BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik dengan rancangan penelitian the post test only control group design. B. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Parasitologi FK UGM, Yogyakarta pada tanggal 21 Desember 2015 - 5 Januari 2016. C. Subjek Penelitian 1. Populasi Subjek yang digunakan dalam penelitian ini adalah larva Aedes aegypti L. instar III yang diperoleh dari Laboratorium Parasitologi FK UGM. Subjek penelitian memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eksklusi. 2. Kriteria Inklusi a. Larva Aedes aegypti L. yang telah mencapai instar III b. Larva Aedes aegypti L. yang masih hidup atau bergerak aktif 3. Kriteria Eksklusi a. Larva Aedes aegypti L. yang belum mencapai instar III b. Larva Aedes aegypti L. yang telah mati atau tidak bergerak c. Larva Aedes aegypti L. yang telah berubah menjadi pupa
26
27
D. Teknik Pengambilan Sampel Pada penelitian ini, pengambilan sampel dilakukan dengan teknik purposive sampling. E. Besar Sampel Sampel yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 725 ekor larva Aedes aegypti L. yang terdiri dari 125 ekor untuk uji pendahuluan dan 600 ekor untuk uji penelitian. Pada uji pendahuluan, sampel dibagi menjadi 5 kelompok yang terdiri dari 1 kelompok kontrol dan 4 kelompok perlakuan. Masing-masing kelompok pada uji pendahuluan terdiri dari 25 ekor larva. Pada uji penelitian, sampel dibagi menjadi 6 kelompok yang terdiri dari 1 kelompok kontrol dan 5 kelompok perlakuan. Penentuan besar sampel pada uji penelitian dihitung dengan rumus Federer sebagai berikut: Keterangan: n = besar sampel t = jumlah kelompok perlakuan (n-1) (t-1) ≥ 15 (n-1) (6-1) ≥ 15 5n – 5
≥ 15
5n
≥ 20
n
≥4
Jadi, besar sampel minimal yang digunakan sebanyak 4 ekor larva. Di dalam penelitian ini larva yang digunakan sebanyak 25 ekor berdasarkan
28
rekomendasi WHO tahun 2005. Pada uji penelitian larva dimasukkan ke dalam 6 kontainer. Tiap-tiap kontainer berisi 25 ekor larva. Jumlah sampel yang diambil dikalikan jumlah replikasi tiap konsentrasi yang diteliti. Banyaknya replikasi masing-masing larva dapat menggunakan rumus berikut: (n-1) (t-1) ≥ 15
Keterangan : t : jumlah perlakuan r : jumlah replikasi (6-1) (r-1) ≥ 15 5r- 5
≥ 15
5r
≥ 20
r
≥4
Maka jumlah replikasi atau pengulangan perlakuan pada uji penelitian paling sedikit dilakukan sebanyak 4 kali. F. Identifikasi Variabel Penelitian 1. Variabel bebas
: konsentrasi granul ekstrak daun salam polyanthum) per 100 ml air.
2. Variabel terikat
: jumlah mortalitas larva Aedes aegypti L.
(Syzygium
29
3. Variabel luar : a. Terkendali 1) Kepadatan larva 2) Umur larva 3) Habitat 4) Volume air 5) Kualitas air 6) Waktu pemaparan 7) Suhu dan kelembaban ruangan b. Tidak Terkendali 1) Kesehatan larva G. Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Granul yang digunakan mengandung ekstrak daun salam dan filler dekstrin dengan perbandingan ekstrak-dekstrin sebesar 1:9. Konsentrasi granul ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum) yang digunakan untuk uji pendahuluan sebesar 1750, 3500, 5250, dan 7000 mg/100 ml air. Konsentrasi untuk uji pendahuluan ini mengacu pada penelitian Lumowa dan Trani (2015) yang menggunakan ekstrak murni daun salam dengan konsentrasi 250, 500, 750 dan 1000 mg/100 ml. Konsentrasi granul ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum) yang digunakan untuk uji penelitian sebesar 1500, 3000, 6000, 9000 dan 12.000 mg/100 ml. Konsentrasi untuk
30
uji penelitian ini didapatkan dari LC50 pada uji pendahuluan dengan variasi konsentrasi 0,25 LC50, 0,5 LC50, LC50, 1,5 LC50 dan 2 LC50 (Yudhani, 2014). Skala variabel bebas termasuk skala rasio. 2. Variabel Terikat Jumlah mortalitas larva Aedes aegypti L. adalah banyaknya larva Aedes aegypti L. instar III yang mati dalam 24 jam setelah diberi perlakuan. Larva dianggap mati apabila mempunyai kondisi seperti: a. Larva jika diberi rangsangan gerakan air tidak ada respon gerakan. b. Larva jika disentuh dengan lidi tidak ada respon gerakan. Larva dianggap hidup apabila: a. Larva aktif bergerak. b. Larva jika diberi rangsangan gerakan air ada respon gerakan. c. Larva jika disentuh dengan lidi ada respon gerakan. Skala variabel terikat termasuk skala rasio. 3. Variabel Luar a. Terkendali 1) Umur Larva Variabel ini dikendalikan dengan cara memilih larva fase instar III. 2) Kepadatan Larva Variabel ini dikendalikan dengan cara menyamakan jumlah larva yaitu 25 ekor tiap 100 ml.
31
3) Habitat Dikendalikan dengan cara menyamakan tempat larva yaitu menggunakan gelas plastik ukuran 250 ml. 4) Volume Air Dikendalikan dengan cara menyamakan volume air masing-masing kelompok perlakuan yaitu 100 ml. 5) Kualitas Air Dikendalikan dengan mengambil air dari sumber air yang sama yaitu akuades. 6) Waktu Pemaparan Dikendalikan dengan cara menyamakan waktu pemaparan yaitu 24 jam. 7) Suhu dan Kelembaban Ruangan Suhu dan kelembaban diatur dengan cara tiap kelompok diberikan perlakuan pada waktu serta tempat yang sama. b. Tidak Terkendali 1) Kesehatan Larva Kesehatan masing-masing larva tidak dapat disamakan.
32
H. Rancangan Penelitian 1. Uji Pendahuluan
Larva Aedes aegypti L. instar III
Purposive sampling sampling 25 larva
Kelompok Kontrol aquades 100 ml + 700 mg dekstrin
25 larva
25 larva
25 larva
Kelompok 1
Kelompok 2
Kelompok 3
Kelompok 4
Konsentrasi granul ekstrak daun salam 1750 mg/ 100 ml
Konsentrasi granul ekstrak daun salam 3500 mg/ 100 ml
Konsenrasi granul ekstrak daun salam 5250 mg/ 100 ml
Konsentrasi granul ekstrak daun salam 7000 mg/ 100 ml
25 larva
Pengamatan setelah 24 jam
Penghitungan jumlah mortalitas larva
Analisis Probit
33
2. Uji Penelitian
Larva Aedes aegypti L. instar III
Purposive sampling sampling 25 larva
Kelompok Kontrol aquades 100 ml + 10.080 mg dekstrin
25 larva
25 larva
25 larva
25 larva
25 larva
Kelompok 1
Kelompok 2
Kelompok 3
Kelompok 4
Kelompok 5
Konsentrasi granul ekstrak daun salam sebesar 1500mg/100 ml
Konsentrasi granul ekstrak daun salam sebesar 3000mg/100 ml
Konsentrasi granul ekstrak daun salam sebesar 6000 mg/100 ml
Konsentrasi granul ekstrak daun salam sebesar 9000 mg/100 ml
Konsentrasi granul ekstrak daun salam sebesar 12.000 mg/100ml
Pengamatan setelah 24 jam
Penghitungan jumlah mortalitas larva
Analisis Data
Replikasi 4 kali
34
I. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat a. Gelas ukur 100 ml b. Gelas plastik ukuran 250 ml c. Sendok d. Lidi e. Timbangan analitik digital f. Pipet 2. Bahan a. Granul ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum) b. Larva Aedes aegypti L. instar III c. Akuades d. Bubuk dekstrin J. Cara Kerja 1. Tahap Persiapan a. Pengambilan Simplisia Daun Salam Simplisia daun salam diperoleh dari Merapi Farma Herbal, Sleman, Yogyakarta. b. Pembuatan Ekstrak Daun Salam Ekstrak daun salam dibuat di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada (UGM). Metode yang digunakan untuk mengekstrak adalah maserasi. Pertama-tama daun salam dicuci terlebih
35
dahulu dengan air mengalir, kemudian dipotong-potong 1 cm. Selanjutnya dikeringkan di dalam almari pengering dengan suhu 400 C selama 48 jam. Setelah itu diserbuk menggunakan mesin penyerbuk dengan diameter lubang saringan 1 mm. Daun salam yang sudah diserbuk kemudian ditambah etanol 70 % lalu diaduk selama 30 menit dan didiamkan selama 24 jam, kemudian disaring (diulangi 2 kali). Filtrat diuapkan dengan menggunakan waterbath suhu 700C sambil diaduk. Setelah itu ekstrak daun salam kental ditimbang dan dikemas. c. Pembuatan Granul Ekstrak daun salam yang masih berbentuk gel kemudian diproses menjadi bentuk granul di Lembaga Pengembangan dan Penelitian Terpadu Universitas Gajah Mada (LPPT UGM). Pembuatan granul dengan menggunakan dekstrin sebagai filler. Ekstrak daun salam sebanyak 60 gram ditambahkan dekstrin sebanyak 540 gram sehingga perbandingan ekstrak-dekstrin sebesar 1:9. Pertama-tama ekstrak ditambahkan dekstrin lalu diaduk sampai homogen di atas penangas. Kemudian campuran tersebut dipanaskan sedikit demi sedikit ke dalam oven dengan suhu sebesar 105oC. Bila sudah kering dan dingin, granul ditimbang. Berat granul kering yang didapatkan sebesar 467,9 gram. Terakhir granul kering dikemas ke dalam wadah.
36
d. Penyediaan Larva Aedes aegypti L. instar III Larva Aedes aegypti L. instar III diperoleh dari Laboratorium Parasitologi FK UGM, Yogyakarta. 2. Tahap Uji Pendahuluan a. Larva dibagi menjadi lima kelompok yang terdiri dari satu kelompok kontrol dan empat kelompok perlakuan. Pada kelompok perlakuan, larva diberi granul ekstrak daun salam dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Konsentrasi granul ekstrak daun salam yang digunakan untuk uji pendahuluan sebesar 1750, 3500, 5250, dan 7000 mg/100 ml air. Konsentrasi ini mengacu pada penelitian Lumowa dan Trani (2015) yang menggunakan ekstrak murni daun salam dengan konsentrasi 250, 500, 750 dan 1000 mg/100 ml. b. Bubuk dekstrin ditimbang hingga mendapatkan 700 mg lalu dimasukkan ke dalam gelas plastik ukuran 250 ml dan diberi label kelompok kontrol. Berat dekstrin sebesar 700 mg merupakan hasil penghitungan dari 1% dikali berat granul pada kelompok IV (7000 mg). c. Granul ekstrak daun salam diambil dengan sendok kemudian ditimbang sesuai dengan berat yang dibutuhkan lalu dimasukkan ke dalam gelas plastik ukuran 250 ml dan diberi label kelompok perlakuan I, II, III, dan IV. d. Air sebanyak 100 ml dimasukkan dengan menggunakan gelas ukur ke dalam gelas plastik.
37
e. Dua puluh lima ekor larva Aedes aegypti L. instar III dimasukkan menggunakan pipet ke masing-masing gelas plastik. f. Jumlah larva yang mati dihitung setelah 24 jam perlakuan. 3. Tahap Uji Penelitian a. Larva dibagi menjadi enam kelompok yang terdiri dari satu kelompok kontrol dan lima kelompok perlakuan. Pada kelompok perlakuan larva diberi granul ekstrak daun salam dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Konsentrasi granul ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum) yang digunakan pada uji penelitian sebesar 1500, 3000, 6000, 9000, dan 12000 mg/100 ml air. Konsentrasi tersebut didapatkan dari LC50 pada uji pendahuluan dengan variasi konsentrasi 0,25 LC50, 0,5 LC50, LC50, 1,5 LC50 dan 2 LC50 (Yudhani, 2014). b. Bubuk dekstrin ditimbang hingga mendapatkan 10.080 mg lalu dimasukkan ke dalam gelas plastik ukuran 250 ml dan diberi label kelompok kontrol. Berat dekstrin sebesar 10.080 mg merupakan hasil dari penghitungan 9% dikali berat granul pada kelompok V (12.000 mg). c. Granul ekstrak daun salam diambil dengan sendok kemudian ditimbang sesuai dengan berat yang dibutuhkan lalu dimasukkan ke dalam gelas plastik ukuran 250 ml dan diberi label kelompok perlakuan I, II, III, IV dan V.
38
d. Air sebanyak 100 ml dimasukkan dengan menggunakan gelas ukur ke dalam gelas plastik. e. Dua puluh lima ekor larva Aedes aegypti L. instar III dimasukkan menggunakan pipet ke masing-masing gelas plastik. f. Setiap kelompok perlakuan dilakukan 4 kali pengulangan g. Jumlah larva yang mati dihitung setelah 24 jam perlakuan. K. Teknik Analisis Data a. Uji Kruskal-Wallis Data yang didapatkan dari uji penelitian pertama-tama dihitung rerata mortalitas larva Aedes aegypti L. tiap kelompok perlakuan. Kemudian data rerata mortalitas larva Aedes aegypti L. tersebut dimasukkan ke dalam tabel sesuai dengan kelompok konsentrasi granul ekstrak daun salam. Data kemudian dianalisis menggunakan uji Kruskal-Wallis untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan rerata mortalitas larva Aedes aegypti L. diantara kelompok perlakuan. Uji Kruskal-Wallis digunakan karena data rerata mortalitas larva Aedes aegypti L. mempunyai distribusi yang tidak normal. b. Analisis Probit Uji ini digunakan untuk mengetahui daya bunuh granul ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum) terhadap larva Aedes aegypti L. yang dinyatakan dengan Lethal Concentration (LC) yaitu Lethal Concentration 50% (LC50).
