BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Patologi Serangga Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian
dilaksanakan dari Februari 2011 sampai September 2011. Alat dan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah larva S. litura, SlNPV, sunblock komersil, daun kedelai, daun talas, buffer SDS 0,1%, kertas tisu, dan air destilata. Alat-alat yang digunakan adalah wadah pembiakan dan pemeliharaan S. litura, cawan petri, mikroskop stereo, lemari pendingin, pinset, mortar, hemositometer, pipet, tabung reaksi, sentrifus, otoklaf, timbangan digital, kuas, dan wadah plastik. Metode Penyiapan suspensi SlNPV Larva S. litura hasil pemeliharaan dikontaminasi dengan perlakuan kontaminasi pakan yang diberi virus NPV dari laboratorium.
Larva yang
terinfeksi dikumpulkan dan dibersihkan, kemudian digerus menggunakan mortar dan pistil di dalam buffer SDS 0,1% untuk mendapatkan suspensi kasar. Suspensi kasar yang diperoleh disentrifugasi dengan sentrifus (High speed micro refrigerated centrifuge Tommy 151) untuk memurnikan polihedra dan untuk memperoleh suspensi virus yang lebih halus dan lebih bersih dari berbagai macam kotoran ataupun dari sisa jaringan larva. Suspensi kasar disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatan dikumpulkan dan endapannya dibuang. Supernatan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit, kemudian endapannya diambil dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 2 menit. Supernatan disentrifugasi kembali dengan tahapan yang sama seperti sebelumnya sampai diperoleh hasil berupa endapan akhir yang relatif bersih. Endapan akhir tersebut diresuspensi dengan akuades secukupnya. .Suspensi yang didapatkan kemudian diencerkan untuk
12
mempermudah penghitungan konsentrasi Polyhedra Inclusion Bodies (PIBs). Suspensi induk sebanyak 0,01 ml diencerkan dengan akuades sebanyak 0,99 ml untuk mendapatkan pengenceran 100 kali. Suspensi hasil pengenceran tersebut diambil dengan pipet tetes dan diteteskan pada hemositometer burker kemudian diamati dan dihitung konsentrasi polihedranya di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali (Gambar 1). Konsentrasi PIBs dalam suspensi induk yang diperoleh yaitu 4,35x107 PIBs/ml. Konsentrasi ini merupakan konsentrasi yang akan digunakan dalam uji toksisitas.
Gambar 1. Polihedra Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x Penyiapan Serangga uji Larva yang akan diuji dikoleksi dari lapangan kemudian dipelihara di laboratorium. Larva yang diperoleh dibiakkan dalam kotak serangga dan diberi pakan daun talas. Larva kemudian dipindahkan ke dalam wadah yang berisi serbuk gergaji untuk berpupa. Setelah larva menjadi pupa, pupa-pupa tersebut kemudian dipindahkan ke dalam wadah plastik. Serangga dewasa yang muncul dipindahkan ke dalam wadah plastik yang lebih besar yang diberi madu sebagai pakannya dan dipelihara hingga bertelur. Bagian dalam wadah plastik dilapisi dengan kertas buram sebagai tempat peletakan telur dan dikumpulkan hingga menetas. Larva yang digunakan adalah instar III yang sehat dengan ciri-ciri warna tubuh larva cerah dan tidak lembek, serta larva aktif bergerak.
13
Uji Toksisitas SlNPV Uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan taraf konsentrasi efektif dari SlNPV terhadap larva S. litura.
Penentuan konsentrasi yang digunakan
berdasarkan SlNPV dengan tingkat patogenisitas tertinggi yang dihitung dengan nilai LD 50. Nilai LD 50 (dosis yang mematikan 50% populasi) untuk larva instar III sebesar 4,86x 101 polihedra inclusion bodies (PIBs)/ml dan sebagai kontrol digunakan akuades. Pengujian toksisitas SlNPV terhadap larva S. litura dilakukan dengan metode kontaminasi pakan.
Ekstrak virus yang diuji dengan lima taraf
konsentrasi mulai dari 4,35x107 PIBs/ml dengan pengenceran 10 kali hingga 4,35x103 PIBs/ml. Hal ini diharapkan dapat mengakibatkan kematian S. litura 10% sampai 100%.
Metode kontaminasi pakan dilakukan dengan cara
meneteskan 100µl SlNPV pada daun kedelai yang telah dipotong dengan ukuran 2 x 2 cm. Daun kontrol hanya ditetesi akuades. Daun perlakuan dan kontrol masing-masing sebanyak satu lembar dimasukkan ke dalam wadah plastik, kemudian satu larva instar tiga S. litura dimasukkan ke dalam wadah dan diulang tiga kali. Setiap ulangan terdiri atas 30 larva. Pakan diganti setiap hari dengan daun kedelai yang tidak mengandung NPV. Pengamatan dilakukan setiap hari selama delapan hari. Data hubungan konsentrasi dengan mortalitas diolah dengan program polo-pc. Jika persentase kematian S. litura pada kontrol maksimal 5% maka dilakukan koreksi dengan menggunakan rumus Abbott ( 1925) sebagai berikut : Pt = {(P0 – Pc)/(100 – Pc)} x 100% Pt = % Kematian terkoreksi P 0 = % Kematian kumulatif pada perlakuan Pc = % Kematian kumulatif pada kontrol Uji Efektivitas Bahan UV Protektan Dalam penelitian ini, bahan UV protektan yang digunakan pada penelitian ini adalah 2 jenis sunblock komersil yatu sunblock 1 dan sunblock 2. Kedua sunblock diencerkan dengan menggunakan aquades steril dengan 2 konsentrasi
14
yaitu 0,1% dan 0,5%. Setelah dilakukan pengujian awal, diperoleh dan digunakan konsentrasi yang diinginkan yaitu 0,5% untuk masing-masing sunblock. Metode Pengujian Pemaparan SlNPV dengan penambahan sunblock dilakukan di bawah sinar matahari langsung selama 0, ½, 1, dan 3 jam. Pengukuran terhadap intensitas sinar Ultraviolet dilakukan dengan menggunakan pengukur UV 290 - 390 nm (UV 340 Lutron). Percobaan ini terdiri atas tiga faktor perlakuan, faktor pertama yaitu penggunaan SlNPV dan tanpa SlNPV, faktor kedua yaitu sunblock komersil dengan konsentrasi 0,5%. Faktor ketiga yaitu waktu pemaparan di bawah sinar matahari langsung selama 0, ½, 1, dan 3 jam. Sunblock dicampurkan kedalam suspensi NPV hingga konsentrasi akhir UV protektan sebesar 5%. Konsentrasi NPV yang digunakan adalah 107 PIBs/ml. Sebanyak 100 ml suspensi dituangkan ke dalam cawan petri berdiameter 14 cm.
Cawan petri tersebut diletakan dalam keadaan terbuka di bawah sinar
matahari langsung sesuai dengan perlakuan yang telah ditentukan. Daun kedelai segar berukuran 2 x 2 cm dicelupkan selama 5 detik kedalam suspensi NPV kemudian dikering anginkan selama 30 detik. Daun kedelai tersebut dimasukkan ke dalam wadah plastik yang sudah berisi larva S. litura instar III. Setelah pakan habis, diganti dengan daun-daun talas yang tidak diberi perlakuan virus dan diberikan sesuai kapasitas makan, sehingga larva tidak kekurangan pakan. Kematian larva dicatat setiap hari hingga larva menjadi pupa. Persentase mortalitas larva dikoreksi dengan menggunakan rumus Abbott dengan formula seperti yang telah disebutkan pada percobaan sebelumnya. Persentase mortalitas larva S. litura (%). Pengamatan mortalitas dihitung setiap hari. dihitung dengan menggunakan rumus : P
n x 100% N Keterangan : P
= Persentase mortalitas larva
n
= Jumlah larva yang mati
N
= Jumlah larva yang diuji.
Persentase mortalitas larva
15
Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan 3 ulangan, setiap ulangan terdiri dari 30 larva. Faktor pertama adalah bahan tambahan sunblock. K
= H 2 O+H 2 O
S1
= H 2 O+sunblock 1
S2
= H 2 O+sunblock 2
V
= NPV+H 2 O
VS1
= NPV+sunblock 1
VS2
= NPV+sunblock 2
Faktor yang kedua yaitu waktu pemaparan di bawah sinar matahari langsung yaitu: T0
= 0 jam
T1/ 2
= ½ jam
T1
= 1 jam
T3
= 3 jam
Analisis Data Data yang diperoleh diolah menggunakan program Statistical Analisis System (SAS) for Windows versi 9.0 untuk memperoleh analisis ragam. Apabila terjadi perbedaan, dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata α = 0,05.
