1
BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan completely rendomized posttest only control group design.
S
R
K
Q1
P1
Q2
P2
Q3
P3
Q4
Gambar 4.1 Rancangan Penelitian. Keterangan : S = Sampel penelitian, Streptoccocus mutans diambil dari satu serotype. R = Random untuk meletakkan difusi disk (perlakuan) pada plate. K = Kontrol dengan etanol. P1 = Perlakuan dengan ekstrak mengkudu konsentrasi 50%. P2 = Perlakuan dengan ekstrak mengkudu konsentrasi 75%.
P3 = Perlakuan dengan ekstrak mengkudu konsentrasi 100%. Q1 = Nilai observasi pada kelompok kontrol. Q2 = Nilai obsevasi pada kelompok P1 setelah perlakuan. Q3 = Nilai observasi pada kelompok P2 setelah perlakuan. Q4 = Nilai observasi pada kelompok P3 setelah perlakuan. 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian 4.2.1 Lokasi penelitian : Laboratorium Mikrobiologi FK Unud. 4.2.2 Waktu penelitian : 3 bulan (Maret – Mei 2011). 4.3 Sampel Penelitian 4.3.1 Sampel penelitian : Streptococcus mutans ATCC 35668. Besar sampel ditentukan dengan menggunakan rumus Pocock (2008):
(1)
3
dibulatkan menjadi 7 plate. Keterangan :
σ = 3.104 (Sumono, 2009). α = 0,05 β = 0,10 ʃ (α,β) = 10,5 µ1 = 105
(Rerata jumlah Streptococcus mutans pada kelompok kontrol).
µ2 = 3.104 (Rerata jumlah Streptococcus mutans setelah pemberian ekstrak mengkudu). Jadi besar sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah tujuh plate pada masing – masing kelompok perlakuan. Plate dibagi atas empat kuadran dengan empat perlakuan, peletakan masing – masing perlakuan (difusi disk) dirandom dengan sistem undian (simple random sampling). 4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Variabel bebas : a. Ekstrak mengkudu konsentrasi 50%, 75%, 100%. 4.4.2 Variabel tergantung : Diameter zona hambat Streptococcus mutans. 4.4.3 Variabel kendali : a. Suhu pengeraman Streptococcus mutans. b. Waktu pengeraman Streptococcus mutans. c. Media pengeraman Streptococcus mutans.
d. Jumlah Streptococcus mutans. 4.5 Definisi Operasional Variabel 1. Ekstrak mengkudu konsentrasi 50%, 75% dan 100% adalah sediaan pekat yang didapat dengan mengektraksi zat aktif dari buah mengkudu dengan menggunakan pelarut etanol. Pada penelitian ini dibuat larutan ekstrak mengkudu konsentrasi 50%, 75%, 100%. 2. Diameter zona hambat Streptococcus mutans adalah diameter zona bening yang muncul pada difusi disk yang diukur dengan jangka sorong (dalam millimeter) untuk mengetahui kekuatan daya hambat ekstrak mengkudu terhadap pertumbuhan Streptococcus mutans. Kekuatan daya hambat bakteri dikategorikan menurut Davis dan Stout (1971) : sangat kuat ( zona bening >20mm), kuat (zona bening 10 – 20mm), sedang (zona bening 5 – 10mm), lemah (<5mm) (Dewi, 2010). 3. Suhu adalah
satuan besaran yang menyatakan derajat panas yang
diperlukan untuk pertumbuhan optimal Streptococcus mutans yang diukur menggunakan thermometer dengan skala derajat celcius yaitu 37ºC. 4. Waktu adalah besaran yang menunjukkan lamanya peristiwa mulai dari masuknya media pertumbuhan Streptococcus mutans ke inkubator selama proses inkubasi sampai dikeluarkannya media dengan satuan jam yaitu antara 18 - 24 jam menggunakan timer.
5
5. Media pengeraman adalah media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri Streptococcus mutans yaitu media padat Mueller Hinton ditambah 5% darah kambing. 6. Jumlah koloni Streptococcus mutans adalah jumlah Streptococcus mutans yang sesuai dengan 108 CFU/ml diperoleh dengan membuat kekeruhan bakteri
yang
setara
dengan
0,5
Mac
Farland
dilihat
dengan
spektrofotometer. 4.6 Bahan Dan Instrumen Penelitian 4.6.1 Bahan utama : a. Buah mengkudu yang matang, putih, transparan dan ukuran buahnya relatif besar (Djauhariya, 2006). b. Bakteri Streptococcus mutans ATCC 35668. 4.6.2 Bahan penunjang : a. Media isolasi dan numerisasi : agar Mueller-Hinton ditambah 5% darah kambing untuk bakteri Streptococcus mutans. b. Media TSH untuk refresh bakteri. c. Etanol 96% untuk ekstraksi buah mengkudu. d. Bahan NaCl 0,9 % untuk membuat kekeruhan. 4.6.3 Instrumen penelitian :
1. Erlenmeyer untuk pembuatan media. 2. Autoclave untuk sterilisasi alat – alat dan media. 3. Mikroskop untuk melihat pertumbuhan Streptococcus mutans. 4. Spektrofotometer untuk melihat kekeruhan. 5. Clinipette (mikro-pipet) ukuran 0,1 ml/0,01 ml untuk pembuatan konsentrasi ekstrak. 6. Ose (sengkelit) dan lidi kapas steril untuk pengambilan koloni bakteri. 7. Tabung – tabung reaksi untuk tempat media cair, media semi solid, media coklat miring dan untuk perlakuan. 8. Difusi disk untuk melihat zona hambat. 9. Penjepit, spatula. 10. Cawan petri untuk tempat media padat datar atau agar. 11. Lampu spiritus/ Bunsen. 12. Bahan pengecatan Gram. 13. Sorbitol Broth. 14. Manitol Broth. 15. Voges Proskauer
7
4.7 Alur Penelitian
Streptococcus mutans ATCC 35668
Mueller Hinton agar darah 5% Pembuatan kekeruhan sebanding 108
Random difusi disk
Etanol
Ekstrak mengkudu konsent. 75% Ekstrak mengkudu konsent. 50% Ekstrak mengkudu
Diameter zona hambat Streptococcus mutans.
konsent. 100%
Tabulasi data
Analisis data
Gambar 4.2 Alur Penelitian. 4.8 Protokol Penelitian 4.8.1 Pembuatan ekstrak mengkudu Ekstrak mengkudu dibuat dengan metode maserasi. Buah mengkudu sebanyak ± 5kg dicuci bersih kemudian ditiriskan dan dipotong – potong tipis. Potongan buah selanjutnya dijemur di bawah sinar matahari, dengan naungan kain hitam. Penjemuran dilakukan beberapa hari, sampai potongan buah benar – benar kering, mudah dipatahkan dengan tangan. Potongan buah yang sudah kering, berbentuk kepingan, dipisahkan antara daging buah dengan bijinya. Daging buah yang sudah kering selanjutnya dibuat serbuk (simplisia) dengan cara dihancurkan dengan blender, simplisia yang dihasilkan ± 325 gram. Simplisia siap dimaserasi dengan merendam ke dalam pelarut etanol 96% sampai terendam seluruhnya selama ± 24 jam, kemudian disaring dengan kertas penyaring. Residu kembali dimaserasi lagi dengan cara yang sama, sampai tiga kali. Ekstrak atau filtrat hasil maserasi ditampung menjadi satu dan diuapkan untuk memisahkan pelarutnya. Penguapan dilakukan dengan menggunakan alat Rotary evaporator pada suhu 45 -
9
50ºC, sampai pelarut habis menguap, sehingga didapatkan ekstrak kental buah mengkudu (Dewi, 2010). 4.8.2 Pembuatan konsentrasi ekstrak mengkudu Ekstrak kental buah mengkudu dibuat tiga seri konsentrasi (50%, 75% dan 100%) dengan menggunakan etanol. Untuk membuat konsentrasi suatu larutan dengan jumlah gram zat dalam 100ml pelarut (etanol). Konsentrasi 50% dibuat dengan memasukkan 50 gram ekstrak mengkudu dalam tabung ditambahkan etanol sampai volume 100ml. Konsentrasi 75% : 75gram esktrak mengkudu ditambah etanol sampai volume 100ml. Konsentrasi 100% : 100gram ekstrak mengkudu ditambah etanol sampai volume 100ml (Anief, 2000). 4.8.3 Prosedur kerja di laboratorium. 1. Menimbang Mueller Hinton agar 3,4gr dalam 100ml aquades, dilarutkan dan dimasukkan dalam autoclave dengan suhu 121º C selama 15 menit. 2. Ditaruh di water bath hingga suhu ±50ºC, ditambahkan 5% darah kambing. 3. Dituang pada cawan petri dengan diameter 10cm. 4. Kemudian 5% dari media Mueller Hinton + 5% darah kambing diatas diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam, untuk mengetahui sterilitas media. 5. Bila media dalam keadaan tanpa ada koloni (steril) bisa langsung digunakan sebagai media penanaman Streptococcus mutans.
6. Penanaman Streptococcus mutans pada media di atas kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. 7. Koloni yang tumbuh dilakukan pengecatan Gram, dengan prosedur pengecatan: a. Carbol gentian violet , didiamkan selama 1-3 menit, dicuci air mengalir. b. Lugol didiamkan selama 0,5 sampai 1menit, cuci air mengalir. c. Alkohol 96% didiamkan selama 0,25-0,5 menit, cuci air mengalir. d. Safranin didiamkan 1-2 menit, cuci air mengalir. f. Hasil pengecatan diamati secara mikroskopis berbentuk coccus, susunan berderet dan bersifat Gram positif (ungu), untuk meyakinkan bakteri yang tumbuh adalah Streptococcus mutans, dilanjutkan dengan uji identifikasi bakteri. 8. Identifikasi bakteri dengan uji Streptococcal grouping kit. a. Enzim dipipet 0,4 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. b. Koloni Streptococcus diambil dengan ose steril, dimasukkan ke dalam tabung reaksi diatas, kemudian dihomogenkan. c. Diinkubasi selama 10 menit dengan suhu 370C dengan inkubator, kemudian dipipet dan diteteskan pada lubang slide grouping kit masing – masing sebanyak 50 mikron. Satu slide lagi berfungsi sebagai kontrol positif juga ditetesi sebanyak 50 mikron. Dimana pada masing – masing lubang kemudian ditetesi dengan serum grouping A (pada lubang satu), serum grouping B
11
(lubang dua), serum grouping C (lubang tiga), serum grouping D (lubang empat), serum grouping F (lubang lima), serum grouping G (lubang enam), pada lubang ketujuh kontrol positif. d. Masing – masing lubang dihomogenkan dengan batang pengaduk kayu dan digoyangkan. Dari pengamatan apabila terjadi aglutinasi, menunjukkan hasil positif. Bila tidak terjadi aglutinasi berarti hasil negatfi. Pada penelitian ini bakteri menunjukkan aglutinasi pada serum grouping D.
9. Identifikasi lanjutan dengan uji biokimia, yang meliputi uji dengan : a. Manitol broth : Ditimbang 2 gr serbuk manitol broth, dilarutkan dengan 100ml aquades. Kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume masing – masing 5ml, yang sebelumnya pada tabung tersebut sudah berisi tabung durham (dengan posisi terbalik) untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. Kemudian dimasukkan ke dalam autoclave dengan suhu 1210C selama 15 menit, selanjutnya ditaruh di water bath hingga suhu ± 500C. Untuk mengetahui sterilitas, media diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Bila media dalam keadaan steril bisa digunakan sebagai media uji bakteri. b. Sorbitol broth : Ditimbang 2 gr serbuk sorbitol broth dalam 100ml aquades, kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume masing – masing 5ml.
Kemudian dimasukkan ke dalam autoclave dengan suhu 1210C selama 15 menit, selanjutnya ditaruh di water bath hingga suhu 370C selama 24 jam. Bila media dalam keadaan steril bisa digunakan sebagai media uji bakteri. c. VP (Voges Proskauer) : Ditimbang 1,7gr VP dalam 100ml aquades, kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume masing – masing 5ml. Kemudian dimasukkan ke dalam autoclave dengan suhu 1210C selama 15 menit, selanjutnya ditaruh di water bath hingga suhu 370C selama 24 jam. Bila media dalam keadaan steril bisa digunakan sebagai media uji bakteri. Setelah media uji siap, dilanjutkan dengan memasukkan bakteri uji ke dalam tabung reaksi dengan ketiga media tersebut di atas dengan menggunakan ose steril. Kemudian tabung reaksi dimasukkan kembali ke inkubator dengan suhu 370C selama 24 jam. Hasil pengamatan menunjukkan adanya kekeruhan dan perubahan warna (kuning) pada media manitol dan sorbitol. Sedangkan pada media VP terjadi kekeruhan yang bila ditambah dengan reagen kovac berubah menjadi merah kulit anggur. Perubahan – perubahan tersebut menunjukkan bahwa koloni tersebut merupakan bakteri Streptococcus mutans. 10. Pembuatan kekeruhan Streptococcus mutans sebanding dengan 108 CFU/ml :
13
Koloni Streptoccocus mutans dimasukkan ke tabung yang berisi NaCl 0,9% . Dibuat kekeruhan sebanding dengan 108 CFU/ml yang setara dengan 0,5 Mac Farland, sehingga dapat terbaca dengan spektrofotometer. 11. Dengan menggunakan lidi kapas steril, Streptococcus mutans dioleskan secara merata pada media agar Mueller-Hinton + 5% darah kambing (agar darah) pada petri dan dipasangkan dengan paper disk yang telah direndam dengan etanol, ekstrak mengkudu 50%, ekstrak mengkudu 75% dan ekstrak mengkudu 100%. Kemudian media dieramkan dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37ºC. 4.8.4 Penilaian kemampuan ekstrak mengkudu terhadap pertumbuhan kultur Streptococcus mutans Penilaian kemampuan hambatan ekstrak mengkudu terhadap pertumbuhan Streptococcus mutans dengan mengukur zona bening disekitar difusi disk dengan menggunakan jangka sorong secara vertikal, horizontal dan diagonal, kemudian dirata – ratakan dalam millimeter (Pratiwi, 2005). 4.9 Analisis Data Untuk menganalisis data hasil penelitian dipakai : 4.9.1 Analisis deskriptif : analisis data untuk memberikan gambaran tentang mean, standar deviasi dan rerata yang didapatkan dari hasil penelitian. 4.9.2 Uji normalitas dan homogenitas :
a. Uji Normalitas : distribusi data diameter zona hambat dari masing – masing kelompok percobaan diuji dengan Shapiro Wilks dengan tingkat kemaknaan 5%. Data berdistribusi normal bila nilai p dari uji normalitas > α. b. Uji Homogenitas : varian data diameter zona hambat antar kelompok percobaan diuji dengan Levene’s test dengan tingkat kemaknaan 5%. Data homogen bila nilai p dari uji Levene’s test > α, dan data heterogen bila nilai p uji Levene’s test ≤ α.
4.9.3 Uji efek perlakuan a. Data daya hambat pertumbuhan Streptococcus mutans berdistribusi normal, perbedaan rerata diameter zona hambat antar kelompok perlakuan diuji dengan uji parametrik One Way Anova, dengan tingkat kemaknaan α = 5% dengan hipotesis statistik : H0 = µ1 = µ2 = µ3, Ha : tidak semua kelompok sama. b. Perbedaan daya hambat antar kelompok pada konsentrasi ekstrak mengkudu dan kontrol dilanjutkan dengan uji Tamhane pada tingkat kemaknaan α = 5% dengan hipotesis statistik sebagai berikut : 1). Untuk kontrol – P1 : Ho : µ0 = µ1 Ha : µ0 ≠ µ1
15
2) Untuk kontrol – P2 : Ho : µ0 = µ2 Ha : µ0 ≠ µ2 3) Untuk kontrol – P3: Ho : µ0 = µ3 Ha : µ0 ≠ µ3 4) Untuk P1 – P2 : Ho : µ1 = µ2 Ha : µ1 ≠ µ2 5) Untuk P1 – P3 : Ho : µ1 = µ3 Ha : µ1 ≠ µ3 6) Untuk P2 – P3 : Ho : µ2 = µ3 Ha : µ2 ≠ µ3 4.9.4 Analisis Kualitatif Mengelompokkan diameter zona hambat ke dalam empat kelompok yaitu sangat kuat, kuat, sedang dan lemah. Analisis hubungan antara konsentrasi ekstrak mengkudu dengan kualitas daya hambat menggunakan tabulasi silang dengan tingkat signifikansi hubungan diuji dengan uji Chi Square.
