Resistensi Chlorella sp. dan Potensinya Sebagai Bioakumulator Kadmium Enny Zulaika1* dan Ryan Widi A.K.1 1
Jurusan Biologi FMIPA ITS-Surabaya *
[email protected]
Abstrak Kadmium merupakan logam berat yang beracun dan berbahaya, dapat mencemari lingkungan dan terakumulasi pada makhluk hidup melalui rantai makanan. Mikroalga Chlorella sp. dapat mengakumulasi logam berat termasuk kadmium. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui resistensi Chlorella sp., viabilitas dan potensinya sebagai bioakumulator kadmium. Subkultur untuk pemeliharaan Chlorella sp. dilakukan setiap 48 jam. Uji resistensi terhadap kadmium (CdCl2) dilakukan dengan konsentrasi 0 – 50 mg/L selama 24, 48, dan 72 jam. Konsentrasi logam kadmium untuk uji bioakumulasi adalah 0, 5, 10, dan 15 mg/L. Pengukuran bioakumulasi kadmium menggunakan serapan atom (AAS). Chlorella sp. mampu resisten terhadap logam kadmium sampai dengan 15 mg/L. Bioakumulasi Chlorella sp. terhadap logam kadmium yang tertinggi 0,51 mg/L.dw-1 dengan konsentrasi 5 mg/L pada pemaparan 72 jam, efisiensi bioakumulasi tertinggi 1,1 %.dw-1 dengan konsentrasi 10 mg/L pada pemaparan 48 jam. Kata Kunci : Bioakumulasi, Chlorella sp., Kadmium, Resistensi.
Pendahuluan Kegiatan industri mempunyai dampak posistif dan negatif, salah satu dampak yang merugikan lingkungan dan manusia adalah pencemaran logam berat di perairan (Ahuja, 2009). Keberadaan logam kadmium di perairan dapat berasal dari limbah elektroplating, pabrik cat, industri plastik, dan baterai (Monteiro et al., 2010). Cd merupakan logam non-esensial bagi organisme tetapi dapat menggantikan logam esensial seng dengan fungsi sebagai bagian dari penyusun enzim dehydrogenase, peptidase, protease (Ahemad & Kibret, 2013). Bioakumulasi Cd pada konsentrasi tinggi dapat menyebabkan kerusakan ginjal, hati, degenerasi tulang, bahkan kanker (Monteiro et al., 2009). Dekontaminasi logam berat dari limbah industri sangat penting bagi masyarakat sebagai upaya untuk mendaur ulang dan menghilangkan logam dari lingkungan, namun removal logam berat dengan metode fisika-kimia masih mahal dan tidak ramah lingkungan (Hashim et al., 2004). Teknik bioremoval logam berat dengan memanfaatkan fitoplankton atau mikroalga merupakan salah satu alternatif di lingkungan perairan (Monteiro et al., 2010). Beberapa penelitian tentang mikroorganisme khususnya mikroalga sebagai agen bioremediasi telah banyak dikembangkan, seperti Isochrysis galbana dan Planothidium lanceolatum (Sbihi et al., 2012), sehingga mikroalga Chlorella sp. berpotensi sebagai agen bioremediasi terutama untuk bioakumulator 1
kadmium. Tujuan dari penelitian adalah menguji resistensi Chlorella sp. dan potensinya sebagai bioakumulator kadmium sehingga dari penelitian diharapkan mikroalga Chlorella sp. dapat dihgunakan sebagai alternatif bioremoval kadmium dan agensia bioremediasi di Instalasi Pengolah Air Limbah (IPAL) yang mengandung kadmium. Metode Media untuk kultivasi Chlorella sp. menggunakan air tawar yang disaring dengan filter bag, dipanaskan sampai mendidih (100o C, 5 menit), didinginkan dan disaring dengan kertas saring Whatman no. 1, filtrat ditampung ke dalam wadah kaca volume 250 mL. Nutrisi untuk kultivasi Chlorella sp. menggunakan pupuk Aqua-Walne (Cahyaningsih et al., 2006). Chlorella sp. diperoleh dari Balai Besar Penelitian Air Payau (BBAP) Situbondo dengan kepadatan awal (100x104) sel/mL. Stok kultur Chlorella sp. merupakan campuran 100 mL biakan Chlorella sp., air tawar 400 mL, pupuk aqua-Walne 1 mL. Kultur di shaker 100 rpm pada suhu ruang dan pencahayaan 12 jam menggunakan lampu TL 40 watt (Sbihi et al., 2012). Setiap 48 jam dilakukan sub kultur untuk kontinyuitas kultivasi Chlorella sp (Monteiro et al., 2010). Kurva pertumbuhan Chlorella sp.. Pertumbuhan sel Chlorella sp. diamati dengan mengukur optical density (OD) pada 600 nm menggunakan spektrofotometer UV. Pengukuran dilakukan setiap 2 jam sekali selama 24jam, umur inokulum untuk perlakuan ditentukan pada titik tengah (µ) fase eksponensial (Monteiro et al, 2010). Uji resistensi logam kadmium dilakukan untuk mencari range finding test dan menentukan konsentrasi maksimal yang dapat ditolerir oleh Chlorella sp. Logam kadmium yang digunakan adalah CdCl2 dengan konsentrasi 0; 2,5; 5; 7,5; 10 mg/L (Edris et al., 2012), kemudian konsentrasi ditingkatkan 12,5; 15 mg/L, 25 mg/L dan 50 mg/L. Kultur yang dipapar CdCl2 diinkubasi di atas rotary shaker 100 rpm dengan pencahayaan 12 jam menggunakan lampu TL 40 watt (Sbihi et al., 2012). Pengamatan dan penghitungan jumlah kepadatan sel hidup dilakukan setelah kultur berumur 24 jam menggunakan haemacytometer dan mikroskop. Resistensi Chlorella sp. dihitung adalah jumlah sel hidup dibagi jumlah sel total (hidup dan mati) dikalikan 100%; Chlorella sp. resisten jika jumlah sel hidup > 50%. Perlakuan untuk uji bioakumulasi menggunakan konsentrasi dari range finding test. Kultur Chlorella sp. 100 ml pada (µ) jam sesuai kurva pertumbuhan dipapar dengan CdCl2 sesuai range finding test. Pemaparan CdCl2 dilakukan 24 jam, 48 jam, dan 72 jam dengan ulangan dua kali. Setelah inkubasi, kultur disaring dengan kertas saring Whatman no. 1, filtrat 10 mL ditambah 2 tetes HNO3, dipanaskan ± 80o C (30 menit). Konsentrasi logam Cd diukur dengan AAS (Martin & Martin, 1990). Berat kering Chlorella sp. diukur dengan menimbang pelet hasil filtrasi. Kertas saring yang mengandung pelet dikeringkan dengan oven ± 60o C, ± 24 jam (Monteiro et al., 2010). Berat kering pelet
2
dihitung dengan mengurangkan antara berat kering kertas saring mengandung pelet dan kertas saring tanpa pelet. Bioakumulasi dihitung dengan formula: Kb = [(K0 – K1) / mg Bi]
Keterangan: Kb : konsentrasi Cd yang terakumulasi Ko : konsentrasi awal Cd K1 : konsentrasi Cd pada medium filtrat Bi : berat kering (biomassa) mikroalga
Efisiensi bioakumulasi dihitung dengan formula: Eb = [(K0 – K1) / K0] x 100%
Keterangan: Eb : Efisiensi bioakumulasi K0 : Konsentrasi Cd awal K1 : Konsentrasi Cd dalam media filtrat
Hasil dan Pembahasan Keberhasilan pemeliharaan stok kultur Chlorella sp. ditandai dengan kultur yang berwarna hijau dan kultur yang mati hijaunya memudar dan menjadi jernih (Gambar 1). Sel Chlorella sp. yang hidup ditunjukkan dengan bentuk bulat, utuh, dan berwarna hijau dan sel yang mati bentuknya tidak utuh, pecah (lisis), dan berwarna pudar (bening) karena tidak mengandung kloroplas (Gambar 2).
b
a
c Gambar 1. Kultur Chlorella sp. a. hidup, b. mati, c. Chlorella sp. mati menggumpal di dasar tabung kultur. (Dokumentasi Pribadi, 2014).
a Chlorella sp. dalam kulturb tanpa logam Cd. a. hidup, b mati Gambar 2. Sel (Dokumentasi pribadi, 2014).
3
Sel induk Chlorella sp. dalam waktu 15 menit akan berubah menjadi sporangium yang berisi 2-4 autospora (Klochkova & Kim, 2005), selanjutnya lapisan dinding sel induk sporangium pecah dan 2-4 autospora dilepas, autospora kemudian akan membentuk sel vegetatif baru (Manisha, 2007). Kurva pertumbuhan Chlorella sp. dari selama 24 jam mempunyai pola seperti yang ditampilkan pada Gambar 3.
Optical density (600 nm)
Kurva Pertumbuhan Chlorella sp. 0.59 0.58 0.57 0.56 0.55 0.54 0.53 0.52 0.51 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Waktu (Jam)
Gambar 3. Kurva pertumbuhan Chlorella sp. Kultur Chlorella sp. mencapai fase eksponensial pada jam ke 4-12, sehingga umur inokulum yang digunakan untuk uji resistensi dan bioakumulasi adalah 8 jam setelah kultur. Range finding test untuk menentukan konsentrasi maksimal perlakuan CdCl2. Hasil Range finding test adalah resistensi Chlorella sp. terhadap logam Cd yaitu bervariasi dari 44% 100% (Gambar 4).
sel hidup (%)
Uji Resistensi Chlorella sp. 120
0 jam
100
1 jam
80
2 jam
60
3 jam
40
4 jam
20 0
0 jam 1 jam 2 jam 3 jam 4 jam 5 jam
5 jam
0 ppm 100 100 100 100 100 100
5 ppm 100 70 80 69 73 70
10 ppm 100 77 77 64 61 60
15 ppm 100 75 77 74 76 64
25 ppm 100 67 43 41 45 46
50 ppm 100 64 51 53 55 44
Gambar 4 Resistensi Chlorella sp. terhadap CdCl2 Pada konsentrasi 0 mg/L CdCl2, persentase sel hidup mencapai 100 % sampai dengan jam ke 5. Pemaparan CdCl2 5, 10 dan 15 mg/L terjadi penurunan jumlah sel hidup Chlorella sp. Pada
4
konsentrasi 15 mg/L CdCl2, persentase sel hidup rata-rata di atas 50%, sehingga konsentrasi maksimal yang dapat ditolerir oleh Chlorella sp. supaya tetap hidup dan memungkinkan untuk digunakan sebagai agen bioremediasi adalah 15 mg/L CdCl2. Selanjutnya konsentrasi perlakuan yang digunakan adalah 0, 5, 10 dan15 mg/L CdCl2. Menurut Arunukumara & Zhang (2008), Cd merupakan logam berat yang dapat terakumulasi di dalam sel mikroalga, bersifat fitotoksik kuat, menghambat pertumbuhan dan bahkan dapat menyebabkan kematian. Secara umum efek logam berat terhadap sel mikroalga adalah menghambat aktivitas enzim, dengan menggantikan gugus sulfuhidrilnya oleh ion Cd2+, sehingga enzim tersebut kehilangan aktivitasnya. Menurut Carfagna et al., (2013), logam Cd mempunyai muatan ion positif sehingga akan berikatan dengan protein atau enzim di dalam sel yang mempunyai muatan ion negatif. Salah satu asam amino dari enzim adalah sistein yang berfungsi mengikat radikal bebas (ROS), namun kehadiran ion Cd2+ menyebabkan sistein harus mengikat radikal bebas dan ion Cd2+ bersamaan. Kehadiran ion Cd2+ dalam jumlah berlebihan di dalam sitoplasma sel Chlorella sp. akan menyebabkan keseimbangan (homeostasis) Chlorella sp. terganggu. Jika jumlah logam Cd yang diikat grup sufuhidril sistein berlebih akan menyebabkan sel terganggu dan akhirnya mati dengan bentuk tidak utuh, pecah (lisis), dan berwarna pudar (bening) tidak mengandung kloroplas seperti ditunjukkan pada Gambar 5.
b
a
Gambar 5. Sel Chlorella sp. yang dipapar CdCl2. a. hidup, b. mati (Dokumentasi pribadi, 2014). Pada perlakuan 5 mg/L CdCl2 terjadi peningkatan nilai bioakumulasi seiring dengan bertambahnya waktu pemaparan sebesar 0,02 mg/L. dw-1 (24 jam); 0,04 mg/L. dw-1 (48 jam); dan 0,04 mg/L. dw-1 (72 jam). Hal yang sama juga terjadi pada konsentrasi 10 mg/L dan 15 mg/L CdCl2. Semakin besar konsentrasi CdCl2 yang dipaparkan nilai bioakumulasi relatif tidak berbeda kecuali pada perlakuan 5 mg/L jika dibandingkan dengan 10 mg/L dan 15 mg/L CdCl2 (Tabel 1) Tabel 1. Bioakumulasi logam Cd oleh Chlorella sp. Bioakumulasi Cd mg/L.dw-1 Konsentrasi CdCl2 (mg/L) 24 jam 48 jam 72 jam 5 0,02 0,04 0,04 10 0,09 0,11 0,08 15 0,07 0,14 0,13 Mikroalga menggunakan gugus fungsional protein yang disebut phytochelatin yang bermuatan negatif untuk mengikat logam yang bermuatan positif sehingga terjadi homeostasis dan detoksifikasi logam di dalam sel. Phytochelatin (PCN) adalah kelompok peptida dengan struktur umum (γ-Glu-Cys) n-Gly (n=2 sampai 11) disintesis oleh enzim phytochelatin synthase yang diaktifkan oleh kehadiran ion logam berat seperti Cd2+ (Scarano & Morelli, 2002). Ion Cd2+ mengaktifkan enzim PC phytochelatin syntase yang mengubah GSH (gluthationin) menjadi PC
5
(phytochelatin). PC-Cd kompleks melalui protein transporter di membran vakuolar membawa PC-Cd menuju vakuola dan disimpan di rongga vakuola tersebut (Arunukumara & Zhang, 2008). Efisiensi bioakumulasi logam Cd oleh Chlorella sp. meningkat dari 24 jam sampai dengan 48 jam, dan relatif sama atau bahkan cenderung menurun setelah 72 jam. Peningkatan efisiensi bioakumulasi terjadi pada perlakuan CdCl2 5 mg/L (72 jam) tetapi pada konsentrasi 10 mg/L & 15 mg/L terjadi penurunan efisiensi bioakumulasi setelah 48 jam (Tabel 2.) Efisiensi bioakumulasi logam Cd pada Chlorella sp. yang relatif efisien terjadi waktu pemaparan 24 jam dan 48 jam dibandingkan 72 jam. Pada waktu pemaparan 24 - 48 jam terjadi peningkatan efisiensi bioakumulasi yang relatif tinggi ≥ 0,2 % dibandingkan dengan efisiensi bioakumulasi pada 48 - 72 jam yang relatif tetap atau menurun ≥ 0,1 %. Jika jumlah logam Cd yang terpapar semakin tinggi maka phytochelatin jumlahnya juga semakin tinggi, akibatnya bioakumulasi logam Cd semakin tinggi. Tabel 2. Efisiensi bioakumulasi logam Cd pada Chlorella sp. Efisiensi Bioakumulasi Cd % Konsentrasi CdCl2 mg/L 24 jam 48 jam 72 jam 5 0,49 0,72 0,75 10 0,85 1,09 0,80 15 0,47 0,91 0,88 Fakta efisiensi bioakumulasi pada konsentrasi 15 mg/L dibandingkan dengan efisiensi bioakumulasi pada konsentrasi 5 mg/L di pemaparan 48 jam disebabkan oleh dinamika sel Chlorella sp. yang berbeda dalam setiap kultur perlakuan. Efisiensi bioakumulasi pada waktu pemaparan 48 – 72 jam relatif sama atau menurun. Hal ini kemungkinan vakuola sebagai tempat penyimpanan PC-Cd sudah jenuh atau penuh sehingga mikroalga Chlorella sp. tidak mampu lagi melakukan bioakumulasi. Methalothionin atau Phytochelatin yang diproduksi di dalam organel sitosol Chlorella sp. berfungsi utnuk mengikat Cd2+ dan mentransportnya ke dalam vakuola, semakin lama akan jenuh dan vakuola sebagai tempat penyimpanan logam toksik termasuk Cd akan berlebihan atau dosebut hiperakumulasi (Perales et al., 2005).
Kesimpulan Kesimpulan dari penelitian ini adalah Mikroalga Chlorella sp. resisten sampai dengan 15 mg/L CdCl2. Chlorella sp. mampu mengakumulasi logam Cd2+ 0,14 mg/L.dw-1 pada konsentrasi 15 mg/L CdCl2 dengan waktu pemaparan 48 jam. Efisiensi bioakumulasi yang tertinggi adalah 1,09 %.dw-1 pada konsentrasi 10 mg/L dengan waktu pemaparan 48 jam. Mikroalga Chlorella sp. berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen bioremediasi logam berat kadmium di IPAL yang mengandung logam kadmium.
Referensi Ahemad, M. & Kibret, M. 2013. Recent Trends in Microbial Biosorption of Heavy Metals: A Review. Biochemistry & Moleculer Biology. 1 (1): 19-26. Ahuja, S. 2009. Overview in Satinder Ahuja edition, Handbook of Water Quality and Purity 1st edition. Academic Press. New York. Arunakumara, K. K. I. U. & Zhang, X. 2008. Heavy Metal Bioaccumulation and Toxicity with Special Reference to Microalgae. Journal Ocean University Chinesse. 1 (7): 25-30. Cahyaningsih, S., Muchtar, A.N.M., Purnomo, S.J., Pujiati, Kusumaningrum, I., Haryono, A. Slamet., Y;ulaeni, F., Ramadhan, F. & Bagus. 2006. Petunjuk Teknis Produksi Pakan Alami. Departemen Kelautan dan Perikanan Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya Balai Budidaya Air Payau Situbondo.
6
Carfagna, S., Lanza, N., Salbitani, G., Basile, A., Sorbo, S. & Vincenza, V. 2013. Physiological and Morphological Responses of Lead or Cadmium Exposed Chlorella sorokiana 211-8K (Clorophyceae). SpringerPlus. 2: 147. Edris, G., Alhamed, Y. & Alzahrani, A. 2012. Cadmium and Lead Biosorption by Chlorella vulgaris. Sixteenth International Water Technology Conference. Turkey. 16: 1-11. Hashim, S.O., Delgado,O., Hatti, K.R., Mulaa, F.J. & Mattiasson, B. 2004. Starch Hydrolyzing Bacillus halodurans Isolated From A Kenyan Soda Lake. Biotechnology. 26 (8): 23–828. Klochkova, T.A. & Kim, G.H. 2005. Ornamented Resting Spores of a Green Alga, Chlorella sp., Perales, V.G.H., Pena, C.J.M. and Canizares, V.R.O. 2005. Revie Heavy Metal Detoxification in Eukaryotic Microalgaae. Chemosphere. 64 (1): 1-10. Manisha, S.C.A. 2007. Growth, Survival and Reproduction in Chlorella vulgaris and Chlorella variegata with Respect to Culture Age and Under Different Chemical Factors. Folia Microbiology. 52 (4): 399-406. Martin, T.D. & Martin, E.R. Method 200.7. 1990. Determination Of Metals And Trace Elements In Water And Wastes By Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry. Enviromental Monitoring System Laboratory Office of Research and Development. US Enviromental Protection Agency. Ohio. 45268. Monteiro, C.M., Castro, P.M.L. & Malcata, F.X. (2009). Use of The Microalgae Scenedesmus obliquus to Remove Cadmium Cations From Aqueous Solutions. Microbiology Biotechnology. 25: 1573-1578. Perales, V.G.H., Pena, C.J.M. and Canizares, V.R.O. 2005. Revie Heavy Metal Detoxification in Eukaryotic Microalgaae. Chemosphere. 64 (1): 1-10. Sbihi, K., Cherifi O., Gharmali A.E., Oudra, B. & Aziz. 2012. Accumulation and Toxicological Effects of Cadmium, Copper And Zinc on The Growth and Photosynthesis of The Freshwater Diatom Planothidium lanceolatum (Brébisson) Lange-Bertalot: A laboratory study. Journal Material Environmental Science. 3 (3) 497-506. Scarano, G. & Morelli, E. (2002). Characterization of Cadmium and Lead Phytochelatin Complexes Formed in a Marine Microalga in Response to Metal Exposure. Biometals. 15: 145-151.
7
