BAKTERI RESISTEN LOGAM BERAT YANG BERPOTENSI SEBAGAI BIOSORBEN DAN BIOAKUMULATOR

ISBN 978-602-95595-4-5

BAKTERI RESISTEN LOGAM BERAT YANG BERPOTENSI SEBAGAI BIOSORBEN DAN BIOAKUMULATOR 1

1

1

Enny ZULAIKA* , Arif LUQMAN , Tutut ARINDAH , dan Umi SHOLIKAH 1 Program Studi Biologi FMIPA ITS, Surabaya * e-mail : [email protected]

1

ABSTRAK Bakteri yang resisten terhadap logam berat berpotensi digunakan sebagai biosorben dan bioakumulator sehingga dapat dimanfaatkan sebagai agensia bioremediasi pencemaran logam berat. Bakteri mampu resisten terhadap logam berat karena pada bakteri mempunyai mekanisme biotransformasi, bioadsorbsi, biosorbsi, bioakumulasi dan/atau biopresipitasi baik secara fisik, mekanis, ataupun enzimatis. Tujuan dari penelitian ini adalah menemukan bakteri yang resisten terhadap logam Hg, Pb, Cd dan Cu yang diisolasi dari Kalimas Surabaya. Dari 72 isolat bakteri yang didapatkan, isolat yang resisten terhadap logam Hg, Pb, Cd dan Cu dengan kadar 25 ppm hanya 10 isolat. Setelah dilakukan identifikasi dan karakterisasi menggunakan panduan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, isolat tersebut terkelompokkan menjadi 5 genera yaitu Azotobacter, Proteus, Staphylococcus, dan Corynebacterium, dan Bacillus, dengan genera yang melimpah adalah Bacillus sebayak 4 isolat. Semua isolat halotoleran pada salinitas 50 ‰. Kata kunci: Kalimas, logam berat, karakterisasi, halotoleran

1. Pendahuluan Keberadaan logam berat di lingkungan dalam konsentrasi tinggi merupakan pen cemar dan problem lingkungan yang sangat penting sehingga dapat menimbul kan permasalah ekologi yang serius. Logam timbal, merkuri, kromium, arsen, tembaga, kobalt, kadmium, seng, nikel, beryllium, mangan dan tin merupakan logam berat yang sangat toksik berdasar menurut USA Environmental Protection Agency (Velásquez & Dussan, 2009). Mendegradasi dan menghilangkan logam berat tidak semudah mendegradasi limbah organik sebab logam berat bersifat nonbiodegradable (Gupta & Rastogi, 2008), tetapi degradasi dan reduksi logam berat tetap dapat dilakukan yaitu dengan cara fisik dan kimia melalui pertukaran ion, presipitasi, koagulasi, inverse osmosis dan adsorpsi. Semua metode di atas cukup efisien, tetapi akan sangat merugikan jika digunakan untuk mengolah limbah industri, karena relatif mahal, membutuhkan energi dan bahan kimia cukup besar (Atkinson et al., 1998). Pendekatan secara bioteknologi dengan menggunakan bakteri merupakan alternatif yang dapat dilakkan untuk masa yang akan datang dan merupakan rekayasa yang cukup menjanji kan sebab secara teknis maupun ekonomis sangat menguntungkan (Malik, 2004). Bioremediasi menggunakan bakteri lebih feasible sebab bakteri dapat melakukan mekanisme degradasi dan transformasi logam berat, salah satu mekanisme tersebut adalah biosorbsi dan bioakumulasi yang tidak akan mempengaruhi daya hidup bakteri (Vijayaraghavan & Yun, 2008). Kalimas adalah salah satu bahan baku air minum kota Surabaya, pada tahun 2002 kadar merkurinya mencapai 0,099 mg/L hampir 100 kali dari kadar yang disyaratkan pemerintah PP. No.82/2001 yaitu 0,001 mg/L (Anonim, 2009), pada tahun 2009 kadar merkuri di sedimen Kalimas bagian tengah 0,105 mg/L (Shovitri et al., 2008), bahkan pada tahun 2011 kadar tersebut meningkat pada saat dilakukan pengukuran di sedimen Kalimas bagian hilir yaitu 6,3 mg/L (Zulaika et al., 2011). Bakteri yang diisolasi dari lingkungan yang tercemar logam berat sangat potensial digunakan sebagai agensia bioremediasi, sebab bakteri mempunyai daya resistensi dan toleransi logam berat yang ada di sekitarnya. Mekanisme resistensi bakteri terhadap logam berat salah satunya melalui mekanisme biosorbsi dan biakumulasi (Chojnacka, 2010). Seminar Nasional Waste Management for Sustainable Urban Development Teknik Lingkungan, FTSP-ITS, 21 Pebruari 2012.

hal 1

ISBN 978-602-95595-4-5

Berdasarkan kenyataan di atas, bakteri endogenik Kalimas Surabaya yang sudah mulai tercemar logam merkuri akan diuji daya resistensinya terhadap logam berat Hg (merkuri), Pb (timbal), Cu (tembaga) dan Cd (kadmium) untuk mendapatkan bakteri yang unggul sebagai agensia bioremediasi logam berat. 2. METODE PENELITIAN 2.1. Lokasi dan Waktu Penelitian Lokasi pengambilan sampel air dan sedimen sebagai sumber inokulum bakteri resisten logam berat adalah Kalimas Surabaya yaitu hulu (Wonokromo, S: 07°18’00,7” dan E: 112°44’17,4”), tengah (Gubeng, S: 07°15’57,4” dan E: 112°45’ 03,3”) dan hilir (dekat pelabuhan Tanjung Perak, S: 07°11’57,8” dan E: 112°44’06,8”). Preparasi sampel dilakukuan di Laboratorium Mikrobiologi & Bioteknologi, Jurusan Biologi FMIPA ITS. Penelitian dilakukan pada bulan September 2011 sampai dengan bulan Januari 2012. 2.2. Isolasi Bakteri Isolasi bakteri dari sampel air dan sedimen menggunakan metode pengenceran bertingkat dan metode sebar secara aseptis. Satu ml air atau satu gram sedimen dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril, dicampur secara homogen (pengenceran 101 ), kemudian dilakukan pe ngenceran bertingkat sampai dengan 10-10. Dari pengenceran 10-7 10-10 diambil masing-masing 100 µl, dan diteteskan di atas media padat Nutrient Agar (NA) dengan metode sebar, kemudian inokulum diratakan dan diinkubasikan pada suhu 37°C, setelah ± 24 jam diamati koloninya yang tumbuh (Harley & Prescot, 2002). Koloni yang tumbuh adalah isolat endogenik Kalimas Surabaya. 2. 3. Purifikasi Isolat BRM Koloni yang tumbuh dipurifikasi sampai diperoleh kultur murni. Satu koloni isolat bakteri diambil secara aseptis dengan jarum ose dan diinokulasikan ke permukaan media padat NA dengan metode 16 goresan dan diinkubasikan pada suhu 37°C ± 24 jam. Satu koloni yang tumbuh diambil lagi kemudian dipindahkan ke media NA baru dengan metode 16 goresan. Pemindahan isolat dilakukan berulang-ulang sampai di dapatkan kultur murni. Untuk mengetahui kemurnian isolat dilakukan pengamatan bentuk sel secara mikroskopis dengan metode preparat apus dan pewarnaan methylen blue. Pengamatan sel bakteri dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan menggunakan bantuan minyak imersi (Harley & Prescot, 2002). 2.4. Skrining Bakteri Resisten Hg, Pb, Cu dan Cd Skrining bakteri yang resisten terhadap logam Hg, Pb, Cu dan Cd menggunakan metode streak plate dengan media NA-HgCl2, NA-PbCl2, NA-CuCl2 dan NA-CdCl2, konsentrasi yang digunakan 10, 15, 20 dan 25 ppm. Setelah 24 jam masa inkubasi, isolat yang tumbuh merupakan isolat yang resisten terhadap logam Hg, Pb, Cu dan Cd. Kemudian pada isolat yang resisten logam tersebut dilakukan perhitungan CFU (Coloni Forming Unit) untuk mengetahui daya hidup bakteri menggunakan metode pour plate dengan pengenceran bertingkat seperti sub-bab 3.2. 2.5. Verifikasi, Profil Matching dan Generic Assignment Isolat hasil skrining di atas dilakukakn karakterisasi pada morfologi, fisiologi dan uji biokimia. Kemudian dari karakterisasi tersebut dilakukan verifikasi dengan Profile matcing pada karakter kunci (Generic assignment) untuk menentukan genera bakteri yang diduga mirip. Verifikasi mengacu pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacterio logy (Holt et al., 1994) Karakterisasi terdiri dari bentuk dan warna koloni, morfologi sel (bentuk, endo spora, kapsula dan cysta), sifat pengecatan Gram dan tahan asam, serta uji fisiologis dan biokimiawi Seminar Nasional Waste Management for Sustainable Urban Development Teknik Lingkungan, FTSP-ITS, 21 Pebruari 2012.

hal 2

ISBN 978-602-95595-4-5

yang meliputi uji motilitas, metabolisme karbohidrat, aktivitas enzimatis, kebutuhan oksigen dan lain sebagainya. (Harley & Prescott, 2002). 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini didapatkan 72 isolat, yaitu 19 isolat dari sungai bagian hulu, 29 isolat dari tengah dan 24 isolat dari hilir. Setelah dilakukan uji resistensi terhadap logam berat Hg, Cu, Pb dan Cd konsentrasi 25 mg/L hanya 8 isolat bakteri yang resisten terhadap ke empat logam berat tersebut. Isolat tersebut adalah A7, A10, S1, S8, S13, SA1, SS19 dan DA11 (Gambar 1). Menurut Canstein et al. (2002), isolat yang dapat tumbuh pada media sintetis mengandung logam berat ≥ 5 mg/L, merupakan isolat yang memiliki resistensi tinggi terhadap logam berat. Setelah dilakukan perhitungan daya hidup pada 8 isolat di atas, semua isolat sangat resisten terhadap logam Hg, Pb, Cu dan Cd. Jumlah CFU/ml yang paling besar adalah isolat yang diperlakukan dengan logam Hg (Tabel 1). Menurut Chojnacka (2010), bakteri yang diisolasi dari lingkungan yang tercemar logam berat mempunyai daya resistensi terhadap logam berat yang ada di sekitarnya. Resistensi tersebut dapat melalui mekanisme biosorbsi dan/atau biakumulasi. Sumber inokulum bakteri di atas adalah air dan sedimen Kalimas, dimana sedimen di bagian hilir Kalimas Surabaya telah tercemar merkuri sebesar 1,05 - 6,3 mg/L, sehingga iIsolat di atas merupakan kelompok bakteri yang potensial dikembangkan sebagai agensia bioremediasi.

Gambar 1. Isolat yang resisten logam Hg, Cd, Pb dan Cu 25 ppm

Tabel 1. Daya hidup isolat BRM terhadap logam berat lainnya No 1 2 3 4 5 6 7 8

Isolat A7 A10 S1 S8 S13 SA1 SS19 DA11

Hg 10 0,5 x 10 10 0,1 x 10 10 0,3 x 10 10 5,4 x 10 10 0,9 x 10 10 2,5 x 10 10 2,6 x 10 11 3,0 x 10

CFU/ml pada media 25 ppm Pb Cu 8 7 0,3 x 10 0,3 x 10 8 7 2,8 x 10 0,3 x 10 8 7 0,7 x 10 0,3 x 10 8 7 0,9 x 10 0,3 x 10 8 7 2,6 x 10 3,9 x 10 8 7 1,7 x 10 1,1 x 10 8 7 0,6 x 10 0,3 x 10 8 7 3,0 x 10 0,8 x 10

Cd 6 1,4 x 10 6 0,3 x 10 6 0,3 x 10 6 0,3 x 10 6 0,2 x 10 6 3,0 x 10 6 3,0 x 10 6 2,1 x 10

Sebagian bakteri menunjukkan resistensi terhadap logam berat baik di lingkungan perairan, tanah ataupun di limbah industri. Resistensi tersebut berhubungan dengan gen di kromosom, plasmid atau transposon yang mengatur mekanisme tersebut. Gen tersebut diantaranya, Gen mer-operon untuk resistensi terhadap Hg, cadA-operon untuk Cd, copoperon untuk Cu dan transport aktif yang melibatkan ATP untuk Pb (Silver, 1996; Bruins et al., 1999). Hasil karakterisasi morfologi, fisiologi, dan uji biokimia pada isolat yang kemudian dilanjutkkan verifikasi dengan Profile matcing terhadap karakter kunci untuk menentukan genera isolat bakteri dengan acuan Bergeys Manual of Determinative Bacterio logy (Holt et Seminar Nasional Waste Management for Sustainable Urban Development Teknik Lingkungan, FTSP-ITS, 21 Pebruari 2012.

hal 3

ISBN 978-602-95595-4-5

al.,1994), dari delapan isolat bakteri di atas terkelompokkan menjadi empat genera yaitu Bacillus, Corynebacterium, Proteus dan Azotobacter (Tabel 2). Menurut Nithya et al. (2011), bakteri yang mempunyai habitat tercemar logam berat mempunyai resistensi terhadap logam berat tersebut melalui mekanisme biosorbsi dan atau bioakumulasi. Mekanisme biosorbsi biasanya berhubungan dengan adanya eksopolisakarida (EPS) pada dinding sel bakteri yang dapat berfungsi sebagai pengkelat logam berat di permukaan sel (Iyer et al., 2005), sedangkan bioakumulasi berhubungan dengan adanya operon sesuai dengan logam yang diakumulasi (Silver, 1996).

NA NA NA + + + + + + + + + + + + + + +

NA + + NA + + + + + + + + + + + + +

+ + NA + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

S13

SA1

SS19

DA11

+

+

+

+

NA NA NA + + + + + + + + + + + + + + +

NA + + NA + + + + + + + + + + + + +

NA + + NA + + + + + + + + + + + + +

NA + + NA + + + + + + + + + + + + + Bacillus

NA + NA + + + + + + + + + + + + +

S8

Bacillus

+

Bacillus

S1

+

Azotobacter

A10

+

Bacillus

Kesimpulan : Isolat termasuk Genera

A7

Proteus

Karakter Sel bentuk batang Sel bentuk ovoid ø sel 1,5 - 2,0 Pewarnaan Gram Pewarnaan Acid Fast Endospora Cysta Motilitas Aerob Anaerob fakultatif Kemoorganotrof (O/F) Katalase Oksidase Urease Amilase Ornitin dekarboksilase MR VP Indol Citrat H2S Toleran NaCl 5% Toleran NaCl 10% Fermentasi glukosa Fermentasi fruktosa Fermentasi manosa Fermentasi manitol Fermentasi laktosa Fermentasi galaktosa Fermentasi sukrosa Fermentasi xylosa Fermentasi sorbitol Yellow Pigment Colony

Corynebacterim

No 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Proteus

Tabel 2. Karakterisasi morfologi, fisiologi dan uji biokimia

Seminar Nasional Waste Management for Sustainable Urban Development Teknik Lingkungan, FTSP-ITS, 21 Pebruari 2012.

hal 4

ISBN 978-602-95595-4-5

Kesimpulan Berdasar hasil penelitian ini dapat disimpulkan, 4 isolat genera Azotobacter, Proteus, Corynebacterium, dan Bacillus. sangat resisten terhadap merkuri (Hg), Timbal (Pb), Tembaga (Cu) dan Cadmium (Cd) konsentrasi 25 ppm. Genera di atas merupakan genera unggul sebagai agensia bioremediasi. Pustaka Anonim. 2009. Pencemaran merkuri di Kali Surabaya. http://www.antarafoto. Com. peristiwa/v 1269335101/ tingkat-pencemaran-merkuri, diunduh pada tanggal Juli 2009. Atkinson, B.W., Bux, F.H., & Kasan, C. 1998. Considerations for application of biosorption technology to remediatemetal-contaminated industrial effluents. Water SA. 24: 129 135. Bruins, M. R., Kapil, S. & Oehme, F.W. 2000., Microbial Resistance to Metals in the Environment, Ecotoxicology and Environmental Safety. 45: 198-207. Canstein, H.V., Li, Y., Leonhauser, J., Haase, E., Felske, A., Deckwer, W.D. and Dobler, I.W. 2002. Spatially oscillating activity and microbial succession of mercury-reducing biofilms in a technical-scale bioremediation system. Appl. Environ. Microbiol, vol. 68,pp. 1938 - 1946. Chojnacka, K. 2010. Biosorption and bioaccumulation, the prospects for practical applications. Environment International. 36: 299 - 307. Gupta, V.K. & Rastogi, A. 2008. Biosorption of lead (II) from aqueous solutions by nonliving algal biomass Oedogonium sp. and Nostoc sp. - a comparative study,Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 64 170–178. Harley, J.P. and Prescott, L.M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology 4th Edition.The Mc Graw −Hill Companies : New York. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, H.A., Staley, J.T. and Wiliam, S.T., 1994, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Ed, William & Wilkins, Baltimor. Iyer, A., Mody, K. & Jha, B. 2005. Biosorption of heavy metals by a marine bacterium. Marine Pollution Bulletin. 50: 340 - 343. Malik, A., 2004. Metal bioremediation through growing cells. Environment International. 30, 261–278. Nithya, C., Gnanalakshmi, B. & Pandian, S.K. 2011. Assessment and characterization of heavy metal resistance in Palk Bay sediment bacteria. Marine Environmental Research. 71: 283 - 294. Silver, S. 1996. Bacterial resistances to toxic metal ions - a review 1. Gene. 179: 9-19 Shovitri, M., Zulaika, E. dan Koentjoro, M.P. 2010, Reduction of Toxic Mercuric Ion by solated Bacteria from the Mas River Surabaya. Inovasi Bioproduk dalam embangunan Berkelanjutan Velásquez, L & Dussan, J. 2009. Biosorption and bioaccumulation of heavy metals on dead and living biomass of Bacillus sphaericus. Journal of Hazardous Materials 167: 13 - 716. Vijayaraghavan, K & Yun, Y.S. 2008. Bacterial biosorbents and biosorption. Biotechnology Advances. 26: 266 - 291. Zulaika, E., Widiyanti, A. & Shovitri, M. 2011. Bakteri Resisten Merkuri Endogenik Hilir Kali Mas Surabaya. Seminar Nasional Teori dan Aplikasi Teknologi Kelautan SENTA 2011, Fakultas Teknologi Kelautan, ITS. 15-16 Desember, 2011, Surabaya, Indonesia

Seminar Nasional Waste Management for Sustainable Urban Development Teknik Lingkungan, FTSP-ITS, 21 Pebruari 2012.

hal 5