10 BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Rumah Kaca Balai Besar Penelitian Tanaman Padi Kebun Percobaan Muara, Bogor dan di laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2010 hingga Mei 2011. Alat dan bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa wereng uji N. lugens dan larutan 0,1% acid fuchsin. Varietas padi Inpari 3, Inpari 4, Inpari 6, Inpari 13, IR26, IR42, IR64, IR74 dan varietas pembanding PTB33 dan TN1. Metode Penelitian Pemeliharaan dan Perbanyakan Tanaman Inang Empat varietas benih padi Pelita, IR26, IR42, dan Ciherang digunakan untuk diperbanyak sebagai tanaman inang biakan stok populasi WBC uji berturutturut untuk biotipe 1, biotipe 2, biotipe 3 dan populasi lapang dari daerah Klaten dan 10 varietas benih padi yaitu TN1, Inpari 3, Inpari 4, Inpari 6, Inpari 13, IR26, IR42, IR64, IR72 dan PTB33 digunakan untuk pengujian keperidian WBC uji. Benih tersebut diperoleh dari BB Padi Sukamandi. Setiap varietas benih padi uji disemai pada baki yang telah dilapisi tanah untuk media semai secukupnya di laboratorium rumah kaca BB Padi KP Muara, Bogor. Setelah bibit padi berumur 10 hari digunakan sebagai inang populasi WBC masing-masing dipindahkan ke dalam ember berisi tanah lumpur. Tanaman dipupuk dengan urea dosis 2 g/pot, atau setara dengan 250 kg/ha.
Setelah
tanaman berumur 1 bulan siap digunakan untuk memperbanyak populasi WBC. Pada pengujian keperidian WBC digunakan tanaman berumur satu bulan yang diperoleh dari pemeliharaan di lapangan.
11
Perbanyakan WBC Uji WBC biotipe 1, 2, dan 3 diperoleh dari biakan wereng yang dipelihara di Rumah Kaca KP Muara, Bogor, sedangkan biotipe lapang diperoleh dengan mengoleksi wereng dari daerah Klaten di lokasi peledakan populasi WBC. Tiga pasang imago jantan dan betina WBC diambil dan dipindahkan ke rumpun tanaman padi berumur 35 HST yang telah disediakan dengan menggunakan aspirator. WBC biotipe 1 dipelihara pada varietas Pelita, biotipe 2 pada varietas IR 26, biotipe 3 pada varietas IR 42, dan biotipe lapang pada varietas Ciherang. Tanaman yang telah dinvestasi WBC dikurung dengan kurungan kasa berkerangka besi, berbentuk silinder berdiameter 25 cm, tinggi 85 cm, bagian permukaan atasnya ditutup kain kasa dan di bagian samping pangkal kurungan diberi ventilasi berukuran 10 x 10 cm. Imago yang baru eklosi generasi pertama hasil pertumbuhan dan perkembangbiakan WBC digunakan sebagai serangga uji pada pengujian keperidian wereng.
Sebagai bahan pengukuran tubuh serangga (body size)
digunakan individu WBC hasil pengamatan pertumbuhan populasi WBC biotipe 2 dan 3 pada varietas padi TN1, Inpari 3, Inpari 4, Inpari 6, Inpari 13, IR26, IR42, IR64, IR72 dan PTB33 selama satu musim tanam. Pengujian Keperidian WBC Indikator fitness berkaitan dengan perkembang biakan serangga diukur dengan mengamati keperidian (fecundity) dan lama hidup imago (longevity). WBC biotipe 3, instar IV dan V di atas dipilih dan dipisahkan dari populasi stok, kemudian dipindahkan ke rumpun tanaman baru yang telah dipersiapkan ditanam dalam pot seperti diuraikan di atas. Pengumpulan instar ini dilakukan untuk mendapatkan individu imago WBC uji yang baru eklosi dengan jumlah yang cukup dan umur seragam. Sepasang imago WBC yang baru eklosi diambil dari kurungan dan diletakkan pada tanaman uji berumur satu bulan di dalam kurungan pengujian berbentuk silinder, yang terbuat dari plastik mika berdiameter 5 cm dan tinggi 20 cm. Setiap perlakuan diulang 4-10 kali. Tanaman diletakkan dalam posisi tegak dengan cara menyisipkan bagian pangkal tanaman pada celah busa plastik di bagian pangkal dan ujung kurungan (Gambar 3). Sejumlah kurungan
12 tersebut dimasukkan di dalam toples berukuran 5 liter berisi air yang diposisikan sebatas tinggi akar, agar tanaman tidak layu. Bagian pangkal pelepah padi ini merupakan tempat bertenggernya WBC, makan dan peletakkan telur. Jumlah telur WBC yang diletakkan pada jaringan pelepah padi diamati setiap interval dua hari selama masa hidup imago serangga uji. Pengamatan telur dilakukan dengan cara mengambil tanaman uji dan menggantikannya dengan tanaman baru setiap dua hari sekali. Bagian jaringan pelepah tanaman yang telah disisipi telur direndam di dalam larutan pewarna 0.1% acid fuchsin selama 15 menit sampai 1 jam agar saat pembedahan dapat dibedakan antara warna telur dan jaringan tanaman. Pembedahan dilakukan di atas objek gelas dengan bantuan gunting dan pinset dan telur diamati di bawah mikroskop cahaya. Jumlah telur yang diletakkan pada tanaman dihitung dan dicatat. Sisa telur yang tidak diletakkan pada tanaman diamati dengan membedah wereng pasca peneluran, tepatnya saat wereng mati di akhir pengujian. Fitness berkaitan dengan reproduksi dinyatakan dengan (Ellers dan Jervis 2003): Keperidian riil = jumlah telur yang diletakkan pada tanaman inang selama hidup imago Potensi keperidian = keperidian riil + jumlah telur dalam ovari.
Gambar 3 Lokasi penempatan wereng uji pada inang Kiri: kurungan pengujian, a. posisi wereng pada tanaman; Kanan: toples penampung kurungan.
13 Analisis Morfometrik Tubuh Wereng Indikator fitness yang berkaitan dengan morfologi tubuh WBC N. lugens pada penelitian ini adalah pengukuran body size yang meliputi ovipositor, rostrum, kepala bagian depan, sayap depan, dan tibia berikut taji tungkai belakang dari WBC biotipe 2 dan 3. Pengukuran body size digunakan metode analisis program Proscrustes TPSutil dan TPSdigg2 yang diunduh dari penelusuran internet melalui web site: http://life.bio.sunysb.edu/morph (Rohlf 1999). Metode ini mengacu pada pengukuran body size sayap parasitoid T. brassicae (Kapuge dan Hoffmann 2001) dan beberapa serangga lainnya, seperti lalat Drosophila melanogaster, Chironomis tepperi, Lucilia cuprina, dan ngengat buah apel Epiphyas postvittana (Hoffmann et al. 2005). Wereng yang dibedah adalah WBC yang diambil dari sumber yang sama terhadap perlakuan penghitungan jumlah telur dan WBC yang diambil dari pemeliharan pada perlakuan varietas TN1, Inpari 3, Inpari 4, Inpari 6, Inpari 13, IR26, IR42, IR64, IR72 dan PTB33. Preparasi bagian tubuh yang akan diukur dilakukan dengan cara yang berbeda yaitu preparasi sayap direkatkan pada gelas obyek yang telah diberi plastik berperekat ganda (double selotype), sedangkan preparasi bagian tubuh lainnya digunakan perekat Cutex yang diteteskan pada gelas obyek. Bagian kanan dan kiri sayap depan WBC masing-masing diisolasi dari tubuh serangga dengan mencabut pangkal sayap menggunakan pinset halus dan melekatkannya pada gelas obyek yang telah dilapisi selotip berperekat ganda (double selotype). Selanjutnya, preparat ditutup dengan gelas penutup, disimpan dalam kotak atau rak gelas preparat, dan siap difoto untuk pengambilan image sayap. Bagian sklerit ovipositor, rostrum, kepala bagian depan, sayap, dan tibia berikut taji tungkai belakang diisolasi dengan cara membedah tubuh WBC yang telah diambil sayapnya seperti yang uraian di atas dan setiap bagian tubuh tersebut dilekapkan pada setetes Cutex berpelarut aseton. Media pelarut Cutex tersebut dibiarkan mengering dan sklerit yang menempel pada objek gelas siap difoto untuk diambil imagenya.
Pengambilan foto digital sayap dan bagian tubuh
lainnya dilakukan dengan menggunakan alat potret Olympus DP 11D yang dihubungkan dengan perangkat komputer. Image foto tersebut disimpan dalam format JPEG.
14 Pengukuran “image body size” dilakukan dengan cara membuka program Proscrustes TPSutil dan TPSdigg2 (Rohlf 1999) menggunakan komputer dan menyisipkan (insert) seluruh data dari setiap bagian tubuh yang akan diukur dalam satu folder data.
Luasan dari setiap bagian tubuh yang diukur diplot
dengan menentukan beberapa titik pengukuran seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.
Pengukuran setiap titik landmark secara otomatis diubah dalam
program tersebut ke dalam koordinat sumbu x dan sumbu y dalam bentuk lembaran data bmp yang kemudian ditransfer ke CSV file sehingga dapat dibaca dalam software program Microsoft exell. Urutan prosedur pengukuran untuk mentransformasi landmark titik ke nilai angka adalah sebagai berikut: -
Log on computer untuk mendapat program TPSutil dan TPSdigg2 melalui penelusuran internet, alamat web site: http://life.bio.sunysb.edu/morph.
-
Start program
-
Click tpsutil
-
Build TPS file from images
-
Input
-
Buka folder sayap
-
Click pada file pertama
-
Click open
-
Click output
-
Create file (beri nama file)
-
Save
-
Set up
-
Click on create (masukkan semua file dalam include path)
-
Close
-
Open tps digg2
-
Buka file
-
Pilih TPS file by input source
-
Open foto spesimen sayap yang akan diukur
-
Tentukan letak titik-titik pada venasi sayap yang akan diukur
-
Save
-
Overwrite.
15 Transformasi data dari tps data ke Microsoft exell melalui tahapan: -
Open tps util. Pilih: convert tps/ints file
-
Input
-
Open file with double klik pada file yang sudah diukur (tampak pada tampilan screen)
-
Output
-
Save in CSV file
-
Created
-
Closed
-
Open folder
-
Open and find file with CSV di Microsoft exell
-
Maka data sudah ditransformasi
-
Save.
Gambar 4 Lansekap titik pengukuran body size WBC Keterangan: A) Enam belas titik pengukuran pada sayap depan; B) Delapan titik pengukuran pada tungkai belakang; C) Dua titik pengukuran pada ovipositor; D) Lima titik pengukuran pada rostrum; E) Tujuh titik pengukuran pada kepala.
16 Dari data hasil transformasi tersebut di atas, nilai jarak dari sumbu x (centroid x) dan sumbu y (centroid y) dihitung menggunakan program Microsoft Excel 2007, sehingga dapat ditentukan luasan bagian tubuh yang terukur (centroid size dalam satuan piksel atau luasan body size dalam satuan m). Pengukuran ovipositor, rostrum, kepala bagian depan, dan tibia berikut taji tungkai belakang dilakukan dengan cara yang sama seperti pengukuran sayap. Pengukuran nilai asimetri body size pada penelitian ini hanya dilakukan pada bagian sayap dan tungkai.
Nilai fluktuasi asimetri sayap atau tungkai merupakan nilai mutlak
selisih luasan sayap atau tungkai kiri dan kanan (asimetry direction). Semakin kecil nilai fluktuasi asimetri sayap menunjukkan semakin tinggi angka keseimbangan tubuh. Data hasil transformasi (x1, x2, x3, ..........x8) dan (y1, y2, y3,.........y8) dihitung melalui program Microsoft exell dengan rumus sebagai berikut: Centroid x = (x1+ x2+ x3 + ..........xn)/n
..........................................(1)
Centroid y = (y1+ y2+ y3 +...........yn)/n
..........................................(2)
Distanced = SQRT ((xn - Centroid x)^2 + ((yn - Centroid y)^2
............(3)
Centroid size = Sum (distanced 1, distanced 2, ..... distanced n) n
...............(4)
Luasan tubuh yang di ukur = Centroid size setiap spesimen ......................(5) Centroid size objektif mikrometer Asimetry direction = Centroid size (sayap kanan - sayap kiri)
................. (6)
Fluktuasi asimetri (FA) = │Asimetry direction│
Pengolahan Data Seluruh data hasil pengamatan keperidian dianalisis dengan ANOVA melalui program komputer Statistic Analyze System (SAS) 9.1. for Windows Data. Pengukuran tubuh serangga ditampilkan melalui program Proscrustes TPSutil dan TPSdig2, kemudian ditransformasi ke program Microsoft Excel 2007 dan dilanjutkan dengan analisis program SAS 9.1. for Windows, kemudian data ratarata antar perlakuan dibedakan berdasarkan analisis Duncan pada taraf
= 5%.
