Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Resisten Merkuri Di Hilir Kali Mas Surabaya
Atik Widiyanti*, Maya Shovitri1, Nengah Dwianita Kuswytasari2
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri resisten merkuri dari sedimen dan air sungai tersebut. Isolasi dilakukan dengan menggunakan medium Nutrient Agar (NA) yang mengandung 10‰ NaCl dan 10 ppm HgCl2. Dari hasil penelitian diperoleh 24 isolat bakteri resisten merkuri. Berdasarkan 13 karakter biokimia yang diujikan, isolat tersebut cenderung masuk ke dalam 9 genus berbeda, yaitu Bacillus, Mycobacterium, Escherichia, Providencia, Erwinia, Staphylococcus, Micrococcus, Neisseria, Azotobacter. Kata kunci: merkuri, Hilir Kali Mas, bakteri resisten merkuri ABSTRACT This study was aimed to isolate and characterize mercury resistant bacteria from sediment and water of the river. Isolation was performed using a Nutrient Agar (NA) medium containing 10‰ NaCl and 10 ppm HgCl2. The study was successfully isolated 24 mercury resistant bacteria. Based on 13 biochemical tested character they were tended to fall into 9 different genera: Bacillus, Mycobacterium, Escherichia, Providencia, Erwinia, Staphilococcus, Micrococcus, Neisseria, Azotobacter. Key word: mercury, the Downstream Mas River Surabaya, mercury resistant bacteria
*Corresponding Author Phone: 085730098675 Email:
[email protected] 1,2 Alamat sekarang: Jurusan Biologi, FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya
I PENDAHULUAN Pencemaran logam berat merkuri (Hg) pada tanah dan air sangat membahayakan lingkungan dan kesehatan manusia. Senyawa merkuri dalam bentuk Hg(II) dapat terikat pada residu sistein protein atau enzim manusia atau binatang, sehingga protein atau enzim kehilangan
aktivitasnya. Selain Hg(II), senyawa merkuri yang paling berbahaya bagi kesehatan manusia adalah senyawa organomerkuri, khususnya metilmerkuri dan fenilmerkuri. Senyawa ini bersifat sangat reaktif dan mempunyai mobilitas tinggi dibanding dengan Hg(O) atau Hg(II). Hal ini disebabkan gastrointestine manusia mampu
menyerap sekitar 95% senyawa metilmerkuri, dan senyawa ini juga dapat menyerang syaraf manusia melalui peredaran darah (Rugh et al., 2000 dalam: Nofiani dan Guzrisal, 2004). Salah satu usaha untuk detoksifikasi merkuri dapat dilakukan menggunakan mikroorgansime resisten merkuri. Bakteri resisten merkuri merupakan bakteri yang mempunyai gen resisten merkuri mer operon untuk bertahan pada lingkungan yang mengadung merkuri (Silver & Phung,1998). Struktur mer operon berbeda untuk tiap jenis bakteri. Umumnya struktur mer operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan organomerkuri liase (merB) (Liebert et al., 1999). Beberapa ordo bakteri resisten merkuri yang terindentifikasi diantaranya adalah Burkholderiales, Nitrosomonadales, Rhodocyclales, Altermonadales (Ramond et al., 2008). Kali Mas Surabaya merupakan sungai yang banyak menerima limbah domestik maupun limbah industri di sepanjang alirannya. Pada tahun 2009 terukur konsentrasi merkuri di Kali Mas sebesar 0.105 ppm. Konsentrasi tersebut melebihi ambang batas minimal yaitu 0.001 ppm yang ditetapkan Pemerintah melalui PP no. 82 tahun 2001 (Shovitri et al., 2010). Hilir Kali Mas Surabaya berada di Pelabuhan Tanjung Perak. Pelabuhan Tanjung Perak Surabaya merupakan salah satu pelabuhan pintu gerbang di Indonesia. Tanjung Perak adalah pusat kolektor dan distributor barang dari/ke Kawasan Timur Indonesia, khususnya untuk Propinsi Jawa Timur. Pelabuhan Tanjung Perak Surabaya merupakan pelabuhan dengan lalu lintas kapal yang cukup padat yaitu sekitar 40 kapal yang bersandar tiap harinya. Ramainya lalu lintas tersebut menimbulkan
kecenderungan meningkatnya volume buangan kapal (Rezvani, 2006). Selain itu, di sekitar lokasi pelabuhan Tanjung Perak Surabaya terdapat industri galangan kapal seperti beberapa galangan di Tambatan Nilam, PT. PAL Indonesia dan PT. Dok dan Perkapalan Surabaya (Rezvani, 2006). Kondisi tersebut berpotensi meningkatkan polutan termasuk merkuri. Berdasarkan uji pendahuluan, diketahui bahwa salinitas rerata di hilir Kali Mas Surabaya adalah 10‰. II METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Januari-Mei 2011 di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi ITS. Analisa kandungan merkuri dilakukan di Laboratorium Kwanti/Analisa Makanan Universitas Surabaya (UBAYA). Pengambilan Sampel Sampling dilakukan dengan mengambil air dan sedimen di hilir Kali Mas Surabaya pada koordinat S: 07o11’57.8” dan E: 112o44’06.8” (Garmin, Etrex 12 Channel®, Taiwan). Botol film steril dimasukkan ke dalam kolom air dengan arah mulut berlawanan dengan arus sungai. Tutup botol dibuka di dalam air dan dibiarkan terisi air hingga penuh kemudian ditutup pada posisi masih di bawah kolom air.Sedimen diambil dengan Ekman Bottom Grab yang dimasukkan ke dalam kolom air hingga mencapai dasar sungai. Selanjutnya Ekman Bottom Grab ditarik. Botol steril dimasukkan ke dalam tumpukan sedimen, tutup botol dibuka di dalam tumpukan sedimen dan sedimen dimasukkan ke dalam botol film hingga penuh. Kemudian botol film ditutup pada posisi masih di dalam sedimen..
Isolasi Bakteri Sampel air dan sedimen yang telah diambil dilakukan secara terpisah tetapi dilakukan dengan metode yang sama yaitu metode pengenceran bertingkat dan dilanjutkan dengan metode sebar. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat. Hngga didaptkan 10-5 untuk sampel air dan 10-7 untuk sampel sedimen. Tiga pengenceran terakhir masing-masing diambil 100 m dengan menggunakan pipet mikro dan diteteskan ke permukaan medium padat NA 10‰-HgCl2 10 ppm. Inokulum kemudian diratakan dengan spatel Graygalsky. Kultur biakan selanjutnya diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC dan diamati setiap 24 jam selama 2 hari. Purifikasi Isolat Koloni yang tumbuh dipurifikasi sampai diperoleh isolat murni. Satu koloni isolat bakteri diambil dari cawan petri secara aseptis dan inokulasikan ke permukaan medium padat NA 10‰-HgCl2 10 ppm, dengan metode 16 goresan dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam.. Pemindahan koloni isolat dilakukan sebanyak 5 kali. Untuk mengetahui apakah dalam tiga kali pemindahan telah didapatkan isolat murni, maka dilakukan pengamatan bentuk sel secara mikroskopis dengan cara pewarnaan sederhana. Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Pengamatan makroskopis adalah pengamatan bentuk pertumbuhan koloni bakteri yang tumbuh dipermukaan medium padat NA 10‰-HgCl2 10 ppm. Parameter karakter koloni meliputi: a. Bentuk koloni (dilihat dari atas): berupa titik-titik, bulat, berbenang, tak teratur, serupa akar, serupa kumparan
b. Permukaan koloni (dilihat dari samping): rata, timbul-datar, melengkung, membukit, serupa kawah c. Tepi koloni (dilihat dari atas): utuh, berombak, berbedah, bergerigi, berbenang d. Warna koloni : keputih-putihan, kelabu, kekuning-kuningan atau hampir bening. Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri berdasarkan sistem Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Pada tahap awal identifikasi, bakteri resisten merkuri dilakukan uji morfologi dengan pewarnaan gram, pewarnaan endospora dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan Gram Preparat ulas ditetesi larutan kristal violet sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir. Gram’s iodine mordant (Emerck) diteteskan sebanyak 2-3 tetes diatas permukaan preparat lalu didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya preparat ditetesi etil alkohol 95% setetes demi setetes sampai kristal violet tercuci. Kemudian dicuci dengan air mengalir kembali. Berikutnya preparat ditetesi safranin selama 45 detik dan dicuci dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dan diamati dengan mikroskop. Pewarnaan Endospora Preparat ulas ditempatkan pada rak pewarna. Preparat ulas ditutup penuh dengan kertas saring. Kemudian zat warna hijau malakit diteteskan dengan pipet Pasteur ke permukaan kertas saring secara merata dan selanjutnya dipanaskan selama 5 menit dan didinginkan. Setelah preparat dingin, kertas
saring saring dibuang dan preparat dibilas dengan air yang mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian preparat diwarnai dengan safranin selama 1 menit dan dibilas dengan air yang mengalir dan dikeringanginkan. Setelah itu ditutup dengan gelas penutup. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dengan minyak imersi yang diteteskan di luar atas kaca penutup. Pewarnaan Tahan Asam Preparat ulas ditempatkan pada rak pewarna. Karbol fuchsin diteteskan pada preparat ulas. Selanjutnya dipanaskan selama 5 menit. Preparat. Kemudian didingin anginkan, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Setelah itu ditetesi alkohol asam setetes demi setetes. Selanjutnya dicuci dengan air dan dikering anginkan. Preparat kemudian ditetesi metilen blue dan dibiarkan selama 2 menit. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x. Uji Biokimia Uji Fermentasi Karbohidrat Karbohidrat yang digunakan adalah glukosa, laktosa dan manitol. Medium fermentasi antara lain 1% glukosa (Difco, USA), 0.5% laktosa (Difco, USA), dan 0.5% manitol (Difco, USA) yang masing-masing dilarutkan ke dalam 100 ml medium cair pepton water (Oxoid, Inggris)-10‰ NaCl serta indikator bromthymol blue 0,1% sebanyak 1 ml (EG-Kennzeichnung, Jerman). Selanjutnya medium fermentasi tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung Durham sebanyak 3 ml. Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam medium fermentasi tersebut secara aseptis dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu
37°C (Noviani, 2002; Collins and Lyne, 1985). Uji Pembentukan Indol Satu ose isolat bakteri diinokulasikan secara aseptis ke 3 ml medium cair Trptic Soy Broth-10‰ NaCl dalam tabung reaksi. Kemudian diinkunbasi selama 24 jam pada suhu 370C dan setelah itu ditambahkan dengan Kovacs reagent (Merck, Jerman) (Cappuccino & Sherman, 2001). Hasil uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah. Uji Produksi H2S Dan Gas Isolat bakteri resisten merkuri dinokulasikan secara aseptis ke medium Triple Iron Sugar Agar (TSIA)-10‰ NaCl dengan jarum inokulasi yang ujungnya tajam yang telah mengandung isolat bakteri. Selanjutnya, diinkubasi selama 24-48 jam (Cappuccino & Sherman 1983). Uji positif produksi H2S ditandai dengan terbentuknya warna hitam pada medium. Uji positif pembentukan gas ditandai dengan terbentuknya gas di dasar medium, sehingga medium naik ke atas. Uji Motilitas Uji motolitas ini dapat diperoleh dari uji produksi H2S dan gas seperti yang telah diuraikan pada paragraf sebelumnya. Uji positif ditandai terbentuknya sebaran pada daerah bekas inokulasi (tusukan) artinya bakteri melakukan aktivitas bergerak (motil). Uji Kebutuhan Oksigen Sebanyak 3 gram agar dan 29.5 gram medium thioglycollate (Oxoid, CMO173®, Inggris) dan 10 mg NaCl dilarutkan ke dalam 1 liter akuades dan dipanaskan di atas pemanas sampai agar larut dan homogenkan. Kemudian medium dipindahkan ke dalam
tabung reaksi sebanyak 7 ml dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dan tekanan 1,5 atm. Setelah dikeluarkan dari autoklaf, tabung reaksi yang berisi medium langsung dimasukkan ke dalam bak yang berisi air yang telah diatur suhunya setinggi 50°C untuk mencegah terjadinya pemadatan agar. Setelah suhu medium teradaptasi pada suhu 50°C, kemudian sebanyak satu ose isolat bakteri berumur 24 jam di inokulasikan ke dalam medium tersebut secara aseptis. Tabung reaksi kemudian diputar dengan bantuan telapak tangan, agar bakteri terdistribusi merata di dalam agar. Setelah masa inkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C, pola pertumbuhan dari isolat bakteri diamati. Oksidase Fermentasi (OF) Satu ose biakan bakteri yang berumur 24 jam diinokulasikan pada 2 tabung ± 7 ml medium basal OF (Difco®, USA)-10‰ NaCl, dengan karbohidrat yang digunakan adalah 1% glukosa. Salah satu tabung tersebut ditetesi dengan minyak steril ± 1 ml, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan medium menjadi kuning. Uji Penggunaan Sitrat Satu ose biakan bakteri diinokulasikan pada 5 ml medium padat miring Simmons Citrat Agar (Difco®, USA)-10‰ NaCl dalam tabung reaksi dan indikator Bromthymol blue secara aseptis lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam (Cappuccino &Sherman 1983). Hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan bakteri dan medium pertumbuhan berubah warna dari hijau menjadi biru. Sedangkan hasil negatif sebaliknya (Cappuccino and Sherman, 2001).
Uji Katalase Sebanyak satu tetes H2O2 3% diteteskan ke atas kaca objek steril kemudian sebanyak satu ose isolat bakteri digoreskan secara aseptis. Hasil positif ditandai dengan timbulnya gas atau gelembung udara di sekitar goresan bakteri tersebut (Harley and Prescott, 2002). Uji Oksidase Satu ose isolat bakteri yang berumur 24 jam dioleskan ke permukaan kertas oksidase (Oxoid, Inggris) secara aseptis. Hasil uji positif apabila setelah 5 detik terbentuk warna ungu pada kertas oksidase tersebut (Harley, 2002). Uji Ornithin Decarbaoxylase Satu ose isolat bakteri yang berumur 24 jam diinokulasikan pada tabung reaksi yang berisi medium ornithin broth. Bagian atas medium kemudian ditetesi dengan minyak steril. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan terbantuknya warna ungubiru. Hasil negatif terbentuk warna kuning. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Data yang diperoleh dianalisa secara deskriptif. Isolat bakteri yang telah dipurifikasi, dideskripsikan karakteristik secara makroskopis, mikroskopis dan karakter biokimia sesuai dengan buku panduan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. III PEMBAHASAN Nutrient Agar (NA) mengandung NaCl sebesar 10‰ dan HgCl2 sebesar 10 ppm. Salinitas medium NA dikondisikan sama dengan rerata salinitas di hilir Kali Mas Surabaya, supaya tidak terjadi tekanan osmotik yang menyebabkan sel bakteri lisis. Medium dikondisikan mengandung 10 ppm
merkuri, karena menurut Canstein et al., (2002) isolat bakteri yang dapat tumbuh pada medium sintesis dengan minimal 5 ppm HgCl2 merupakan isolat bakteri resisten merkuri tinggi. Dalam penelitian ini diperoleh 24 isolat bakteri, yang terdiri dari 13 isolat bakteri dari sedimen dengan kode: S1Hg, S2Hg, S3Hg, S4Hg, S5Hg, S6Hg, S7Hg, S8Hg, S9Hg, S10Hg, S11Hg, S12Hg, dan S13Hg, serta 11 isolat bakteri dari air dengan kode: A1Hg, A2Hg, A3Hg, A4Hg, A5Hg, A6Hg, A7Hg, A8Hg, A9Hg, A10Hg dan A11Hg. Jumlah isolat yang didapat dari sedimen lebih banyak daripada dari air. Ini mungkin karena disedimen kandungan merkuri lebih banyak daripada di air. Hal
Gram Positif Basil Isolat bakteri yang termasuk Gram positif basil adalah: S1Hg, S3Hg, A7Hg. Hasil uji biokimia ke-3 isolat bakteri tersebut cenderung masuk ke dalam 2 genus
tersebut berkaitan dengan berat atom merkuri yaitu sebesar 200.58 g/mol, sehingga relatif cenderung mengendap di sedimen. Gambar 1 menunjukkan kemurnian dan bentuk sel ke-24 isolat bakteri resisten merkuri. Berdasarkan pewarnaan Gram dan bentuk sel ke-24 isolat bakteri dikelompokkan menjadi 4 kelompok besar, yaitu: 1).Bakteri Gram Positif Basil, 2).Bakteri Gram Negatif Basil, 3).Bakteri Gram Positif Kokus, 4).Bakteri Gram Negatif Kokus.
yang berbeda, yaitu Bacillus spp. (S1Hg, S3Hg) dan Mycobacterium spp. (A7Hg) (Gambar2)
Gram Negatif Basil Isolat bakteri yang masuk dalam kelompok bakteri Gram negatif basil adalah: S4Hg, S11Hg, S13Hg, A5Hg, A10Hg. Berdasarkan kunci identifikasi bakteri ke-5
isolat bakteri cenderung berasal dari 3 genus yang berbeda, yaitu Escherichia (A5Hg), Providencia (S4Hg, S11Hg, S13Hg) dan Erwinia (A10Hg) (Gambar 3).
Gram Positif Kokus Isolat Bakteri yang termasuk dalam Gram positif kokus adalah: S2Hg, S5Hg, S7Hg, S10Hg, A8Hg, A11Hg. Berdasarkan kunci utama identifikasi bakteri dari 6 isolat
bakteri tersebut cenderung masuk dalam 2 genus yang berbeda yaitu Staphylococcus (S2Hg, S10Hg, A8Hg, A11Hg) dan Micrococcus (S5Hg, S7Hg) (Gambar 4).
Gram Negatif Kokus Isolat bakteri yang masuk dalam Gram negatif kokus adalah: S6Hg, S8Hg, S9Hg, S12Hg, A1Hg, A2Hg, A3Hg, A4Hg, A6Hg, A9Hg. Dari 10 isolat tersebut, 9 isolat
bakteri cenderung masuk dalam genus Azotobacter (S6Hg, S8Hg, S9Hg, A1Hg, A2Hg, A3Hg, A4Hg, A6Hg, A9Hg), sedangkan 1 isolat bakteri masuk kedalam genus Neisseria (S12Hg) (Gambar 5).
V KESIMPULAN Dari hilir Kali Mas didapatkan 24 isolat bakteri yang tahan terhadap HgCl2 10 ppm dan NaCl 10‰. Berdasarkan karakter mikroskopis, makroskopis dan 13 karakter biokimia yang diuji, ke-24 isolat bakteri tersebut cenderung masuk ke dalam 9 genus yang berbeda, yaitu: Bacillus, Mycobacterium, Escherichia, Providencia, Erwinia, Staphylococcus, Micrococcus, Azotobacter dan Neisseria.
DAFTAR PUSTAKA Canstein HV, Li Y, Leonhauser J, Haase E, Felske A, Deckwer WD, dan Dobler IW, 2002. Spatially Oscillating Activity and Microbial Succession of Mercury-Reducing Biofilms in a Technical-Scale Bioremediation System. Appl. Environ. Microbiol. 68: 19381946 Cappuccino, J.G. & Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison-Wesley: California. Harley, J.P. and L.M. Prescott. 2002. Laboratory Exercises in th Microbiology, 5 Edition. The Mc Graw Hill Companies : New York Holt, J.G., N.R. Krieg, P. Sneath, J. T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th Edition. Williams and Wilkins Pub: USA. Liebert, C.A., Hall, R.M. and Summers, A.O. 1999. Transposon Tn21, flagship of the floating genome.
Microbiol.Mol. Biol. Rev. 63: 507-522. Nofiani dan Gusrizal. 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari Daerah Bekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. Jurnal Natur Indonesia. 6(2): 67-74
