BAB IV METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian Rancangan penelitian ini bersifat eksperimental murni (true experiment), memakai kelompok kontrol dengan menggunakan rancangan Post test only control group design (Marczyk dkk., 2005). Bagan rancangan penelitian sebagai berikut :
S
RA P0
O0 P1i
O1i
P2 j
O2j
P3k
O3k
Gambar 4.1 : Rancangan Penelitian
Keterangan S = Sampel Streptococcus mutans ATCC 35668 R A = Random Alokasi P0 = Perlakuan yang diberi aquadest steril O0 = Observasi P0 P1i = Kelompok perlakuan yang diberi larutan garam dapur bermerk (i= 4%, 6%, dan 8%) O1i P2j O2j P3k O3k
= Observasi P1i (i= 4%, 6%, dan 8%) = Klompok perlakuan yang diberi larutan garam dapur tidak bermerk (j= 4%, 6%, dan 8%) = Observasi klompok P2j (j= 4%, 6%, dan 8%) = Klompok perlakuan yang diberi larutan iodium yang konsentrasinya dibuat setara dengan konsentrasi garam beriodium bermerk (k= 4%, 6%, dan 8%) = Observasi klompok P3k (k= 4%, 6%, dan 8%)
1
2
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian
ini
dilakukan
di
Laboratorium
Mikrobiologi
Fakultas
Kedokteran Universitas Udayana. Waktu yang diperlukan adalah 2 bulan, yaitu April - Mei 2011.
4.3 Penentuan Populasi dan Sampel Penelitian ini menggunakan bakteri, sehingga penentuan besar sampel ditetapkan sesuai dengan penetapan baku uji bakteri yaitu menggunakan 108 bakteri. Untuk mendapatkan data yang valid dilakukan pengulangan sesuai rumus Federer (1977) : (n-1) (t-1) ≥ 15 n = banyak pengulangan t = perlakuan, dalam hal ini ada 10 perlakuan P0, ( P1i, P2j, P3k masingmasing dengan 3 konsentrasi), sehingga: (n-1) (10-1) = 15 (n-1) (9) = 15
n-1 = 159 = 1,667
3
n= 1,667 + 1= 2.667 ≈ 3 Jadi banyaknya pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebanyak 3 kali.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Variabel bebas Larutan garam dapur beriodium (bermerk dan tidak bermerk) dan larutan iodium yang konsentrasinya dibuat setara dengan konsentrasi garam beriodium bermerk. 4.4.2 Variabel tergantung Zona hambatan Streptococcus mutans. 4.4.3 Variabel terkendali a. Suhu dan waktu pengeraman Streptococcus mutans. b. Media pengeraman dan pembuatan Streptococcus mutans. c. Cara penghitungan zona hambat terhadap Streptococcus mutans. d. Sterilisasi alat dan bahan.
4.5 Definisi Operasional Variabel a. Larutan garam dapur tidak bermerk dan bermerk dengan konsentrasi 4%, 6%, dan 8% adalah larutan yang dibuat dengan menimbang masingmasing 4, 6, dan 8 g garamnya dilarutkan masing-masing ke dalam 100 ml
4
akuades. Untuk lebih mendapatkan data yang valid masing-masing garam yang dibuat dianalisis kandungan iodiumnya secara iodatometri. b. Larutan iodium adalah larutan iodium murni yang konsentrasi iodiumnya dibuat setara dengan iodium pada garam dapur bermerk konsentrasi 4%, 6%, dan 8% c. Zona hambatan Streptococcus mutans adalah zona bening yang terbentuk karena
kemampuan
larutan
dalam
menghambat
pertumbuhan
Streptococcus mutans. d. Cara penghitungan zona hambatan terhadap Streptococcus mutans adalah mengukur zona hambat yang tampak dengan menggunakan jangka sorong dengan tingkat ketelitian 0,02 mm. 1)
Diameter zona bening 20mm atau lebih berarti
mempunyai daya hambat yang sangat kuat 2)
Diameter
zona
bening
10mm-20mm
berarti
bening
5mm-10mm
berarti
mempunyai daya hambat kuat 3)
Diameter
zona
mempunyai daya hambat sedang 4)
Diameter zona bening < 5mm berarti mempunyai
daya hambat lemah (Dewi, 2010). e. Media pengeraman adalah media yang dipakai untuk menumbuhkan Streptococcus mutans dalam hal ini berbentuk agar, yang dipakai adalah Mueller-Hinton (MH) agar + darah kambing.
5
f. Sterilisasi alat dan bahan adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan, terutama kehidupan mikroorganisme
4.6 Bahan Penelitian. a. Larutan garam dapur beriodium 4%, 6%, dan 8% (bermerk dan tidak
bermerk). b. Larutan Iodium yang konsentrasi iodiumnya dibuat setara dengan iodium
pada garam dapur bermerk konsentrasi 4%, 6%, dan 8%. c. Akuades steril. d. Streptococcus mutans ATCC 35668. e. Mueller-Hinton (MH) agar, kode VL 124037 006 dengan merek dagang
MERCK. f. Darah Kambing. g. Streptococcal grouping kit. h. Media untuk test biokimia: Mannitol broth, Sorbitol broth, dan Voges
proskauer. i. Reagen Kovaʼc. j. Larutan NaCl 0,9%. k. Larutan amilum.
6
4.7 Instrumen Penelitian a. Labu erlenmeyer untuk pembuatan media, larutan garam dapur beriodium
(bermerk dan tidak bermerk) dan larutan iodium. b. Cawan petri untuk tempat media padat datar atau agar. c. Tabung reaksi untuk tempat media. d. Tabung durham untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. e. Inkubator untuk suasana pertumbuhan optimal bakteri. f. Ose/sengkelit untuk mengambil koloni bakteri. g. Autoclaf untuk sterilisasi alat-alat dan media. h. Lampu spiritus/Bunsen untuk flamber bahan dan sterilkan ose. i. Lidi kapas steril. j. Stop watch merk Citizen buatan Jepang untuk mengukur waktu
perendaman. k. Jangka sorong merk Vernier Caliper buatan Tricle Brand, Shanghai-China
untuk mengukur diameter zona bening. l. Kamera merk Sony buatan Jepang untuk mendokumentasikan kegiatan
yang berkaitan dengan penelitian ini.
4.8 Prosedur dan Alur Penelitian 4.8.1 Pembuatan media MH agar darah Pembuatan media MH agar darah dilakukan dengan menimbang 6,8 gram bubuk media MH agar, dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi 200 ml akuades lalu diaduk, kemudian di autoclave pada tekanan 121 atm selama 15
7
menit. Selanjutnya media ditaruh dalamwater bath hingga suhu ± 500C dan ditambahkan 10 cc darah kambing dan dihomogenkan. Media MH agar yang sudah diproses tersebut dituangkan pada cawan petri steril untuk 10 cawan petri lalu didinginkan hingga beku. Kita ambil 5% dari jumlah total cawan petri yang berisi media dalam hal ini diambil 2 cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 370C. Keesokkan harinya kita kontrol sterilitas daripada media, jika bening berarti steril bisa kita pakai untuk media penanaman Streptococcus mutans.
4.8.2 Peremajaan isolat Streptococcus mutans Dari stok Streptococcus mutans kita ambil dengan ose steril beberapa koloni kemudian kita goreskan ke media MH agar darah, lalu masukkan ke dalam inkubator untuk diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 370C keesokan harinya akan terlihat koloni kecil-kecil, lembut berwarna bening.
4.8.3 Uji grup Streptococcus mutans Memakai Streptococcal grouping kit, sebelumnya enzim dipipet 0,4 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi steril, kemudian koloni Streptococcus mutans pada MH agar darah diambil dengan ose steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian dihomogenkan agar tidak menggumpal lalu di inkubasi dalam inkubator dengan suhu 370C selama 10 menit. Dikeluarkan dari inkubator lalu di pipet kemudian ditaruh pada 6 lubang slide grouping kit masing-masing sebanyak 50 µ dan 50 µ lagi untuk kontrol positip dimana selanjutnya pada masing-masing
8
lubang ditetesi : lubang 1 serum latex A, lubang 2 serum latex B, lubang 3 serum latex C, lubang 4 serum latex D, lubang 5 serum latex F, lubang 6 serum latex G dan satu lubang untuk kontrol. Masing-masing dihomogenkan dengan batang pengaduk kayu dan digoyang, hasil pengamatan terjadi aglutinasi menunjukkan positip (+) sedangkan bila homogen berarti negatip (-).
4.8.4 Identifikasi Streptococcus mutans Pada
penelitian
ini
dilakukan
identifikasi
Streptococcus
mutans
menggunakan uji biokimia meliputi:
4.8.4.1 Pembuatan media Mannitol Broth
Ditimbang 2 g bubuk Mannitol Broth, dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer yang telah berisi 100 ml akuades steril kemudian dilarutkan, lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan volume ± 5 ml yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik dengan tabung reaksi gunanya untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. Selanjutnya di autoklaf. Kita ambil 5% dari jumlah total tabung reaksi yang berisi media dalam hal ini diambil 4 tabung reaksi dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 370C. Keesokkan harinya kita kontrol sterilitas daripada media, jika bening berarti steril bisa kita pakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans.
4.8.4.2 Pembuatan media Sorbitol Broth
9
Ditimbang 2 g bubuk Sorbitol Broth dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer yang telah berisi 100 ml akuades steril kemudian dilarutkan, lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan volume ± 5 ml yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik dengan tabung reaksi gunanya untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. Selanjutnya di autoklaf, diambil 5% dari jumlah total tabung reaksi yang berisi media, dalam hal ini diambil 4 tabung reaksi dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 370C. Keesokkan harinya, dilihat sterilitas media, jika bening berarti steril bisa dipakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans.
4.8.4.3 Pembuatan media Voges Proskauer
Ditimbang 1,7 g bubuk Voges Proskauer, dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer yang telah berisi 100 ml akuades steril kemudian dilarutkan, lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan volume ± 5 ml. Selanjutnya di autoklaf. Kita ambil 5% dari jumlah total tabung reaksi yang berisi media dalam hal ini diambil 4 tabung reaksi dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 370C. Keesokkan harinya kita kontrol sterilitas media, jika bening berarti steril bisa kita pakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans. Media uji biokimia di atas siap dipakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans. Koloni Streptococcus mutans pada MH agar darah diambil dengan ose steril dimasukkan ke masing-masing media di homogenkan kemudian di inkubasi pada
10
inkubator dengan suhu 370C selama 24 jam, hasil pengamatan menunjukkan adanya kekeruhan dan perubahan warna (kuning) pada media Mannitol Broth dan Sorbitol Broth, sedangkan pada media Voges Proskauer terjadi kekeruhan yang ditambah dengan reagent Kovaʼc berubah menjadi merah anggur. Perubahanperubahan tersebut menunjukkan bahwa koloni tersebut benar Streptococcus mutans.
4.8.5 Membuat suspensi Streptococcus mutans Dari koloni yang tumbuh pada media MH agar darah, diambil 1-2 koloni dimasukkan ke dalam media NaCl 0,9%, dibuat kekeruhan setara dengan 0,5 Mac-Farland. Lidi kapas steril kita celupkan ke dalam suspensi di atas, lidi kapas steril yang sudah dicelupkan tadi diperas pada dinding tabung supaya cairan yang diambil tidak berlebihan. Kemudian dioleskan secara merata 3 radian pada media MH agar darah.
4.8.6 Pembuatan larutan garam dapur beriodium Pada penelitian ini digunakan dua jenis garam yaitu; garam rakyat yang diproduksi secara tradisional selanjutnya disebut garam tanpa merk dan garam dapur bermerk serta larutan iodium yang konsentrasi iodiumnya disetarakan dengan konsentrasi iodium garam bermerk. Masing-masing garam tersebut dibuat dengan konsentrasi 4, 6, dan 8%. Hal ini dilakukan dengan menimbang masing-
11
masing 4, 6, dan 8 g garamnya dan dilarutkan masing-masing ke dalam 100 ml akuades. Untuk lebih mendapatkan data yang valid masing-masing garam yang dibuat dianalisis kandungan iodiumnya secara iodatometri.
4.8.7 Mengukur efektifitas larutan garam dapur beriodium terhadap Streptococcus mutans. Siapkan 9 cawan petri yang berisi Mueller-Hinton (MH) agar darah kambing dan 40 paper disk dengan diameter 5mm. Pada masing - masing larutan garam dapur beriodium dengan konsentrasi 4%, 6% dan 8% (bermerk dan tidak bermerk) juga larutan iodium dengan konsentrasi yang setara dengan larutan garam dapur beriodium yang bermerk dimasukkan 3 paper disk sedangkan untuk kontrol negatifnya dipakai akuades steril selama 60 detik, lalu paper disk dikeluarkan dan dikeringkan pada petri disk steril selama ± 10 menit agar jangan terlalu kering, kemudian dish tersebut kita tempelkan di atas media MuellerHinton (MH) agar darah kambing, selanjutnya diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 370C selama 24 jam. Keesokan harinya kita lihat dan ukur zona bening yang terbentuk.
4.9 Alur Penelitian Untuk lebih memudahkan dalam pelaksanaan penelitian, maka dibuat alur penelitian, seperti ditunjukkan dengan Gambar 4.8.
12
Isolat Streptococcus mutans
Peremajaan Streptococcus mutans
Kontrol Aquadest steril
Klompok 1 Larutan garam dapur ber-merk 4%, 6%, dan 8%
Klompok 2 Larutan garam dapur tidak bermerk 4%, 6%, dan 8%
Mengukur Diameter Zona Hambat Data Zona Hambat
Klompok 3 Larutan iodium dg konsentrasi iodiumnya setara dg konsentrasi iodium garam dapur bermerk 4%, 6%, dan 8%
13
Analisis Data Simpulan Penelitian
Gambar 4.8 : Alur Penelitian
4.10 Analisis Data Untuk menganalisis data hasil penelitian dilakukan langkah-langkah: semua data dideskripsikan untuk memberikan gambaran tentang karakteristik data yang didapatkan dari hasil penelitian. Analisis perbedaan perlakuan dilakukan menggunakan SPSS sesuai dengan berikut ini:
4.10.1 Uji normalitas dan homogenitas : a. Uji Normalitas dengan uji Kolmogorov-Smirnov (KS) oleh karena sampelnya > 30 b. Uji Homogenitas dengan uji Levene’s test.
4.10.2 Uji efek perlakuan Dalam penelitian ini didapatkan bahwa data tidak berdistribusi normal maka digunakan uji non parametrik yaitu uji Kruskal-Wallis. Dilakukan untuk membandingkan rerata data hasil pengukuran pada post test yaitu antara O0, O1i, O2j, dan O3 (Handoko, 2007; Anonim, 2008).
14
Pada penelitian ini, juga dilakukan analisis regresi linier untuk menentukan apakah peningkatan konsentrasi garam dapat digunakan sebagai prediktor peningkatan zona hambat Streptococcus mutans.
