = Efisiensi bioakumulasi genera Bacillus HgCl2 10 mg/L) diinokulasikan dalam 10 ml media cair CeqK = Konsentrasi akhir logam Hg dalam media kontrol ® Nutrient Broth (NB) (Merck , Jerman) dalam tabung reaksi, tanpa inokulum Bacillus diinkubasikan pada temperatur ruang di atas rotary shaker CbP = Konsentrasi logam Hg yang tidak diakumulasi sel (100 rpm). Kultur yang berumur 24 jam diambil sebanyak 5 Bacillus pada perlakuan (filtrate) ml dan diinokulasikan ke dalam 45 ml media cair Nutrient ® (Joshi, 2003 dalam Badjoeri, 2008) Broth (NB) (Merck , Jerman) dengan konsentrasi HgCl2 10 mg/L dalam Erlenmeyer, diinkubasikan dalam suhu ruang di atas rotary shaker (100 rpm). Satu ml kultur dilarutkan 2.4 Pengukuran Viabilitas genera Bacillus Untuk mengetahui viabilitas Bacillus uji, dilakukan dalam 9 ml aquades steril, di homogenkan, Kemudian larutan kultur dimasukkan dalam kuvet spektrofotometer dan diukur pengamatan pertumbuhan menggunakan metode pour plate nilai Optical Density (OD)nya dengan spektrofotometer dengan interval waktu 0, 12, dan 24 jam. Satu ml kultur (Boeco S-22, Jerman) pada panjang gelombang (λ) 600 nm. starter Bacillus dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang Pengukuran Optical Density (OD) dimulai dari jam ke-0 beisi 9 mL medium cair NB-HgCl2 25 mg/L. Sebanyak 1 mL sampai dengan 24 jam dengan selang waktu 1 jam. Data diambil secara aseptis, diencerkan, dan pada masing-masing Optical Density (OD) yang didapatkan kemudian dibuat pengenceran ditambahkan media NA-HgCl2 10 mg/L (sesuai kurva pertumbuhan dengan sumbu x sebagai waktu (t) dan dengan kondii awal isolasi) sebanyak 12 ml. Kemudian sumbu y sebagai Optical Density (OD). Setelah diketahui fase diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Diamati pertumbuhannya, maka penentuan starter dapat diketahui pertumbuhannya dan dihitung jumlah CFU/mL dengan menggunakan colony counter (Suntex 570) (Harley & yaitu pada pertengahan fase eksponensial. Prescott, 2002). 2.3
Uji Bioakumulasi Hg Perlakuan konsentrasi HgCl2 yang digunakan adalah 25 mg/L. Sebanyak 1 ml kultur starter Bacillus uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang beisi 9 mL medium cair NBHgCl2 25 mg/L. Inkubasi dilakukan di atas rotary shaker (100 rpm) pada suhu ruang selama 24 jam (Badjoeri, 2008). Kultur disentrifuge 4000 rpm selama 20 menit untuk
2.5 Rancangan Penelitian dan Analisis Data Rancangan penelitian yang digunakan adalah deskriptif kuantitatif. Viabilitas dan kemampuan bioakumulasi logam merkuri oleh genera Bacillus uji, dideskripsikan sesuai angka yang didapatkan dengan tiga kali pengulangan. Bioakumulasi
3 dihitung dengan kadar ppb (part perbillion) dan viabilitas dihitung dengan jumlah CFU/mL. III. HASIL DAN DISKUSI 3.1 Kurva Pertumbuhan Starter Menurut Cooper (2003), pertumbuhan bakteri merupakan pertambahan sel dan kemampuan bakteri untuk berkembang biak, yang dapat divisualisasikan dengan kurva pertumbuhan. Kurva pertumbuhan tersebut akan menggambarkan pola pertumbuhan bakteri yang terbagi menjadi empat fase yaitu lag, eksponensial, stasioner, dan kematian. Menurut Harley & Prescott (2002), keempat fase pertumbuhan bakteri dapat diketahui dari pengukuran turbiditas populasi bakteri pada kultur cair menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang (λ) 550-600 nm.
Gambar 1. kurva pertumbuhan Bacillus S1
Gambar 2. kurva pertumbuhan Bacillus cereus ATCC1178
Gambar 3. kurva pertumbuhan Bacillus SS19
Gambar 4. kurva pertumbuhan Bacillus DA11
Berdasarkan grafik di atas (Gambar 2), pola pertumbuhan bakteri genera Bacillus S1, SS19, DA11, dan Bacillus cereus ATCC1178 selama 24 jam inkubasi menunjukkan pola pertumbuhan yang seragam. Kurva pertumbuhan tersebut sesuai dengan kurva pertumbuhan bakteri pada umumnya dan menurut Harley & Prescott (2003) yaitu berbentuk kurva sigmoid. Pada dua jam pertama merupakan fase adaptasi yaitu fase dimana bakteri beradapatasi dengan lingkungannya dan mulai bertambah sedikit demi sedikit kecuali pada Bacillus cereus ATCC1178 yang mengalami fase adaptasi pada lima jam pertama. Pada jam ketiga sampai jam ke-18 merupakan fase eksponensial dari Bacillus S1 dan DA11, pada jam kelima sampai jam ke-18 merupakan fase eksponensial dari Bacillus cereus ATCC1178, dan pada jam kedua sampai jam ke-18 merupakan fase eksponensial dari SS19 dimana fase eksponensial merupakan fase dimana pembiakan bakteri berlangsung dengan cepat. Setelah jam ke18, pola pertumbuhan bakteri mulai menurun yaitu pada isolat Bacillus cereus ATCC1178 dan Bacillus SS19, sedangkan Bacillus S1 dan Bacillus DA11 pola pertumbuhannya mulai menurun pada jam ke-20 sehingga tidak terlihat fase stasioner pada semua kurva pertumbuhan. Adanya penurunan jumlah bakteri menunjukkan bahwa bakteri tersebut telah memasuki fase kematian (Gambar 2). Perbedaan fase pada tiap genera Bacillus tersebut disebabkan karena mekanisme resistensi dari masing-masing bakteri yang berbeda. Starter merupakan kultur mikroorganisme yang siap diinokulasikan ke dalam media perlakuan. Umur starter dapat diketahui dari pertengahan fase eksponensial. Menurut Hogg (2005) , pada saat fase eksponensial, sel mikroorganisme dalam keadaan yang stabil, sel-sel baru terbentuk dengan laju konstan dan sel mikroorganisme membelah secara optimum pada saat doubling time (waktu lipat dua) sehingga biasanya tercapai di tengah-tengah fase eksponensial. Selain itu menurut Mushlihah et al (2011), kebutuhan energi bagi bakteri pada fase eksponensial lebih tinggi, namun zat-zat metabolik yang dibutuhkan dalam memenuhi kebutuhan nutrisinya juga lebih banyak diproduksi. Pada kurva pertumbuhan diketahui bahwa adaptasi Bacillus berlangsung dengan cepat yaitu setelah dua sampai lima jam inokulasi. Bacillus merupakan bakteri yang mampu beradaptasi pada kondisi lingkungan yang beragam dan resisten terhadap banyak kondisi lingkungan yang kurang baik dan lingkungan
4 ekstrim seperti lingkungan yang tercemar merkuri (Nakamura, 2000; Nevado et al., 2010). Selain itu, genera Bacillus memiliki kemampuan fisiologis yang luas dengan faktor lingkungan seperti pH, temperatur dan salinitas (Holt et al., 1994). 3.2 Uji Bioakumulasi Hg Resistensi bakteri terhadap logam merkuri dapat melalui mekanisme biosorbsi dan biakumulasi. Mekanisme biosorpsi merupakan proses pasif, sehingga logam tidak meracuni sel bakteri. Sedangkan mekanisme bioakumulasi merupakan proses aktif dimana logam berat dapat meracuni sel bakteri (Chojnacka, 2010). Menurut Iyer et al (2005), mekanisme biosorbsi berhubungan dengan adanya eksopolisakarida (EPS) pada dinding sel bakteri yang berfungsi sebagai pengkelat logam berat di permukaan sel. Molekul kompleks pada dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan yang tersusun oleh molekul-molekul yang lebih sederhana antara lain fosforil, karboksil, dan asam amino yang mempunyai muatan negatif, muatan negatif akan berinteraksi dengan ion atau molekul yang bermuatan positif di lingkungan luarnya sehingga berbentuk ikatan ligan. Ion logam bermuatan positif, sehingga secara elektrostatik akan terikat pada permukaan sel (Langley & Baveridge, 1999). Interaksi antara ion logam dan dinding sel bakteri Gram positif terutama Bacillus sp., menunjukkan adanya peranan gugus karboksil pada peptidoglikan dan gugus fosforil pada polimer sekunder asam teikoat dan teikuronat (Loyd, 2002). Mekanisme bioakumulasi berhubungan dengan adanya gen operon yang mengatur resistensi bakteri terhadap logam. Bakteri resisten merkuri mempunyai gen mer operon untuk mekanisme resistensi terhadap merkuri. Gen mer operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen yang menyandi enzim merkuri reduktase (merA) dan gen yang menyandi enzim organomerkuri liase (merB) (Brown et al., 2002). Proses resistensi bakteri terhadap merkuri ion (Hg2+) melalui reaksi ikatan ligan dan reaksi enzimatis yang dapat mereduksi Hg 2+ menjadi Hg0 volatil, sehingga Hg2+ tidak akan meracuni sel bakteri (Nascimento & Chartone-Souza, 2003). Perlakuan biakumulasi merkuri menggunakan konsentrasi 25 ppm (25.000 ppb) dengan menambahkan 0,5 mL HgCl 2 (500 ppm) ke dalam medium NB dengan volume total 10 mL setelah ditambahkan HgCl2, tetapi setelah dilakukan pengukuran, diketahui konsentrasi awal medium tanpa inokulum terjadi penurunan yaitu 3202,37 ppb (Tabel 1). Perubahan konsentrasi Hg2+ dalam medium dapat disebabkan adanya adsorpsi senyawa merkuri oleh dinding wadah dan menguapnya senyawa merkuri. Pengukuran konsentrasi awal dilakukan setelah 24 jam inkubasi sehingga sampel memiliki waktu kontak yang lebih lama dengan wadah atau tempat penampung sampel. Wadah atau tempat penampung sampel yang digunakan seharusnya menggunakan wadah yang terbuat dari borosilikat, namun dalam penelitian ini telah digunakan wadah yang terbuat dari polietilen. Menurut Bothner et al (1975), senyawa Hg2+ dan HgCl2 akan diadsorpsi oleh dinding wadah polietilen sehingga
konsentrasi Hg2+ dalam larutan semakin berkurang. Pembuktian adanya adsorpsi oleh wadah yang terbuat dari polietilen telah dilakukan oleh Way dan Lo (Lo et al., 1975) dengan menggunakan radio isotop 203 Hg sebagai perunut (tracer) untuk menelusuri hilangnya merkuri dari sampel. Hasil penelitian tersebut menyebutkan bahwa merkuri yang hikang dari sampel terdapat dalam dinding wadah polietilen yang dideteksi mengandung radioaktivitas yang tinggi. Selain itu, menurut Lo et al (1975) menemukan bahwa sebagian merkuri yang hilang dari sampel telah menguap. Uap Hg diperkirakan terbentuk dari senyawa Hg2+ yang mengalami reduksi menjadi Hg+ dengan reaksi disporporsionasi Hg+ membentuk uap Hg. Menurut Cotton et al (1995), reduksi Hg2+ disebabkan adanya kontaminasi senyawa yang bersifat reduktor dalam sampel sesuai dengan reaksi di bawah ini.
2Hg2+ + 2e- ↔ Hg22+ Hg22+ ↔ Hg2+ Hg0 Kemungkinan lain yang menyebabkan pengurangan konsentrasi Hg2+ pada medium yaitu adanya Hg2+ yang berikatan dengan komponen medium Nutrient Broth (NB) yaitu pepton dan meat extract. Ion Hg2+ akan berikatan dengan ion yang bermuatan negatif penyusun pepton dan meat extract. Pepton merupakan produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Sedangkan Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi. Dari seluruh komponen penyusun Nutrient Broth tersebut terdapat gugus protein. Protein sendiri terdiri dari protein struktural dan protein fungsional. Salah satu protein fungsionalnya yaitu enzim metaloprotease. Metaloprotease merupakan enzim protease (pendegradasi protein) yang paling banyak ditemukan dan dicirikan oleh kebutuhan adanya ion logam untuk aktivitasnya sehingga keberadaan logam Hg dalam medium berkurang (Rao et al., 1998). Pengurangan konsentrasi Hg2+ tersebut dapat juga disebabkan kurangnya penambahan HNO3 yang berfungsi untuk mengekstraksi larutan sampel sehingga Hg2+ lebih banyak terdapat pada pelet dibandingkan dengan yang terdapat pada filtrat. Berdasarkan EPA (2007), penambahan HNO3 dalam sampel yang akan diuji dengan menggunakan ICP AES yaitu 1 ml HNO3 dalam 10 mL sampel, namun dalam penelitian ini telah ditambahkan sebanyak 2 tetes HNO3 ke dalam 10 mL sampel (Badjoeri, 2008).
5 Tabel 1. Bioakumulasi Merkuri pada Genera Bacillus
Isolat Bacillus
Konsentrasi awal tanpa inokulum (ppb)
Bioakumulasi (ppb) pada
Efisiensi Bioakumulas i pada
12 jam
24 jam
12 jam
24 jam
Bacillus cereus ATCC1178
3202,37
2722.01
2850.11
85%
89%
S1
3202,37
2850.11
2882.13
89%
90%
SS19
3202,37
1909.38
1178.9
60%
37%
DA11
3202,37
1805.35
1027.29
56%
32%
Hasil bioakumulasi pada Bacillus S1 dan Bacillus cereus ATCC1178 memiliki efisiensi bioakumulasi yang tinggi terhadap merkuri yaitu 89 % dan 85 % pada 12 inkubasi, 90 % dan 89 % pada 24 jam inkubasi (Gambar 3). Efisiensi bioakumulasi pada Bacillus S1 dan Bacillus cereus ATCC1178 cenderung meningkat pada inkubasi 24 jam. Tanda adanya kehidupan bakteri menunjukkan proses bioakumulasi masih berlangsung, sehingga efisiensi bioakumulasi jika dibandingkan dengan 12 jam inkubasi relatif lebih tinggi walaupun perbedaannya tidak ekstrim. Pada genera Bacillus SS19 dan DA11 efisiensi bioakumulasi mencapai 60 % dan 56 % pada 12 jam inkubasi; 37 % dan 32 % setelah inkubasi 24 jam. Efisiensi bioakumulasi merkuri pada Bacillus SS19 dan DA11 lebih rendah dibandingkan dengan Bacillus S1 dan Bacillus cereus ATCC1178 (Gambar 3). Menurut De & Ramaiah (2007), bakteri yang diisolasi dari tempat yang tercemar merkuri lebih resisten dari pada bakteri yang diisolasi dari tempat yang tidak tercemar merkuri, walaupun kedua bakteri tersebut mempunyai gen mer operon sebagai salah satu mekanisme resistensinya. Bacillus SS19 dan DA 11 merupakan bakteri yang diisolasi dari Kalimas Surabaya bagian tengah dan hulu yang kondisi lingkungan yang mempunyai kadar merkuri 0,105 mg/L (Zulaika et al., 2012). Sedangkan Bacillus S1 adalah bakteri yang diisolasi dari Kalimas bagian hilir yang mempunyai kadar merkuri 6,3 mg/L (Zulaika et al., 2011). Bakteri endogenik yang berasal dari habitat tercemar merkuri lebih efektif untuk mengurangi atau menghilangkan merkuri dan dapat digunakan sebagai agensia bioremediasi, hal tersebut sesuai dengan pernyataan Ghosal et al (2011).
3.3 Pengukuran Viabilitas genera Bacillus Viabilitas merupakan tingkat ketahanan dan kemampuan hidup dari suatu organisme pada lingkungan yang baru (Sobariah, 2007). Pada saat penelitian uji bioakumulasi merkuri pada genera Bacillus juga dilakukan uji viabilitas terhadap isolat genera Bacillus S1, SS19, DA11 yang diisolasi dari Kalimas Surabaya serta Bacillus cereus ATCC1178 dengan media isolasi awal NA-HgCl2 10 mg/L dan dikondisikan pada media yang mengandung NB-HgCl2 25 mg/L. Metode yang digunakan adalah metode secara langsung dengan penghitungan jumlah sel/mL menggunakan Haemocytometer dan penghitungan tidak langsung dengan metode pour plate pada medium NA-HgCl2 10 mg/L yang divisualisasikan dengan CFU/mL. Genera Bacillus SS19, DA11, S1, dan Bacillus cereus ATCC1178 menunjukkan pola viabilitas yang sama pada media tumbuh yang baru (NBHgCl2 konsentrasi 25 mg/L) baik jumlah sel/mL maupun jumlah CFU/mL (Gambar 4). Penghitungan tidak langsung dengan metode pour plate memiliki ketentuan jumlah penghitungan koloni yaitu 25-250 CFU/mL (Harley & Prescott, 2002). Jika jumlah koloni yang dihitung kurang atau melebihi jumlah yang telah ditentukan maka jumlah tersebut tidak diperhitungkan. Pada penelitian ini, pada setiap pengenceran tidak dilakukan pour plate (pada pengenceran tertentu yang dilakukan pour plate) sehingga belum diketahui pengenceran yang sesuai untuk mendapatkan CFU/mL sesuai dengan ketentuan Harley & Prescott (2002). Semua koloni yang tumbuh pada medium NA-HgCl2 dihitung meskipun jumlah koloninya kurang dari 25 CFU/mL atau lebih dari 250 CFU/mL dengan menggunakan metode pembagian bidang dalam proses penghitungannya. Pada metode pour plate ini juga terjadi kontaminasi kultur karena terdapat koloni yang tumbuh di bagian atas ataupun di bagian tengan dari kultur, padahal dalam metode pour plate seharusnya koloni hanya tumbuh pada permukaan medium. Selain itu juga terdapat perbedaan morfologi dari koloni. Untuk memastikan adanya kontaminasi, seharusnya terdapat kontrol negatif yang diperlakukan sama seperti perlakuan sehingga jika terdapat pertumbuhan mikroorganisme pada kontrol negatif maka dapat dipastikan bahwa kultur tersebut mengalami kontaminasi.
(a) (b) Gambar 6. Viabilitas genera Bacillus pada media NB-HgCl2 ( 25 mg/L) a) Viabilitas genera Bacillus dengan Haemocytometer b) Viabilitas genera Bacillus dengan pour plate
Gambar 5. Grafik Efisiensi Bioakumulasi Merkuri oleh Genera Bacillus
Bacillus SS19 dan DA11 menunjukkan perbedaan viabilitas dengan Bacillus S1 dan Bacillus cereus ATCC1178. Pada Bacillus SS19 dan DA11 viabilitasnya menurun sedangkan Bacillus S1 dan Bacillus cereus
6 ATCC1178 viabilitasnya meningkat. CFU merupakan indikator suatu bakteri hidup, satu koloni bakteri dianalogikan dengan satu sel bakteri sehingga dengan CFU dapat diketahui jumlah bakteri yang hidup. Sedangkan penghitungan secara langsung pada sel bakteri kurang mewakili untuk menunjukkan viabilitas bakteri karena jumlah sel yang hidup dan mati semuanya dihitung. Semua isolat Bacillus uji menunjukkan jumlah sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah CFU. Menurut Effendi (2008), viabilitas bakteri berhubungan erat dengan kondisi fisiologis sel bakteri seperti keberadaan gen mer operon dan jumlah plasmid untuk resistensi merkuri, ketersediaan nutrisi yang dibutuhkan seperti sumber oksigen, karbon, atau nitrogen untuk menunjang metabolisme, serta faktor lingkungan di luar bakteri seperti pH, tekanan osmotik, serta keberadaan logam berat. Berdasarkan data bioakumulasi dan viabilitas genera Bacillus, dapat diketahui potensi dari masing-masing genera Bacillus. Viabilitas yang tinggi pada Bacillus S1 dan Bacillus cereus ATCC1178, sesuai dengan daya akumulasinya yang tinggi terhadap Hg2+ antara 89 - 90 % dan viabilitas Bacillus SS19 dan DA11 yang lebih rendah mempunyai daya bioakumulasi terhadap Hg2+ yang relatif rendah pula yaitu 32 - 60%. Berdasarkan beberapa penelitian, beberapa spesies Bacillus mampu mengakumulasi logam merkuri sehingga dapat mengurangi konsentrasi merkuri di media tumbuhnya seperti Bacillus sp. 68% (Green-Ruiz, 2006), Bacillus megaterium 98% (Badjoeri, 2008), Bacillus sphaericus 47 % (Velasques & Dussan, 2009), dan Bacillus cereus (JUBT1) 94 % (Goshal et al, 2011). Genera Bacillus S1, SS19, dan DA11 merupakan bakteri resisten merkuri yang mempunyai daya bioakumulasi terhadap merkuri. Daya bioakumulasinya berturut-turut dari yang tinggi ke rendah adalah Bacillus S1, SS19, dan DA11 mulai dari 89 %, 60 %, 56 %, (12 jam) dan 90 %, 37 %, 32 % (24 jam). Bacillus S1merupakan bakteri yang memiliki daya bioakumulasi yang tinggi terhadap merkuri jika dibandingkan dengan Bacillus cereus ATCC1178 yang merupakan bakteri yang memiliki kemampuan bioakumuasi terhadap merkuri (Ghosal et al., 2006). Pada penelitian ini, konsentrasi bioakumulasi merkuri oleh Bacillus S1 lebih tinggi dari pada Bacillus cereus ATCC1178 yaitu 89% - 90 % sedangkan Bacillus cereus ATCC1178 85% - 89% sehingga Bacillus S1 berpotensi sebagai agensia bioremediasi pencemaran merkuri. IV. KESIMPULAN Penelitian mengenai uji potensi genera Bacillus sebagai bioakumulator merkuri dapat disimpulkan sebagai berikut: 1. Bioakumulasi merkuri yang tertinggi adalah Bacillus S1 sebesar 89 % (12 jam inkubasi) dan 90 % (24 jam inkubasi), kemudian diikuti Bacillus cereus ATCC1178 sebesar 85 % (12 jam inkubasi) dan 89 % (24 jam inkubasi), Bacillus SS19 sebesar 60 % (12 jam inkubasi) dan 37 % (24 jam inkubasi), serta
Bacillus DA11 sebesar 56% (12 jam inkubasi) dan 32 % (24 jam inkubasi). 2. Bacillus S1 berpotensi digunakan sebagai agensia bioremediasi pencemaran merkuri dan memiliki viabilitas yang tinggi terhadap HgCl 2 mg/L
UCAPAN TERIMA KASIH Penulis (Umi Sholikah) mengucapkan terima kasih kepada ITS yang telah memberikan dukungan finansial melalui penelitian hibah laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi FMIPA-ITS dengan dana PNPB ITS tahun 2002, sesuai surat perjanjian penugasan dalam rangka pelaksanaan penelitian laboratorium ITS tahun 2002 nomor 1027.82/IT2.7/PN/.01/2012. DAFTAR PUSTAKA Badjoeri, M. 2008. Uji Kemampuan Bacillus megaterium Menyerap Logam Berat Merkuri. Pusat Penelitian Limnologi LIPI: Bogor. Ball, M.M., Carrero, P., Castro, D., Yarzábal, L.A., 2007. Mercury resistance in bacterial strains isolated from Tailing Ponds in a gold mining area near El Callao (Bolívar State, Venezuela). Current Microbiology 54, 149 154. Boening D.W. 2000. Ecological Effects, Transport And Fate of Mercury : A General Review. Chemosphere. 40 :1335-1351. Bogdanova, E., Minakhin, L., Bass, I., Volodin, A., Hobman, J.A., Nikiforov, V. 2011. Class II broad-spectrum mercury resistance transposons in Grampositive bacteria from natural environments. Res. Microbiol. 152: 503– 514. Brown, N., Shih, Y., Leang, C., Glendinning, K., Hobman, J., Wilson,J. 2002. Mercury transport and resistance. International biometals Symposium. Chojnacka, K. 2010. Biosorption and bioaccumulation, the prospects for practical applications. Environment International. 36: 299 - 307. Cooper, S. 1991. Bacterial Growth and Division: Biochemistry and Regulation of Prokaryotic and Eukaryotic Division Cycles. Academic Press: San Diego. Csuros, M. and Csuros, C. 2002. Cold Vapour AAS for Solid and Semi Solids. In Environmental Sampling and Analysis for Metals. Lewis Publishers: Tokyo. De, J. dan N. Ramaiah. 2007. Characterization of marine bacteria highly resistant to mercury exhibiting multiple resistances to toxic chemicals. Ecological Indicators 7 : 511–520. Effendi, M. 2008. Faktor Lingkungan Mikroba- Agroindustri Produk Fermentasi. Universitas Brawijaya: Malang. EPA. 2007. Determination Of Metals And Trace Elements In Water And Wastes by Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry. Ghoshal, S., Bhattacharya, P., Chowdhury, R. 2011. De-mercurization of wastewater by Bacillus cereus (JUBT1): Growth kinetics, biofilm reactor study and field emission scanning electron microscopic analysis. Journal of Hazardous Materials.194: 355–361. Green-Ruiz, C. 2006. Mercury(II) removal from aqueous solutions by nonviable Bacillus sp. from a tropical estuary. Bioresource Technology. 97: 1907– 1911.
7 Guzzi, G. P., La Porta, C. A. M. 2008. Molecular mechanisms triggered by mercury. Toxicology 244 : 1–12.
Silver, S. and Phung, L.T. 1996. Bacterial heavy metal resistance: new suprises. Annu. Rev. Microbiol. 50: 753-789.
Harley, J.P. and L.M. Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5th Edition. The Mc Graw Hill Companies : New York.
Sinha, A., Khare, S.K. 2011. Mercury bioremediation by mercury accumulating Enterobacter sp. cells and its alginate immobilized application. Biodegradation. DOI 10.1007/s10532-011-9483-z.
Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd: England. Holt, J.G., Krieg, N., Sneath, P., Staley, J., Williams, S. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.Waferly Company: Philadelphia. Huang, C.C., Narita, M., Yamagata, T., Yukihiro, I., Endo, G., 1999. Structure analysis of class II transposon encoding the mercury resistance of the Gram-positive bacterium Bacillus megaterium MB1, a strain isolated from Minamata Bay, Japan. Gene. 234: 361–369. Iyer, A., Mody, K. & Jha, B. 2005. Biosorption of heavy metals by a marine bacterium. Marine Pollution Bulletin. 50: 340 - 343. Joshi, N.2003. Biosorption of Heavy Metals, Thesis. Department of Biotechnology and Environmental sciences. Thapar Institute of Engineering Technology. Patiala..http://www.dspaceMet.ac.in:bitstream/I23456789/280/l/91860.idf Langley, S., Beveridge, T.J. 1999. Effect of O-side chine lipopolysaccharide chemistry on metal binding. Appl Environ Microbial 65: 489-498. Liebert, C.A., Hall, R.M., Summers, A.O. 1999. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 63: 507-522. Loyd, J.R. 2002. Bioremediation of metals, the application of microorganisms that make and break minerals. Microbial today 29: 67-69. Manohar D.M., Anoop K., Krishman T.S., dan Anirudhan, 2002. Removal of Mercury (II) From Aqueous Solutions and Chlor Alkali Indistry Wastewater Using 2-Mercaptobenzimidazole-Clay. Water Res. 36 :16091619. Mushlihah, S., Herumurti, W. 2011. Pengaruh pH dan Konsetrasi Zymomonas mobilis untuk Produksi Etanol dari Sampah Buah Jeruk. Skripsi Jurusan Teknik Lingkungan FTSP-ITS. Nakamura, L. 2000. Phylogeny of Bacillus sphaericus-like organisms. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50: 1715–1722. Nascimento, A. M. A., Chartone-Souza, E. 2003. Operon mer: Bacterial resistence to mercury and potential for bioremediation of contaminated environments. Genetics and molecular research 1: 92-101. Nevado, J.B., Doimeadios, R.M., Bernardo, G., Moreno, J., Herculano, A.M., Nascimento, D., López, C. 2010. Mercury in the Tapajós River basin, Brazilian Amazon: A review. Environment International. 36: 593–608. Oehmen, A., J. Fradinho, S.Serra, G. Carvalho, J.L. Capelo, S. Velizarov, J.G. Crespo,M.A.M. 2009. Reis The effect of carbon source on the biological reduction of ionic mercury. Journal of Hazardous Materials 165: 1040– 1048. Pepi, M., Gaggi, C., Bernardini, E., Focardi, S., Lobianco, A., Ruta, M., Nicolardi, V., Volterrani, M., Gasperini, S., Trinchera, G., Renzi, P., Gabellini, M., Focardi, S.E. 2011. Mercury-resistant bacterial strains Pseudomonas and Psychrobacter spp. isolated from sediments of Orbetello Lagoon (Italy) and their possible use in bioremediation processes. International Biodeterioration & Biodegradation 65 :85 91. Rao, M.B., Tanksale, A.M., Ghatge, M.S and Deshpande, V.V. 1998. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews Shovitri, M., E. Zulaika dan M.P. Koentjoro. 2010. Bakteri Tahan Merkuri Dari Kali Mas Surabaya Berpotensi Sebagai Agen Bioremediasi Merkuri. Jurnal Penelitian Berkala Hayati Edisi Khusus No.4F.
Sobariah, E. 2007. Viabilitas Bakteri Probiotik In Vitro dan Pengaruh Pemberian Air Beroksigen terhadap Viabilitas Bakteri Probiotik secara In Vivo. Tesis Pasca Sarjana IPB-Bogor. Velásquez, L & Dussan, J. 2009. Biosorption and bioaccumulation of heavy metals on dead and living biomass of Bacillus sphaericus. Journal of Hazardous Materials 167: 13 - 716. Widiyanti, A. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Resisten Merkuri di Hilir Kali Mas Surabaya. Tugas Akhir Jurusan Biologi FMIPA-ITS. Zulaika, E., Luqman, A., Arinda, T., Sholikah, U. 2012. Bakteri resisten logam berat yang berpotensi sebagai biosorben dan bioakumulator. Seminar Nasional SCET. Fakultas Teknik Sipil dan Perencanaan-ITS. Zulaika, E., Widiyanti, A. & Shovitri, M. 2011. Bakteri Resisten Merkuri Endogenik Hilir Kali Mas Surabaya. Seminar Nasional Teori dan Aplikasi Teknologi Kelautan SENTA 2011. Fakultas Teknologi Kelautan-ITS. 15-16 Desember.
